JP3089619B2 - 核酸の検出方法及びその装置 - Google Patents
核酸の検出方法及びその装置Info
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- JP3089619B2 JP3089619B2 JP03149719A JP14971991A JP3089619B2 JP 3089619 B2 JP3089619 B2 JP 3089619B2 JP 03149719 A JP03149719 A JP 03149719A JP 14971991 A JP14971991 A JP 14971991A JP 3089619 B2 JP3089619 B2 JP 3089619B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は核酸の検出方法及びその
装置に関する。詳しくは標的ＤＮＡの検出を簡便に短時
間に行うことができ、例えば、生体内に存在しうる病因
遺伝子の検出や遺伝子学的研究等に有用な検出方法及び
それに用いる装置に関する。
装置に関する。詳しくは標的ＤＮＡの検出を簡便に短時
間に行うことができ、例えば、生体内に存在しうる病因
遺伝子の検出や遺伝子学的研究等に有用な検出方法及び
それに用いる装置に関する。
【０００２】
【従来の技術・発明が解決しようとする課題】ウィルス
や細菌が原因となる病気の診断を遺伝子レベルで行う試
みが行われている。遺伝子レベルで病気の原因菌をつき
とめるための方法の１つに遺伝子増幅法を用いた方法が
ある。この方法は、ポリメラーゼチェーンリアクション
（ＰＣＲ）(Saiki, R. K. et al., Science 239, 487-4
91 (1988))と呼ばれる。
や細菌が原因となる病気の診断を遺伝子レベルで行う試
みが行われている。遺伝子レベルで病気の原因菌をつき
とめるための方法の１つに遺伝子増幅法を用いた方法が
ある。この方法は、ポリメラーゼチェーンリアクション
（ＰＣＲ）(Saiki, R. K. et al., Science 239, 487-4
91 (1988))と呼ばれる。
【０００３】この方法は、極く微量の遺伝子（ＤＮＡ）
から目的とするＤＮＡ領域だけを数時間のうちに約１０
０万倍に増幅させることができる。即ち、増幅させたい
遺伝子領域を挟んで＋鎖、−鎖に対するＤＮＡプライマ
ー（１８〜３０ヌクレオチド）を合成し、ＤＮＡポリメ
ラーゼによりＤＮＡ断片の合成を繰り返し行うと、１サ
イクルごとにＤＮＡは２倍に増幅され、ｎサイクル後に
は、２n 倍に増幅される。
から目的とするＤＮＡ領域だけを数時間のうちに約１０
０万倍に増幅させることができる。即ち、増幅させたい
遺伝子領域を挟んで＋鎖、−鎖に対するＤＮＡプライマ
ー（１８〜３０ヌクレオチド）を合成し、ＤＮＡポリメ
ラーゼによりＤＮＡ断片の合成を繰り返し行うと、１サ
イクルごとにＤＮＡは２倍に増幅され、ｎサイクル後に
は、２n 倍に増幅される。
【０００４】この際ＤＮＡプライマーとして、目的遺伝
子に特異的な配列を選ぶことで選択性の高いポリメラー
ゼ反応がおこる。そのため、目的遺伝子中にプライマー
領域（増幅されるべきＤＮＡ断片）が１箇所しかなけれ
ば、増幅されるＤＮＡ断片はある長さを有する１種類の
断片しか原理的には、生成されないはずである。
子に特異的な配列を選ぶことで選択性の高いポリメラー
ゼ反応がおこる。そのため、目的遺伝子中にプライマー
領域（増幅されるべきＤＮＡ断片）が１箇所しかなけれ
ば、増幅されるＤＮＡ断片はある長さを有する１種類の
断片しか原理的には、生成されないはずである。
【０００５】しかしながら、実際には異なる長さを持つ
複数のＤＮＡ断片を生成することがある。例えば、食中
毒菌の同定の例を挙げると、サルモネラ菌を同定しよう
とする際、サルモネラ菌のＬ−アラビノースオペロン中
のａｒａＣ遺伝子中の特定の配列２種を用いてサルモネ
ラ菌を含む溶液をＰＣＲ反応させると、０．３３ｋｂｐ
のＤＮＡ断片が生じるが、サルモネラ菌以外の菌、例え
ば、ビブリオ・パラヘモリティカス菌（V. parahaemoly
ticus WP1株) 、バチルス・セレウス(B. cereus JCM21
52株) を含む溶液をＰＣＲしても、それぞれ０．３７ｋ
ｂｐ、０．２０ｋｂｐのＤＮＡ断片を生じる。
複数のＤＮＡ断片を生成することがある。例えば、食中
毒菌の同定の例を挙げると、サルモネラ菌を同定しよう
とする際、サルモネラ菌のＬ−アラビノースオペロン中
のａｒａＣ遺伝子中の特定の配列２種を用いてサルモネ
ラ菌を含む溶液をＰＣＲ反応させると、０．３３ｋｂｐ
のＤＮＡ断片が生じるが、サルモネラ菌以外の菌、例え
ば、ビブリオ・パラヘモリティカス菌（V. parahaemoly
ticus WP1株) 、バチルス・セレウス(B. cereus JCM21
52株) を含む溶液をＰＣＲしても、それぞれ０．３７ｋ
ｂｐ、０．２０ｋｂｐのＤＮＡ断片を生じる。
【０００６】このようにＰＣＲ法は超微量標的ＤＮＡが
存在すればプライマーを用いて大量に標的ＤＮＡ配列を
増幅させる方法として優れており、ＤＮＡ検出に広く利
用されているが、ＰＣＲ法で検出されるＤＮＡは目的と
するＤＮＡばかりでなく、２つのプライマーによって増
幅されうるＤＮＡであれば、標的ＤＮＡ以外のものであ
っても増幅され得る。従って、複数の増幅ＤＮＡ断片が
共存することもあり、特異性を要求されるＤＮＡ断片の
検出に問題が生じているのが実情である。
存在すればプライマーを用いて大量に標的ＤＮＡ配列を
増幅させる方法として優れており、ＤＮＡ検出に広く利
用されているが、ＰＣＲ法で検出されるＤＮＡは目的と
するＤＮＡばかりでなく、２つのプライマーによって増
幅されうるＤＮＡであれば、標的ＤＮＡ以外のものであ
っても増幅され得る。従って、複数の増幅ＤＮＡ断片が
共存することもあり、特異性を要求されるＤＮＡ断片の
検出に問題が生じているのが実情である。
【０００７】また、ＰＣＲ反応を行う操作は煩雑かつ時
間を要するため、研究用途等の少数サンプルを扱う際に
はあまり支障にならないが、特に臨床検査等の多くの検
体を扱う際には支障となる。例えば、電気泳動法では約
１時間以上、プローブ法では約２時間以上を要するなど
の点から、簡易な検出方法の開発が要請されている。
間を要するため、研究用途等の少数サンプルを扱う際に
はあまり支障にならないが、特に臨床検査等の多くの検
体を扱う際には支障となる。例えば、電気泳動法では約
１時間以上、プローブ法では約２時間以上を要するなど
の点から、簡易な検出方法の開発が要請されている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前述のよ
うな課題を解消するため特異的なＤＮＡ断片をいかに効
率よく増幅し、検出することが可能かを鋭意研究し、複
数段階で異なったプライマーを機能させることによって
特異性を高めることが可能であることを見出し、さら
に、該方法に適した検出装置を開発し、本発明を完成し
た。即ち、本発明の要旨は、（ａ）２種のオリゴヌクレオチドを鎖長反応のプライマ
ーとして機能させ、標的ＤＮＡ中の特定のＤＮＡをＤＮ
Ａ合成酵素を用いて選択的に増幅させる第１反応液を供
給する第１反応液供給手段と、該手段により供給される
反応液を収容する反応ライン上を移動可能に配設された
容器群と、第１反応の終了した該容器群中の容器に、第
１反応で増幅させたＤＮＡに第１反応で用いたプライマ
ーと１種または２種異なるプライマー２種を機能させ、
ＤＮＡ合成酵素を用いて選択的に該ＤＮＡ内のＤＮＡ断
片をさらに増幅させる第２反応液を供給する第２反応液
供給手段と、該容器群中の反応温度を制御するヒーター
ブロックとを備えてなるＰＣＲ部；並びに （ｂ）第２反応の終了した増幅ＤＮＡ断片を検出する検
出手段を備えていることを特徴とする核酸の検出装置 に
関する。
うな課題を解消するため特異的なＤＮＡ断片をいかに効
率よく増幅し、検出することが可能かを鋭意研究し、複
数段階で異なったプライマーを機能させることによって
特異性を高めることが可能であることを見出し、さら
に、該方法に適した検出装置を開発し、本発明を完成し
た。即ち、本発明の要旨は、（ａ）２種のオリゴヌクレオチドを鎖長反応のプライマ
ーとして機能させ、標的ＤＮＡ中の特定のＤＮＡをＤＮ
Ａ合成酵素を用いて選択的に増幅させる第１反応液を供
給する第１反応液供給手段と、該手段により供給される
反応液を収容する反応ライン上を移動可能に配設された
容器群と、第１反応の終了した該容器群中の容器に、第
１反応で増幅させたＤＮＡに第１反応で用いたプライマ
ーと１種または２種異なるプライマー２種を機能させ、
ＤＮＡ合成酵素を用いて選択的に該ＤＮＡ内のＤＮＡ断
片をさらに増幅させる第２反応液を供給する第２反応液
供給手段と、該容器群中の反応温度を制御するヒーター
ブロックとを備えてなるＰＣＲ部；並びに （ｂ）第２反応の終了した増幅ＤＮＡ断片を検出する検
出手段を備えていることを特徴とする核酸の検出装置 に
関する。
【０００９】本発明においてプライマーとして使用でき
るものは従来公知のものが使用でき、目的ＤＮＡに対
し、特異性を有するプライマーであれば、特に限定され
るものではない。通常１５〜４０個の塩基からなる。本
発明に使用するプライマーは公知のＤＮＡ合成方法によ
り容易に得ることができる。オリゴヌクレオチドを、例
えば、ミリジェン社製のＤＮＡ合成機サイクロン・プラ
ス等を用いて合成し、合成したオリゴヌクレオチドは逆
相カラムを用いたＨＰＬＣ、ＤＮＡ吸着性カラムあるい
はポリアクリルアミドゲル電気泳動等を用いた公知の方
法により精製し、プライマーとして用いることができ
る。
るものは従来公知のものが使用でき、目的ＤＮＡに対
し、特異性を有するプライマーであれば、特に限定され
るものではない。通常１５〜４０個の塩基からなる。本
発明に使用するプライマーは公知のＤＮＡ合成方法によ
り容易に得ることができる。オリゴヌクレオチドを、例
えば、ミリジェン社製のＤＮＡ合成機サイクロン・プラ
ス等を用いて合成し、合成したオリゴヌクレオチドは逆
相カラムを用いたＨＰＬＣ、ＤＮＡ吸着性カラムあるい
はポリアクリルアミドゲル電気泳動等を用いた公知の方
法により精製し、プライマーとして用いることができ
る。
【００１０】本発明の検出方法は以下の手順に従って、
行うことができる。 （１）標的ＤＮＡの抽出動物組織、菌体、培養細胞など
から得られた新鮮、凍結あるいはホルマリンなどで固定
した検体をプロテイナーゼ等の酵素処理によりタンパク
質を消化した後、フェノール抽出およびエタノール沈澱
処理など常法によりＤＮＡを抽出する。
行うことができる。 （１）標的ＤＮＡの抽出動物組織、菌体、培養細胞など
から得られた新鮮、凍結あるいはホルマリンなどで固定
した検体をプロテイナーゼ等の酵素処理によりタンパク
質を消化した後、フェノール抽出およびエタノール沈澱
処理など常法によりＤＮＡを抽出する。
【００１１】（２）第１反応 （１）で得られた標的ＤＮＡに、合成された本発明にお
けるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼを加え、常法に従いＰＣＲ反応を
行ない、増幅されたＤＮＡを得る。
けるオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、耐熱
性ＤＮＡポリメラーゼを加え、常法に従いＰＣＲ反応を
行ない、増幅されたＤＮＡを得る。
【００１２】ＰＣＲは具体的には一般に次のような工程
でなされる。検体中の標的ＤＮＡに対し、プライマー
（Ａ）を機能させてハイブリダイズ（アニーリング工
程）させて鎖長反応を行なう（イクステンション工
程）。これにより得られた２本鎖ヌクレオチドを１本鎖
に分離し（ディナチュレーション工程）、その相補鎖を
他方のプライマーの鋳型として機能させる。他方のプラ
イマー（Ｂ）を機能させて、これら２つのプライマーに
よる鎖長反応生成物の鋳型から分離操作を繰り返すこと
により特定のヌクレオチド断片を増幅させる。プライマ
ーによる鎖長反応は、通常、前記のような公知の耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼが用いられる。鎖長反応生成物の鋳
型からの分離操作は種々の公知の方法により行なわれる
が、熱変性により行なうのが好ましい。
でなされる。検体中の標的ＤＮＡに対し、プライマー
（Ａ）を機能させてハイブリダイズ（アニーリング工
程）させて鎖長反応を行なう（イクステンション工
程）。これにより得られた２本鎖ヌクレオチドを１本鎖
に分離し（ディナチュレーション工程）、その相補鎖を
他方のプライマーの鋳型として機能させる。他方のプラ
イマー（Ｂ）を機能させて、これら２つのプライマーに
よる鎖長反応生成物の鋳型から分離操作を繰り返すこと
により特定のヌクレオチド断片を増幅させる。プライマ
ーによる鎖長反応は、通常、前記のような公知の耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼが用いられる。鎖長反応生成物の鋳
型からの分離操作は種々の公知の方法により行なわれる
が、熱変性により行なうのが好ましい。
【００１３】ＰＣＲに用いる検体中の標的ＤＮＡ量は、
通常１ｐｇ〜１０ｎｇ程度を標準とし、プライマーの量
は通常、０．１ｎｍｏｌ程度を用いる。ＰＣＲの条件
は、ディナチュレーション工程は通常９４℃で０．５〜
１分、アニーリング工程が通常３７〜７２℃で１〜３
分、イクステンション工程が通常６０〜７２℃で１〜３
分の条件であり、これらの工程を１サイクルとしたＰＣ
Ｒを通常２５〜４５サイクル行なう。
通常１ｐｇ〜１０ｎｇ程度を標準とし、プライマーの量
は通常、０．１ｎｍｏｌ程度を用いる。ＰＣＲの条件
は、ディナチュレーション工程は通常９４℃で０．５〜
１分、アニーリング工程が通常３７〜７２℃で１〜３
分、イクステンション工程が通常６０〜７２℃で１〜３
分の条件であり、これらの工程を１サイクルとしたＰＣ
Ｒを通常２５〜４５サイクル行なう。
【００１４】（３）第２反応 （２）で得られた増幅されたＤＮＡ断片に、プライマー
（Ａ）と（Ｃ）、プライマー（Ｂ）と（Ｄ）、あるいは
プライマー（Ｃ）と（Ｄ）を機能させ、第１反応と同様
のＰＣＲ反応を行ない、増幅されたＤＮＡ断片を得る。
ディナチュレーション工程、アニーリング工程、イクス
テンション工程を１サイクルとしたＰＣＲを通常２５〜
４５サイクル行なう。
（Ａ）と（Ｃ）、プライマー（Ｂ）と（Ｄ）、あるいは
プライマー（Ｃ）と（Ｄ）を機能させ、第１反応と同様
のＰＣＲ反応を行ない、増幅されたＤＮＡ断片を得る。
ディナチュレーション工程、アニーリング工程、イクス
テンション工程を１サイクルとしたＰＣＲを通常２５〜
４５サイクル行なう。
【００１５】ここでプライマー（Ｃ）、（Ｄ）とは、第
１反応で増幅されたＤＮＡ内の特定のＤＮＡ断片を特異
的に増幅するために用いられるものであり、それに適し
たオリゴヌクレオチドの合成を行うことにより得られ
る。従って、第２反応でのプライマーとしては、第１反
応でのプライマーと１種または２種異なるものが使用さ
れる。
１反応で増幅されたＤＮＡ内の特定のＤＮＡ断片を特異
的に増幅するために用いられるものであり、それに適し
たオリゴヌクレオチドの合成を行うことにより得られ
る。従って、第２反応でのプライマーとしては、第１反
応でのプライマーと１種または２種異なるものが使用さ
れる。
【００１６】（４）増幅ＤＮＡ断片の検出 増幅されたＤＮＡ断片を断片の長さによって分離する方
法としては、電気泳動法が知られている。この方法は、
（i) アクリルアミドゲル担体中で、ラジオアイソト
ープでラベルしたあるいはラベルしていないＤＮＡ断片
を泳動させ、そのゲルのオートラジオグラフィーをとる
方法、（ii） 薄層シリカゲルプレート上におき、ＵＶ
ランプでゲルを照らし写真を取る方法、（iii) アガロ
ースゲル担体中でＤＮＡ断片を泳動させ、その後エチジ
ウムブロマイドでＤＮＡを染色し、泳動漕からゲルをト
ランスイルミネーター（紫外光を発する）上におき、写
真をとる方法（T. Maniatis et al.,Molecular Clonin
g,Cold Spring Harbour (1982))、（iv） ＤＮＡの配
列を決定できるＤＮＡシーケンサーによる方法、即ち、
蛍光標識したＤＮＡプライマーを蛍光ラベルし、シーケ
ンスしたいＤＮＡをアクリルアミドゲルに泳動させ、ア
ルゴンレーザーを用いてＤＮＡ由来の蛍光強度を測定す
る方法 (Smith, L. M. et al., Nature 321, 674-679
(1986))などが知られている。
法としては、電気泳動法が知られている。この方法は、
（i) アクリルアミドゲル担体中で、ラジオアイソト
ープでラベルしたあるいはラベルしていないＤＮＡ断片
を泳動させ、そのゲルのオートラジオグラフィーをとる
方法、（ii） 薄層シリカゲルプレート上におき、ＵＶ
ランプでゲルを照らし写真を取る方法、（iii) アガロ
ースゲル担体中でＤＮＡ断片を泳動させ、その後エチジ
ウムブロマイドでＤＮＡを染色し、泳動漕からゲルをト
ランスイルミネーター（紫外光を発する）上におき、写
真をとる方法（T. Maniatis et al.,Molecular Clonin
g,Cold Spring Harbour (1982))、（iv） ＤＮＡの配
列を決定できるＤＮＡシーケンサーによる方法、即ち、
蛍光標識したＤＮＡプライマーを蛍光ラベルし、シーケ
ンスしたいＤＮＡをアクリルアミドゲルに泳動させ、ア
ルゴンレーザーを用いてＤＮＡ由来の蛍光強度を測定す
る方法 (Smith, L. M. et al., Nature 321, 674-679
(1986))などが知られている。
【００１７】本発明の方法では、前記の従来法とは異な
り、ＰＣＲ反応の終了後に反応液に直接染色剤を作用さ
せ、染色された溶液の蛍光強度または吸光度を測定する
ことにより増幅ＤＮＡ断片を検出する。染色剤として
は、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、クロ
モマイシンＡ３、Hoechst 33258 、ＤＩＰＩ (4',6-bis
(2'-imidazolinyl-4H,5H)-2-phenylindole) 等のＤＮＡ
親和物質等が例示される。染色剤の添加は、あらかじめ
蛍光セルに入れておくか、あるいはＰＣＲ反応終了後に
サンプルチューブに添加してもよい。
り、ＰＣＲ反応の終了後に反応液に直接染色剤を作用さ
せ、染色された溶液の蛍光強度または吸光度を測定する
ことにより増幅ＤＮＡ断片を検出する。染色剤として
は、エチジウムブロマイド、アクリジンオレンジ、クロ
モマイシンＡ３、Hoechst 33258 、ＤＩＰＩ (4',6-bis
(2'-imidazolinyl-4H,5H)-2-phenylindole) 等のＤＮＡ
親和物質等が例示される。染色剤の添加は、あらかじめ
蛍光セルに入れておくか、あるいはＰＣＲ反応終了後に
サンプルチューブに添加してもよい。
【００１８】次に、本発明の検出方法を用いるための装
置を図面に基づいて説明する。即ち、逐次処理ダブルＰ
ＣＲ装置を備えた本発明の検出装置の概略図を図３に示
す。説明を簡略化するために、ＰＣＲの第１反応８サイ
クル、第２反応８サイクルの装置について記す。まず、
図の左端のサンプルチューブに、新しくこれから反応を
行うべき試料ＤＮＡを入れる。これと同時に、１６本並
んだ反応中のサンプルチューブ（容器群）がワンステッ
プ右に移動し、最右端の反応の終わったサンプル１つは
反応系から終了サンプルとして出される。
置を図面に基づいて説明する。即ち、逐次処理ダブルＰ
ＣＲ装置を備えた本発明の検出装置の概略図を図３に示
す。説明を簡略化するために、ＰＣＲの第１反応８サイ
クル、第２反応８サイクルの装置について記す。まず、
図の左端のサンプルチューブに、新しくこれから反応を
行うべき試料ＤＮＡを入れる。これと同時に、１６本並
んだ反応中のサンプルチューブ（容器群）がワンステッ
プ右に移動し、最右端の反応の終わったサンプル１つは
反応系から終了サンプルとして出される。
【００１９】次に、第１反応液と第２反応液が、１本目
と９本目のその真下のチューブにそれぞれ第１反応液供
給手段、第２反応液供給手段により供給される。次い
で、容器群は静止し、９４℃のヒータブロックが容器群
の真下から上がってきて、容器群を加熱する。
と９本目のその真下のチューブにそれぞれ第１反応液供
給手段、第２反応液供給手段により供給される。次い
で、容器群は静止し、９４℃のヒータブロックが容器群
の真下から上がってきて、容器群を加熱する。
【００２０】１分間加熱後、９４℃ヒータブロックに代
わって、５５℃ヒータブロックが上がってきて、５５℃
に１分間容器群を加熱する。最後に７２℃のヒータブロ
ックが１分間挿入される。これにより、容器群中の各サ
ンプルチューブは９４℃、５５℃、７２℃の温度変化を
示し、これによりＰＣＲ反応の１サイクルが行われる。
わって、５５℃ヒータブロックが上がってきて、５５℃
に１分間容器群を加熱する。最後に７２℃のヒータブロ
ックが１分間挿入される。これにより、容器群中の各サ
ンプルチューブは９４℃、５５℃、７２℃の温度変化を
示し、これによりＰＣＲ反応の１サイクルが行われる。
【００２１】次に、前述のように図の左から試料ＤＮＡ
の入ったサンプルチューブが新たに導入され、容器群は
本装置の反応ライン上をワンステップ移動することとな
る。この一連の操作を繰り返すことにより、第１反応の
終了した容器には第２反応液が供給され第２反応がくり
返されるので、逐次的に遺伝子増幅反応等を行なえるこ
ととなる。
の入ったサンプルチューブが新たに導入され、容器群は
本装置の反応ライン上をワンステップ移動することとな
る。この一連の操作を繰り返すことにより、第１反応の
終了した容器には第２反応液が供給され第２反応がくり
返されるので、逐次的に遺伝子増幅反応等を行なえるこ
ととなる。
【００２２】この反応を繰り返すことにより、ヒータブ
ロックの穴の数（図３における装置では１６回）だけ、
温度サイクルを行ったものが、順次処理されることにな
る。本装置における第１反応液供給手段および第２反応
液供給手段は、通常自動分注器により行われ、また容器
群の反応ライン上の間欠的な移動はベルトコンベアによ
り行われる。また、３つのヒーターブロックとしてはア
ルミブロックにシースヒータ等が用いられる。
ロックの穴の数（図３における装置では１６回）だけ、
温度サイクルを行ったものが、順次処理されることにな
る。本装置における第１反応液供給手段および第２反応
液供給手段は、通常自動分注器により行われ、また容器
群の反応ライン上の間欠的な移動はベルトコンベアによ
り行われる。また、３つのヒーターブロックとしてはア
ルミブロックにシースヒータ等が用いられる。
【００２３】また、この反応中に反応溶液が蒸発してし
まわないように、反応溶液上部にミネラルオイルをのせ
るか、反応溶液チューブに溶着できる蓋をして、反応チ
ューブを密閉する。また、反応溶液とヒータブロックと
の熱接触をとるためにその間にミネラルオイル等を充填
することもできる。このようにしてＰＣＲにより増幅さ
れたＤＮＡ断片は、公知の検出手段、例えば蛍光分光光
度計などにより容易に検出することができる。
まわないように、反応溶液上部にミネラルオイルをのせ
るか、反応溶液チューブに溶着できる蓋をして、反応チ
ューブを密閉する。また、反応溶液とヒータブロックと
の熱接触をとるためにその間にミネラルオイル等を充填
することもできる。このようにしてＰＣＲにより増幅さ
れたＤＮＡ断片は、公知の検出手段、例えば蛍光分光光
度計などにより容易に検出することができる。
【００２４】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるも
のではない。 実施例１
明するが、本発明はこれらの実施例に何ら限定されるも
のではない。 実施例１
【００２５】（１） 神奈川現象陽性株であるビブリオ
・パラヘモリティカスＷＰ１株を液体培養し、フェノー
ル、クロロホルムを用いる常法でトータルＤＮＡを抽出
した。そのＤＮＡを紫外可視吸光光度計を用いて２６０
ｎｍの値からＤＮＡ量を定量した。この溶液１μｌを用
いて第１ＰＣＲ反応を行った。
・パラヘモリティカスＷＰ１株を液体培養し、フェノー
ル、クロロホルムを用いる常法でトータルＤＮＡを抽出
した。そのＤＮＡを紫外可視吸光光度計を用いて２６０
ｎｍの値からＤＮＡ量を定量した。この溶液１μｌを用
いて第１ＰＣＲ反応を行った。
【００２６】（２） プライマー（ａ）、（ｂ）および
（ｃ）を用いた。これらのプライマーはビブリオ・パラ
ヘモリティカスｔｄｈ遺伝子を特異的に検出できるプラ
イマーであり、本プライマーは M. Nishibuchi et al.,
Mol. Microbiology, 4, 87-99(1990) に記載されてい
るｔｄｈ２遺伝子の配列中の配列を有し、日本細菌学会
第６４回（J. J. Bacteriol. 46, 281 (1991))で報告さ
れたものである。
（ｃ）を用いた。これらのプライマーはビブリオ・パラ
ヘモリティカスｔｄｈ遺伝子を特異的に検出できるプラ
イマーであり、本プライマーは M. Nishibuchi et al.,
Mol. Microbiology, 4, 87-99(1990) に記載されてい
るｔｄｈ２遺伝子の配列中の配列を有し、日本細菌学会
第６４回（J. J. Bacteriol. 46, 281 (1991))で報告さ
れたものである。
【００２７】 即ち、プライマー（ａ）（配列番号：１）： CCATCTGTCCCTTTTCCTGC プライマー（ｂ）（配列番号：２）： CCAAATACATTTTACTTGG プライマー（ｃ）（配列番号：３）： GGTACTAAATGGCTGACATC 試料は以下の組成のものを混合して反応液１０μｌを調
製した。 １０×バッファー １ μｌ ｄＮＴＰ１．６μｌ 各１．２５ｍＭ ビブリオ・パラヘモリティカスｔｄｈ遺伝子特異的な配
列をもつ 第１反応用プライマー（ａ）及び（ｂ） 各０．２５μｌ（２．５ｎｍｏｌ／ｍｌ） ノニデットＰ−４０ ０．５％１μｌ ツイーン２０ ０．５％１μｌ 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ ０．１μｌ（５unit／μｌ）
製した。 １０×バッファー １ μｌ ｄＮＴＰ１．６μｌ 各１．２５ｍＭ ビブリオ・パラヘモリティカスｔｄｈ遺伝子特異的な配
列をもつ 第１反応用プライマー（ａ）及び（ｂ） 各０．２５μｌ（２．５ｎｍｏｌ／ｍｌ） ノニデットＰ−４０ ０．５％１μｌ ツイーン２０ ０．５％１μｌ 耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ ０．１μｌ（５unit／μｌ）
【００２８】この反応液の入った容器にミネラルオイ
ル（ＳＩＧＭＡ社）を５０μｌ加えて反応液を調製し
た。各バッファーの組成を次に示す。 １０×バッファー： ５００ｍＭ ＫＣｌ １００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ０．１％ ゼラチン ｄＮＴＰ溶液 ： ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合物 反応条件は、以下に示す通りであり、１５サイクル行った。 熱変性 ： ９４℃ １分 アニーリング ： ５５℃ １分 重合反応 ： ７２℃ １分
ル（ＳＩＧＭＡ社）を５０μｌ加えて反応液を調製し
た。各バッファーの組成を次に示す。 １０×バッファー： ５００ｍＭ ＫＣｌ １００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ １５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ０．１％ ゼラチン ｄＮＴＰ溶液 ： ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合物 反応条件は、以下に示す通りであり、１５サイクル行った。 熱変性 ： ９４℃ １分 アニーリング ： ５５℃ １分 重合反応 ： ７２℃ １分
【００２９】（３）第２反応 １５サイクル終了後、第２反応液（１０×バッファー１
０μｌ、ｄＮＴＰ１６μｌ、第２反応用プライマー
（ｂ）及び（ｃ）４μｌ（２５ｎｍｏｌ／ｍｌ）、ノニ
デットＰ−４０、ツイーン２０各０．５％１０μｌ、耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌ（５unit／μｌ）に
蒸留水を加えて９０μｌにした溶液）を第１反応終了後
に加えた。その後、第１反応と同じ温度条件で３５サイ
クルＰＣＲ反応を行った。
０μｌ、ｄＮＴＰ１６μｌ、第２反応用プライマー
（ｂ）及び（ｃ）４μｌ（２５ｎｍｏｌ／ｍｌ）、ノニ
デットＰ−４０、ツイーン２０各０．５％１０μｌ、耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌ（５unit／μｌ）に
蒸留水を加えて９０μｌにした溶液）を第１反応終了後
に加えた。その後、第１反応と同じ温度条件で３５サイ
クルＰＣＲ反応を行った。
【００３０】（４）目的遺伝子の検出 第２反応終了後の溶液５０μｌに０．５μｇ／ｍｌのエ
チジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）４０μｌ、２×ＴＡＥ
バッファー（１×ＴＡＥバッファーは０．０４Ｍトリス
酢酸緩衝液、０．００２Ｍ ＥＤＴＡ、pH８．０）２０
０μｌを加えて計４００μｌにした。その溶液を島津蛍
光検出器ＲＦ−５０００で測定した。その際の条件は励
起波長Ｅｘ＝３００ｎｍ、蛍光波長Ｅｍ＝５９０ｎｍ、
感度highで測定した。その結果を図１に示した。なお、
図中の１は反応チューブ中にＤＮＡが存在しない場合、
２は反応チューブ中に１０-1コピーＤＮＡが存在する場
合、３は反応チューブ中に１０0 （＝１）コピーＤＮＡ
が存在する場合、４は反応チューブ中に１０1 コピーＤ
ＮＡが存在する場合、５は反応チューブ中に１０2 コピ
ーＤＮＡが存在する場合、６は反応チューブ中に１０3
コピーＤＮＡが存在する場合、および７は反応チューブ
中に１０4 コピーＤＮＡが存在する場合の蛍光強度を示
す。
チジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）４０μｌ、２×ＴＡＥ
バッファー（１×ＴＡＥバッファーは０．０４Ｍトリス
酢酸緩衝液、０．００２Ｍ ＥＤＴＡ、pH８．０）２０
０μｌを加えて計４００μｌにした。その溶液を島津蛍
光検出器ＲＦ−５０００で測定した。その際の条件は励
起波長Ｅｘ＝３００ｎｍ、蛍光波長Ｅｍ＝５９０ｎｍ、
感度highで測定した。その結果を図１に示した。なお、
図中の１は反応チューブ中にＤＮＡが存在しない場合、
２は反応チューブ中に１０-1コピーＤＮＡが存在する場
合、３は反応チューブ中に１０0 （＝１）コピーＤＮＡ
が存在する場合、４は反応チューブ中に１０1 コピーＤ
ＮＡが存在する場合、５は反応チューブ中に１０2 コピ
ーＤＮＡが存在する場合、６は反応チューブ中に１０3
コピーＤＮＡが存在する場合、および７は反応チューブ
中に１０4 コピーＤＮＡが存在する場合の蛍光強度を示
す。
【００３１】また、同時に従来法であるアガロース電気
泳動パターンを図２に示した。図中、１〜７の数字は図
１と対応し、Ｍはサイズマーカー（φ×１７４HincII）
である。電気泳動時の条件は以下の通りである。ＰＣＲ
後の反応液を各々１０μｌをとり、５０％グリセロー
ル、０．２５％ブロムフェノールブルー、０．２５％キ
シレンシアノールを含む水溶液２μｌを加えて、０．５
μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）を含む
アガロースゲル（３％ｗ／ｖ）にアプライした。直流電
源を用いてＤＣ１００Ｖをかけ、４０分間泳動した。そ
の後、トレーをゲルトレー装着装置にセットし、放電管
（３０２ｎｍにメインピークをもつ）を備えたトランス
イルミネーター上に泳動後のゲルを置いて、ポラロイド
フィルム（６６７）を備えたカメラで撮影した。
泳動パターンを図２に示した。図中、１〜７の数字は図
１と対応し、Ｍはサイズマーカー（φ×１７４HincII）
である。電気泳動時の条件は以下の通りである。ＰＣＲ
後の反応液を各々１０μｌをとり、５０％グリセロー
ル、０．２５％ブロムフェノールブルー、０．２５％キ
シレンシアノールを含む水溶液２μｌを加えて、０．５
μｇ／ｍｌのエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）を含む
アガロースゲル（３％ｗ／ｖ）にアプライした。直流電
源を用いてＤＣ１００Ｖをかけ、４０分間泳動した。そ
の後、トレーをゲルトレー装着装置にセットし、放電管
（３０２ｎｍにメインピークをもつ）を備えたトランス
イルミネーター上に泳動後のゲルを置いて、ポラロイド
フィルム（６６７）を備えたカメラで撮影した。
【００３２】
【発明の効果】本発明では３種類または４種類のプライ
マーを利用してＰＣＲ反応をくり返すことから高い特異
性を有するＤＮＡを得ることができる。従って、ＰＣＲ
反応液に直接染色剤を作用させて増幅ＤＮＡを検出する
ことができ、従来法に比べて短時間、高特異性、高感度
な検出が可能となる。
マーを利用してＰＣＲ反応をくり返すことから高い特異
性を有するＤＮＡを得ることができる。従って、ＰＣＲ
反応液に直接染色剤を作用させて増幅ＤＮＡを検出する
ことができ、従来法に比べて短時間、高特異性、高感度
な検出が可能となる。
【００３３】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CCATCTGTCC CTTTTCCTGC 20
【００３４】配列番号：２ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 CCAAATACAT TTTACTTGG 19
【００３５】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列 GGTACTAAAT GGCTGACATC 20
【図１】図１は第１反応、第２反応を経て増幅されたＤ
ＮＡ断片の蛍光強度を測定した結果を示す図である。な
お、図中の１は反応チューブ中にＤＮＡが存在しない場
合、２は反応チューブ中に１０-1コピーＤＮＡが存在す
る場合、３は反応チューブ中に１０0 （＝１）コピーＤ
ＮＡが存在する場合、４は反応チューブ中に１０1 コピ
ーＤＮＡが存在する場合、５は反応チューブ中に１０2
コピーＤＮＡが存在する場合、６は反応チューブ中に１
０3 コピーＤＮＡが存在する場合、および７は反応チュ
ーブ中に１０4 コピーＤＮＡが存在する場合の蛍光強度
を示す。
ＮＡ断片の蛍光強度を測定した結果を示す図である。な
お、図中の１は反応チューブ中にＤＮＡが存在しない場
合、２は反応チューブ中に１０-1コピーＤＮＡが存在す
る場合、３は反応チューブ中に１０0 （＝１）コピーＤ
ＮＡが存在する場合、４は反応チューブ中に１０1 コピ
ーＤＮＡが存在する場合、５は反応チューブ中に１０2
コピーＤＮＡが存在する場合、６は反応チューブ中に１
０3 コピーＤＮＡが存在する場合、および７は反応チュ
ーブ中に１０4 コピーＤＮＡが存在する場合の蛍光強度
を示す。
【図２】図２はアガロース電気泳動パターンを示す図で
ある。図中、１〜７の数字は図１と対応し、Ｍはサイズ
マーカー（φ×１７４HincII）である。
ある。図中、１〜７の数字は図１と対応し、Ｍはサイズ
マーカー（φ×１７４HincII）である。
【図３】図３は本発明の検出方法を用いる逐次処理ダブ
ルＰＣＲ装置を備えた本発明の検出装置の概略図を示す
図である。
ルＰＣＲ装置を備えた本発明の検出装置の概略図を示す
図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 国際公開90／15881（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12M 1/00 C12Q 1/68 C12N 15/00 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- 【請求項１】 （ａ）２種のオリゴヌクレオチドを鎖長
反応のプライマーとして機能させ、標的ＤＮＡ中の特定
のＤＮＡをＤＮＡ合成酵素を用いて選択的に増幅させる
第１反応液を供給する第１反応液供給手段と、該手段に
より供給される反応液を収容する反応ライン上を移動可
能に配設された容器群と、第１反応の終了した該容器群
中の容器に、第１反応で増幅させたＤＮＡに第１反応で
用いたプライマーと１種または２種異なるプライマー２
種を機能させ、ＤＮＡ合成酵素を用いて選択的に該ＤＮ
Ａ内のＤＮＡ断片をさらに増幅させる第２反応液を供給
する第２反応液供給手段と、該容器群中の反応温度を制
御するヒーターブロックとを備えてなるＰＣＲ部；並び
に （ｂ）第２反応の終了した増幅ＤＮＡ断片を検出する検
出手段を備えていることを特徴とする核酸の検出装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03149719A JP3089619B2 (ja) | 1991-05-24 | 1991-05-24 | 核酸の検出方法及びその装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03149719A JP3089619B2 (ja) | 1991-05-24 | 1991-05-24 | 核酸の検出方法及びその装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04346800A JPH04346800A (ja) | 1992-12-02 |
| JP3089619B2 true JP3089619B2 (ja) | 2000-09-18 |
Family
ID=15481327
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03149719A Expired - Fee Related JP3089619B2 (ja) | 1991-05-24 | 1991-05-24 | 核酸の検出方法及びその装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3089619B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6120822A (en) * | 1998-02-04 | 2000-09-19 | Lynntech, Inc. | Apparatus and method of food decontamination by treatment with ozone |
| CN101151536A (zh) * | 2005-03-30 | 2008-03-26 | 株式会社岛津制作所 | 反应容器中的不挥发性液体分注方法及反应容器处理装置 |
| US20100196209A1 (en) * | 2005-03-30 | 2010-08-05 | Shimadzu Corporation | Method of Dispensing in Reaction Vessel and Reaction Vessel Processing Apparatus |
| JP4781144B2 (ja) * | 2006-03-29 | 2011-09-28 | 凸版印刷株式会社 | 反応容器 |
| US9335339B2 (en) | 2009-06-04 | 2016-05-10 | Universal Bio Research Co., Ltd. | Specimen testing device and method thereof |
-
1991
- 1991-05-24 JP JP03149719A patent/JP3089619B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04346800A (ja) | 1992-12-02 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |