CN103917665B

CN103917665B - 用于沙门氏菌检测的序列和它们的用法

Info

Publication number: CN103917665B
Application number: CN201280054931.9A
Authority: CN
Inventors: S.瓦凯; D.R.德马科
Original assignee: EI Du Pont de Nemours and Co
Current assignee: Qualicon Diagnostics Ltd
Priority date: 2011-11-09
Filing date: 2012-11-07
Publication date: 2016-11-16
Anticipated expiration: 2032-11-07
Also published as: EP2776576B1; US9388473B2; JP2014533111A; CN103917665A; JP2017213003A; BR112014011094A2; AU2012335983B2; EP2776576A1; AU2012335983A1; US20130115600A1; WO2013070662A1

Abstract

本发明涉及基于核酸序列的存在的检测样品中沙门氏菌的快速方法，具体地，涉及基于PCR的检测方法，以及涉及因此有用的寡核苷酸分子和试剂以及试剂盒。在某些实施例中，所述方法用于检测食品或水样品中的沙门氏菌。本发明还涉及用于实施本发明的方法的分离的多核苷酸、复制组合物和试剂盒。

Description

用于沙门氏菌检测的序列和它们的用法

技术领域

本发明涉及基于核酸序列的存在的检测样品中沙门氏菌(Salmonella)的快速方法，具体地，涉及基于PCR的检测方法，以及涉及因此有用的寡核苷酸分子和试剂以及试剂盒。在某些实施例中，所述方法用于检测食品或水样品中的沙门氏菌。本发明还涉及用于实施本发明的方法的分离的多核苷酸、复制组合物和试剂盒。

背景技术

沙门氏菌是一属杆形的、革兰氏阴性菌，其已知会导致多种疾病，包括食物中毒和伤寒发烧。沙门氏菌感染可以从动物转移至人，并且可通过摄取被沙门氏菌污染的食品而获得。在涉及肠炎型沙门氏菌的感染中(其为植物中毒的原因)，该生物体通常通过摄取进入消化道。在健康成年人中，一般来讲必须摄取大量沙门氏菌以导致任何病害。然而，在幼儿中，因为这个群体增加的易感性，已经显示相对少量的细菌的摄取会导致病害。参照沙门氏菌感染的过程，，该细菌在感染症状出现前通常潜伏至多一天。在潜伏期后，出现肠道炎症，导致痢疾(其通常带血)。尽管在免疫功能不全的个体中可出现败血症，但症状一般来讲轻微，没有败血症。另外，儿童中可出现沙门氏菌脑膜炎。

因为其传输模式和一些感染的严重性，样品(诸如食品或饮料样品)中沙门氏菌的检测对于人群的安全是非常重要的。因此，希望有一种用于快速和准确检测样品中沙门氏菌的测试。

发明内容

本发明的一方面是用于检测样品中沙门氏菌的存在的方法，所述样品包含核酸，所述方法包括：(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含至少一种引物和探针，其中所述引物长度至少11个核苷酸，并且所述探针长度至少14个核苷酸，并且其中(i)所述引物包含能够在严格条件下选择性杂交至SEQ ID NO：1的序列或与其互补的序列的核酸序列，并且所述探针包含能够在严格条件下选择性杂交至SEQ ID NO：2的序列或与其互补的序列的核酸序列；或(ii)所述引物包含能够在严格条件下选择性杂交至SEQ ID NO：3的序列或与其互补的序列的核酸序列，并且所述探针包含能够在严格条件下选择性杂交至SEQ ID NO：4的序列或与其互补的序列的核酸序列；以及(b)使用步骤(a)的反应混合物进行所述样品的核酸的聚合酶链反应(PCR)扩增；以及(c)检测步骤(b)的扩增。

在某些实施例中，所述反应混合物包含(i)的引物和探针以及(ii)的引物和探针两者。在某些其它实施例中所述引物和探针各自具有3’末端和5’末端，并且所述探针的3’末端直接或间接地附接至所述引物的5’末端，从而形成引物-探针复合物。在另外的实施例中，所述引物-探针复合物还包含5’茎序列和3’茎序列，其中所述5’茎序列的3’末端直接或间接地附接至所述探针的5’末端，其中所述3’茎序列的5’末端直接或间接地附接至所述探针的3’末端，并且其中所述3’茎序列的3’末端直接或间接地附接至所述引物的5’末端。在另外的实施例中，所述引物-探针复合物包含可检测的标记。在另外的实施例中，所述反应混合物还包含淬灭剂寡核苷酸，其能够在严格条件下选择性杂交至所述探针。

在某些例子中，能够选择性杂交至SEQ ID NO：1的所述引物包含选自SEQ ID NO：40-54的核酸序列，并且能够选择性杂交至SEQ ID NO：2的所述探针包含选自SEQ ID NO：6-39的核酸序列。在其他例子中，能够选择性杂交至SEQ ID NO：3的所述引物包含选自SEQ IDNO：95-111的核酸序列，并且其中能够选择性杂交至SEQ ID NO：4的所述探针包含选自SEQID NO：55-94的核酸序列。在另外的例子中，所述5’茎序列包含选自SEQ ID NO：112-119的核酸序列，并且其中所述3’茎序列包含选自SEQ ID NO：120-130的核酸序列。

在另一方面，本发明涉及分离的多核苷酸，其包含选自SEQ ID NO：6-111的多核苷酸序列。在其它实施例中，本发明涉及分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含引物-探针复合物，其中所述引物-探针复合物包含核酸引物部分和核酸探针部分，其中所述引物部分长度至少为11个核苷酸，并且所述探针部分长度至少为14个核苷酸，其中所述探针部分的3’末端直接或间接地附接至所述所述引物部分的5’末端，并且其中(i)所述引物部分包含能够在严格条件下选择性杂交至SEQ ID NO：1的序列或与其互补的序列的核酸序列，并且所述探针部分包含能够在严格条件下选择性杂交至SEQ ID NO：2的序列或与其互补的序列的核酸序列；或(ii)所述引物部分包含能够在严格条件下选择性杂交至SEQ ID NO：3的核酸序列或与其互补的序列的核酸序列，并且所述探针部分包含能够在严格条件下选择性杂交至SEQ ID NO：4的序列或与其互补的序列的核酸序列。在某些例子中，所述引物部分包含选自SEQ ID NO：40-54的核酸序列，和/或所述探针部分包含选自SEQ ID NO：6-39的核酸序列。在其他例子中，所述引物部分包含选自SEQ ID NO：95-111的核酸序列，和/或所述探针部分包含选自SEQ ID NO：55-94的核酸序列。

在附加的实施例中，所述引物-探针复合物还包含5’茎序列和3’茎序列，其中所述5’茎序列的3’末端直接或间接地附接至所述探针部分的5’末端，其中所述3’茎序列的5’末端直接或间接地附接至所述探针部分的3’末端，并且其中所述3’茎序列的3’末端直接或间接地附接至所述引物部分的5’末端。在某些例子中，所述5’茎序列包含选自SEQ ID NO：112-119的核酸序列，和/或所述3’茎序列包含选自SEQ ID NO：120-130的核酸序列。

在其它方面，本发明涉及用于检测样品中沙门氏菌的试剂片剂或试剂盒。

序列说明

SEQ ID NO：1-5是沙门氏菌基因组的部分的核苷酸序列，其用于检测样品中沙门氏菌的存在。在某些例子中，朝向SEQ ID NO：1的引物与朝向SEQ ID NO：2的探针一起使用。在其他例子中，朝向SEQ ID NO：3的引物与朝向SEQ ID NO：4或5的探针一起使用。在某些其它例子中，所述引物和探针被附接以使形成引物-探针复合物，其中所述探针部分的3’末端直接或间接地附接至所述引物部分的5’末端。能够在严格条件下选择性杂交至SEQ ID NO：1的引物和/或探针包括SEQ ID NO：40-54。能够在严格条件下选择性杂交至SEQ ID NO：2的引物和/或探针包括SEQ ID NO：6-39。能够在严格条件下选择性杂交至SEQ ID NO：3的引物和/或探针包括SEQ ID NO：95-111。能够在严格条件下选择性杂交至SEQ ID NO：4的引物和/或探针包括SEQ ID NO：55-94。

SEQ ID NO：6-39是能够用作引物和探针在严格条件下选择性杂交，并最终检测，SEQ ID NO：2的序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO：40-54是能够用作引物和探针在严格条件下选择性杂交，并最终检测，SEQ ID NO：1的序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO：55-94是能够用作引物和探针在严格条件下选择性杂交，并最终检测，SEQ ID NO：4或的序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO：95-111是能够用作引物和探针在严格条件下选择性杂交，并最终检测，SEQ ID NO：3的序列的核苷酸序列。

SEQ ID NO：112-119是能够用作5’茎序列的核苷酸序列，例如，结合合适的探针序列，诸如SEQ ID NO：6-39和55-94所述的那些。在某些例子中，所述5’茎序列直接或间接地附接至探针序列，使得所述5’茎序列的3’末端直接或间接地附接至所述探针序列的5’末端。

SEQ ID NO：120-130是能够用作3’茎序列的核苷酸序列，例如，结合合适的探针序列，诸如SEQ ID NO：6-39和55-94所述的那些。在某些例子中，所述3’茎序列直接或间接地附接至探针序列或引物序列，使得所述3’茎序列的5’末端直接或间接地附接至所述探针序列的3’末端，并且所述3’茎序列的3’末端直接或间接地附接至所述引物序列的5’末端。

SEQ ID NO：131是包含合成的SV40(“sSV40”)序列的核苷酸序列，其可被有效地使用，例如，作为正对照扩增反应的靶标。在某些实施例中，这个序列可被用作“加标”对照并可使用SEQ ID NO：132-136扩增和检测。

SEQ ID NO：132-136是用于扩增和检测SEQ ID NO：131的正对照序列的核苷酸序列。在某些实施例中，SEQ ID NO：132是5’茎序列，SEQ ID NO：133是探针序列，SEQ ID NO：134是3’茎序列，SEQ ID NO：135是正向引物序列，并且SEQ ID NO：136是反向引物序列。在其它实施例中，SEQ ID NO：132-135被混合以使形成引物-探针复合物，其能够形成茎-环结构。在其它实施例中，引物-探针复合物被用作正向引物/探针结合SEQ ID NO：136作为反向引物以扩增和检测SEQ ID NO：131。

具体实施方式

申请人特别将所有引用的参考文献的完整内容引入本公开内容中。此外，当数量、浓度或其他数值或参数以范围、优选范围或优选上限数值和优选下限数值的列表形式给出时，其应理解为具体地公开由任何范围上限或优选数值和任何范围下限或优选数值的任何一对所构成的所有范围，而无论所述范围是否被单独地公开。凡在本文中给出某一数值范围之处，该范围都意在包括其端点，以及位于该范围内的所有整数和分数，除非另行指出。不旨在将本发明的范围限制为限定范围时详述的具体值。

定义

在本公开中，使用了多个术语和缩写。给出了如下定义。

如本文所用，术语“约”或“大约”表示在给定值或范围的20％内，优选地在10％内，还更优选地在5％内。

术语“包含”旨在包括由术语“基本上由...组成”和“由...组成”涵盖的实施例。类似地，术语“基本上由...组成”旨在包括由术语“由...组成”涵盖的实施例。

“聚合酶链反应”缩写为PCR。

术语“分离的”指如下物质，例如核酸分子和/或蛋白质，该物质基本上不含或者去除了在天然存在的环境中通常伴随该物质或与其反应的组分。分离的多核苷酸可从它们天然存在于其中的宿主细胞纯化。技术人员已知的常规核酸纯化方法可用于获得分离的多核苷酸。该术语也涵盖重组多核苷酸和化学合成的多核苷酸。

术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“核酸片段”和“寡核苷酸”在本文中可互换使用。这些术语涵盖核苷酸序及类似的范围。多核苷酸可以是RNA或DNA的聚合物，它们可以是单链或双链，任选地包含合成的、非天然的或改性的核苷酸碱基。DNA聚合物形式的多核苷酸可由cDNA、基因组DNA、合成DNA或它们的混合物的一条或多条链构成。

术语“扩增产物”或“扩增子”指在引物引导的扩增反应期间产生的核酸片段。引物引导的扩增的典型方法包括聚合酶链反应(PCR)，连接酶链反应(LCR)，或链置换扩增反应(SDA)。如果选择了PCR方法，所述复制组合物可包含用于核酸复制的所述组分，例如：核苷酸三磷酸，具有适当序列的两条(或更多条)引物或引物-探针复合物，热稳定的聚合酶，缓冲液，溶质和蛋白。在美国专利4,683,202(1987，Mullis，等人)和美国专利4,683,195(1986，Mullis，等人)中提供了这些试剂和它们用于扩增核酸的详述步骤。如果选择LCR方法，则所述核酸复制组合物可包含，例如：热稳定的连接酶(例如，水生栖热菌(Thermusaquaticus)连接酶)，两组邻近的寡核苷酸(其中每组的一个成员与每个所述靶链互补)，Tris-HCl缓冲液，KCl，乙二胺四乙酸(EDTA)，NAD，二硫苏糖醇，以及鲑精DNA。参见，例如，Tabor等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：1074-1078(1985)。

术语“引物”指(合成的或天然存在的)寡核苷酸，当被置于其中通过聚合酶催化互补链合成的条件下时，它能够作为沿互补链进行核酸合成或复制的起始点。引物还能包含可检测的标记，例如5’末端标记。在某些实施例中，本发明的引物为长度8-60个核酸。在其他的实施例中，引物为长度10-50，14-40，或20-30个核酸。在某些具体实施例中，引物长度为至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个核苷酸。

术语“探针”是指(合成的或天然存在的)寡核苷酸，其与所关注的多核苷酸互补(但不一定完全互补)并且通过与所关注的多核苷酸的至少一条链杂交形成双链结构。探针或引物-探针复合物还可包含可检测的标记。在某些实施例中，本发明的探针为长度8-60个核酸。在其他的实施例中，探针为长度10-50，14-40，或20-30个核酸。在某些具体实施例中，探针长度为至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个核苷酸。

探针可以是一个独立的实体或复合或换句话讲连接到引物，诸如其中探针经由其3′末端直接或间接地附接至引物的5′末端。在一些例子中，所述探针和引物是通过接头连接的，所述接头可为核苷酸或非核苷酸接头并且其可为非扩增的接头，诸如六乙二醇(HEG)或18-碳接头。在这种情况下，这将被称为“引物-探针复合物”。此类引物-探针复合物的一个例子可见于美国专利6,326,145，全文以引用方式并入本文，其在很多情况下被称为“Scorpion探针”或“Scorpion引物”。在典型的引物-探针复合物中，所述引物部分可为，例如，长度至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个核苷酸，而所述探针部分可为，例如，长度至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个核苷酸。

如本文所用，术语“标记”和“可检测的标记”是指能够检测包括但不限于放射性同位素、荧光剂、化学发光剂、酶、酶底物、酶的辅助因子、酶抑制子、发色团、染料、金属离子、金属溶胶、半导体纳米晶体、配基(例如，生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或半抗原)等的分子。可检测的标记也可包括报告基因和淬灭剂的组合。

术语“报告基因”是指物质或其一部分，其能够表现出可检测的信号，其信号能被淬灭剂抑制。所述报告基因的可检测的信号为例如在可检测范围内的荧光。术语“淬灭剂”是指物质或其一部分，其能够抑制、降低、抑制等由所述报告基因产生的可检测的信号。

如本文所用，术语“淬灭”和“荧光能量传递”是指如下过程，即，当报告基因和淬灭剂密切接近时，并且所述报告基因被能量源激发，所述激发态的能量的主要部分非辐射性地转移至所述淬灭剂，其中它要么非辐射性地耗散或者以不同于所述报告基因的发射波长发射。

优选地，所述报告基因可选自用适宜的连接基团修饰的荧光有机染料，以连接至所述寡核苷酸，诸如连接至所述末端3′碳或末端5′碳。所述淬灭剂也可选自有机染料，取决于本发明的实施例，所述有机染料可以为荧光的，也可以不是荧光的。一般来讲，如果所述淬灭剂是荧光的或只是通过非辐射衰减从所述报告基因释放被转移的能量，所述淬灭剂的吸收带会至少基本上覆盖所述报告基因的荧光射线带以优化淬灭。非荧光淬灭剂或暗淬灭剂通常通过从被激发的报告基因吸收能量起作用，但不放射性地释放所述能量。

对于特定探针的适宜的报告基因-淬灭剂对的选择可根据已知技术进行。在例如Berlman的Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules，第二版，Academic Press，New York，1971中列出并详述了可选择的来自示例性报告基因-淬灭剂对的荧光和暗淬灭剂以及它们相关的光学性能，其内容以引用的方式并入本文。在例如Haugland的Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals，MolecularProbes of Eugene，Oreg.，1992中可找到经由常见的反应基团(能添加至本发明的寡核苷酸)的共价连接修饰报告基因和淬灭剂的例子，其内容以引用方式并入本文。

优选的报告基因-淬灭剂对可选自呫吨类染料，包括荧光素和罗丹明染料。这些化合物的多个适宜形式可商购获得，所述化合物苯基上具有取代基，其可被用作结合位点或作为连接至寡核苷酸的结合官能团。另一个用作报告基因的优选的荧光化合物基团是萘胺，其在α-或β-位点具有氨基。包含在此类萘胺化合物中的有1-二甲基氨萘基-5磺酸、1-苯氨基-8-萘磺酸和2-对甲苯胺基-6-萘磺酸。其他染料包括3-苯基-7-香豆素异氰酸酯；吖啶诸如9-异硫氰酸酯吖啶；N-(p-(2-苯并唑基)苯基)马来酰亚胺；苯并二唑；芪类；芘等等。

最优选地，所述报告基因和淬灭剂选自荧光素和罗丹明染料。连接至寡核苷酸的这些染料和适当的连接方法为本领域所熟知。

淬灭剂的适宜的例子可选自6-羧基-四甲基-罗丹明、4-(4-二甲氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABYL)、四甲基罗丹明(TAMRA)、BHQ-0^TM、BHQ-1^TM、BHQ-2^TM、以及BHQ-3^TM，其中每个购自Biosearch Technologies，Inc.of Novato，Calif.，QSY-7^TM、QSY-9^TM、QSY-21^TM和QSY-35^TM，其中每个购自Molecular Probes，Inc.等。

报告基因的适宜的例子可选自染料诸如SYBR绿、5-羧基荧光素(5-FAM^TM购自Applied Biosystems of Foster City，Calif.)、6-羧基荧光素(6-FAM)，四氯-6-羧基荧光素(TET)、2,7-二甲氧基-4,5-二氯-6-羧基荧光素、六氯-6-羧基荧光素(HEX)、6-羧基-2′，4，7，7′-四氯荧光素(6-TET^TM购自Applied Biosystems)、羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基-4′,5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素(6-JOE^TM购自Applied Biosystems)、VIC^TM染料产品(购自Molecular Probes，Inc.)、NED^TM染料产品(购自Applied Biosystems)等。

包含报告基因和淬灭剂的探针的一个例子是处于单分子或双分子构象的Scorpion探针。在单分子Scorpion中，所述引物-探针复合物的探针部分侧翼为自身互补区，当所述探针从其靶DNA解绑时所述自身互补区使得所述探针形成茎-环结构。在某些实施例中，这些被称为5’茎序列(其3’末端连接到所述探针的5’末端)，和3’茎序列(其5’末端连接到所述探针的3’末端并且其3’末端连接至所述引物)。这些链接可为直接的或间接的，诸如通过接头。另外，在单分子Scorpion中，报告基因通常连接在或靠近所述自身互补区的一个，诸如在所述Scorpion探针的5′末端处，而淬灭剂连接在或靠近另一个所述自身互补区，诸如紧接所述非扩增接头的5′，使得当所述探针处于其茎-环构象时所述淬灭剂足够靠近所述报告基因以导致淬灭。在双分子Scorpion中，通常不采用自身互补侧翼区，而是采用分离的“阻断寡核苷酸”或“淬灭寡核苷酸”结合所述Scorpion探针。当所述探针从其靶DNA解绑时，这个阻断寡核苷酸能杂交至所述Scorpion探针的探针区。另外，在双分子Scorpion中，所述报告基因通常连接到所述Scorpion探针的探针区，诸如所述Scorpion探针的5’末端，而所述淬灭剂连接至所述阻断寡核苷酸，诸如所述阻断寡核苷酸的3′末端，使得当所述探针从其靶DNA解绑并且相反杂交至所述阻断寡核苷酸时，所述淬灭剂足够接近所述报告基因以导致淬灭。

包含报告基因和淬灭剂的探针的另一个例子是在5′-核酸外切酶测定(诸如实时聚合酶链反应技术)中使用的探针。在此上下文中，所述寡核苷酸探针邻近5′端其将具有足够数量的磷酸二酯键使得产生的5′至3′核酸酶活性能高效地降解所述绑定探针以分离所述报告基因和淬灭剂。包含报告基因和淬灭剂的探针的另一个例子是Molecular Beacon型探针，其包含探针区，侧翼具有自身互补区，所述自身互补区使得所述探针从所述探针的靶序列解绑时形成茎-环结构。此类探针通常具有连接至或靠近一侧末端的报告基因和连接或靠近另一侧末端的淬灭剂，使得当所述探针处于解绑状态并且从而形成茎-环结构时，所述淬灭剂足够接近所述报告基因以导致淬灭。

术语“复制抑制部分”是指任何连接至寡核苷酸的3′末端羟基的原子、分子或化学基团，其将阻止核酸链复制的链延伸的引发。例子包括但不限于：3′-脱氧核苷酸(例如，虫草素)，双脱氧核苷酸，磷酸酯，配体(例如，生物素和二硝基苯酚)，报告基因分子(例如，荧光素和罗丹明)，碳链(例如，丙醇)，错配的核苷酸或多核苷酸，或肽核酸单位。术语“非参与”是指对于核酸分子的扩增反应缺乏探针或引物的参与。具体地非参与探针或引物是将不作为底物或被DNA或RNA聚合酶延伸的探针或引物。“非参与探针”本质上不能通过聚合酶延伸链。它可以有或没有复制抑制部分。

当所述核酸分子的单链形式能够在合适的温度和溶液离子浓度条件下对其他核酸分子退火时，核酸分子对另一个核酸分子如cDNA、基因组DNA、或RNA来说是“可杂交的”。杂交和洗涤条件为人们所熟知，示例参见例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory：Cold Spring Harbor，NY(1989)，尤其是在该文献第11章和表11.1(全文以引用方式并入本文)中进行了例示。温度和离子强度条件确定杂交的“严格性”。对于同源核酸初步筛选，低严格性杂交条件对应于Tm为55℃，可使用例如5X SSC，0.1％SDS，0.25％牛奶，并且无甲酰胺；或30％甲酰胺，5XSSC，0.5％SDS。中度严格性杂交条件对应于更高的Tm，例如，40％甲酰胺，和5X或6X SSC。杂交需要两种核酸含有互补序列，但取决于杂交的严格性，碱基之间可能会发生错配。用于使核酸杂交的合适的严格性取决于核酸的长度和互补的程度，它们为本领域熟知的变量。两条核苷酸序列之间的相似性或同源性程度越高，具有那些序列的核酸的杂交体的Tm值就越大。核酸杂交的相对稳定性(对应较高的Tm)按以下顺序依次降低：RNA:RNA、DNA：RNA、DNA：DNA。就长度大于100个核苷酸的杂交体而言，已经获得了计算Tm的方程式(参见Sambrook等人，同上，9.50-9.51)。对于较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更重要，而且寡核苷酸的长度决定了其特异性(参见Sambrook等人，同上，11.7-11.8)。在一个优选的实施例中，可杂交核酸的长度为至少约10个核苷酸。更优选地，可杂交核酸的最小长度为至少约11个核苷酸，至少约12个核苷酸，至少约13个核苷酸，至少约14个核苷酸，至少约15个核苷酸，至少约16个核苷酸，至少约17个核苷酸，至少约18个核苷酸，至少约19个核苷酸，至少约20个核苷酸，至少约21个核苷酸，至少约22个核苷酸，至少约23个核苷酸，至少约24个核苷酸，至少约25个核苷酸，至少约26个核苷酸，至少约27个核苷酸，至少约28个核苷酸，至少约29个核苷酸，或者最优选地，至少30个核苷酸。此外，技术人员将认识到，必要时可根据诸如探针长度之类的因素来调节温度和洗涤溶液的盐浓度。

在某些实施例中，引物探针能够在选择性的(例如，严格的)杂交条件下选择性杂交至靶核酸序列。术语“选择性杂交”包括指在严格杂交条件下，核酸序列与特定核酸靶序列以比其与非靶核酸序列的杂交更高的可检测程度(例如至少2倍于背景)杂交，并指基本排除了非靶核酸。选择性杂交的核酸序列通常彼此具有约至少70％的序列同一性，优选地至少80％的序列同一性，最优选地90％、95％、97％、99％，或100％的序列同一性。

本文所用的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域所熟知，并且描述于例如，Sambrook等人(同上)；以及Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology中，Greene Publishing Assoc.和Wiley-Interscience出版(1987)。

寡核苷酸

已经开发了通过检测一个或多个靶核酸序列用于检测样品中沙门氏菌细菌的方法。在某些实施例中，所述方法涉及包含引物和探针的分离的多核苷酸和/或反应混合物，其中(i)所述引物能够在严格条件下选择性杂交至SEQ ID NO：1或与其互补的序列，并且所述探针能够在严格条件下选择性杂交至SEQ ID NO：2的或与其互补的序列；或(ii)所述引物能够在严格条件下选择性杂交至SEQ ID NO：3或与其互补的序列，并且所述探针能够在严格条件下选择性杂交至SEQ ID NO：4或与其互补的序列。在一些实施例中，能够选择性杂交至SEQ ID NO：1的探针包括SEQ ID NO：40-54。在其它实施例中，能够选择性杂交至SEQID NO：2的引物包括SEQ ID NO：6-39。在另外的实施例中，能够选择性杂交至SEQ ID NO：3的探针包括SEQ ID NO：95-111。在另外的实施例中，能够选择性杂交至SEQ ID NO：4的引物包括SEQ ID NO：55-94。

在一些实施例中，所述引物和探针是直接或间接地附接的，从而形成引物-探针复合物。在一些例子中，通过将所述探针的3’末端直接或间接地附接至所述引物的5’末端形成所述引物-探针复合物。本发明的这些引物-探针复合物也可包含不可扩增的接头，其将所述探针区的3’末端连到所述引物区的5’末端。这个不可扩增的接头阻止互补链延伸进入所述引物-探针复合物的探针区。此类不可扩增的接头的例子包括六乙烯乙二醇(HEG)和优选地18碳接头。

本发明的引物-探针复合物也可包含自身互补区，包括3′茎序列和5′茎序列，当所述探针从其靶DNA解绑时其使得所述引物-探针复合物形成茎-环结构，这可用于例如使所述报告基因和淬灭剂彼此足够接近，以导致所述报告基因信号被淬灭。在一些实施例中，所述5’茎序列是SEQ ID NO：112-119之一，并且所述3’茎序列是SEQ ID NO：120-130之一。

在另外的实施例中，所述引物、探针、或引物-探针复合物还包含可检测的标记，诸如5’末端标记或报告基因-淬灭剂对。在一些情况下，可使用淬灭剂寡核苷酸和探针或引物-探针复合物，其中所述探针区从其靶DNA解绑时淬灭剂寡核苷酸能杂交至所述引物或引物-探针复合物的探针区。如果所述报告基因连接到所述引物或引物-探针复合物并且所述淬灭剂连接到所述阻断寡核苷酸，这将使所述报告基因和淬灭剂彼此足够接近以使得淬灭发生。

在某些实施例中，所述引物或引物-探针复合物与反向引物一起使用。在另外的实施例中，使用了两个此类引物-探针复合物，一个作为正向引物-探针复合物而另一个作为反向引物-探针复合物。在图1A-1C中提供了探针部分、引物部分、5’和3’茎序列、接头部分和可检测的标记的示例性组合。

除了它们在PCR中的用处，这些引物-探针复合物也可用于其他核酸扩增方法诸如连接酶链式反应(LCR)(Backman等人，1989，EP0 320308；Carrino等人，1995，J.Microbiol.Methods23：3-20)；基于核酸序列的扩增(NASBA)，(Carrino等人，1995，同上)；和自主序列复制(3SR)和‘Q复制酶扩增’(Pfeffer等人，1995VeterinaryRes.Comm.19：375-407)。

此外，本发明的寡核苷酸也可用作杂交探针。很多情况下采用使用DNA探针的杂交检测食物、临床的和环境样品中的病原体，并且一般来讲所述方法学对本领域技术人员是已知的。普遍认为探针杂交的敏感性和特异性的程度低于通过之前描述的扩增技术实现的敏感性和特异性。

测定方法

可以任何合适的方式实现所述选定的基因靶标的检测，以及样品中沙门氏菌的存在的后续检测。优选的方法是引物导向的扩增方法和核酸杂交方法。这些方法可用于检测样品中的沙门氏菌，所述样品是复合的基质或是经纯化的培养物，例如，来源于疑似被污染的动物、环境或食物来源。

本发明的优选的实施例包括(1)在非选择性培养基中培养复合物样品混合物以复苏靶细菌，(2)释放靶细菌总DNA，以及(3)加入引物和探针，或本发明的引物-探针复合物和反向引物，或本发明的两个引物-探针复合物(一个充当正向引物而第二个充当反向引物)，使所述总DNA按扩增方案实施。

引物导向的扩增测定方法

本领域已知有多种引物导向的核酸扩增方法可用于本发明中，包括热循环方法(例如，聚合酶链反应(PCR)，反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，和LCR)，以及等温方法和链置换扩增反应(SDA)。优选的方法是聚合酶链反应(PCR)。在一个优选的实施例中，如图1A-1C示出的所述引物-探针复合物可用作引物用于引物指导的核酸扩增以检测所述靶核酸，并最终地，检测沙门氏菌。

样品制备：

根据本发明的所述寡核苷酸和方法可直接用于任何适宜的临床或环境样品，无需样品制备。为了获得更高的灵敏度，并且在时间不是限制性因素的情况下，预处理所述样品并且进行预扩增富集是优选的。

检测食品源性细菌病原体的最低行业标准为，可靠地检测25克的食品基质中一个病原体细胞的存在的方法，如Andrews等人，1984，“FoodSample andPreparation ofSample Homogenate”，Bacteriological Analytical Manual，第8版的第1章，Revision A，Association of Official Analytical Chemists，Arlington，VA中所述。为了满足这个严格的标准，已开发出富集方法和培养基以增强所述靶病原体细胞的生长，以通过生物化学，免疫学或核酸杂交方法方便其检测。典型的富集步骤使用了培养基，其将增强所述靶细菌的生长和健康并且也会抑制存在的任何背景或非靶微生物的生长。例如，USDA示出了对于富集碎牛肉的样品以测试病原性大肠杆菌(E.coli)的方案(美国食品和药物管理局，Bacterial Analytical Manual)。

已开发出多种细菌病原体的选择性培养基，本领域技术人员了解选择适于待富集的特定生物体的培养基。非选择性培养基的综述性讨论和配方在由Association ofAnalytical Chemists，Suite400，2200Wilson Blvd，Arlington，VA22201-3301出版和发行的FDA Bacteriological Analytical Manual(1998)中有所描述。

在选择性生长后，取出所述复合混合物的样品用于进一步分析。这个取样步骤可以通过本领域的技术人员熟知的多种方式完成。在一个优选的实施例中，取出5μl所述富集培养物，然后添加至200μl的包含蛋白酶的裂解溶液中。加热所述裂解溶液至37℃，20分钟，随后在95℃蛋白酶失活10分钟，如System User's Guide，DuPont Qualicon，Inc.，Wilmington，DE中所述。

聚合酶链反应(PCR)测定方法：

用于检测本发明的靶核酸以及随后样品中沙门氏菌的存在的优选的方法包括(a)使用引物和探针或本发明的引物-探针复合物，诸如在图1A-1C中所述的那些，以及合适的反向引物进行PCR扩增；以及(b)检测所述扩增，从而所述扩增的阳性检出表明了样品中沙门氏菌的存在。在另一个实施例中，使用本发明的两个不同引物-探针复合物进行PCR扩增，所述引物-探针复合物具有充分分离的引物结合区，其使得一个引物-探针复合物充当正向引物而第二个引物-探针复合物充当反向引物。参见图1A-1C，此类正向作用的引物-探针复合物例子包括S35C610-1、S35C610-2、S35C610-2a、S35C610-3a、S35C610-3a、S35C610-3a、S35C610-3b、S35C610-4b、S35C610-5b、S35FAM-3a、S35Q670-2a、S35TEX1、S35TEX1a、S35TEX2、S35TEX2、S35TEX2b、S35TEX2c、S35TEX3、S35TEX3a、S35TEX3a、S35TEX-3a、和SB35C610，而此类反向作用的引物-探针复合物的例子包括S761aC610-4d、S76IbC610-4g、S761bC610-5g、S761C610-3、S761C610-3a、S761C610-3b、S761C610-3c、S761C610-4c、S761C610-4d、S761C610-4e、S761C610-4f、S761C610-4g、S761C610-5f、S761C610-5g、SB761C610、和SB761C610-g。

在另一个优选的实施例中，在进行PCR扩增之前，可进行制备所述样品的步骤。所述制备步骤可包括下列步骤的至少一个：(1)细菌富集，(2)从所述样品分离细菌细胞，(3)细胞裂解，以及(4)总DNA提取。

扩增条件：

技术人员会理解，使用根据本发明的寡核苷酸，任何一般来讲可接受的PCR条件可用于成功检测所述核酸靶标和所述靶沙门氏菌细菌，并且根据待测样品和其他实验室条件，对PCR条件进行常规优化可能是必要的，以达到最佳的灵敏度和特异性。

检测/检验/分析：

可使用各种方法分析由本发明的所述方法产生的引物指导的扩增产物。匀质检测是指用于检测扩增产物的优选的方法，其中不需要分离(诸如通过凝胶电泳)来自模版或引物的扩增产物。通常通过在扩增过程中或紧接扩增测量所述反应混合物的荧光水平完成均质检测。此外，在本发明中能使用异质检测方法，其涉及在检测过程中或之前分离扩增产物。

可使用匀质检测以实施“实时”引物导向的核酸扩增和检测，使用本发明的引物-探针复合物(例如，“实时”PCR和“实时”反转录PCR)。尤其优选的“实时”检测方法是在美国专利6,326,145中示出的所述Scorpion探针测定法，其据此全文引入以供参考。在所述Scorpion探针测定法中，使用Scorpion探针(单分子或双分子)作为引物-探针复合物进行PCR扩增，所述Scorpion探针具有一个适当的报告基因-淬灭剂对，使得在所述引物伸长之前淬灭所述报告基因的可检测的信号。伸长后，所述淬灭效应被消除，并且存在的信号数量被定量。随着扩增产物数量增加，将会观察到可检测的信号的等同增加，从而使得将存在的扩增产物的数量确定为测得的可检测信号数量的函数。当在本发明的Scorpion探针测定法中使用多于一种的Scorpion探针时，每种探针可连接相同的可检测的标记或不同的可检测的标记，从而允许独立于其他探针地检测每种探针。

另一个优选的“实时”检测方法是所述5’-核酸外切酶检测方法，如美国专利5,804,375，5,538,848，5,487,972和5,210,015中示出的，其中的每个据此全文引入以供参考。在所述5’-核酸外切酶检测中，在PCR过程中使用修饰过的探针，所述探针结合在一对扩增引物对的两个成员中间或之间。所述修饰过的探针具有报告基因和淬灭剂，并且被设计为在PCR过程中生成可检测的信号以表明其已经与所述靶核酸序列杂交。只要所述报告基因和所述淬灭剂都在所述探针之上，所述淬灭剂则使所述报告基因停止发射可检测的信号。然而，在扩增过程中随着聚合酶延伸所述引物，所述聚合酶固有的5′至3′核酸酶活性降解了所述探针，将所述报告基因和所述淬灭剂分离，并且使得可检测的信号能够被发射。一般来讲，在扩增循环过程中生成的可检测的信号的数量与每个循环中生成的产物数量成正比。

已经熟知淬灭的效率是所述报告基因和所述淬灭剂的接近度的强函数，即，随着两个分子逐渐靠近，所述淬灭效率增加。由于淬灭强烈依赖于所述报告基因和所述淬灭剂的物理接近，所述报告基因和所述淬灭剂优选地附接至所述探针，彼此在几个核苷酸内，通常彼此在30个核苷酸内，更优选地在从约6至16个核苷酸的分离内。通常，通过将报告基因-淬灭剂对的一个成员连接至所述探针的5′末端，并且将另一个成员连接至约6至16个核苷酸之外来实现这种分离。

另外，当在本发明的5’-核酸外切酶检测分析中使用多于一种的探针时，诸如导向SEQ ID NO：686-696中的两个或更多个的一种探针，每种探针可连接不同的可检测的标记(例如，报告基因-淬灭剂对)，从而允许独立于其他探针地检测每种探针。

除了匀质检测方法，本领域已知多种其他异质检测方法可用于本发明中，包括标准非变性凝胶电泳(例如，丙烯酰胺或琼脂糖)，变性梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳。标准非变性凝胶电泳是一种简单和快速的PCR检测方法，但可能不适于所有应用。

仪器：

当使用匀质检测时，优选地使用激光荧光计测量荧光水平，例如ABI PrismModel7500Fast Sequence Detector。然而，本发明包括了用于测量样品中荧光水平的类似检测系统。

试剂和试剂盒：

可使用任何形式的任何适宜的核酸复制组合物(“复制组合物”)。用于PCR扩增的典型的复制组合物可包含，例如，dATP、dCTP、dGTP、和dTTP；靶标特异性引物、探针、或引物-探针复合物；以及合适的聚合酶。

如果所述复制组合物是液体形式的，可使用在本领域中已知的适宜的缓冲剂(Sambrook，J.等人，同上)。

作为另外一种选择，如果所述复制组合物包含在片剂形式中，则典型的片剂化试剂可包括诸如稳定剂和结合剂。在美国专利4,762,857和4,678,812中示出了优选的片剂化技术，其中每个据此全文引入以供参考。

在某些实施例中，本发明的所述复制组合物包含至少一种引物和探针以及热稳定的DNA聚合酶，其中所述引物长度为至少10个核苷酸，并且所述探针长度为至少10个核苷酸，并且其中(i)所述引物包含能够在严格条件下选择性杂交至SEQ ID NO：1的序列或与其互补的序列的核酸序列，并且所述探针包含能够在严格条件下选择性杂交至SEQ ID NO：2的序列或与其互补的序列的核酸序列；或(ii)所述引物包含能够在严格条件下选择性杂交至SEQ ID NO：3的序列或与其互补的序列的核酸序列，并且所述探针包含能够在严格条件下选择性杂交至SEQ ID NO：4的序列或与其互补的序列的核酸序列。在某些具体实施例中，所述引物长度为至少11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个核苷酸。在另外的实施例中，所述探针长度为至少11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、或30个核苷酸。

在一些例子中，所述引物和探针是直接或间接地附接的，从而形成引物-探针复合物。在其他的例子中，所述引物-探针复合物涉及所述探针的3’末端与所述引物的5’末端的直接或间接地附接。在另外的例子中，所述引物-探针复合物的探针部分的侧翼是5’茎序列(诸如如SEQ ID NO：112-119所示)，和3’茎序列(诸如如SEQ ID NO：120-130所示)。

在一些实施例中，能够在严格条件下选择性杂交至SEQ ID NO：1的所述引物部分包含选自SEQ ID NO：40-54的核酸序列。在其它实施例中，能够在严格条件下选择性杂交至SEQ ID NO：2的所述引物部分包含选自SEQ ID NO：5-39的核酸序列。在另外的实施例中，能够在严格条件下选择性杂交至SEQ ID NO：3的所述引物部分包含选自SEQ ID NO：95-111的核酸序列。在另外的实施例中，能够在严格条件下选择性杂交至SEQ ID NO：4的所述引物部分包含选自SEQ ID NO：55-94的核酸序列。

在其它具体的实施例中，本发明的所述复制组合物包含(a)至少一种选自图1A-1C的引物-探针复合物，和(b)热稳定的DNA聚合酶。另一个优选的复制组合物包含(a)至少两种选自图1A-1C的引物-探针复合物，每个朝向不同的靶DNA区使得一个复合物充当正向引物而另一个充当反向引物；和(b)热稳定的DNA聚合酶。在某些例子中，所述正向作用的引物-探针复合物是选自S35C610-1、S35C610-2、S35C610-2a、S35C610-3a、S35C610-3a、S35C610-3a、S35C610-3b、S35C610-4b、S35C610-5b、S35FAM-3a、S35Q670-2a、S35TEX1、S35TEX1a、S35TEX2、S35TEX2、S35TEX2b、S35TEX2c、S35TEX3、S35TEX3a、S35TEX3a、S35TEX-3a、和SB35C610，而所述反向作用的引物-探针复合物是选自S761aC610-4d、S761bC610-4g、S761bC610-5g、S761C610-3、S761C610-3a、S761C610-3b、S761C610-3c、S761C610-4c、S761C610-4d、S761C610-4e、S761C610-4f、S761C610-4g、S761C610-5f、S761C610-5g、SB761C610、和SB761C610-g。在某些例子中，所述复制组合物还包含合适的淬灭剂寡核苷酸，其能够结合所述引物-探针复合物的探针部分并且淬灭其信号。

本发明的优选的试剂盒包含上述复制组合物的任一种。本发明的优选的片剂包含上述复制组合物的任一种。更优选地，本发明的试剂盒包含前述优选的片剂。

在一些情况下，在反应中可包括内部阳性对照。所述内部阳性对照可包括对照模板核酸(例如DNA或RNA)，对照引物，以及对照核酸探针。之前已经描述包含在PCR反应内的内部阳性对照的优点(美国专利6,312,930和PCT申请WO97/11197，其中的每个据此全文引入以供参考)，并且包括：(i)可使用单引物扩增所述对照物；(ii)所述对照扩增产物的数量不依赖于样品中包含的任何靶标DNA或RNA；(iii)所述对照DNA能用其他扩增试剂标记以易于使用，并且在手动和自动测试程序中都有高度重复性；(iv)所述对照可用于均质检测，即，不从反应物分离产物DNA；并且(v)所述内参具有不同于反应中其他潜在扩增产物的熔融特征，和/或在所述对照核酸上具有可检测标记，其不同于引导至所述靶标的核酸探针上的所述可检测的标记。

对照DNA将具有适当的大小和碱基组合物以允许在引物引导的扩增反应中扩增。可从任何合适的来源获得所述对照模板DNA序列，但必须在相同条件下可重复地扩增以允许所述靶标扩增产物的扩增。

优选的对照序列包括，例如，定向SV40DNA的对照引物和探针。

所述对照反应适用于验证所述扩增反应。所述对照DNA的扩增发生在与被测试的所述样品相同的反应管中，因此当样品为靶标阴性、即没有生成靶标扩增产物时，表明是成功的扩增反应。为了获得所述扩增反应的显著验证，在每个扩增反应中必须包括适宜数量的所述对照DNA模板的复制。

在一些情况下，包括附加的阴性对照复制组合物可能是有用的。所述阴性对照复制组合物将包含与所述复制组合物相同的试剂，但没有聚合酶。当所述方法使用荧光检测方法时，此类对照的主要作用是监测均质形式的伪背景荧光。

可根据是否设计用于扩增靶标DNA或对照DNA来修饰复制组合物。将扩增所述靶标DNA的复制组合物(测试复制组合物)可包含(i)聚合酶(一般来讲是热稳定的)，(ii)能杂交至所述靶标DNA的引物对，和(iii)用于扩增反应进行的必需的缓冲剂。将扩增所述对照DNA(阳性对照或阳性复制复合物)的复制组合物可包含(i)聚合酶(一般来讲是热稳定的)(ii)所述对照DNA；(iii)至少一个能够杂交至所述对照DNA的引物；和(iv)用于扩增反应进行的必需的缓冲剂。此外，用于靶DNA或对照DNA扩增的所述复制组合物可包含核酸探针，优选地其具有可检测的标记。

实例

本发明将在下面的实例中得到进一步阐述。应该理解，这些实例尽管说明了本发明的优选实施例，但仅是以例证的方式给出的。

实例1

通过测定确定所述各个靶标的包容性/排他性

分析生物体样品以建立本发明的众多探针的包容性/排他性。对于包容性，使用了独立的、真实的沙门氏菌分离物。对于排他性，使用密切相关的非靶标生物体以保证所述测定法可将所述靶标生物体和其他非靶标生物体区分开。

DNA溶解物的制备

被测材料是所述靶标和非靶标生物体在37℃、BHI培养基中过夜生长的纯培养物。纯培养物生长过夜至大约1×10⁹cfu/ml的细胞密度。对于排他性，测试了1∶10稀释的过夜培养物。对于包容性，过夜培养物以大约1∶10,000稀释至TSB中。5μl的待测所述材料加入200μl的裂解试剂(DuPont Qualicon，Wilmington，DE)。所述混合物在37℃孵育20分钟，随后在95℃再孵育10分钟，并且最终冷却至5℃。

PCR条件

30μl的DNA溶解物被用于水合物冻干的PCR反应组分以获得DNA溶解物/PCR反应组分混合物。所述PCR反应组分是定制的试剂的形式，其包含GoTaq DNA聚合酶(Promega，Madison，WI)、脱氧核苷酸deoxynucleotides(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)、BSA和表面活性剂(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。此外，包括了所提供数量的表1中列出的所述引物和探针。如此表说明，这些探针的每个被设计为单分子使得其结构包括(以5’至3’顺序)：5’荧光末端标记、5’茎序列、探针序列、3’茎序列、内部淬灭剂、18-碳非扩增的接头、和引物序列。

表1：在包容性/排他性研究中使用的引物和探针

在Q7仪器(DuPont Qualicon，Wilmington，DE)上进行扩增和测试。热循环条件如下：在95℃下2分钟，随后46个循环(在95℃下10秒钟、然后70℃50秒，在每个循环的70℃步骤中捕集荧光信号)。

结果

如表2-3中可见，使用探针，本发明的所述方法能够适当地检测多种靶标，包括区分靶标和非靶标生物体。

表2：包容性结果

表3：排他性结果

序列表

<110> E.I. du Pont de Nemours and Company

Varkey, Stephen

DeMarco, Daniel R.

<120> 用于沙门氏菌检测的序列和它们的用法

<130> MD6687 US and PCT

<150> US 61/557,469

<151> 2011-11-09

<160> 136

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针结合位点

<400> 1

gcatgttagc cgggacgctt aatgcggtta acgccatg 38

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针结合位点

<400> 2

acgccatgcc gacaccagcg cccgccagcg 30

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针结合位点

<400> 3

aaataattca ggccacactg gaagcggtaa agacctat 38

<210> 4

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针结合位点

<400> 4

dycgtwmgrc gcgycaatga ycmtragcga cgkgaaaaaa twattca 47

<210> 5

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针结合位点

<400> 5

gccgtaagac gcgccaatga tcctaagcga cgggaaaaaa taattca 47

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 6

acgccatgcc gacaccagcg cccgccagcg 30

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 7

acgccatgcc gacaccag 18

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 8

cgccatgccg acaccagc 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 9

gccatgccga caccagcg 18

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 10

ccatgccgac accagcgc 18

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 11

catgccgaca ccagcgcc 18

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 12

atgccgacac cagcgccc 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 13

tgccgacacc agcgcccg 18

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 14

gccgacacca gcgcccgc 18

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 15

ccgacaccag cgcccgcc 18

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 16

cgacaccagc gcccgcca 18

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 17

gacaccagcg cccgccag 18

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 18

acaccagcgc ccgccagc 18

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 19

caccagcgcc cgccagcg 18

<210> 20

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 20

ccgacaccag cgcc 14

<210> 21

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 21

ccgacaccag cgcccg 16

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 22

cgctggcggg cgctggtgtc ggcatggcgt 30

<210> 23

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 23

cgctggcggg cgctggtg 18

<210> 24

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 24

gctggcgggc gctggtgt 18

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 25

ctggcgggcg ctggtgtc 18

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 26

tggcgggcgc tggtgtcg 18

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 27

ggcgggcgct ggtgtcgg 18

<210> 28

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 28

gcgggcgctg gtgtcggc 18

<210> 29

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 29

cgggcgctgg tgtcggca 18

<210> 30

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 30

gggcgctggt gtcggcat 18

<210> 31

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 31

ggcgctggtg tcggcatg 18

<210> 32

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 32

gcgctggtgt cggcatgg 18

<210> 33

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 33

cgctggtgtc ggcatggc 18

<210> 34

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 34

gctggtgtcg gcatggcg 18

<210> 35

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 35

ctggtgtcgg catggcgt 18

<210> 36

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 36

ggcgctggtg tcgg 14

<210> 37

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 37

cgggcgctgg tgtcg 15

<210> 38

<211> 11

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 38

cgggcgctgg t 11

<210> 39

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 39

caggggctgg tgtcggca 18

<210> 40

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 40

ggatgttagc cgggacgctt aatgcggtta acgccatg 38

<210> 41

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 41

ggatgttagc cgggacgctt aatgcg 26

<210> 42

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 42

gatgttagcc gggacgctta atgcgg 26

<210> 43

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 43

atgttagccg ggacgcttaa tgcggt 26

<210> 44

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 44

tgttagccgg gacgcttaat gcggtt 26

<210> 45

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 45

gttagccggg acgcttaatg cggtta 26

<210> 46

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 46

ttagccggga cgcttaatgc ggttaa 26

<210> 47

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 47

tagccgggac gcttaatgcg gttaac 26

<210> 48

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 48

agccgggacg cttaatgcgg ttaacg 26

<210> 49

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 49

gccgggacgc ttaatgcggt taacgc 26

<210> 50

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 50

ccgggacgct taatgcggtt aacgcc 26

<210> 51

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 51

cgggacgctt aatgcggtta acgcca 26

<210> 52

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 52

gggacgctta atgcggttaa cgccat 26

<210> 53

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 53

ggacgcttaa tgcggttaac gccatg 26

<210> 54

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 54

ggacgcttaa tgcg 14

<210> 55

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 55

aatgatccta agcgacggga aaaaataatt ca 32

<210> 56

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 56

aatgatccta agcgacggga 20

<210> 57

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 57

atgatcctaa gcgacgggaa 20

<210> 58

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 58

tgatcctaag cgacgggaaa 20

<210> 59

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 59

gatcctaagc gacgggaaaa 20

<210> 60

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 60

atcctaagcg acgggaaaaa 20

<210> 61

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 61

tcctaagcga cgggaaaaaa 20

<210> 62

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 62

cctaagcgac gggaaaaaat 20

<210> 63

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 63

ctaagcgacg ggaaaaaata 20

<210> 64

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 64

taagcgacgg gaaaaaataa 20

<210> 65

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 65

aagcgacggg aaaaaataat 20

<210> 66

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 66

agcgacggga aaaaataatt 20

<210> 67

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 67

gcgacgggaa aaaataattc 20

<210> 68

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 68

cgacgggaaa aaataattca 20

<210> 69

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 69

agcgacggga aaaaataatc 20

<210> 70

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 70

gcgacgggaa aaaataatcc 20

<210> 71

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 71

cgacgggaaa aaataatcca 20

<210> 72

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 72

taagcgacgg gaaaaa 16

<210> 73

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 73

gtaagacgcg ccaatgatcc taagcgacgg gaaaaaataa 40

<210> 74

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 74

gtaagacgcg ccaatgatcc taagcgac 28

<210> 75

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 75

taagacgcgc caatgatcct aagcgacg 28

<210> 76

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 76

aagacgcgcc aatgatccta agcgacgg 28

<210> 77

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 77

agacgcgcca atgatcctaa gcgacggg 28

<210> 78

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 78

gacgcgccaa tgatcctaag cgacggga 28

<210> 79

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 79

acgcgccaat gatcctaagc gacgggaa 28

<210> 80

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 80

cgcgccaatg atcctaagcg acgggaaa 28

<210> 81

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 81

gcgccaatga tcctaagcga cgggaaaa 28

<210> 82

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 82

cgccaatgat cctaagcgac gggaaaaa 28

<210> 83

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 83

gccaatgatc ctaagcgacg ggaaaaaa 28

<210> 84

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 84

ccaatgatcc taagcgacgg gaaaaaat 28

<210> 85

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 85

caatgatcct aagcgacggg aaaaaata 28

<210> 86

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 86

aatgatccta agcgacggga aaaaataa 28

<210> 87

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 87

cgccaatgat cctaagcgac ggga 24

<210> 88

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 88

gccgtaagac gcgccaatga tcctaagcga cgggaaaaa 39

<210> 89

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 89

gccaatgatc ctaagcgacg ggaaa 25

<210> 90

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 90

cgcgtcaatg accctgagcg acgtgaaa 28

<210> 91

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 91

ccgttcgacg cgtcaatgac cctgagcgac gtgaaaaa 38

<210> 92

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 92

gtcaatgacc ctgagcgacg tgaaa 25

<210> 93

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 93

cgcgccaatg accataagcg acgtgaaa 28

<210> 94

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 94

aatgaccctg agcgacgtg 19

<210> 95

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 95

ataggtcttt accgcttcca gtgtggcctg aattattt 38

<210> 96

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 96

ataggtcttt accgcttcca gtgtgg 26

<210> 97

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 97

taggtcttta ccgcttccag tgtggc 26

<210> 98

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 98

aggtctttac cgcttccagt gtggcc 26

<210> 99

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 99

ggtctttacc gcttccagtg tggcct 26

<210> 100

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 100

gtctttaccg cttccagtgt ggcctg 26

<210> 101

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 101

tctttaccgc ttccagtgtg gcctga 26

<210> 102

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 102

ctttaccgct tccagtgtgg cctgaa 26

<210> 103

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 103

tttaccgctt ccagtgtggc ctgaat 26

<210> 104

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 104

ttaccgcttc cagtgtggcc tgaatt 26

<210> 105

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 105

taccgcttcc agtgtggcct gaatta 26

<210> 106

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 106

accgcttcca gtgtggcctg aattat 26

<210> 107

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 107

ccgcttccag tgtggcctga attatt 26

<210> 108

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 108

cgcttccagt gtggcctgaa ttattt 26

<210> 109

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 109

cgcttccagt gtgg 14

<210> 110

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 110

ttttaccgcg tccagtgtgg cctgaa 26

<210> 111

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 111

ctttaccgct tccagggtgg cctgaa 26

<210> 112

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 自身互补茎序列

<400> 112

agggaccc 8

<210> 113

<211> 7

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 自身互补茎序列

<400> 113

aggaccc 7

<210> 114

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 自身互补茎序列

<400> 114

agggcccc 8

<210> 115

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 自身互补茎序列

<400> 115

aggcgccg 8

<210> 116

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 自身互补茎序列

<400> 116

acggccgc 8

<210> 117

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 自身互补茎序列

<400> 117

acggaccgc 9

<210> 118

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 自身互补茎序列

<400> 118

aagggccc 8

<210> 119

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 自身互补茎序列

<400> 119

aaggtgccc 9

<210> 120

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 自身互补茎序列

<400> 120

gggtccct 8

<210> 121

<211> 7

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 自身互补茎序列

<400> 121

gggtccc 7

<210> 122

<211> 7

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 自身互补茎序列

<400> 122

gggtcct 7

<210> 123

<211> 6

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 自身互补茎序列

<400> 123

gggtcc 6

<210> 124

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 自身互补茎序列

<400> 124

ggggccct 8

<210> 125

<211> 7

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 自身互补茎序列

<400> 125

ggggccc 7

<210> 126

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 自身互补茎序列

<400> 126

cggcgcct 8

<210> 127

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 自身互补茎序列

<400> 127

gcggccgt 8

<210> 128

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 自身互补茎序列

<400> 128

gcggtccgt 9

<210> 129

<211> 8

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 自身互补茎序列

<400> 129

gggccctt 8

<210> 130

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 自身互补茎序列

<400> 130

gggcacctt 9

<210> 131

<211> 146

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成阳性对照靶序列

<400> 131

gagcatagtt attaatagca gacactctat gcctgtgtgg agtagcggcg gcggtcgtct 60

gtataaaggt tacagaatat ttttccataa ttttcttgta tagcagtgca gctttttcct 120

ttgtggtgta aatagcaaag caagca 146

<210> 132

<211> 7

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 自身互补茎序列

<400> 132

aggcgcc 7

<210> 133

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 133

cagacgaccg ccgccgct 18

<210> 134

<211> 7

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 自身互补茎序列

<400> 134

ggcgcct 7

<210> 135

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 135

gagcatagtt attaatagca gacactctat gcctgtgtg 39

<210> 136

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物/探针序列

<400> 136

tgcttgcttt gctatttaca ccacaaagga aaaagctg 38

Claims

1.用于检测样品中沙门氏菌(Salmonella)的存在的方法，所述样品包含核酸，所述样品是食物和环境样品，所述方法包括：

(a)提供反应混合物，所述反应混合物包含：

(i)一种引物，其包含能够在高于55℃的Tm下选择性杂交至SEQ ID NO:1的序列的SEQID NO:47的核酸序列，和一种探针，其包含能够在高于55℃的Tm下选择性杂交至SEQ IDNO:2的序列的SEQ ID NO:29的核酸序列；和

(ii)任选地，至少一种其他的引物和探针，其中所述引物长度为至少11个核苷酸，并且所述探针长度为至少14个核苷酸，并且其中

(A)所述引物包含能够在高于55℃的Tm下选择性杂交至SEQ ID NO:1的序列或与其互补的序列的核酸序列，并且所述探针包含能够在高于55℃的Tm下选择性杂交至SEQ ID NO:2的序列或与其互补的序列的核酸序列；或

(B)所述引物包含能够在高于55℃的Tm下选择性杂交至SEQ ID NO:3的核酸序列或与其互补的序列的核酸序列，并且所述探针包含能够在高于55℃的Tm下选择性杂交至SEQ IDNO:4的序列或与其互补的序列的核酸序列；

其中所述(i)和(ii)的引物和探针各自具有3’末端和5’末端，并且其中所述探针的3’末端直接或间接地附接至所述引物的5’末端，从而形成引物-探针复合物；并且其中所述引物-探针复合物还包含5’茎序列和3’茎序列，其中所述5’茎序列的3’末端直接或间接地附接至所述探针的5’末端，其中所述3’茎序列的5’末端直接或间接地附接至所述探针的3’末端，并且其中所述3’茎序列的3’末端直接或间接地附接至所述引物的5’末端；以及

(b)使用步骤(a)的反应混合物进行所述样品的所述核酸的PCR扩增；以及

(c)检测步骤(b)的扩增。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物包含(i)的引物和探针以及(ii)的引物和探针两者。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述引物-探针复合物包含可检测的标记。

4.根据权利要求1所述的方法，其中能够选择性杂交至SEQ ID NO:1的所述其他的引物包含选自SEQ ID NO:40-46和48-54的核酸序列，并且其中能够选择性杂交至SEQ ID NO:2的所述其他的探针包含选自SEQ ID NO:6-28和30-39的核酸序列。

5.根据权利要求1所述的方法，其中能够选择性杂交至SEQ ID NO:3的所述其他的引物包含选自SEQ ID NO:95-111的核酸序列，并且其中能够选择性杂交至SEQ ID NO:4的所述其他的探针包含选自SEQ ID NO:55-94的核酸序列。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述5’茎序列包含选自SEQ ID NO:112-119的核酸序列，并且其中所述3’茎序列包含选自SEQ ID NO:120-130的核酸序列。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述反应混合物还包含淬灭剂寡核苷酸，其能够在高于55℃的Tm下选择性杂交至所述探针。

8.反应混合物在制备用于通过以下方法检测样品中沙门氏菌(Salmonella)的存在的试剂盒中的用途，所述样品包含核酸，所述反应混合物包含：

(ii)任选地，至少一种其他的引物和探针，其中所述引物长度为至少11个核苷酸，并且所述探针长度为至少14个核苷酸，并且其中：

所述方法包括：

(a)提供所述反应混合物，

(c)检测步骤(b)的扩增。

9.根据权利要求8所述的用途，其中所述反应混合物包含(i)的引物和探针以及(ii)的引物和探针两者。

10.根据权利要求8所述的用途，其中所述引物-探针复合物包含可检测的标记。

11.根据权利要求8所述的用途，其中能够选择性杂交至SEQ ID NO:1的所述其他的引物包含选自SEQ ID NO:40-46和48-54的核酸序列，并且其中能够选择性杂交至SEQ ID NO:2的所述其他的探针包含选自SEQ ID NO:6-28和30-39的核酸序列。

12.根据权利要求8所述的用途，其中能够选择性杂交至SEQ ID NO:3的所述其他的引物包含选自SEQ ID NO:95-111的核酸序列，并且其中能够选择性杂交至SEQ ID NO:4的所述其他的探针包含选自SEQ ID NO:55-94的核酸序列。

13.根据权利要求8-12中任一项所述的用途，其中所述5’茎序列包含选自SEQ ID NO:112-119的核酸序列，并且其中所述3’茎序列包含选自SEQ ID NO:120-130的核酸序列。

14.根据权利要求8所述的用途，其中所述反应混合物还包含淬灭剂寡核苷酸，其能够在高于55℃的Tm下选择性杂交至所述探针。

15.分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含引物-探针复合物，其中所述引物-探针复合物包含核酸引物部分和核酸探针部分，其中所述引物部分长度为至少11个核苷酸，并且所述探针部分长度为至少14个核苷酸，其中所述探针部分的3’末端直接或间接地附接至所述引物部分的5’末端，并且其中

(i)所述引物部分包含能够在高于55℃的Tm下选择性杂交至SEQ ID NO:1的序列或与其互补的序列的选自SEQ ID NO:40-54的核酸序列，并且所述探针部分包含能够在高于55℃的Tm下选择性杂交至SEQ ID NO:2的序列或与其互补的序列的选自SEQ ID NO:6-39的核酸序列；或

(ii)所述引物部分包含能够在高于55℃的Tm下选择性杂交至SEQ ID NO:3的核酸序列或与其互补的序列的选自SEQ ID NO:95-111的核酸序列，并且所述探针部分包含能够在高于55℃的Tm下选择性杂交至SEQ ID NO:4的序列或与其互补的序列的选自SEQ ID NO:55-94的核酸序列；

其中所述引物-探针复合物还包含5’茎序列和3’茎序列，其中所述5’茎序列的3’末端直接或间接地附接至所述探针部分的5’末端，其中所述3’茎序列的5’末端直接或间接地附接至所述探针部分的3’末端，并且其中所述3’茎序列的3’末端直接或间接地附接至所述引物部分的5’末端。

16.根据权利要求15所述的分离的多核苷酸，其中所述5’茎序列包含选自SEQ ID NO:112-119的核酸序列，并且其中所述3’茎序列包含选自SEQ ID NO:120-130的核酸序列。

17.用于检测样品中沙门氏菌的试剂盒，包含权利要求15或16的分离的多核苷酸。

18.试剂片剂，包含权利要求15或16的分离的多核苷酸。