CN105960467A - 利用核酸和信号探针的非对称等温扩增的核酸检测方法 - Google Patents

利用核酸和信号探针的非对称等温扩增的核酸检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105960467A
CN105960467A CN201580004417.8A CN201580004417A CN105960467A CN 105960467 A CN105960467 A CN 105960467A CN 201580004417 A CN201580004417 A CN 201580004417A CN 105960467 A CN105960467 A CN 105960467A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
rna
primer
target
mentioned
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201580004417.8A
Other languages
English (en)
Inventor
金珉煥
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Really Dix
Original Assignee
Really Dix
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Really Dix filed Critical Really Dix
Publication of CN105960467A publication Critical patent/CN105960467A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6832—Enhancement of hybridisation reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及使用外部引物对、正向和反向DNA‑RNA‑DNA杂交引物的比例不同的内部引物对、DNA‑RNA‑DNA杂交信号探针，在等温下以非对称方式扩增靶核酸的同时，扩增探针的信号，从而准确地检测靶核酸的方法。根据本发明，相比于作为现有方法的采用相同比例引物的等温引物及探针扩增方法的对称iTPA方法等，可以有效地扩增探针的信号，可应用于检测及确认正确的病原菌、检测可带来规定表现型的DNA变更、诊断遗传疾病有关感受性、DNA表现的评估及各种基因项目，有利于分子生物学研究及疾病诊断。

Description

利用核酸和信号探针的非对称等温扩增的核酸检测方法
技术领域
本发明涉及核酸和信号探针的等温扩增方法及利用扩增的信号探针的核酸检测方法，更具体地涉及利用外部引物对、脱氧核糖核酸-核糖核酸-脱氧核糖核酸(DNA-RNA-DNA)杂交引物对及DNA-RNA-DNA杂交信号探针，同时扩增靶核酸和信号探针，并迅速地检测靶核酸的方法。进一步具体地涉及，采用不同比例的正向DNA-RNA-DNA杂交引物和反向DNA-RNA-DNA杂交引物，以非对称方式扩增核酸，与此同时，利用具有在以非对称方式扩增的DNA中因过量使用引物而以非对称方式过量扩增的DNA互补的碱基序列的DNA-RNA-DNA杂交信号探针并扩增信号，从而在等温下检测核酸的方法。
背景技术
核酸扩增技术在检测和分析少量核酸的过程中属于非常有用的技术。针对靶核酸的核酸扩增技术的高度敏感性促进了感染性疾病及遗传性疾病的诊断和分析所需的DNA分离技术以及法医学层面的特定核酸检测技术的发展，也开发了基于这种核酸检测方法而执行非常敏感的诊断分析的方法(Belkum，Current Opinion in Pharmacology，3:497，2003)。核酸的检测基于DNA链的互补性和体外中单链核酸形成双链杂交分子的能力，借助上述能力，可从样本中检测出特定核酸(Barry et al.,Current Opinion in Biotechnology，12:21，2001)。
用于核酸检测的探针由存在于核酸样本的靶序列和可杂交化的特定序列组成。上述探针可由化学物质、免疫-化学物质、荧光或放射线同位素读取。大体上，探针包括针对靶核酸互补序列的短片段核酸和可读取DNA杂交的荧光物质或生物素及双加氧酶(dioxygenase)等标记或报道分子。
但是，根据如上所述的核酸检测方法，无法检出尤其是染色体DNA上的短序列，复制数低，在解决野生型基因有关变形对立DNA的有限复制数方面存在局限性。作为核酸检测方法的其他存在问题，与限制靶序列、化学物质或探针与其它分子或结构的物理相互作用的体外(in vitro)或体内(in situ)的环境条件有关。
靶核酸检测方法可以分组为三类，作为使靶核酸扩增的方法的靶核酸序列扩增，使探针分子本身扩增的探针扩增，将各探针表现出的信号借助复合探针或连接探针技术增加的信号扩增。
体外(in vitro)核酸扩增技术用作检测和分析少量核酸的方法。其中，聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)是最广泛使用的核算的扩增方法，将互补性序列的各螺旋(strand)用作模板，借助引物来反复进行核酸合成，由此，完成互补性序列的各螺旋的复制本。为了执行聚合酶链式反应过程，需要预先编程的热循环装备(thermalcycling instrument)。但是，这种方法所需费用高，特异性较低，而且为了呈现结果，需要将执行步骤高度标准化。
作为其他核酸扩增方法的连接酶链式反应(ligase chain reaction，LCR)，两个相邻的寡核苷酸与靶核酸杂交，借助连接酶(ligase)而连接。由此，所形成的探针(probe)与互补的核苷酸一同借助温度周期(temperature cycling)而被扩增。
连接酶链式反应具有比利用引物的核酸的引物延伸(primer extension)高的识别力(discriminatory power)，因此，对于基因的点突变(genotyping point mutation)，相比于聚合酶链式反应(PCR)，表现出更高的对立基因特异性(allele specificity)。连接酶链式反应具有截至目前开发的核酸扩增技术中最高的特异性，所有识别机制已得到最优化，因此，可以最方便地执行，但缺点是反应速度最慢、并需要大量的变形探针。
根据如连接酶链式反应利用连接(ligation)的方法，借助在连接酶链式反应或滚环扩增(rolling circle amplication，RCA)过程中伴随的DNA接合，利用第一个圆形化的锁式探针(padlock probe)并以滚环扩增方法进行扩增，由此，无需执行靶扩增聚合酶链式反应，也可以分析DNA分型(genotyping)(Qi et al.,Nucleic Acids Research，29:e116，2001)。
链置换扩增(strand displacement amplification，SDA)是通过核酸内切酶来置换螺旋(strand displacement)，使样本内的靶核酸序列及其互补性螺旋扩增的方法。该方法使用包含核酸聚合酶(nucleic acid polymerase)、至少一个被置换的脱氧核苷三磷酸(deoxynucleosidetriphosphate，dNTP)的三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTPs)以及包含至少一个对靶片段(target fragment)的3’末端互补的引物的杂交物。各引物在5’末端具有可由限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)认知的序列(Walker et al.,Nucleic Acids Res.,20:1691，1992)。
作为与链置换扩增方法类似的方法，有使用RNA-DNA杂交引物或RNA引物，使引物进行引物延伸后，使用用于切断与模板DNA构成杂交化的RNA引物的RNaseH酶，切断引物和模板DNA后，借助链置换而使新的引物进行引物延伸的方法；使用5’-RNA-DNA-3’引物的单引物恒温扩增(single primer isothermal amplification，SPIA)方法(美国专利6,251,639)；使用5’-DNA-RNA-3’引物的ICAN(isothermal chimeric primer-initiated amplification of nucleic acid)方法(美国专利申请2005/0123950)；使用RNA引物的Riboprimer方法(美国专利申请2004/0180361)；利用外部引物和内部DNA-RNA-DNA杂交引物的方法(美国专利5,824,517)等。
转录介导的扩增技术(transcription mediated amplification，TMA)方法是在一定温度、一定离子强度(ionic strength)及一定pH下，仅使用一个启动-引物，扩增靶核酸的方法(Kwoh et al.,Proc.Nat.Aca.Sci.USA，86:1173，1989)。转录介导的扩增技术方法的特征在于，实质上，使由靶核酸构成的杂交物和启动-引物(promoter-primer)相结合，上述启动-引物是与用于与靶核酸的3’末端部位或与其相邻的部位杂交的靶序列的3’末端部位互补的寡核苷酸。上述启动-引物包括位于配合序列(complexing sequence)的5’末端部位的RNA聚合酶有关启动部位序列。上述启动-引物及靶序列形成启动-引物/靶序列杂交，使DNA引物延伸。
在上述转录介导的扩增技术方法的DNA引物延伸(extension)过程中，据推测，靶序列的3’末端从接近配合序列和靶序列之间启动引物被杂交化的复合体(complex)的位置开始引物延伸。启动序列用作生成第一个DNA引物延伸生成物并形成双螺旋启动序列的上述引物延伸过程的模板。启动-引物的3’末端还可用作第二个DNA引物延伸过程的引物。在上述引物延伸过程中，使用靶序列作为模板而形成双螺旋核酸复合体。关于上述复合体，在使用RNA靶序列的情况下为DNA/RNA复合体，在使用DNA靶序列的情况下为DNA/DNA复合体。接着，为了生产靶序列的各种RNA复制本，认知启动-引物的启动的RNA聚合酶使用上述第一个DNA引物延伸生成物来合成RNA。
在核酸基础序列扩增(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)方法中，包括单螺旋RNA的合成、单螺旋DNA的合成及双螺旋DNA的合成(Compton，Nature，350:91，1991)。上述单螺旋RNA成为对于第一个引物的模板，上述单螺旋DNA成为对于第二个引物的模板，上述双螺旋DNA在合成上述第一个模板的复制本的过程中成为第三个模板。
在聚合酶链式反应等的使用热循环过程的扩增方法中，为了达到各周期的“目标”温度，需要热循环模块，截止到热模块达到目标温度，需要延迟时间，因此，完成扩增反应需要较长时间。
链置换扩增、核酸基础序列扩增及转录介导的扩增技术等等温靶核酸扩增方法在一定温度下完成核酸扩增，因此，不需要另行的热循环装置，具有操作容易的优点。但是，目前为止公开的等温靶核酸扩增方法还具有几个缺点。根据链置换扩增方法的核酸扩增，需要用于规定限制酶的部位，因此，其应用性受限，而核酸基础序列扩增及转录介导的扩增技术等转录-基础扩增方法，需要借助引物的聚合酶启动序列和扩增生成物相结合，这一过程会导致非-特异性扩增。由于这种缺点，借助这种转录-基础扩增方法的DNA靶扩增机制难以成立。
并且，根据目前使用的扩增方法，另一个缺点是存在因先行扩增反应的扩增生成物导致试验样本被污染的可能性，由此会带来样本的非-目标特异性扩增。为了防止这种情况，开发了在扩增反应的最后或靶核酸的扩增开始之前，采用可使试验样本去污染的各种手段和物理方法的试验溶液的污染检测方法，但这些大部分会导致核酸扩增操作过程复杂化。
作为用于核酸检测的另一方法，还有信号扩增方法，而不是靶核酸或探针扩增。在这些方法中，有为了截取靶核酸，而是用四组探针的bDNA(branched DNA)扩增法(Ross et al.,J.Virol.Method.,101:159，2002)。利用信号扩增的杂交截取方法，直接检测靶核酸，并具有可比拟靶核酸扩增方法的敏感性，为了检测信号而使用抗体或化学发光物质(van der Pol et al.,J.ClinicalMicrobiol.,40:3564，2002；Nelson et al.,Nucleic Acids Research，24:4998，1996)。
并且，作为信号探针扩增方法，有环状探针技术(cycling probetechnology，CPT)扩增方法(Duck et al.,BioTechniques，9:142，1990)。上述方法使用具有与靶核酸的互补的碱基序列的DNA-RNA-DNA杂交信号探针，在靶核酸与上述探针杂交的情况下，杂交信号探针的RNA部分借助RNaseH酶而被切断，被切断的杂交信号探针与靶核酸分离，并且有另一DNA-RNA-DNA杂交信号探针与靶核酸杂交，再次生成被切断的探针，最终循环地扩增信号探针。还有利用在DNA-RNA-DNA两个末端标记荧光物质和荧光抑制物质(quencher)并检测被切断的信号探针的荧光共振能量转移现象(FRET；fluorescent resonance energy transfer)的探针检测方法(美国专利申请2005/0214809)等。但是，上述环状探针技术方法的扩增效率较低，即，扩增效率为102～104，因此，难以用于独立诊断，借助聚合酶链式反应方法等现有的核算扩增方法，先增加靶核酸的特定部位的量后，另行扩增信号探针，因此，存在使用复杂和成本增加的缺点。
非对称(asymmetric)聚合酶链式反应方法是在双螺旋DNAtemplate中仅选择性地扩增单一DNA的聚合酶链式反应的衍生技术，有效地用于碱基序列sequencing的单链DNA模板(template)合成。(Innis et al.Proc.Nalt.Acad.Sci.USA85:9436，1988，美国专利5,066,584)并且，非对称聚合酶链式反应方法使用molecular beacon probe，相对于对称聚合酶链式反应方法，在腺病毒检测方面表现出显著的有效性。(Poddar Mol.Cell.Probes 14:25，2000)并且，非对称聚合酶链式反应方法用于factor V基因的单一碱基变异(Single nucleotide polymorphism)所需荧光共振能量转移(FRET)形态的hybridization探针的template合成。(Szilvasi et al.Clin.Chem.38:727，2005)使用同量正向(forward)引物和反向(reverse)引物的一般对称(symmetric)聚合酶链式反应方法中，在合成一定程度的扩增产物后，扩增产物之间的结合概率高于扩增产物与引物的结合概率。这是由于，引物的碱基序列长度显著短于扩增产物的碱基序列长度。因此，相比于扩增产物和引物的结合，扩增产物之间的结合机会变高，最终，扩增效率下降，从而达到扩增被中断的坪(plateau)阶段。(Rice et al.Prenatal Diagn.22:1130，2002)非对称聚合酶链式反应方法采用不同浓度的正向和反向引物，引导借助正向引物合成的扩增产物和借助反向引物合成的扩增产物的量不同，提供可解决扩增产物之间结合有关问题的方法。(Gyllensten et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:7652，1988)在正向或反向中，当少量的引物被耗尽时，过量的引物引导线性扩增，并提高聚合酶链式反应的扩增效率。但是，相对于对称聚合酶链式反应，非对称聚合酶链式反应的扩增效率虽高，但其差异并不大。(Gyllensten et al.Methods Enzymol 218：3，1993)这是由于，在聚合酶链式反应的提高温度的denaturation过程中，扩增产物之间的结合或扩增产物与引物之间的结合会再次发生。在通过提高温度来省略denaturation过程的等温扩增的情况下，相比于聚合酶链式反应，非对称方法更加有效。尤其，在使用与借助正向或反向引物而合成的扩增产物相结合的探针的方法中，非对称扩增方法非常有效。即，在使用同量的正向和反向引物的对称扩增中，会发生借助正向和反向引物而合成的扩增产物之间的结合和与探针互补的扩增产物与探针之间的竞争结合。通常而言，由于扩增产物的碱基序列长度大于探针的碱基序列长度，相比于借助扩增产物和探针相结合而产生信号的概率，因扩增产物之间的结合而不产生信号的概率显著高。在反应初期，探针的浓度高于扩增产物的浓度，扩增产物与探针之间的结合占优势，但随着扩增反应的进行，扩增产物的浓度变高，扩增产物之间的结合比扩增产物和探针之间的结合占据优势，借助探针结合的信号发生减少，最终中断信号的产生。因此，在借助正向或反向引物而合成的扩增产物中，当过量使用用于合成与探针相结合的扩增产物的引物时，相比于扩增产物之间的结合，引导具有与探针互补的碱基序列的扩增产物与探针之间的结合，最终，提高借助探针结合的信号产生概率，最终更加有效地完成扩增。
包含聚合酶链式反应的核酸扩增方法的最大问题之一就是非特异性扩增。非特异性扩增导致伪阳性结果，导致诊断正确度下降，从而被划入非常严重的问题。因此，大部分引物利用生物信息学的计算机模拟等尖端技术进行设计。但是，计算机模拟并不始终与实际实验结果一致，借助生物信息学技术设计的引物也无法完全排除非特异性扩增。在扩增过程中，因过量使用的引物之间的结合所产生的扩增primer-dimer现象，会导致阻碍核酸扩增正确度的结果。尤其，相比于聚合酶链式反应引物，使用长度相对更长的引物的等温扩增中，其问题非常严重。由于这种问题的存在，在等温扩增方法中使用多种类型的引物的多重(multiplex)扩增相比于聚合酶链式反应方法更具难度是事实。但是，在使用非对称扩增方法的情况下，可以解决这种问题。即，相比于对称扩增方法，使正向或反向引物中的一个引物采用显著低的浓度，从而显著降低引物之间的结合机会，并减少primer-dimer现象。
根据本发明人的先行专利(韩国专利10-0957057号)，一种利用同量的正向和反向DNA-RNA-DNA杂交引物，同时等温扩增核酸和信号探针，并检测靶核酸的对称等温扩增方法，其问题在于，敏感度为每反应100细胞数，若用于诊断，则存在局限性，而且还会造成因非特异性反应的伪阳性结果。并且，根据本先行专利减少，为了扩增，使包含靶DNA和引物对的反应杂交物变性后，需要添加酶反应杂交液。
对此，本发明人为了克服如上所述的缺点，试图开发可改善靶核酸的检测敏感度并使其正确扩增的方法及靶核酸扩增的同时检测上述扩增产物的方法，确认当利用非对称(asymmetric)时，即采用不同的具有与靶核酸互补的碱基序列的外部引物对和具有与靶核酸部分互补的碱基序列的DNA-RNA-DNA杂交引物对的正向引物和反向引物的比例，则相比于对称方法，在等温下可有效地进行更多信号探针扩增，还可以降低因引物之间结合的非特异性扩增，从而完成了本发明。并且，本发明人着眼于另一等温扩增方法的LAMP方法的先例(MaruyamAet al.Appl.Environ.Microbiol.69:5023，2003)，即，在等温的靶核酸扩增过程中，无需独立的改性过程，也可以实现扩增，将其适用于本发明，并确认无需经过独立的改性过程也可以实现简便有效的扩增，从而完成了本发明。
发明内容
技术问题
最终，本发明的目的在于提供一种在等温下可迅速准确地扩增靶核酸和信号探针的方法。本发明的另一目的在于提供一种在等温下可同时执行靶核酸和探针信号扩增的靶核酸的检测方法。
解决问题的方法
为了达成上述目的，本发明提供一种靶DNA的检测方法，其特征在于，上述靶DNA的检测方法利用靶DNA的等温扩增方法及上述扩增的信号探针，上述靶DNA的等温扩增方法包括如下步骤：向反应杂交物添加能够置换链的DNA聚合酶、RNA分解酶后，使上述靶DNA和上述信号探针在等温下同时扩增的步骤，上述反应杂交物包括：(i)靶DNA；(ii)具有与上述靶DNA互补的碱基序列的外部引物对；(iii)上述靶DNA和3’末端DNA部分互补，5’末端DNA-RNA部分非互补碱基序列的DNA-RNA-DNA杂交引物对；以及(iv)具有与借助上述外部引物对和杂交引物对所生成的扩增产物互补的碱基序列的DNA-RNA-DNA杂交信号探针。用于上述反应杂交物的DNA-RNA-DNA杂交引物对的正向引物和反向引物的比例包括因过量使用其中的一种而以非对称方式扩增单链核酸的情况。
发明的效果
本发明具有可提供在等温下迅速准确地扩增靶核酸的方法及在等温下同时执行靶核酸的扩增及信号探针的扩增的核酸检测方法的效果。根据本发明，相比于作为现有方法的聚合酶链式反应方法等，简便并且无污染危险性，可迅速准确地扩增靶核酸，并可同时扩增信号探针，可应用于检测及确认病原菌、检测可带来规定表现型的基因的改变、诊断遗传疾病或疾病有关感受性、基因表现的评估及各种基因项目，有利于分子生物学研究及疾病诊断。并且，作为非对称等温扩增方法，相比于现有的对称等温扩增方法，可改善敏感度和特异度，从而实现更加准确的诊断。
附图说明
图1为根据本发明的靶DNA的等温扩增方法的图示。
图2为根据本发明的靶DNA和信号探针的等温扩增方法的图示。
图3为根据本发明的对称等温扩增方法和非对称等温扩增方法的差异点的图示。
图4为以结核菌为靶的将根据本发明的对称等温扩增方法和借助非对称等温扩增方法所生成的荧光信号(DeltARn)以实时荧光检测装备进行测定的结果。
图5为以衣原体为靶的将根据本发明的对称等温扩增方法和借助非对称等温扩增方法所生成的荧光信号(DeltARn)以实时荧光检测装备进行测定的结果。
图6为以淋菌为靶的将根据本发明的对称等温扩增方法和借助非对称等温扩增方法所生成的荧光信号(DeltARn)以实时荧光检测装备进行测定的结果。
图7为以李斯特菌为靶的将根据本发明的对称等温扩增方法和借助非对称等温扩增方法所生成的荧光信号(DeltARn)以实时荧光检测装备进行测定的结果。
图8为以沙门氏菌为靶的将根据本发明的对称等温扩增方法和借助非对称等温扩增方法所生成的荧光信号(DeltARn)以实时荧光检测装备进行测定的结果。
具体实施方式
根据本发明的一实施方式，本发明提供一种靶DNA的检测方法，其特征在于，上述靶DNA的检测方法利用靶DNA的等温扩增方法及上述扩增的信号探针，上述靶DNA的等温扩增方法包括如下步骤：向反应杂交物添加能够置换链的DNA聚合酶、RNA分解酶后，使上述靶DNA和上述信号探针在等温下同时扩增的步骤，上述反应杂交物包括：(i)靶DNA；(ii)具有与上述靶DNA互补的碱基序列的外部引物对；(iii)上述靶DNA和3’末端DNA部分互补，5’末端DNA-RNA部分非互补碱基序列的DNA-RNA-DNA杂交引物对；以及(iv)具有与借助上述外部引物对和杂交引物对所生成的扩增产物互补性碱基序列的DNA-RNA-DNA杂交信号探针。用于上述反应杂交物的DNA-RNA-DNA杂交引物对的正向引物和反向引物的比例包括因过量使用其中的一种而以非对称方式扩增单链核酸的情况。
如图1所示，根据本发明的靶DNA的等温扩增能够以下述过程执行。
首先，在作为拟扩增的模板的靶DNA、外部引物对、DNA-RNA-DNA杂交引物对及DNA-RNA-DNA杂交探针的杂交物中，杂交包含有DNA聚合酶和RNA分解酶的酶反应溶液后进行扩增。此时，在反应液内，上述外部引物对和上述DNA-RNA-DNA杂交引物对退火到靶DNA。优选地，相比于杂交引物对，上述外部引物对包含与接近靶DNA的两侧末端的序列互补的序列，相比于外部引物，杂交引物对包含接近靶DNA的中心的序列，在此情况下，相比于外部引物，杂交引物退火到DNA链延伸方向的前方。退火的外部引物和杂交引物，借助具有链置换能力的DNA聚合酶来延伸，随着外部引物沿着靶DNA延伸，从位于延伸方向的前方的杂交引物中延伸的DNA链从靶DNA中脱落，并发生链置换，最终，可获得从杂交引物中延伸的单螺旋DNA扩增产物和从外部引物中延伸的双螺旋DNA扩增产物。
以作为上述扩增产物的单螺旋DNA作为模板，对外部引物和杂交引物进行退火。退火的外部引物和杂交引物借助具有链置换能力的DNA聚合酶来延伸，随着外部引物沿着单螺旋DNA延伸，从位于延伸方向的前方的杂交引物中延伸的DNA链从单螺旋DNA中脱落并发生链置换，最终，获得从杂交引物中延伸的新的单螺旋的DNA扩增产物和从外部引物中延伸的双螺旋的DNA扩增产物。上述扩增的单螺旋DNA作为模板，DNA-RNA-DNA杂交引物被退火和延伸，从而获得包括RNA的双螺旋DNA扩增产物。双螺旋DNA的RNA部分被RNase H分解，借助延伸、链置换而生成单螺旋DNA。上述的单螺旋DNA作为模板，反复进行引物的退火、延伸、链置换、RNA切割的过程，从而扩增靶DNA(图1)。
如图2所示，根据本发明的一实施例的信号探针的扩增与上述的核酸等温扩增同时进行。通过上述靶DNA的等温扩增而被扩增的DNA与DNA-RNA-DNA杂交信号探针被退火并形成RNA/DNA杂交双螺旋，借助RNase H的活性，DNA-RNA-DNA杂交信号探针的RNA部分被切断，被切断的信号探针从靶DNA中分离并脱落，结合新的DNA-RNA-DNA杂交信号探针，不断反复借助RNase H的切断、分离周期，从而扩增信号探针(图2)。
如图3所示，在根据本发明的一实施例的杂交引物对中，采用不同的正向杂交引物和反向杂交引物的比例，过量的引物生成一侧方向的扩增产物，提高与具有与过量扩增的一侧方向的DNA互补的碱基序列的信号探针相结合的机会，最终，相比于对称等温扩增方法，非对称等温扩增方法提高信号探针的扩增机会。尤其，借助引物而扩增的扩增产物的长度长于探针的长度，在对称扩增方法的情况下，扩增产物之间的结合概率高于扩增产物与探针之间的结合概率，导致探针扩增的效率下降，但在非对称方法中，可以有效地引导过量扩增的扩增产物与探针之间的结合，提高探针的扩增效率，并最终大幅改善靶DNA的检测灵敏度。
如图4～图6的结果所示，相比于现有的对称等温扩增方法，非对称等温扩增方法的敏感度得到改善。
如图7和图8的结果所示，相比于现有的对称等温扩增方法，非对称等温扩增方法的特异度得到改善。
优选地，在本发明中使用的外部引物对可使用选自由寡聚DNA、寡聚RNA及杂交寡聚RNA/DNA组成的组中的一种，与靶核酸序列互补(complementary)，并具有15～30碱基。并且，优选地，与上述外部引物互补的靶DNA序列为与杂交引物互补的靶DNA序列相邻的序列(1～60bp差异)，优选地，与外部引物互补的靶DNA序列为，相比于与杂交引物互补的DNA序列，接近靶DNA序列的3’末端侧的序列。
本发明的特征在于，在本发明中使用的DNA-RNA-DNA杂交引物对中，5’末端DNA-RNA部分具有与靶DNA序列非互补的碱基序列，3’末端DNA部分具有与靶DNA互补的碱基序列。优选地，上述DNA-RNA-DNA杂交引物由32～66碱基组成，此时，优选地，DNA部分的长度分别由15～30碱基组成，RNA部分的长度由1～6碱基组成。
优选地，在本发明中与DNA-RNA-DNA杂交引物互补的靶DNA的序列包含:相比于与外部引物互补的靶DNA的序列，位于3’末端侧的序列，优选地，与杂交引物互补的靶DNA序列为与外部引物互补的靶DNA序列相邻的序列(1～60bp差异)。
在本发明中使用的DNA聚合酶作为可沿着DNA模板扩张核酸引物的酶，应能够从结合有所置换的链的多核苷酸中置换核酸链。优选地，在本发明中可使用的DNA聚合酶为耐热性DNA聚合酶，作为耐热性DNA聚合酶，可以举出Bst DNA聚合酶、exo(-)vent DNA聚合酶、exo(-)Deep vent DNA聚合酶、exo(-)Pfu DNA聚合酶、BcADNA聚合酶、phi29DNA聚合酶等。
优选地，在本发明中使用的RNA分解酶在切断RNA/DNA杂交体的RNA链上具有特异性，优选地，单链RNA不应分解，优选地，使用RNase H。
优选地，在本发明中使用的DNA-RNA-DNA杂交信号探针为具有与在上述DNA-RNA-DNA杂交引物对中的正向或反向引物中过量使用的引物而被扩增的核酸扩增产物互补的碱基序列的寡核苷酸，优选地，DNA-RNA-DNA杂交信号探针的5’末端和3’末端由寡聚DNA组成，中间部分由寡聚RNA组成。
优选地，上述DNA-RNA-DNA杂交信号探针由18～38碱基组成，5’末端及3末端的DNA部分分别由8～16碱基组成，位于中间的RNA部分由1～6碱基组成。
并且，上述DNA-RNA-DNA杂交信号探针的特征可以是末端以标记物质进行标记，上述标记物质可使用荧光物质(fluorescein)和荧光信号抑制物质(quencher)等。
在本发明中使用的杂交引物对中，正向引物和反向引物的浓度比例可以是1:5至1:20，或者也可以是5:1至20:1，更优选地，可以是1:10或10:1。过量使用的杂交引物具有与杂交探针互补的碱基序列。
在本发明中，优选地，上述等温扩增可以使本发明的引物和模板DNA退火，在实际上不抑制所使用的酶的活性的温度下实施。在本发明中，执行扩增反应的温度，优选为30～75℃，更优选为37～70℃，最优选为50～65℃。
根据本发明的核酸的等温扩增方法，使用补充外部引物，因此，相比于使用单一RNA-DNA杂交引物的现有方法(美国专利6,251,639)，不仅其特异性高，借助外部引物而被置换的内部引物作为新的模板，以几何级数方式扩增，由此，可以彻底改善扩增效率。并且，根据现有的方法，使用单一RNA-DNA杂交引物来扩增靶碱基序列时，为了扩增一定部位，适用用于阻断扩增的独立的阻断剂(blocker)或模板开关寡核苷酸(TSO)，而本发明使用正向引物和反向引物对，不使用独立的阻断剂或模板开关寡核苷酸，可以干净地扩增所需部位。
并且，将扩增的DNA作为模板，反复由DNA-RNA-DNA杂交信号探针相结合和相分离的周期，并使信号探针扩增，因此，可在一个步骤(single-tube)中实现核酸扩增和信号探针扩增，因此，相比于作为现有技术的利用DNA-RNA-DNA杂交引物来仅扩增核酸的技术(美国专利5,824,517)或仅扩增DNA-RNA-DNA杂交信号探针的技术(美国专利申请2005/0214809)，具有可同时扩增核酸和信号探针的优点。
根据本发明的核酸的等温扩增方法，相比于现有的使用同量正向引物和反向引物的对称方式的等温核酸及信号探针扩增方法，提供不同比例的正向引物与反向引物的以非对称方式过量扩增的DNA，提高具有与此互补的碱基序列的信号探针被退火的机会，有效地扩增信号探针，并最终改善核酸检测的灵敏度和特异度。
本发明的优点还有，在所使用的DNA-RNA-DNA杂交引物中，5’末端DNA-RNA部分具有与模板非互补的碱基序列，无需考虑在使用单一RNA-DNA杂交引物的现有方法中存在的RNA分解酶的反应活性高于DNA聚合酶的引物扩张活性时所产生的问题。
并且，根据本发明的DNA的等温扩增方法，经过最初的引物扩张和链置换反应后，当最新合成的扩增产物使用新模板时，与模板非互补的RNA部位作用于与引物互补的模板，提高与引物的结合(annealing)温度，不仅增加扩增效率，而且防止引物-二聚体(primer-dimer)的形成，从而提高扩增产物的纯度。
根据本发明的核酸的等温扩增方法，从样本的DNA提取到完全扩增，耗时约1小时，当完成样本DNA的提取时，耗时约40分钟，具有可非常迅速地完成扩增反应的优点。
根据本发明的另一方面，提供一种靶DNA的检测方法，其特征在于，上述靶DNA的检测方法利用靶DNA的等温扩增方法及上述扩增的信号探针，上述靶DNA的等温扩增方法包括如下步骤：向反应杂交物添加能够置换链的DNA聚合酶、RNA分解酶后，使上述靶DNA和上述信号探针在等温下同时扩增的步骤，上述反应杂交物包括：(i)靶DNA；(ii)具有与上述靶DNA互补的碱基序列的外部引物对；(iii)上述靶DNA和3’末端DNA部分互补，5’末端DNA-RNA部分非互补碱基序列的DNA-RNA-DNA杂交引物对；以及(iv)具有与借助上述外部引物对和杂交引物对所生成的扩增产物互补的碱基序列的DNA-RNA-DNA杂交信号探针。用于上述反应杂交物的DNA-RNA-DNA杂交引物对的正向引物和反向引物的比例包括因过量使用其中的一种而以非对称方式扩增单链核酸的情况。
借助本发明的方法而被扩增的信号探针利用荧光检测器可直接从反应管中检测荧光信号，而无需独立的后处理过程。此时，DNA-RNA-DNA杂交探针的末端分别标记有荧光物质(fluorescence)和荧光信号抑制物质(quencher)，在探针被切断之前，荧光能量转移到荧光信号抑制物质，抑制荧光信号释放，在探针被切断以后，不发生荧光信号转移的FRET(fluorescence resonance energy transfer)形态的信号探针。
根据本发明的核酸的等温扩增方法及核酸检测方法，作为在一定温度下进行反应的一站式(one-step)核酸及信号探针等温扩增，不需要特殊的热转换装置，因此，可以迅速简单地完成扩增，在扩增过程中使用两对引物对和探针，因此，相比于现有的方法，不仅可以准确地扩增靶核酸，还可以扩增信号探针，它是在扩增过程中采用不同比例的正向杂交引物和反向杂交引物的非对称核酸及信号探针方法，相比于现有的方法，提高所扩增的DNA模板和信号探针的退火机会，最终可改善灵敏度和特异度。并且，根据本发明的核酸的等温扩增方法及核酸的检测方法，在等温的一个管(one-tube)内完成，因此，具有可实现用于核酸实时检测的大量处理。这种优点可以使限制扩增技术的广泛使用的污染所造成的附加反应产生的风险最小化。
下面，将通过实施例对本发明进行更加详细的说明。这些实施例仅仅是为了示例本发明，不应解释为本发明的范围受这些实施例的限制，这对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说是显而易见的。
实施例1：结核DNA的等温扩增
作为靶DNA，定量稀释市售的结核菌(Mycobacterium tuberculosis)DNA组DNA，用作等温扩增反应的模板。(Vircell，Spain)
外部引物(序列号1及序列号2)设计成包含与Mycobacterium tuberculosis IS6110碱基序列互补的序列，序列号1(正向，sense)及序列号2(反向，anti-sense)如下。
序列号1：5’-CGATCGAGCAAGCCA-3’
序列号2：5’-CGAGCCGCTCGCTGA-3’
在DNA-RNA-DNA杂交引物(序列号3及序列号4)中设计成，5’末端寡聚DNA-RNA部分具有与Mycobacterium tuberculosis IS6110碱基序列非互补的序列，3’末端寡聚DNA部分具有与Mycobacterium tuberculosis IS6110碱基序列互补的序列，序列号3(正向，sense)及序列号4(反向，anti-sense)如下(寡聚RNA部分用下划线表示)。
序列号3：5’-CGATGACTGACTATACAAGAGGAAAGGCGTACTCGACCTGA-3’
序列号4：5’-CATTCCAGTTAAGCTAGCAGGTACTGAGATCCCCT 3’
用于执行信号探针扩增的DNA-RNA-DNA杂交信号探针(序列号5)具有与借助上述的引物对而扩增的DNA互补的碱基序列，5’末端标记为FAM dye，3’末端标记为DABCYL quencher，序列号5(anti-sense)如下(寡聚RNA部分用下划线表示)。
序列号5：5’-FAM-ATCCGTAUGGTGGATAACGTCTTTCA-DABCYL-3’
为了利用上述外部引物对和杂交引物对来扩增靶核酸，首先准备含有上述外部引物对、杂交引物对的反应杂交物和酶杂交物。上述反应杂交物通过在10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)(pH 8.5)缓冲液中添加10mM硫酸铵((NH4)2SO4)、10mM MgSO4、50mM氯化钾(KCl)、1.6mM脱氧核苷三磷酸(Fermentas)、1.6mM二硫苏糖醇(DTT)、0.1μg牛血清白蛋白(BSA)、0.6mM精胺(spermine)、100mM海藻糖(trehalose)、0.11μM外部引物对(IDT)、1.1μM的杂交引物对(IDT)(在非对称等温扩增的情况下，2.2μM正向杂交引物(sense)及0.22μM反向杂交引物(anti-sense))而制备。上述酶杂交物通过添加1unit Bst polymerase(NEB)、6units RNase H(Epicentre)、6units RNase inhibitor(NEB)、50nM杂交信号探针(IDT)而制备。
在常温下，向0.2ml聚合酶链式反应管添加上述反应杂交物5μl、酶杂交物5μl、不同浓度的模板DNA10μl，在61℃条件下等温扩增1.5小时。另一方面，作为阴性对照组，使用蒸馏水10ml。在扩增反应中，使用等温扩增荧光检测装备(Shinko，韩国)，将反应温度设置为61℃，设置为每分钟取得荧光信号。
其结果，如图4所示，相比于对称等温扩增方法，非对称等温扩增方法具有优秀的检测能力。
实施例2：衣原体DNA的等温扩增
作为靶DNA，使用衣原体(Chlamydi Atrachomatis)DNA组DNA。为了提取衣原体的DNA组DNA，在衣原体菌株(ATCC Cat.No.VR-887)中，使用G-spinTM DNA组DNA提取试剂盒(iNtRON Biotechnology，Cat.No.17121)，提取DNA组DNA后，实施扩增反应。提取DNA组DNA时，将菌悬浊液500μl以13,000rpm进行离心分离1分钟并去除上层液，杂交少量500μl磷酸盐缓冲液(PBS)(pH 7.2)进行离心分离并去除上层液后，添加含有RNase A，Proteinase K的G-buffer溶液300μl，并使细胞聚合体(cell pellet)悬浊，在65℃温度条件下静置15分钟。接着，添加结合缓冲液(Binding buffer)250μl并均匀杂交后，吸附柱(spin column)与DNA相结合。添加洗涤缓冲液(washing buffer)A 500ml后，在13000rpm中进行离心分离1分钟并去除，添加洗涤缓冲液(washing buffer)B 500ml并进行离心分离。1.5ml微量离心管(microcentrifuge tube)移至柱，并添加50μl的洗脱缓冲液(eleution buffer)后，离心分离1分钟，获得15.8ng/ml的DNA组DNA。将其稀释一定量并用作等温扩增反应的模板。
外部引物(序列号6及序列号7)设计成包含与ChlamydiAtrachomatis cryptic plasmid DNA碱基序列互补的序列，序列号6(正向，sense)及序列号7(反向，anti-sense)如下。
序列号6：5’-TAAACATGAAAACTCGTTCCG-3’
序列号7：5’-CAGTTATAGGTAATCCATTGTC-3’
在DNA-RNA-DNA杂交引物(序列号8及序列号9)中设计成，5’末端寡聚DNA-RNA部分具有与ChlamydiAtrachomatis cryptic plasmid DNA非互补的序列，3’末端寡聚DNA部分具有与ChlamydiAtrachomatis cryptic plasmid DNA碱基序列互补的序列，序列号8(正向，sense)及序列号9(反向anti-sense)如下(寡聚RNA部分用下划线表示。)。
序列号8：5’-ACCGCATCGAATCGATGTAAAATAGAAAATCGCATGCAAGATA-3’
序列号9：5’-CGATTCCGCTCCAGACTTAAAAAGCTGCCTCAGAATATACTCAG-3’
用于信号探针扩增的DNA-RNA-DNA杂交信号探针(序列号5)具有与借助上述的引物对而扩增的DNA互补的碱基序列，5’末端标记为FAM dye，3’末端标记为BHQ1quencher，序列号10(sense)如下(寡聚RNA部分用下划线表示)。
序列号10：5’-FAM-GGTAAAGCTCUGAUAUTTGAAGACTCT-BHQ1-3’
为了利用上述外部引物对和杂交引物对来扩增靶核酸，首先准备含有上述外部引物对、杂交引物对的反应杂交物和酶杂交物。上述反应杂交物通过在5mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)(pH 8.5)缓冲液中添加10mM硫酸铵((NH4)2SO4)、20mM MgSO4、10mM氯化钾(KCl)、1mM脱氧核苷三磷酸(Fermentas)、1mM二硫苏糖醇(DTT)、0.1μg牛血清白蛋白(BSA)、0.15mM精胺(spermine)、20mM海藻糖(trehalose)、0.2μM外部引物对(IDT)、1μM的杂交引物对(IDT)(在非对称等温扩增的情况下，0.4μM正向杂交引物(sense)及2μM反向杂交引物(anti-sense))而制备。上述酶杂交物通过添加3units Bst polymerase(NEB)、8units RNase H(Epicentre)、6units RNase inhibitor(NEB)、50nM杂交信号探针(IDT)而制备。
在常温下，向0.2ml聚合酶链式反应管添加上述反应杂交物5μl、酶杂交物5μl、不同浓度的模板DNA10μl，在61℃条件下等温扩增1.5小时。另一方面，作为阴性对照组，使用蒸馏水10ml。在扩增反应中，使用等温扩增荧光检测装备(Shinko，韩国)，将反应温度设置为61℃，设置为每分钟取得荧光信号。
其结果，如图5所示，相比于对称等温扩增方法，非对称等温扩增方法具有优秀的检测能力。
实施例3：淋菌DNA的等温扩增
作为靶DNA，使用淋菌(NeisseriA gonorrhoease)DNA组DNA。为了提取淋菌的DNA组DNA，在淋菌菌株(ATCC Cat.No.49226)中，使用G-spinTMDNA组DNA提取试剂盒(iNtRON Biotechnology，Cat.No.17121)，提取DNA组DNA后，实施扩增反应。提取DNA组DNA时，将菌悬浊液500μl以13,000rpm进行离心分离1分钟并去除上层液，杂交少量500μl磷酸盐缓冲液(PBS)(pH 7.2)进行离心分离并去除上层液后，添加含有RNase A，Proteinase K的G-buffer溶液300μl，并使细胞聚合体(cell pellet)悬浊，在65℃温度条件下静置15分钟。接着，添加结合缓冲液(Binding buffer)250μl并均匀杂交后，吸附柱(spin column)与DNA相结合。添加洗涤缓冲液(washing buffer)A 500ml后，在13000rpm中进行离心分离1分钟并去除，添加洗涤缓冲液(washing buffer)B 500ml并进行离心分离。1.5ml微量离心管(microcentrifuge tube)移至柱，并添加50μl的洗脱缓冲液(eleution buffer)后，离心分离1分钟，获得4.7ng/ml的DNA组DNA。将其稀释一定量并用作等温扩增反应的模板。
外部引物(序列号11及序列号12)设计成包含与NeisseriAgonorrhoease opA基因DNA碱基序列互补的序列，序列号11(正向，sense)及序列号12(反向，anti-sense)如下。
序列号11：5’-TCATCCGCCATATTGTG-3’
序列号12：5’-TTTCGGCTCCTTATTCGGTTT-3’
DNA-RNA-DNA杂交引物(序列号13及序列号14)设计成，5’末端寡聚DNA-RNA部分包含有与NeisseriAgonorrhoease opA基因DNA碱基序列非互补的序列，3’末端寡聚DNA部分包含有与NeisseriAgonorrhoease opA基因DNA碱基序列互补的序列，序列号13(正向，sense)及序列号14(反向anti-sense)如下(寡聚RNA部分用下划线表示)。
序列号13：5’-GCATAGCTCAAGTATATGGCACATTGAAACACCGCCCGGAA-3’
序列号14：5’-CTATCACGTGAAGCTAACGACCGGTTAAAAAAAGATTTTCACTG-3’
用于扩增信号探针的DNA-RNA-DNA杂交信号探针(序列号15)具有与借助上述的引物对而扩增的DNA互补的碱基序列，5’末端标记为FAM dye，3’末端标记为DABCYL quencher，序列号15(anti-sense)如下(寡聚RNA部分用下划线表示)。
序列号15：5’-FAM-ATGTTGAAGGACGGATTATATCGGDABCYL-3’
为了利用上述外部引物对和杂交引物对来扩增靶核酸，首先准备含有上述外部引物对、杂交引物对的反应杂交物和酶杂交物。上述反应杂交物通过在10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)(pH 8.5)缓冲液中添加10mM硫酸铵((NH4)2SO4)、10mM MgSO4、10mM氯化钾(KCl)、1.6mM脱氧核苷三磷酸(Fermentas)、5mM二硫苏糖醇(DTT)、0.1μg牛血清白蛋白(BSA)、0.4mM精胺(spermine)、20mM海藻糖(trehalose)、0.1μM外部引物对(IDT)、1μM的杂交引物对(IDT)(在非对称等温扩增的情况下，4.4μM正向杂交引物(sense)及0.44μM反向杂交引物(anti-sense))而制备。上述酶杂交物通过添加5units Bst polymerase(NEB)、5units RNase H(Epicentre)、6units RNase inhibitor(NEB)、30nM杂交信号探针(IDT)而制备。
在常温下，向0.2ml聚合酶链式反应管添加上述反应杂交物5μl、酶杂交物5μl、不同浓度的模板DNA10μl，在61℃条件下等温扩增1.5小时。另一方面，作为阴性对照组，使用蒸馏水10ml。在扩增反应中，使用等温扩增荧光检测装备(Shinko，韩国)，将反应温度设置为61℃，设置为每分钟取得荧光信号。
其结果，如图6所示，相比于对称等温扩增方法，非对称等温扩增方法具有优秀的检测能力。
实施例4：李斯特DNA的等温扩增
作为靶DNA，使用李斯特(Listeria monocytogene)DNA组DNA。为了提取李斯特菌的DNA组DNA，在李斯特菌株(ATCC Cat.No.35152)中，使用G-spinTMDNA组DNA提取试剂盒(iNtRON Biotechnology，Cat.No.17121)，提取DNA组DNA后，实施扩增反应。提取DNA组DNA时，将菌悬浊液500μl以13,000rpm进行离心分离1分钟并去除上层液，杂交少量500μl磷酸盐缓冲液(PBS)(pH 7.2)进行离心分离并去除上层液后，添加含有RNase A，Proteinase K的G-buffer溶液300μl，并使细胞聚合体(cell pellet)悬浊，在65℃温度条件下静置15分钟。接着，添加结合缓冲液(Binding buffer)250μl并均匀杂交后，吸附柱(spin column)与DNA相结合。添加洗涤缓冲液(washing buffer)A 500ml后，在13000rpm中进行离心分离1分钟并去除，添加洗涤缓冲液(washing buffer)B 500ml并进行离心分离。1.5ml微量离心管(microcentrifuge tube)移至柱，并添加50μl的洗脱缓冲液(eleution buffer)后，离心分离1分钟，获得8.4ng/ml的DNA组DNA。将其稀释一定量并用作等温扩增反应的模板。
外部引物(序列号16及序列号17)设计成包含与Listeria monocytogenene actA基因DNA碱基序列互补的序列，序列号16(正向，sense)及序列号17(反向，anti-sense)如下。
序列号16：5’-TGCGTGCGATGATGGTAGTTTT-3’
序列号17：5’-CTTGGCTGCTCTTCTGTTTT-3’
DNA-RNA-DNA杂交引物(序列号18及序列号19)设计成，5’末端寡聚DNA-RNA部分包含有与Listeria monocytogenene actA基因DNA碱基序列非互补的序列，3’末端寡聚DNA部分包含有与Listeria monocytogenene actA基因DNA碱基序列互补的序列，序列号18(正向，sense)及序列号19(反向anti-sense)如下(寡聚RNA部分用下划线表示)。
序列号18：5’-CATCACCAACAAGAAGTAGAUUATGCATTACGATTAACCCCGAC-3’
序列号19：5’-CTGTCATTCATAGTCTCGTCUACUTCTTCCCATTCATCTGTGTTCA-3’
用于扩增信号探针的DNA-RNA-DNA杂交信号探针(序列号20)具有与借助上述的引物对而扩增的DNA互补的碱基序列，5’末端标记为FAM dye，3’末端标记为black hole quencher 1(BHQ1)，序列号20(anti-sense)如下(寡聚RNA部分用下划线表示)。
序列号20：5’-FAM-ATTTGCAGCGACAGATAGCGAAGABHQ1-3’
为了利用上述外部引物对和杂交引物对来扩增靶核酸，首先准备含有上述外部引物对、杂交引物对的反应杂交物和酶杂交物。上述反应杂交物通过在10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)(pH 8.5)缓冲液中添加10mM硫酸铵((NH4)2SO4)、12mM MgSO4、10mM氯化钾(KCl)、1.8mM脱氧核苷三磷酸(Fermentas)、6mM二硫苏糖醇(DTT)、0.1μg牛血清白蛋白(BSA)、0.8mM精胺(spermine)、0.1μM外部引物对(IDT)、1μM的杂交引物对(IDT)(在非对称等温扩增的情况下，0.01μM正向外部引物(sense)、0.1μM正向杂交引物(sense)及0.1μM反向外部引物(anti-sense)、1μM反向杂交引物(anti-sense))而制备。上述酶杂交物通过添加3units Bstpolymerase(NEB)、6units RNase H(Epicentre)、6units RNaseinhibitor(NEB)、15nM杂交信号探针(IDT)而制备。
在常温下，向0.2ml聚合酶链式反应管添加上述反应杂交物5μl、酶杂交物5μl、不同浓度的模板DNA10μl，在61℃条件下等温扩增1.5小时。另一方面，为了测定特异度的菌株使用以与李斯特菌DNA提取方法相同的方法所提取的金黄色葡萄球菌(Staphylcoccus aureus：Korean collection type culture(KCTC)1927)、沙门氏菌(Salmonella enterica；KCTC 1925)、肠炎弧菌(Vibrio parahaemolyticus；ATCC 17802)、芽孢杆菌(Bacillus cereus；ATCC 49953)、志贺氏杆菌(ShigellAflexneri；KCTC 2517)、肠出血性大肠菌(EscherichiAcoli O157:H7；ATCC 35150)DNA10ml。在扩增反应中，使用等温扩增荧光检测装备(Shinko，韩国)，将反应温度设置为61℃，设置为每分钟取得荧光信号。
其结果，如图7所示，相比于对称等温扩增方法，非对称等温扩增方法具有优秀的特异性。
实施例5：沙门氏菌DNA的等温扩增
作为靶DNA，使用沙门氏菌(SalmonellAenterica)DNA组DNA。为了提取沙门氏菌的DNA组DNA，在沙门氏菌菌株(KCTC 1925)中，使用G-spinTMDNA组DNA提取试剂盒(iNtRON Biotechnology，Cat.No.17121)，提取DNA组DNA后，实施扩增反应。提取DNA组DNA时，将菌悬浊液500μl以13,000rpm进行离心分离1分钟并去除上层液，杂交少量500μl磷酸盐缓冲液(PBS)(pH 7.2)进行离心分离并去除上层液后，添加含有RNase A，Proteinase K的G-buffer溶液300μl，并使细胞聚合体(cell pellet)悬浊，在65℃温度条件下静置15分钟。接着，添加结合缓冲液(Binding buffer)250μl并均匀杂交后，吸附柱(spin column)与DNA相结合。添加洗涤缓冲液(washing buffer)A500ml后，在13000rpm中进行离心分离1分钟并去除，添加洗涤缓冲液(washing buffer)B 500ml并进行离心分离。1.5ml微量离心管(microcentrifuge tube)移至柱，并添加50μl的洗脱缓冲液(eleution buffer)后，离心分离1分钟，获得6.7ng/ml的DNA组DNA。将其稀释一定量并用作等温扩增反应的模板。
外部引物(序列号16及序列号17)设计成包含与SalmonellAentericAinvA基因DNA碱基序列互补的序列，序列号21(正向，sense)及序列号22(反向，anti-sense)如下。
序列号21：5’-CTGATTCTGGTACTAATGGTGATGATC-3’
序列号22：5’-CTGAGGATTCTGTCAATGTAGAACGA-3’
DNA-RNA-DNA杂交引物(序列号23及序列号24)设计成，5’末端寡聚DNA-RNA部分包含有与SalmonellAentericAinvA基因DNA碱基序列非互补的序列，3’末端寡聚DNA部分包含有与SalmonellAentericAinvA基因DNA碱基序列互补的序列，序列号23(正向，sense)及序列号24(反向anti-sense)如下(寡聚RNA部分用下划线表示)。
序列号23：5’-ACCTCAGACATCCAGGAGAGTTCGTCATTCCATTACC-3’
序列号24：5’-ATCGCAGATTAGGCTCAGAGAACACCAATATCGCCAGTA-3’
用于扩增信号探针的DNA-RNA-DNA杂交信号探针(序列号20)具有与借助上述的引物对而扩增的DNA互补的碱基序列，5’末端标记为FAM dye，3’末端标记为black hole quencher 1(BHQ1)，序列号25(anti-sense)如下(寡聚RNA部分用下划线表示)。
序列号25：5’-FAM-TCAGTGCGATCAGGAAATCAACCAGATABHQ1-3’
为了利用上述外部引物对和杂交引物对来扩增靶核酸，首先准备含有上述外部引物对、杂交引物对的反应杂交物和酶杂交物。上述反应杂交物通过在10mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl)(pH 8.5)缓冲液中添加10mM硫酸铵((NH4)2SO4)、12mM MgSO4、10mM氯化钾(KCl)、1.8mM脱氧核苷三磷酸(Fermentas)、6mM二硫苏糖醇(DTT)、0.1μg牛血清白蛋白(BSA)、0.75mM精胺(spermine)、0.075μM外部引物对(IDT)、1.125μM的杂交引物对(IDT)(在非对称等温扩增的情况下，0.075μM正向外部引物(sense)、2.25μM正向杂交引物(sense)及0.075μM反向外部引物(anti-sense)、0.225μM反向杂交引物(anti-sense))而制备。上述酶杂交物通过添加3units Bst polymerase(NEB)、6units RNase H(Epicentre)、6units RNase inhibitor(NEB)、25nM杂交信号探针(IDT)而制备。
另一方面，为了测定特异度的菌株使用以与李斯特菌DNA提取方法相同的方法所提取的金黄色葡萄球菌(Staphylcoccus aureus：Korean collection type culture(KCTC)1927)、李斯特菌(Listeria monocytogenene：ATCC 5152)、肠炎弧菌(Vibrio parahaemolyticus；ATCC 17802)、芽孢杆菌(Bacillus cereus；ATCC 49953)、志贺氏杆菌(ShigellAflexneri；KCTC 2517)、肠出血性大肠菌(EscherichiAcoli O157:H7；ATCC 35150)DNA10ml。在扩增反应中，使用等温扩增荧光检测装备(Shinko，韩国)，将反应温度设置为61℃，设置为每分钟取得荧光信号。
其结果，如图8所示，相比于对称等温扩增方法，非对称等温扩增方法具有优秀的特异性。
以上，对本发明内容的特定部分进行了详细说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员而言，这种具体的说明仅仅是优选实施方式，应明确的是，本发明的范围不受此限制。因此，本发明的实质性范围应由所附的本发明要求保护范围及其等同技术方案定义。

Claims (16)

1.一种靶DNA的检测方法，其特征在于，
上述靶DNA的检测方法利用靶DNA的等温扩增方法及扩增的信号探针，
上述靶DNA的等温扩增方法包括如下步骤：
向反应杂交物添加能够置换链的DNA聚合酶、RNA分解酶后，使上述靶DNA和上述信号探针在等温下同时扩增的步骤，
上述反应杂交物包括：
(i)靶DNA；
(ii)外部引物对，具有与上述靶DNA互补的碱基序列；
(iii)DNA-RNA-DNA杂交引物对，具有上述靶DNA和3’末端DNA部分互补且上述靶DNA和5’末端DNA-RNA部分非互补的碱基序列；
(iv)引物对，在上述DNA-RNA-DNA杂交引物对的正向引物和反向引物的比例中，过量使用其中的一种而以非对称方式扩增核酸；以及
(v)DNA-RNA-DNA杂交信号探针，具有与借助上述外部引物对和杂交引物对所生成的扩增产物互补的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的靶DNA的检测方法，其特征在于，上述外部引物对为选自由寡聚DNA、寡聚RNA以及杂交寡聚RNA/DNA组成的组中的一种。
3.根据权利要求1所述的靶DNA的检测方法，其特征在于，在上述DNA-RNA-DNA杂交引物对中，5’末端DNA-RNA部分具有与靶DNA序列非互补的碱基序列，3’末端DNA部分具有与靶DNA互补的碱基序列。
4.根据权利要求1所述的靶DNA的检测方法，其特征在于，上述DNA-RNA-DNA杂交探针具有与因上述DNA-RNA-DNA引物对中过量使用的引物而被扩增的产物互补的碱基序列。
5.根据权利要求4所述的靶DNA的检测方法，其特征在于，上述正向引物和反向引物具有1:5至1:20的比例或者具有与上述比例相反的比例。
6.根据权利要求1所述的靶DNA的检测方法，其特征在于，上述DNA-RNA-DNA杂交探针具有与因上述DNA-RNA-DNA引物对中过量使用的引物而被扩增的产物互补的碱基序列。
7.根据权利要求1所述的靶DNA的检测方法，其特征在于，上述DNA聚合酶为耐热性DNA聚合酶。
8.根据权利要求7所述的靶DNA的检测方法，其特征在于，上述耐热性DNA聚合酶为选自由Bst DNA聚合酶、exo(-)vent DNA聚合酶、exo(-)Deep vent DNA聚合酶、exo(-)Pfu DNA聚合酶、BcADNA聚合酶以及phi29DNA聚合酶组成的组中的一种。
9.根据权利要求1所述的靶DNA的检测方法，其特征在于，上述RNA分解酶为RNase H。
10.根据权利要求1所述的靶DNA的检测方法，其特征在于，上述DNA-RNA-DNA杂交引物由32～66碱基组成。
11.根据权利要求10所述的靶DNA的检测方法，其特征在于，在上述DNA-RNA-DNA杂交引物中，DNA部分的长度分别由15～30碱基组成，RNA部分的长度由1～6碱基组成。
12.根据权利要求1所述的靶DNA的检测方法，其特征在于，上述DNA-RNA-DNA杂交信号探针由18～38碱基组成。
13.根据权利要求12所述的靶DNA的检测方法，其特征在于，在上述DNA-RNA-DNA杂交信号探针中，DNA部分的长度分别由8～16碱基组成，RNA部分的长度由1～6碱基组成。
14.根据权利要求1所述的靶DNA的检测方法，其特征在于，上述DNA-RNA-DNA杂交信号探针的末端以标记物质进行标记。
15.根据权利要求14所述的靶DNA的检测方法，其特征在于，上述标记物质选自由荧光物质和荧光信号抑制物质组成的组。
16.根据权利要求1所述的靶DNA的检测方法，其特征在于，上述等温扩增在30～75℃下执行。
CN201580004417.8A 2014-02-21 2015-02-02 利用核酸和信号探针的非对称等温扩增的核酸检测方法 Pending CN105960467A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2014-0020322 2014-02-21
KR1020140020322A KR101589483B1 (ko) 2014-02-21 2014-02-21 핵산과 신호 프로브의 비대칭 등온증폭을 이용한 핵산의 검출방법
PCT/KR2015/001070 WO2015126078A1 (ko) 2014-02-21 2015-02-02 핵산과 신호 프로브의 비대칭 등온증폭을 이용한 핵산의 검출방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN105960467A true CN105960467A (zh) 2016-09-21

Family

ID=53878533

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580004417.8A Pending CN105960467A (zh) 2014-02-21 2015-02-02 利用核酸和信号探针的非对称等温扩增的核酸检测方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20160348159A1 (zh)
EP (1) EP3081653A4 (zh)
JP (1) JP2017501737A (zh)
KR (1) KR101589483B1 (zh)
CN (1) CN105960467A (zh)
WO (1) WO2015126078A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110088296A (zh) * 2016-12-16 2019-08-02 姆提普力科姆公司 改进的多重和多步扩增反应及其试剂
CN112135913A (zh) * 2018-05-18 2020-12-25 株式会社百义纳理 使用等温核酸扩增对生物组织三维核酸成像诊断的方法
CN112852929A (zh) * 2021-02-08 2021-05-28 广州普世利华科技有限公司 用于检测dna的组合产品

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101901749B1 (ko) 2016-02-15 2018-09-28 주식회사 누리바이오 실시간 핵산 또는 단백질 검출용 단일핵산 및 이를 이용한 검출 방법
KR101987388B1 (ko) * 2017-10-19 2019-06-12 경상대학교산학협력단 분자비콘을 포함하는 비브리오균의 등온비색 검출용 조성물 및 이의 용도
US20220002792A1 (en) * 2018-10-29 2022-01-06 Igor V. Kutyavin Accelerated polymerase chain reaction
US20220213540A1 (en) * 2019-04-22 2022-07-07 POSTECH Research and Business Development Foundation Novel probe set for isothermal one-pot reaction, and uses thereof
CN110373452A (zh) * 2019-07-05 2019-10-25 四川省丹丹郫县豆瓣集团股份有限公司 用于郫县豆瓣的致病微生物快速筛查方法
WO2023106868A1 (ko) * 2021-12-09 2023-06-15 포항공과대학교 산학협력단 단일가닥 생성 방법 및 이를 이용한 변이 검출 방법
KR20230112886A (ko) * 2022-01-21 2023-07-28 주식회사 원드롭 시약의 색 변화 비율을 이용하여 감염 여부 판단하는 검사기기 및 방법
US20230366038A1 (en) * 2022-05-16 2023-11-16 Bioo Scientific Corporation Compositions and methods relating to loop mediated isothermal amplification (lamp)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030049629A1 (en) * 1999-04-12 2003-03-13 Edman Carl F. Multiplex amplification and separation of nucleic acid sequences on a bioelectronic microchip using asymmetric structures
EP1167524B1 (en) * 1999-03-19 2007-05-16 Takara Bio Inc. Method for amplifying a nucleic acid sequence employing a chimeric primer
WO2007130808A2 (en) * 2006-03-20 2007-11-15 Texas Instruments Incorporated A pre-coder selection based on resource block grouping
US20100311058A1 (en) * 2007-12-03 2010-12-09 Raplegene Inc. Method for detecting nucleic acids by simultaneous isothermal amplification of nucleic acids and signal probe

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5066584A (en) * 1988-09-23 1991-11-19 Cetus Corporation Methods for generating single stranded dna by the polymerase chain reaction
JP3883476B2 (ja) * 1999-03-19 2007-02-21 タカラバイオ株式会社 核酸配列の増幅方法
US6951722B2 (en) * 1999-03-19 2005-10-04 Takara Bio Inc. Method for amplifying nucleic acid sequence
US7601497B2 (en) * 2000-06-15 2009-10-13 Qiagen Gaithersburg, Inc. Detection of nucleic acids by target-specific hybrid capture method
CA2443999A1 (en) * 2001-04-16 2002-10-24 Applera Corporation Methods and compositions for nucleotide analysis
KR100816419B1 (ko) * 2005-10-14 2008-03-27 래플진(주) 핵산의 등온증폭 방법 및 핵산과 신호 프로브의 동시등온증폭을 이용한 핵산의 검출방법
WO2007120808A2 (en) * 2006-04-14 2007-10-25 Biohelix Corporation A method of asymmetric helicase-dependent amplification for probe-based detection of targets
BRPI0909063A2 (pt) * 2008-03-10 2015-08-25 Quantibact As Amplificação de alvo e sequenciamento com iniciadores compreendendo unidades monoméricas de formação de tripla.
CN101736078A (zh) * 2008-11-05 2010-06-16 上海复星医药（集团）股份有限公司 一种核酸等温扩增检测结核分枝杆菌活菌的方法及试剂盒

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1167524B1 (en) * 1999-03-19 2007-05-16 Takara Bio Inc. Method for amplifying a nucleic acid sequence employing a chimeric primer
US20030049629A1 (en) * 1999-04-12 2003-03-13 Edman Carl F. Multiplex amplification and separation of nucleic acid sequences on a bioelectronic microchip using asymmetric structures
WO2007130808A2 (en) * 2006-03-20 2007-11-15 Texas Instruments Incorporated A pre-coder selection based on resource block grouping
US20100311058A1 (en) * 2007-12-03 2010-12-09 Raplegene Inc. Method for detecting nucleic acids by simultaneous isothermal amplification of nucleic acids and signal probe

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PODDAR, S.K.: "Symmetric vs asymmetric PCR and molecular beacon probe in the detection of a target gene of adenovirus.", 《MOLECULAR AND CELLULAR PROBES》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110088296A (zh) * 2016-12-16 2019-08-02 姆提普力科姆公司 改进的多重和多步扩增反应及其试剂
US11578357B2 (en) 2016-12-16 2023-02-14 Agilent Technologies, Inc. Modified multiplex and multistep amplification reactions and reagents therefor
CN110088296B (zh) * 2016-12-16 2023-05-30 安捷伦科技有限公司 改进的多重和多步扩增反应及其试剂
CN112135913A (zh) * 2018-05-18 2020-12-25 株式会社百义纳理 使用等温核酸扩增对生物组织三维核酸成像诊断的方法
CN112852929A (zh) * 2021-02-08 2021-05-28 广州普世利华科技有限公司 用于检测dna的组合产品

Also Published As

Publication number Publication date
WO2015126078A1 (ko) 2015-08-27
US20160348159A1 (en) 2016-12-01
KR101589483B1 (ko) 2016-01-28
EP3081653A1 (en) 2016-10-19
EP3081653A4 (en) 2017-06-28
JP2017501737A (ja) 2017-01-19
KR20150098928A (ko) 2015-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105960467A (zh) 利用核酸和信号探针的非对称等温扩增的核酸检测方法
EP0395292B1 (en) Generation of specific probes for target nucleotide sequences
EP2218780B1 (en) Nucleic acid amplification method, and reagent and reagent kit for use in the method
JP2010532665A (ja) 細菌性および真菌性敗血症の病原菌の高感度な増幅および検出用の核酸配列およびその組合せ
CN107012205A (zh) 使用切口酶的解旋酶依赖性等温扩增
US11479826B2 (en) Nucleic acids and methods for the detection of Enterobacter sakazakii (Cronobacter spp.)
KR101712451B1 (ko) 디지털 pcr을 이용한 식중독균의 검출 방법
CN105755134B (zh) 一种内切酶介导的实时多交叉置换核酸扩增技术及应用
CN109863252A (zh) 用于检测或定量丙型肝炎病毒的组合物和方法
KR101282924B1 (ko) 살모넬라의 동시 검출을 위한 ｐｃｒ 프라이머
JP6569238B2 (ja) ノロウイルスｇｉｉ群の検出方法
US7105319B2 (en) Oligonucleotides for detecting tubercle bacillus and method therefor
Aslan et al. Nucleic Acid–Based Methods in the Detection of Foodborne Pathogens
EP3985131A1 (en) Compositions and methods for detecting zika virus nucleic acid
JP2017521083A (ja) リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）を検出するための配列およびこの配列の使用
JP5110423B2 (ja) 微生物の識別方法、及び該方法に使用するプライマー並びに識別キット
Xu et al. Detecting Targets Without Thermal Cycling in Food: Isothermal Amplification and Hybridization
KR20240058019A (ko) 대장균의 O127, O128ac 또는 O86 혈청형 신속 동정용 프라이머 세트 및 이를 이용한 대장균의 혈청형 동정 방법
KR20240058020A (ko) 대장균의 o146 또는 o51 혈청형 신속 동정용 프라이머 세트 및 이를 이용한 대장균의 혈청형 동정 방법
KR20240058022A (ko) 대장균의 o105, o10, o119, o132, o150, o35, o25, o36, o177, o26 또는 o2 혈청형 신속 동정용 프라이머 세트 및 이를 이용한 대장균의 혈청형 동정 방법
KR20240058024A (ko) 대장균의 o115 혈청형 신속 동정용 프라이머 세트 및 이를 이용한 대장균의 혈청형 동정 방법
JP2017538434A (ja) 強毒型クロストリジウムディフィシル株の存在を検出するための方法
KR20240058025A (ko) 대장균의 o110, o113, o167 또는 o116 혈청형 신속 동정용 프라이머 세트 및 이를 이용한 대장균의 혈청형 동정 방법
KR20240058023A (ko) 대장균의 O104, O124, O55, O157, O128ab, O76, O185, O130, O81, O11 또는 O153 혈청형 신속 동정용 프라이머 세트 및 이를 이용한 대장균의 혈청형 동정 방법
KR20150022132A (ko) 감자t바이러스 진단용 프라이머 세트 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20160921