JP2001501454A - プライマーに制御された増幅産物の蛍光検出による標的細菌の同定 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、食品のような複合体マトリックスから単離され、かつ標的の存在について濃縮されている試料からの標的細菌の同定のための方法を記述する。本方法は、拾いあげの後に、そして更なる処理を必要としないで細胞からのＤＮＡをプライマーで制御された増幅に供せるように試料から培養したコロニーを拾いあげる方法を利用する。増幅産物は介入させた蛍光染料の検出に基づいて検出される。増幅産物から産生された蛍光シグナルはバックグラウンドと比較して容易に識別される。

Description

【発明の詳細な説明】 プライマーに制御された増幅産物の蛍光検出による標的細菌の同定 発明の分野 本発明は、微生物学および分子生物学の分野、および特には食品のような複合 体からの血清型レベルでの細菌の検出のための方法に関する。 発明の背景 細菌汚染を伴う食品は、先進国ならびに発展途上国における顕著な健康被害で ある。例えば、２００〜３００万症例のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）食 中毒が米国では毎年発生しているものと推定される。この疾患の急性症状には悪 心、嘔吐、下痢、悪寒、発熱、および極度疲労がある。米国では毎年約２，００ ０〜３，０００（０．１％）人がサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）中毒で亡 くなっており、この犠牲者には通常乳児、病人、および高齢者が含まれる。 鶏肉、赤身、魚介類、卵、およびこれらの製品を含むいずれかの食品は特に細 菌性病原体を保持する可能性が高い。食品関係の微生物学者に突き付けられた難 題は、多数の多様な別の細菌を含むことが往々にしてある食品製品から少数のこ れら選択された病原体の回収および同定を可能にすることである。 微生物の検出および同定の通常の技術は、ある一定の特異的栄養素を代謝する 能力もしくはその生物が生物特異的抗体に結合する能力のような、その生物の現 象学的もしくは表現型の特徴に基づく。このような方法は本質的にはそれらの方 法の可能性という点では制約を受けており、なぜなら、（ａ）異なる生物は異な る成長用および同定用技術を必要とするであろうし；（ｂ）多数の異なる生物の 詳細な特徴決定に必要とさ れる方法の数は必然的に収拾不可能なくらい多くなるであろうし；そして（ｃ） ある生物が単離された場合の成長の経歴および環境が表現型上での動向に影響を 及ぼすことがあるためである。 今日の微生物学的検査の大半は、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌ ｙｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（ＢＡＭ）の方法に従う通常の培養技術を用いて行 われている。これらは多数の段階を必要とし、かつ特定の生物についての確定的 な結果を得るのに最高１４日を必要とする手作業による方法である。 培養に基づく検査は、食品試料を非特異的成長培地中に均一化し、そしてそれ を２４時間インキュベートすることから始まる。この非特異的培地はその試料中 に存在する全ての微生物の成長を促進し、かつ損傷を被った生物の回復を容易に する。次の段階は選択的増殖であり、この段階は非選択的ブロスの試料の、特異 的標的生物のために特別にあつらえた選択培地への転移を必要とする。これらの 試料をさらに２４〜４８時間インキュベートする。この選択培地は「バックグラ ウンド」となる生物の成長を抑制もしくは除去さえしながらも標的病原体の成長 を支援する作用物質を含む。最終成長段階では、その選択培地の内の幾つかの試 料をその後、幾つかの固形で、選択的、かつ鑑別用培地（アガー）上に画線する 。これらのアガー培地は更にバックグラウンド生物の成長を抑制しながらも標的 病原体の成長を支援してそれらを単離し分化したコロニーへと成長させる。 特定されたインキュベーション期間の後、プレートを通常は標的細菌の成長の 証拠として読み取らせる。プレート培養したコロニーの分析は一般的には時間が かかり、かつ当て推量を必要とすることもよくある。 もしそのプレートが、適切な形態学的特徴を有する明らかに特定されるコロニー を含む場合には、被疑物の確認という意味での同定および特徴決定のために一連 の生化学的および／または血清学的検査を行う必要がある。特異的成長用プレー ト上のコロニーが明白には特定されない場合には、再度画線段階を行う必要があ るかも知れない。特定されたインキュベーション期間の間にコロニーが全く観察 されない場合には、その食品試料はその特異的病原体については陰性と見なされ る。 プレート培養したコロニーの分析を必要とする培養法に伴う問題点は多数あり 、そしてそれは：初歩レベルの情報、整合性のとれない結果、標的生物に対して 独特な方法および試薬数の拡大、長い所要時間、労力を要するプロトコール、な らびにオペレーターの技術への依存を含む。 成長に依存せず、生物工学を基にする技術は、成長に基づく方法の際の時間の かかるコロニー分析に対する有望な解決策を提供する。これらの、成長に基づか ない技術は迅速方法と称されており、産物の品質保証を一層確実なものとし、よ り優れた高処理作業への移行を可能とさせ、かつ食品製造業者と検査室との両方 についての経費節約を伴う迅速な検査結果を提供する目的で引き続き改良が加え られている。 ２つの別の検査法である、免疫アッセイおよび核酸プローブがどんどん使われ るようになってきている。別の新しく進出してきた技術は、アデノシン三リン酸 （ＡＴＰ）生物発光、コンダクタンスおよびインピーダンス法、フローサイトメ トリー、バイオセンサー、ならびにＤＮＡ増幅である。 最も一般的な免疫学的方法は、病原体特異的抗原の検出のための抗体に連結さ せた酵素レポーターの内の幾つかの形態を必要とする。免疫反 応では抗体は反応用培地上もしくは培地中で標的微生物上の抗原に結合し、その ことにより抗体／抗原複合体を形成するであろう。その後に抗原を、ある「共役 複合体」すなわちその抗体／抗原複合体に結合する、酵素でラベル化させた第二 の抗体の添加により「サンドイッチ」を形成させて検出する。分離もしくは洗浄 段階の後には酵素濃度を、基質溶液を添加し、そして得られるシグナルを肉眼も しくは分光光度分析のいずれかにより測定することにより測定する。特定の閾値 を上回る計測値は陽性結果を示す。酵素免疫定量法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅ ｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）（ＥＬＩＳＡ）および酵素免疫 蛍光法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ａｓｓａｙ） （ＥＬＦＡ）が典型的である。 核酸（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）プローブも、例えばサルモネラ（Ｓａ ｌｍｏｎｅｌｌａ ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、および大腸菌（Ｅ．ｃ ｏｌｉ ）のような特定の病原体の検出には有用である。これらのアッセイはリボ ソームＲＮＡを検出するための比色法用の （ｃａｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）フォ ーマットを用いる（ＤＮＡが単一コピーであるのとは対照的に何千ものＲＮＡの コピーが各細胞内に存在する）。従って標的としてのＲＮＡの使用によりアッセ イの感受性が上昇する。免疫アッセイの場合と同様に濃縮段階は依然として必要 である。ある生物に特異的なＲＮＡプローブはその標的ＲＮＡを細胞から放出さ せるための溶解用試薬で処理してある濃縮させた試料と反応させる。その標的Ｒ ＮＡの近接領域にハイブリダイズする２本の異なるプローブ（検出用プローブ（ ｄｅｔｅｃｔｏｒ ｐｒｏｂｅ）および捕捉用プローブ（ｃａｐｔｕｒｅ ｐｒ ｏｂｅ））が用いられる。検出用プローブは蛍 光ラベル（フルオロセイン（ｆｌｕｏｒｏｃｅｉｎ））を有する一方で捕捉用プ ローブはチミジンヌクレオチドからなる「テイル」（「ポリｄＴ」）を有する。 この２本のプローブを標的ＲＮＡとハイブリダイズさせる。その後、ハイブリダ イゼーション複合体全体を、ポリｄＡ分子（この分子は捕捉用プローブ上のポリ ｄＴテイルに対して相補的である）でコーティングしてあるプラスティック製の 計量棒上に捕捉する。洗浄段階の後、酵素でラベルしてある抗−フルオロセイン 抗体を添加する。基質の添加により分光光度計において検出することができる色 変化が生じる。全アッセイ段階は多くの点でＥＬＩＳＡに類似するが、追加的段 階が必要とされる。 プローブアッセイは免疫アッセイよりも一層複雑かつ高価であり、一層多くの プロトコール段階と共に十分な設備の整った研究室を必要とする。両タイプのア ッセイ共時間がかかり複雑な上、実施するためには一連の試薬を必要とする。よ り簡潔で、より迅速な方法が必要とされる。 免疫学的およびプローブ技術とは対照的に、血清型特異的ＤＮＡもしくはＲＮ Ａの増幅を必要とする遺伝子的同定方法により、いずれかの微生物の同定のため に同一の基本的アプローチを広汎に適応することができるという標準化された方 法という見込みがでてくる。従って、いずれかの特異標的微生物の存在もしくは 非存在は原理的には、適切な遺伝子マーカーの存在もしくは非存在を立証するこ とにより属、種、もしくは亜種レベルで容易に確認することができる。 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による細菌ゲノムの特異的部分の増幅に基づ く食品汚染細菌を同定する方法が当該技術分野で知られている。例えば、Ｍａｈ ｅｒら（Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｐｒｏｂｅｓ （１９ ９５）、９（４）、２６５−７６）は種特異的プライマーセットで作成したＰＣ Ｒ産物を蛍光的に検出することによるリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）のような 病原性細菌の同定のための方法を教示している。同様にＹｕｅら（米国特許第５ ，３２１，１３０号）、Ｈｉｇｕｃｈｉ Ｒ．Ｇ．（カナダ特許第２０６７９０ ９号）、およびＳｕｔｈｅｒｌａｎｄら（米国特許第５，５６３，０３７号）は 全て血清型特異的産物の検出のためのシアニン染料のＰＣＲ増幅産物内への取り 込みを用いる細菌検出法を開示している。Ｂａｓｓｌｅｒら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖ ｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９５）、６１（１０）、３７２４−８） は、標的の増幅をモニターするための、内部蛍光原性（ｆｌｏｕｏｒｇｅｎｉｃ ）プローブの加水分解に依存するリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）検出法を教示 している。これらのような方法は高度に特異的でありかつ感受性はよいが、標的 ＤＮＡのクリーンな試料を必要とする。食品試料の分析にこれらの方法を適用す るなら、混入性非特異的ＤＮＡ（これは高いバックグラウンド蛍光をもたらすで あろう）およびＰＣＲ反応を阻害するであろう他の物質を含まない試料を産生す るために先に記載される手間のかかる増殖方法の内の多くのものが必要となるで あろう。 食品から単離された細菌からの標的ＤＮＡの蛍光に基づくＰＣＲ増幅に関連す る困難性にもかかわらず、幾つかの方法が開発されている。例えば、Ｃａｎｏら （Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９３）、７５（３）、２４７−５ ３）は、牛乳試料からの標的ＤＮＡを増幅するためにＬ．モノサイトゲネス（Ｌ ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）とサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）とに特 異的なプライマー対を用いており、ここでは増幅産物は臭化エチジウムで標識さ れていた。 同定は、固定化されたフルオレセン標識化プローブに対するハイブリダイゼーシ ョンに基づいて行われた。Ｃａｎｏら（Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔ．（１９９５） 、５８（６）、６１４−２０）は更に、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）特異的 標的ＤＮＡの増幅にのみに独占的に依存する、食品からのリステリア（Ｌｉｓｔ ｅｒｉａ ）の検出のためのマイクロウエルアッセイをも教示している。Ｃａｎｏ らの方法は濃縮されたコロニーからの標的細菌の選択は教示しておらず、かつ増 幅前には徹底的なＤＮＡ単離および精製を必要とする。 ＣａｎｏらのＰＣＲに基づく方法は食品マトリックスから食品汚染病原体を検 出することは可能であるものの、それらの方法は依然としてハイブリダイゼーシ ョン段階もしくは徹底的な精製のいずれか、および蛍光標識された増幅産物を検 出する目的での標的の増幅に続くゲノムＤＮＡの単離を必要とする。このような 段階がそのアッセイの複雑さを増大させ、そして幾つかの事例では蛍光的に標識 化された適切なハイブリダイゼーションプローブを予め作成および固定化してお くことが必要となる。 従って克服すべき問題は、コロニー分析のための増殖に基づきかつ免疫学的な 方法に基づく同定方法にまつわる厄介な作業がなく、その上プライマー特異的増 幅技術の利益を極大化させる、病原性細菌の同定のための方法を開発することで ある。出願人は記載される問題を、食品試料から単離される標的および非標的細 菌のコロニーを拾いあげ、そして標的特異的増幅産物の作成および蛍光検出のた めのプライマー特異的増幅技術に直接供しうる方法を開発することにより解決し た。 発明の要約 本発明は、試料分析物（ａｎａｌｙｓａｔｅ）であって標的細菌を含む疑いが ありかつ少なくとも一つのコロニーを産生するように培養されている分析物中の 標的細菌を同定するための方法を提供する。この方法は：（ｉ）個別の毛細管に より、ある細菌コロニーの少なくとも一部分を拾いあげる段階；（ｉｉ）段階（ ｉ）のコロニーを含む細胞を適切な分散用緩衝液中に分散させる段階；（ｉｉｉ ）段階（ｉｉ）の分散させた細胞を、その分散させた細胞を有効量の溶解用緩衝 液に接触させて溶解することで、その分散させた細胞内に含まれるＤＮＡを放出 させる段階；（ｉｖ）段階（ｉｉｉ）で放出されたＤＮＡを標的ＤＮＡの増幅に 有用な増幅用プライマーを含む核酸増幅用組成物と接触させることにより増幅反 応混合物を作成する段階；（ｖ）増幅産物混合物を産生するため段階（ｉｉｉ） の放出されたＤＮＡについてプライマーで制御された増幅を行う段階：ならびに 、（ｖｉ）その増幅産物混合物を標的増幅産物の存在について分析する段階であ って、その際その標的増幅産物はインターカレーティング剤を含むものであり、 そのインターカレーティング剤は段階（ＶＩ）の以前のいずれかの時点で添加さ れる、からなる。 図面の簡単な説明 図１は、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の分析の結果のヒストグラムお よび蛍光ＰＣＲアッセイにおけるバックグラウンド細菌である。このアッセイは 、標識化されたサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）特異的増幅産物の閾蛍光値 を決定する目的で、インターカレーティング用染料ＹＯ−ＰＲＯ−１（商標）の 存在下で行った。 発明の詳細な記述 以下の用語は請求の範囲および明細書の解釈ために用いてよい。 用語「標的核酸」もしくは「標的ＤＮＡ」は、本検出法により検出される核酸 断片を意味し、かつ標的細菌の存在を示す。この標的ＤＮＡは典型的には標的細 菌ゲノムの非反復部分であり、そして具体的には他の全ての細菌から標的細菌を 識別する。 用語「増幅用プライマー」もしくは単に「プライマー」は、標的核酸の内の一 本の鎖に沿った少なくとも一つの区分に対して相補的な核酸断片もしくは配列を 意味し、ここでこのプライマーの目的はその鎖に沿う標的核酸の一部分の核酸の 複製を確実なものとしかつ指令することである。プライマーは、ある標的配列の 特異的セグメントに対して相捕的となるように設計することができる。ＰＣＲで は例えば、各プライマーは別のプライマーと組み合わせることで「プライマーセ ット」もしくは「プライマー対」を形成させて用いられ；この対は増幅予定の標 的化された配列をフランクする。用語「プライマー」はそれ自体、本出願人によ っては一般的に、核酸複製過程を開始するように機能するいずれかの配列結合性 オリゴヌクレオチドを包含するように用いられる。 用語「増幅産物」は、いずれかのプライマーで制御された増幅反応により作成 された特異的ＤＮＡ断片を意味する。用語「標的増幅産物」もしくは「増幅され た標的」は、プライマーで制御された増幅により同定および定量される予定の特 異的標的核酸から作成される二本鎖ＤＮＡ（「ｄｓＤＮＡ」）を意味する。標的 増幅産物はいずれかのプライマーで制御された増幅法により製造されうる。更に は、適切な標的増幅産物を調製する全ての方法は、プライマー−二量体断片（ｐ ｒｉｍｅｒ−ｄｉｍｅｒ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）および三重らせんなどのような 偽の非標的増幅アーティファクトを排除するように十分に制御されるものと理解 されている。標的増幅産物は一般的にはｄｓＤＮＡであろうし、かつインターカ レーティング剤による結合を受けやすいであろう。 用語「プライマーで制御された増幅」は、増幅過程を開始させるために特異的核 酸（一つもしくは複数）の認識を用いることで核酸分子の増幅をもたらす当該技 術分野に知られる多数の方法の内のいずれかを意味する。本出願人は、増幅は、 限定されるものでないがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）もしくはリガーゼ連鎖 反応（ＬＣＲ）、および鎖置換（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）増 幅を含む当該技術分野において知られる数々のスキームの内のいずれかにより達 成されてもよいことを企図している。 用語「核酸増幅組成物」は、核酸増幅を行うために必要な成分を含む組成物を意 味する。核酸増幅組成物は、液体混合物ならびに錠剤化された試薬を初めとする 多種多様の形態で提供されてよい。もしＰＣＲ法が選択されるなら、その増幅組 成物は例えばヌクレオチド三リン酸、適切な配列を有する２本のプライマー、Ｄ ＮＡポリメラーゼ、適切な緩衝液、および蛋白質を含むであろう。 用語「標的細菌」は、標的ＤＮＡが増幅されてくる細菌を意味する。標的細菌 は特定された混合培養物のメンバーであるか、もしくは複合体マトリックス（ｃ ｏｍｐｌｅｘ ｍａｔｒｉｃｅｓ）内の混入物として存在してよい。特に目的の 標的細菌は食品汚染病原体である。 用語「非標的細菌」は用語「バックグラウンド細菌」と互換的に用いられるで あろうし、そして標的細菌の存在下には見いだされるが標的細菌ではないいずれ かの細菌を意味するであろう。非標的細菌は遺伝子的もしくは生化学的に標的細 菌に関連しないこともある。本出願に関連し もっとも大きな目的であるこれらの非標的細菌は非病原性食品汚染細菌である。 用語「拾いあげる」は、細菌コロニーの具体的な部分を取り出す過程を意味す る。本明細書に開示されるように、本方法は特異的かつ均一な数の細菌細胞が拾 いあげられ、そのことにより偽の非特異的な結果を最小限に押さえながらも本方 法の再現性をもたらす手法を提供する。 用語「分散用緩衝液」は、細胞を未処理のままに維持する緩衝液を意味し、か つ細菌コロニーから個々の細胞を分散させるのに有用である。緩衝食塩水のよう な等張緩衝液は特に適切である。 用語「溶解用緩衝液」は本明細書に用いられる際には細菌細胞を溶解し、そし て細胞性ＤＮＡを放出させる際の使用に適するいずれかの水溶液を意味する。 用語「増幅反応混合物」は、標的ＤＮＡのプライマーで制御された増幅を行う のに必要な試薬および細胞性物質の全てのものの混合物を意味する。典型的には この増幅反応混合物は、細胞性ＤＮＡを含む溶解用緩衝液と核酸増幅用組成物と の混合から生じる。 用語「増幅産物混合物」は、プライマーで制御された増幅を増幅反応混合物に より行った後に形成される混合物を意味する。もし標的ＤＮＡがこの増幅反応混 合物内に存在すれば、その増幅産物混合物は増幅産物を含むであろう。 用語「インターカレーティング剤」は、核酸分子内に挿入することができる温 度感受性蛍光剤を意味する。用語「インターカレーティング剤」は用語「染料」 と互換的に用いられるであろう。インターカレーティング剤は核酸内に挿入する 際には蛍光を発するであろうし、そして挿入さ れない場合にはいずれかのシグナルは発生しないであろう。典型的なインターカ レーティング剤はＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ．Ｉｎｃ．社（Ｅｕｇｅｎ ｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）から入手することができるＹＯ−ＰＲＯ−１（商標）のよう な非対称（ｕｎｓｙｍｅｔｒｉｃａｌ）シアニン染料である。 用語「閾蛍光値」は、それを上回れば染料でラベル化させた標的増幅産物の存 在が確認される蛍光レベルである。閾蛍光値は、標的および非標的細菌の両方に ついて行われる複数回のプライマー特異的増幅反応の分析により経験的に決定さ れる。 用語「マトリックス」もしくは「複合体マトリックス」は、多種多様の微生物 の成長を支援するであろういずれかの有機物もしくは無機物を意味するであろう 。本発明のマトリックスは自然界においては複合体であろうし、そして多種多様 の異なった有機成長支援用物質からなるであろう。典型的なマトリックスは食品 、生体組織、および有機廃棄産物などを含む。 用語「事前濃縮成長」もしくは「事前濃縮培養」は、ある複合体マトリックス から単離された標的および非標的細菌の、試料採取過程により損傷を被るもしく は弱体化されている両種類の細菌を蘇生させるために設計された培地中での成長 を意味する。「事前濃縮用培地」は、標的細菌およびバックグラウンド細菌の両 方の成長を助長するように設計された液体もしくは固形のいずれかの培地を意味 するであろう。本発明の事前濃縮培地は、多種多様の異なる食品マトリックスの ｐＨの変動を考慮して緩衝化される。 用語「選択的成長」もしくは「選択的濃縮培養」は、選択培地での事 前濃縮培養から単離された標的細菌および非標的細菌の成長を意味する。この選 択培地は混入性バックグラウンドもしくは非標的細菌を上回って標的細菌の成長 を特異的に助長するように設計されている。「選択的成長培地」は、標的細菌の 成長を助長し、かつバックグラウンド細菌の成長を妨害するように特異的に製剤 された固形もしくは液体のいずれかの成長用培地を意味するであろう。選択培地 は、選択的成長を確実なものにするために標的細菌の特異的栄養素要件および所 定の選択的作用物質に対する耐性を利用している。 用語「試料分析物」は、選択的濃縮培養から得られる細菌の試料を意味する。有用性の記述 本発明は、汚染食品マトリックスおよび非標的細菌の存在下での標的生物、特 に細菌の検出を可能にする。この方法は食品の調製、農業および家畜産業におけ る病原性細菌の検出に特に有効であり、かつまた医学的および獣医学的診断への 適用法を有する。 本発明は、（ｉ）連続的事前濃縮および選択的培養からなる標的濃縮、および それに続く（ｉｉ）コロニーの拾いあげ、（ｉｉｉ）細胞溶解、ならびに最後に （ｉｖ）標的ＤＮＡの増幅、により複合体マトリックスからの標的細菌の検出の ための過程を特定する。増幅産物は標的増幅産物に結合したインターカレーティ ング剤により作成されるシグナルにより検出される。標的濃縮 食品汚染細菌性病原体の検出のための最低産業基準は、２５ｇの食品マトリッ クス中に一つの病原体の存在を信頼性をもって検出するであろ う方法である。この厳重な検査に適合させる目的で、標的病原体細胞の検出を容 易にさせるための標的病原体細胞の成長を促進させるための濃縮方法および培地 が開発されている。 典型的には少なくとも２つの濃縮段階が好ましい。第一段階は「事前濃縮段階 」で、ここでは食品試料は、損傷を受けた標的細胞を安定な状態にまで回復させ るためおよび成長を促進させるために栄養素に満ちた非選択的ブイヨン培地内に 濃縮する。次に事前濃縮ブイヨンの試料を選択的濃縮ブイヨンに添加するが、こ こではこの試料は選択的試料を含む成長促進用培地中で更に濃縮される。選択的 濃縮ブイヨンにより標的細菌の継続的増加が可能となる一方で、他のバックグラ ウンド非標的細菌の大半のものの増殖が同時に制限される。サルモネラ（Ｓａｌ ｍｏｎｅｌｌａ ）の選択的濃縮に有用な選択的培地の例はテトラチオネートブイ ヨンおよびセレン酸システインブイヨンである。培地は実質的にはいずれかの既 知の標的細菌について特定されてよく、例えば、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａ ｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ 、８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｓｓｏ ｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉ ｓｔｓ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＶＡ（１９９５）、上述、を参照されたい。 標的濃縮のための先の方法は典型的であるが、それが唯一の可能な方法を示す こと、そして特定された標的細菌の選択的濃縮のための他の方法はその特異的標 的の独特な要件に依存するであろうし、それら全ての方法は、上述されているＢ ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌにおいて 与えられる標準的プロとコールとの組み合わせて当業者にはよく知られている、 ということが評価されるで あろう。コロニーの作成 標的細胞濃縮の後には選択的培養物の試料をコロニー作成用の固形培地上でプ レート培養する。固形培地はバックグラウンドもしくは非標的種の成長を阻害す る一方で標的細胞の成長を更に強化するように選択される。多種多様の培地が当 該技術分野では知られている。例えば、バックグラウンド細菌よりもサルモネラ （Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の選択に特に適する培地はデオキシコール酸キシロー スリシン（ｘｙｌｏｓｅｌｙｓｉｎｅ ｄｅｓｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）（ＸＬＤ ）、亜硫酸ビスマス（ＢＳ）、およびヘクトン腸（Ｈｅｋｔｏｎ ｅｎｔｅｒｉ ｃ）（ＨＥ）アガーを含む。 細菌のプレート培養の方法は一般的であり、かつ当該技術分野ではよく知られ ており、そして多種多様の適切な固形培地が市販品としてそして公的機関で入手 可能である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ ｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉ ｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｅｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅ ｓｓ（１９８９）；Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ 、６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｆ ｆｉｃｉａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ 、ＶＡ（１９８４）、を参照されたい）。コロニーの拾いあげ 固形培地上で成長させたコロニーを拾いあげ、溶解し、そして標的ＤＮＡのプ ライマーで制御された増幅のためのプロトコールに供する。コ ロニーを拾いあげる方法は本発明の主要な要素である。 本発明は、至適数の細胞がプライマーで制御された増幅プロトコールに供され ることを考慮している。細胞数が多いと過剰な蛍光バックグラウンド、およびＤ ＮＡ増幅を阻害することが知られている物質の導入がもたらされる。細胞数が少 ないと標的ＤＮＡの不十分な増幅がもたらされる。 コロニーは５μＬの毛細管を用いて拾いあげた。０．０２６インチと０．０９ ６５インチとの間の外径（「Ｏ．Ｄ．」）を有する毛細管が本発明では好ましく 、そして約０．０３７５インチのＯ．Ｄ．が最も好ましい。本明細書に記載され る実験用に選択される特別な毛細管は長さ約１．２６インチの５μＬ Ｍｉｃｒ ｏｃａｐ毛細管（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ．、Ｂｒｏｏ ｍａｌｌ、ＰＡ）であった。この装置でコロニーを拾いあげることにより１×１ ０⁶と２×１０⁷との間の細胞が溶解用緩衝液中に送られた。 これらの毛細管の他のデザインの態様により有用性が付加される。長さおよび 直径の両方ともが小さなサイズであれば、ボルテックスミキサーでの震盪による 回収細胞の再懸濁のためには一本の試験管内に少なくとも１２本の毛細管を入れ ることができる。これは、個別の試料を取り扱う手作業による方法とは異なり、 複数の試料の迅速な処理および細胞を再懸濁させる際の再現性が一層大きくなる ことを考慮している。それに加え、この拾いあげ過程により、必要とされる数の 細胞を送り込むために生化学アッセイの際に一般的に用いられる光学密度測定の ような定量法の必要が除去される。また、毛細管の直径は、あるコロニーが必要 数の細胞を生じるのに十分に大きいかどうかを決定する際に用いられる ゲージとして作用する。最終的にはガラスの不活性な特性が、拾いあげ用装置か らＰＣＲ阻害性化学物質が放出しないよう防御することとなる。標的ＤＮＡのプライマーで制御された増幅 標的ＤＮＡは、ある特定の生物に独特であるか、またはある特異的な遺伝子的 特性を特定している二本鎖核酸断片の存在を識別するための価値を有するいずれ かの資源からのものであってよい。本発明のある態様では標的ＤＮＡを増幅して 、食品を汚染することが知られている病原性細菌生物から標的増幅産物を製造す る。以下の属、すなわち：リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、サルモネラ（Ｓａ ｌｍｏｎｅｌｌａ ）、クロストリディウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、および エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）のメンバーのような生物から単離され たＤＮＡが特別な目的となるであろう。 本出願人は、増幅は限定される訳ではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、もしくは鎖置換増幅（ＳＤＡ）を含む、当該 技術分野に知られる幾つかのスキームの内のどれにより達成されてもよいことを 企図している。もしＰＣＲ法が選択されれば、この増幅組成物は例えばヌクレオ チド三リン酸、適切な配列を有する２本のプライマー、適切な緩衝液、ＤＮＡポ リメラーゼ、および蛋白質を含むであろう。これらの試薬、ならびに核酸を増幅 させる際のそれらの使用についての詳細を記載している手順は、米国特許第４， ６８３，２０２号および米国特許第４，６８３，１９５号に提供されている。Ｌ ＣＲ法が選択されれば、その核酸増幅組成物は例えば、一例ではＴ．アクアティ クス（Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）リガーゼのような熱安定性リガ ーゼ、２セットの近接するオリゴヌクレオチド（ここでは各セットの内の一つの メンバーは各標的鎖に相捕的である）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液、ＫＣｌ、ＥＤ ＴＡ、ＮＤＡ、ジチオスレイトール、およびサケ精子ＤＮＡを含むであろう（例 えば、Ｔａｂｏｒ．ＳおよびＲｉｃｈａｒｄｓｏｎ．Ｃ．Ｃ．（１９８５）Ｐｒ ｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８２、１０７４−１０７８、を参照されたい ）。ＳＤＡ法が利用されれば、増幅は、ＨｉｎｃＩＩ消化のための一つの部位を 含む一本もしくは二本の内のいずれかの短いプライマー、エキソヌクレアーゼを 欠失するＤＮＡポリメラーゼ、ＨｉｎｃＩＩ制限酵素、ならびに塩基ｄＧＴＰ、 ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、およびデオキシアデノシン ５’［ａ−チオ］三リン酸（ ＡＴＰ［ａＳ］）を用いて達成されてよい。必要な材料を含むＳＤＡプロトコー ルはＷａｌｋｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９、 ３９２、（１９９２）、に概要が記載されている。 適切な標的増幅産物を調製する全ての方法は、プライマー−二量体断片、およ び三重らせんなどのような偽の非特異的増幅アーティファクトを除去するように 十分に制御されることを特筆すべきある。 標的増幅に必要な試薬は、溶液もしくは錠剤化されたかのいずれかの形態で本 方法に供給されてよい。例えば、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）特異的標 的ＤＮＡのＰＣＲ増幅のための適切な錠剤化された試薬は、国際公開第ＵＳ９６ ／１５０８５号に記載されている。蛍光検出が増幅産物の検出のための手段とし て選択される場合には、「陽性対照」および「陰性対照」の錠剤化された試薬を 、増幅反応をキャリブレーションし、そしてバックグラウンド蛍光をモニターす る目的で取り込ませる ことが有用であってよい。例えば「試料錠剤」は、適切なプライマーおよび適切 なＤＮＡポリメラーゼを含む、特異的標的ＤＮＡを増幅するための必要試薬を全 て含むであろう。「陽性対照」錠剤は特定された量の標的ＤＮＡに加え、試料錠 剤内に包含される全ての試薬を含むであろう。ＰＣＲ反応内への陽性対照錠剤の 添加によりその錠剤内の標的ＤＮＡの増幅がもたらされるであろうし、そのこと によりＰＣＲ反応および蛍光検出の両方にとっての対照が提供される。「陰性対 照」錠剤は、ＤＮＡポリメラーゼを除外して、試料錠剤内に包含される全ての試 薬を含む。ＰＣＲ反応における陰性対照錠剤の存在は、バックグラウンド蛍光に ついての照合対照として役立つ。インターカレーティング剤 本方法は、ｄｓＤＮＡに結合し、かつ一本鎖ＤＮＡに対して結合しないもしく は結合する場合に作成されるシグナルから識別され得る蛍光シグナルを発するこ とが可能なインターカレーティング剤を用いる。ヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐ ｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅ）（ＰＩ）と臭化エチジウム（ＥＢ）（Ｓａｉｌｅｒ ら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（１９９６）、２５（２）、１６４−１７２）、オキザ ゾール イエロー（Ｏｘａｚｏｌｅ Ｙｅｌｌｏｗ）（欧州特許第７１４９８６ 号）、ＴＯＴＯ（１，１’−（４，４，７，７−テトラメチル−４，７−ジアザ ウンデカメチレン）−ビス−４−［３−メチル−２，３−ジヒドロ−（ベンゾ− １，３−チアゾール）−２−メチリデン］−四ヨウ化キノリニウム）すなわちチ アゾールオレンジのホモニ量体（Ａｘｔｏｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅ ｓ（１９９４）、８（３）、２４５−５０）、オキザゾールオレンジ（ＹＯＹＯ ；Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎら、Ａｐｐｌ．Ｔｈｅｏｒ． Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒ．（１９９３）、３（５）、２３５−９）、ならびにシ アニン染料（米国特許第５，５６３，０３７号）のような多種多様の適切なイン ターカレーティング剤が当該技術分野において知られている。本発明において好 ましいのは、米国特許第５，５６３，０３７号、米国特許第５，５３４，４１６ 号、および米国特許第５，３２１，１３０号において論議されるもののような非 対称シアニン染料であり、これらの特許は引用により本明細書に取り込まれる。 シアニン染料は本方法における使用には特に適切であり、なぜならそれらは大 半のプライマーで制御された増幅による増幅を阻害しない程度に十分低く、しか しながら検出可能なシグナルを依然として生じるのに十分なほど高い、ＤＮＡに ついての結合定数を有するためである。本発明において有用なシアニン染料につ いての好ましい結合定数は、約１×１０⁴〜約５×１０⁵（モル^-1）である。 最も好ましいのは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ．Ｉｎｃ．社（Ｅｕｇ ｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）から入手することができるシアニン染料ＹＯ−ＰＲＯ− １（商標）（４−［（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンズオキサゾリリデン）メチ ル］−１−［３−（トリメチルアンモニオ）−プロピル］−二ヨウ化キノリニウ ムである。ＹＯ−ＰＲＯ−１（商標）は、高い吸光係数、結合しない際のほぼゼ ロに近い蛍光、二本鎖ＤＮＡに対する適切な親和性、および適度な光安定性のた め、本発明における使用に特に適する。ＹＯ−ＰＲＯ−１（商標）は、一般的に 行われている効果的シグナルを提供するのに用いられる時間間隔での高い処理温 度に対して十分な耐性を示す。 インターカレーティング剤は、蛍光検出前のこの方法のいずれかの段 階において提供することができる。例えばインターカレーティング剤は、拾いあ げてきた細菌コロニーに含まれる細胞を分散させる緩衝液中に存在してよい。他 の態様ではインターカレーティング剤は、溶解用試薬を含む緩衝液中に存在し得 る。更に別の態様では、インターカレーティング剤は増幅組成物の内のある構成 成分としてこの方法内に導入され得る。最終的にはインターカレーティング剤は 、蛍光検出により分析直前に増幅産物混合物に添加することができる。 本方法における使用のために選択されたインターカレーティング剤は温度感受 性であってよく；すなわちｄｓＤＮＡに対するそのインターカレーティング剤の 結合親和性およびそれ故発せられる蛍光シグナルの程度が温度と共に変化してよ い。従って当業者には、器具のキャリブレーション、陽性および陰性対照、なら びに試料は全て、制御された温度条件下でアッセイしなければならないことが容 易に明らかとなる。別法では数学的計算法が、周囲の温度およびキャリブレーシ ョン温度における変動についての補正を行う目的で開発されてよい。例えば以下 の計算法は、試料の測定が行われる周囲の温度（ｔ）およびその温度で記録され る蛍光強度単位（ＦＩｕｔ）の関数としての標準キャリブレーション温度（ＦＩ Ｕｃ）での蛍光値を算出する単式直線乗数（ｓｉｍｐｌｅ ｌｉｎｅａｒ ｍｕ ｌｔｉｐｌｉｅｒ）を含む： ＦＩＵｃ＝ＦＩＵｔ（ＴＣＦ）、式中、 ＦＩＵｃ＝算出された蛍光値； ＦＩＵｔ＝所定の周囲の温度（ｔ）における測定された蛍光値； および ＴＣＦ＝（（０．２５＋０．０５（ｔ））／１．４５。 この計算法により、１５〜３５℃の温度範囲に関しては定常的な結果が算出され る。標的増幅 本方法により標的を同定する目的では、先に記載される方法に従って拾いあげ られる細菌細胞を溶解用緩衝液中で溶解して細胞性ＤＮＡを放出させる。その後 にＤＮＡを、プライマーで制御された増幅についての標準方法に従って増幅させ る。典型的にはＰＣＲが用いられ、そしてその後に適切な核酸増幅組成物の存在 下における標準的サーモサイクル過程を行う。適切な核酸増幅組成物は例えば、 ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、標的特異的プライマー、および適切 なポリメラーゼを含むであろう。プライマーは標的ＤＮＡを特異的に増幅させる ように選択されるであろう。核酸組成物が液体形態をとるのなら、当該技術分野 において知られる適切な緩衝液が用いられる。（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ.ら、Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９））。その組成物が錠剤化された試 薬内に含まれるのなら、国際公開第ＵＳ９６／１５０８５号に記載されるような 典型的な錠剤化用試薬が含まれる。 インターカレーティング剤ＹＯ−ＰＲＯ−１（商標）はＰＣＲ反応に含まれ得 る。ＹＯ−ＰＲＯ−１（商標）を試料に添加して約３μＭの最終染料濃度とする 。サーモサイクルは典型的なサイクリング時間および温度に従って開始する。好ましい態様の記述 本発明の方法は、標的細菌を含む疑いのある試料を回収し、それらの試料を標的 濃縮用プロトコールに供することで始まる。試料をまず最初に非選択的事前濃縮 培地内で培養し、そして約３７℃で約２４時間インキュベートする。事前濃縮の 後には事前濃縮培養物の試料を選択用培地内に希釈して標的細菌の成長を強化す る。その後には選択的培養物のアリコートを、コロニー産生のための適切な固形 培地上に画線する。その後に、特定された数の細菌を、各プレート上の少なくと も一つのコロニーから個別の５μＬ毛細管により拾いあげる。各拾いあげ作業か らの毛細管は一つの容器内に保管し、そして適切な分散用緩衝液中に浸す。光学 的にはこの分散用緩衝液は、ＤＮＡ内に介入しかつ蛍光シグナルを発することが 可能なインターカレーティング剤を含んでよい。その後にその容器を密封し、そ して震盪して毛細管からの細胞を増幅組成物内に分散させる。 胞の震盪および分散の後に、その溶液の試料を、細胞が溶解しそして細胞性Ｄ ＮＡが放出している溶解用緩衝液と接触させる。この溶解用緩衝液は場合によっ ては有効濃度のインターカレーティング剤を含んでよい。細胞の溶解は、浸透圧 差、例えば超音波もしくは熱のような機械的手法を初めとするいずれかの方法に よりもたらされてよい。 標的ＤＮＡのプライマーで制御された増幅（典型的にはＰＣＲ）に必要な試薬 は細胞溶解の後に添加してよい。このような試薬は典型的にはヌクレオチド三リ ン酸、適切な配列を持つ２本のプライマー、適切な緩衝液、ＤＮＡポリメラーゼ 、および蛋白質を含むであろう。これらの試薬は溶液もしくは錠剤化されたかの いずれかの形態で提供されてよい。錠剤化されたＰＣＲ試薬の使用が好ましい。 ３種類の錠剤が用いられ、 それらは：試料錠剤、陽性対照錠剤、および陰性対照錠剤である。試料錠剤は標 的の増幅に必要な全ての試薬を含む。陽性対照錠剤は試料錠剤と同一の試薬を含 み、そこに特定された量の標的ＤＮＡを加えてある。陰性対照錠剤はＤＮＡポリ メラーゼを除き、試料錠剤と同一の試薬を含む。全ての錠剤は同一の条件下での ＰＣＲ反応において処理される。陽性対照錠剤は、反応の効率についてのチェッ クならびに予想される蛍光レベルのモニターとして作用する。陰性対照錠剤は、 非産生性ＰＣＲ試薬により産生されるバックグラウンド蛍光の指標となる。 ＰＣＲ試薬の添加の後には増幅プロトコールを密封した反応容器内で実施する 。容器の密封は、混入が繰り越されることを予防するためには重要である。標的 ＤＮＡが存在すれば、増幅産物が産生され、そして産物が検出および定量される 。 本発明はキット形態でも実施されてよいことが理解されるであろう。典型的な キットは、複数の分析に必要とされる全ての消費可能／ディスポーザブルな要素 を提供するであろう。あるキット（Ｋｉｔ）のための構成成分は例えば、ミクロ キャップチューブ（Ｍｉｃｒｏｃａｐ Ｔｕｂｅｓ）、試料ＰＣＲ用の錠剤化さ れた試薬が封入されているＰＣＲキャップ付きの透明なＰＣＲ用試験管からなる 試料用チューブアセンブリー（Ｓａｍｐｌｅ Ｔｕｂｅ Ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ ）、溶解緩衝液（Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ）、陰性対照ＰＣＲ用の錠剤化され た試薬が封入されている第一のセットのキャップをかぶせてあるＰＣＲ用チュー ブおよび陽性対照ＰＣＲ用の錠剤化された試薬が封入されている第二のセットの キャップをかぶせてあるＰＣＲ用チューブからなる対照用錠剤パッケージ（Ｃｏ ｎｔｒｏｌ Ｔａｂｌｅｔ Ｐａｃｋａｇｅ）、ＹＯ−Ｐ ＲＯ−１（商標）パッケージ（Ｐａｃｋａｇｅ）、ならびに１：２５８の稀釈率 のＥｓｔａｐｏｒ（商標）蛍光ピンクポリスチレン粒子（Ｓｔｏｃｋ Ｃｏｄｅ Ｄ０００１８５２ＣＦ：Ｂａｎｇｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．社 、Ｃａｒｍｅｌ、ＩＮ）で満たされている第一のセットのチューブおよび溶解緩 衝液で満たされている第二のセットのチューブからなるキャリブレーション用チ ューブ（Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ｔｕｂｅｓ）を含む。 本発明は更には以下の実施例において特定される。この実施例は本発明の好ま しい態様を示しはするものの、説明としての意味でのみ与えられることが理解さ れるべきである。先の論議および本実施例から当業者は本発明の主要な特徴を確 かめることができ、かつ本発明の精神および範囲から逸脱することなく本発明の 様々な変法および改変法を様々な使用法および条件下に適用させるために作成す ることができる。 実施例 一般的方法 プライマーで制御された増幅のための手法は当該技術分野においてよく知られ ている。以下の実施例における使用に適する技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら 、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕ ａｌ 、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）において見いだされてよい。 細菌培養物の維持および成長に適する材料および方法は当該技術分野において 知られている。以下の実施例における使用に適する技術は、Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃ ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ （Ｐｈｉｌｌｉｐｐ Ｇｅｒｈａｒｄｔ、Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕ ｒｒａｙ、Ｒａｌｐｈ Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ、Ｅｕｇｅｎｅ Ｗ．Ｎｅｓｔｅ ｒ、Ｗｉｌｌｉｓ Ａ．Ｗｏｏｄ、Ｎｏｅｌ Ｒ．Ｋｒｉｅｇ、およびＧ．Ｂｒ ｉｇｇｓ Ｐｈｉｌｌｉｐｓ、ｅｄｓ）、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ．Ｄ．Ｃ．（１９９ ４）、またはＴｈｏｍａｓ Ｄ．ＢｒｏｃｋのＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ 、Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）Ｓｉｎａｕｅｒ Ａｓｓｏｃｉａ ｔｉｅｓ、Ｉｎｃ．、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ、ＭＡもしくはＢａｃｔｅｒｉｏｌ ｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ．８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ 、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｆｆｉｃｉａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｓ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＶＡ（１９９５）において見いだされ てよい。細菌細胞の成長および維持のために用いられる全ての試薬および材料は 、他に特に特定されていない限り、Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社（Ｍ ｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、ＤＩＦＣＯ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（Ｄｅｔ ｒｏｉｔ、ＭＩ）、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ社（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ） 、もしくはＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉ ｓ、ＭＯ）から取得した。 Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ Ｃｙｃｌｅｒ ９６００（Ｐｅ ｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ社、Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ Ｎ．Ｊ．）を全てのＰＣＲ反 応について用いた。 シアニンインターカレーティング剤ＹＯ−ＰＲＩ−１（商標）はＭｏ ｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）から取得した。 以下の実施例で用いられるサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）−特異的ＰＣ Ｒ試薬は、Ｑｕａｌｉｃｏｎ，Ｌ．Ｌ．Ｃ．社、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ（ ｐａｒｔ ｎｏ．１７４１０５３０）から取得し、そしてサルモネラ（Ｓａｌｍ ｏｎｅｌｌａ ）スクリーニングキット（カタログ番号１７７２０５１９）内に含 まれている。 略語の意味は以下のとうりである：「ｈ」は時間（単数および複数）を意味し 、「ｍｉｎ」は分（単数および複数）を意味し、「ｓｅｃ」は秒（単数および複 数）を意味し、「ｄ」は日数（単数および複数）を意味し、「μＬ」はマイクロ リットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味 し、「ＦＩＵ」は蛍光強度単位を意味する。細胞株 以下のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株を本明細書に提供される実施例 に用いた：Ｓ．エンテリティディス（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）（７３７） 、Ｓ．ティフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（８９７）、Ｓ．ビル コウ（Ｓ．ｖｉｒｃｈｏｗ）（１２４７）、Ｓ．ハダル（Ｓ．ｈａｄａｒ）（１ ２６８）、Ｓ．ケドウゴウ（Ｓ．ｋｅｄｏｕｇｏｕ）（１２５４）、Ｓ．ヘイデ ルベルグ（Ｓ．ｈｅｉｄｅｒｂｅｒｇ）（１２３９）、Ｓ．モンテビデオ（Ｓ．ｍｏｎｔｅｖｉｄｅｏ ）（１２６０）、およびＳ．インファンティス（Ｓ．ｉｎ ｆａｎｔｉｓ ）（７３２）。本明細書で用いられる非標的バックグラウンド生物 は、キトロバクテル ディベルスス（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｄｉｖｅｒｓｕ ｓ ）（２５６０）、キトロバクテル エスピー ピー（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｐ）（２１７）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） （５１０８）、大膓菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（５１１１）、ハフニア アルベイ（Ｈ ａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ）（４９６５）、ハフニア アルベィ（Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ ）（２０１０）、プロテウス ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒ ａｂｉｌｉｓ ）（２３２１）、およびプロテウス ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ）（２３２３）を含む。全ての細菌株はＱａｌｉｃｏｎ Ｌ ．Ｌ．Ｃ．カルチャーコレクションから取得した。括弧内の番号はＱａｌｉｃｏ ｎ Ｌ．Ｌ．Ｃ．カルチャー表示を示す。固形選択培地 ３種類の固形培地を、標的細菌（サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ））およ び非標的細菌からのコロニーの作成のために用いた。それらはデオキシコール酸 キシロースリシン（ＸＬＤ）、亜硫酸ビスマス（ＢＳ）、およびヘクトン腸（Ｈ ｅｋｔｏｅｎ ｅｎｔｅｒｉｃ）アガーからできている。それらの調製のための プロトコールはＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍａ ｎｕａｌ ．８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｆｆｉ ｃｉａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ、 ＶＡ（１９９５）、に見いだされてよい。緩衝液および増幅用試薬 この実施例で用いられる溶解用緩衝液は、３μＭのＹＯ−ＰＲＯ−１（商標） を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２８ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、ｐＨ８．３でできていた。 ＰＣＲ試薬構成成分は： 各３６ｎＭの以下の増幅プライマー： ３ｍＭのマグネシウム、 １６０μＭのｄＮＴＰ、および １．５単位のＴａｑ（商標）ポリメラーゼ／アッセイ、 でできていた。 ＰＣＲ緩衝液は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２８ｍＭ ＫＣｌ、０．１％ Ｔｗｅ ｅｎ−２０緩衝液、ｐＨ８．３、でできていた。蛍光測定器のキャリブレーション タングステン−ハロゲンランプ、４８５ｎｍの励起用フィルター、および５３ ５ｎｍの発光用フィルターを装着させた蛍光測定器を増幅産物から発せられる蛍 光の検出のために用いた。 蛍光測定器のキャリブレーションのために用いた試薬は以下のとうりである： （ｉ）ＤＮＡ標準：５００ｂｐの二本鎖ＤＮＡ断片（ＢｉｏＶｅｎｔｕｒ ｅｓ． Ｉｎｃ．社；カタログ番号Ｍ５００）、 （ｉｉ）溶解／染色用緩衝液：３μＭのＹＯ−ＰＲＯ−１（商標）を含む 溶解用緩衝液。 ＤＮＡ標準は以下の３つの濃度で調製した：０ｎｇ ＤＮＡ、２００ｎｇ Ｄ ＮＡ／５０ｎＬ、および４００ｎｇ ＤＮＡ／５０μＬ。標準曲線は３つの濃度 のＤＮＡ標準から発せられる蛍光を測定することにより作成した。各濃度の３回 全ての測定値の平均値を算出し、そして結果 を以下の表１に表記した。 閾蛍光値の決定 ＹＯ−ＰＲＯ−１（商標）でラベル化させた増幅産物を識別するための蛍光の 閾値を決定する目的で、多重パラメーター組み合わせ実験を実施した。インター カレーティング染料ＹＯ−ＰＲＯ−１（商標）の存在下での６２０回のサルモネ ラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）ＰＣＲアッセイからのデータを、分散分析およびヒ ストグラム技術の両方（ＪＭＰ：Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｄｉｓｃｏｖｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．社、Ｃａｒｙ、ＮＣ ）を用いて分析してサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）についての蛍光閾値を 決定した。これらの分析は各株（サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）および非 サルモネラ（ｎｏｎ−Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ））について行い、そして分散構成 成分の一覧表を得た。分析結果は添付されるヒストグラム図１に見いだすことが できる。サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）については１．５ＦＩＵの閾値が 決定した。 実施例 混合培養物からのサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の同定 非標的非サルモネラ（ｎｏｎ−Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株との混合培 養物中に存在する８つの異なる標的サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株から なるパネルの内の各々を特異的に同定する本方法の能力を決定した。 各サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株につき一つのコロニーを各検査当た りに拾いあげた。非サルモネラ（ｎｏｎ−Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株である合計 １１のコロニーを拾いあげ、そして個々のサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ） コロニーを含む各試験管に添加した。一つの対照サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌ ｌａ ）株をこの方法の一貫性をモニターするために検査した。蛍光（ＦＩＵ）デ ータを記録し、そしてサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）について予め決定し てある閾値に照らし合わせる形での測定を行った。全てのアッセイは三重検査と して行った。蛍光ＰＣＲ検出によるサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）についてのアッセイ Ａ． 以下の試薬および付属品（Ｒｅａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ａｃｃｅｓｓｏｒ ｉｅｓ）を用いた： ＸＬＤプレート上で培養したサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株 ＨＥ、ＸＬＤ、およびＢＳプレート上で培養した非サルモネラ（ｎｏｎ−Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ）株 毛細管（５μＬサイズ） 細胞懸濁用試験管（１．５ｍＬ、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ） ） 細胞溶解用試験管（ネジ蓋付きの２ｍＬの容量のもの） ＰＣＲ用バイアル（標準サイズ−０．２ｍＬ） ＰＣＲ用試料錠剤 ＰＣＲ用陽性対照錠剤 ＰＣＲ用陰性対照錠剤 ＹＯ−ＰＲＯ−１（商標）試薬（５．２６ｍＬ／試験管） 溶解用緩衝液 Ｂ． 本実施例に用いられる装置は以下のものを含む： １） Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＧｅｎｅＡｍｐ（商標）９６００サー マルサイクラー ２） 加熱用水浴槽（最高９５℃まで） ３） 蛍光測定器 Ｃ． 溶解／染色用溶液は以下の要領で調製した。３μＭのＹＯ−ＰＲＯ−１（ 商標）溶液を、１．７５ｍＭの溶解用緩衝液をＹＯ−ＰＲＯ−１（商標）試験管 （製造業者より賜ったもの）の中に添加することにより調製した。ＰＣＲ試薬用 試験管は、１ｍＬの溶解用緩衝液および２００μＬの３μＭ ＹＯ−ＰＲＯ−１ （商標）溶液を、試料ＰＣＲ錠剤（実験用）、陽性対照錠剤、もしくは陰性対照 錠剤のいずれかを含む試験管内にピペッティングにより添加することにより調製 した。 Ｄ． 細胞を拾いあげる方法。 以下のサルモネラ(Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株をＸＬＤプレート上で個別に培 養した：Ｓ．エンテリティディス（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）（７３７）、 Ｓ．ティフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）（８９７）、Ｓ．ビルコ ウ（Ｓ．ｖｉｒｃｈｏｗ）（１２４７）、Ｓ．ハダル（Ｓ．ｈａｄａｒ）（１２ ６８）、Ｓ．ケドウゴウ（Ｓ．ｋｅｄｏｕｇｏｕ ）（１２５４）、Ｓ．ヘイデルベルグ（Ｓ．ｈｅｉｄｅｒｂｅ ｒｇ ）（１２３９）、Ｓ．モンテビデオ（Ｓ．ｍｏｎｔｅｖｉｄｅｏ）（１２６ ０）、およびＳ．インファンティス（Ｓ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）（７３２）。 以下の各バックグラウンド細菌株を個別に、ＸＬＤ、ＨＥ、およびＢＳプレー ト上で培養した：キトロバクテル ディベルスス（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｄ ｉｖｅｒｓｕｓ ）（２５６０）、キトロバクテル エスピーピー（Ｃｉｔｒｏｂ ａｃｔｅｒ ｓｐｐ）（２１７）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（５１０８）、大腸 菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（５１１１）、ハフニア アルベイ（Ｈａｆｎｉａ ａｌｖ ｅｉ ）（４９６５）、ハフニア アルベイ（Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉ）（２０ １０）、プロテウス ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）（２ ３２１）、およびプロテウス ブルガリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ ）（２３２３）。 コロニーを以下の要領で培養プレートから拾いあげた： １） 毛細管用の容器を上下逆さまに保ち、そして毛細管の一端をつかみ 、毛細管のもう一方の端には絶対に手を触れないようにすることにより穴から毛 細管を取り出した。 ２） 一つの単離されたコロニーに対し、毛細管をプレートに対して垂直 に保ち、そして緩やかにコロニーの中央に押し込むことにより毛細管の手で触れ ていない方の端を接触させた。 ３）その毛細管をコロニーから取り外し、そして細胞懸濁用試験管内に落 とし入れた。 非標的細菌の存在下で標的細菌を検出するための本方法の能力の評価 は、同一試験管内に一つの標的（サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ））細菌コ ロニーおよび１１の非標的細菌コロニーを拾い入れることにより実施した。非標 的細菌のコロニーはランダムに拾いあげた。その後にこの試験管に蓋をかぶせ、 そして全速力で少なくとも５秒間ボルテックスミキサーで撹拌した。この拾いあ げ法を、検査する各サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）株について繰り返した 。各非標的細菌株に対するアッセイの応答は、同じ非標的株の１２のコロニーを 単一のアッセイ用試験管内に拾い入れることにより測定した。非標的細菌のコロ ニーは、３つの成長用培地の各々の上で成長している４つのコロニーを同一試験 管内に拾い入れるように拾いあげた。この拾いあげ用のプロトコールを検査する 全ての非標的細菌について繰り返した。 Ｅ． 細胞溶解： 細胞溶解は以下の要領で実施した： １） 各１０μＬのコロニー懸濁物を各試験管から取り出し、そして１９ ０μＬの溶解／染色用溶液を含む溶解用試験管内に入れた。 ２） 各試験管にしっかりと蓋をし、そしてボルテックスミキサーで撹拌 して内容物を混ぜ合わせた。 ３） 試験管を９５℃の水浴槽で１０分間インキュベートした。 ４） インキュベーション期間の後、試料を室温まで冷ました。 Ｆ． ＰＣＲ増幅 ＰＣＲ増幅は以下の要領で実施した： １） サーマルサイクラーを以下の要領でプログラムした： ホールド（ＨＯＬＤ）： ９４℃で２分間を一周期 サイクル（ＣＹＣＬＥ）： ９４℃で１５秒間、 ７２℃で２分間、 を３５周期 ホールド（ＨＯＬＤ）： ７２℃で７分間を一周期 ホールド（ＨＯＬＤ）： ２５℃をずっと継続させる。 試料容積：５０μＬ ３） 各５０μＬの溶解させた試料を各ＰＣＲ試料用試験管内にピペッテ ィングにより入れた。 ４） 各５０μＬの試料を陽性対照用の、そして各５０μＬの試料を陰性 対照用のＰＣＲ試験管にピペッティングにより入れた。 ５） 全ての試験管に蓋をし、そしてサーマルサイクラー内に入れ、そし てプログラムを開始させた。 Ｇ． 蛍光検出 蛍光測定器を暖め、そしてキャリブレーションした。ＰＣＲ反応用試料をサー マルサイクラーから取り出し、そして室温に冷ました。試料について、４８５ｎ ｍの励起光および５３５ｎｍの発光を測定した。測定値を、予め決定してあった 閾値と比較した。 Ｈ． データの解釈 サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）についてのＰＣＲ蛍光閾値は予め１．５ ＦＩＵであると予め決定された。内部対照として陽性対照ＰＣＲの蛍光測定値 は閾値以上に保持され、そして陰性対照ＰＣＲでは閾以下に保持された。 閾値と等しいもしくはそれを上回るいずれかの試料ＰＣＲ蛍光の測定値は陽性 として解釈され、これは増殖産物の存在を示していた。閾値を下回る測定値であ る場合には、その結果は陰性であり、これは増幅産物 が全く作成されなかったことが示していた。結果が表ＩＩに表示されている。 先に示されるデータにより示されるように、８つ全てのサルモネラ（Ｓａｌｍ ｏｎｅｌｌａ ）種（試料番号１−８）におけるＰＣＲ産物シグナルは確立された 閾値（１．５ＦＩＵ）を上回っていた。全ての非サルモネラ（ｎｏｎ−Ｓａｌｍ ｏｎｅｌｌａ ）株（試料番号９−１６）におけるＰＣＲ産物の蛍光シグナルは閾 値以下であった。従って本方法は、数倍大きな数の非標的細菌の状況下において さえも標的コロニーを確認するのに有効であった。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年５月１８日（１９９８．５．１８） 【補正内容】 検出のためのシアニン染料のＰＣＲ増幅産物内への取り込みを用いる細菌検出法 を開示している。Ｂａｓｓｌｅｒら（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂ ｉｏｌ．（１９９５）、６１（１０）、３７２４−８）は、標的の増幅をモニタ ーするための、内部蛍光原性（ｆｌｏｕｏｒｇｅｎｉｃ）プローブの加水分解に 依存するリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）検出法を教示している。これらのよう な方法は高度に特異的でありかつ感受性はよいが、標的ＤＮＡのクリーンな試料 を必要とする。Ｙａｍａｇｉｓｈｉら（英国特許第２２８２１３８号）は、ＰＣ Ｒ増幅よりも有用なものとしてウイルスもしくは細菌の溶解物からＤＮＡを抽出 する方法を教示している。食品試料の分析にこれらの方法を適用するなら、汚染 性非特異的ＤＮＡ（これは高いバックグラウンド蛍光をもたらすであろう）およ びＰＣＲ反応を阻害するであろう他の物質を含まない試料を産生するために先に 記載される手間のかかる増殖方法の内の多くのものが必要となるであろう。 食品から単離された細菌からの標的ＤＮＡの蛍光に基づくＰＣＲ増幅に関連す る難局にもかかわらず、幾つかの方法が開発されている。例えば、Ｃａｎｏら（ Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９３）、７５（３）、２４７−５３ ）は、牛乳試料からの標的ＤＮＡを増幅するためにＬ．モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ ）とサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）とに特異 的なプライマー対を用いており、ここでは増幅産物は臭化エチジウムで標識され ていた。同定は、固定化されてフルオレセント標識化プローブに対するハイブリ ダイゼーションに基づいて行われた。Ｃａｎｏら（Ｊ．Ｆｏｏｄ Ｐｒｏｔ．（ １９９５）、５８（６）、６１４−２０）は更に、リステ リア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）特異的標的ＤＮＡの増幅にのみに独占的に依存する、 食品からのリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）の検出のためのマイクロウエルアッ セイをも教示している。Ｃａｎｏらの方法は濃縮されたコロニーからの標的細菌 の選択は教示しておらず、かつ増幅前には徹底的なＤＮＡ単離および精製を必要 とする。 ＣａｎｏらのＰＣＲに基づく方法は食品マトリックスから食品汚染病原体を検 出することは可能であるものの、それらの方法は依然としてハイブリダイゼーシ ョン段階もしくは徹底的な精製のいずれか、および蛍光的にラベルされた増幅産 物を検出する目的での標的の増幅に続くゲノムＤＮＡの単離を必要とする。この ような段階がそのアッセイの複雑さを増大させ、そして幾つかの事例では蛍光標 識された適切なハイブリダイゼーションプローブを予め作成および固定化してお くことが必要となる。 従って、克服すべき問題は、コロニー分析のための増殖に基づきかつ免疫学的 な方法に基づく同定方法にまつわる厄介な作業がなく、その上プライマーで制御 された増幅技術の利潤を極大化させる、病原性細菌の同定のための方法を開発す ることである。出願人は記載される問題を、食品試料から単離される標的および 非標的細菌のコロニーを拾いあげ、そして標的特異的増幅産物の作成および蛍光 検出のためのプライマーで制御された増幅技術に直接供することができる方法を 開発することにより解決した。 コロニーは５μｌの毛細管を用いて拾いあげた。０．６６ミリメーターと２． ４５ミリメーターとの間の外径（「Ｏ．Ｄ．」）を有する毛細管が本発明では好 ましく、そして約０．９５２ミリメーターのＯ．Ｄ．が最も好ましい。本明細書 に記載される実験用に選択される特定の毛細管は長さ約３２ミリメーターの５μ Ｌ Ｍｉｃｒｏｃａｐ毛細管（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏ ．、Ｂｒｏｏｍａｌｌ、ＰＡ）であった。この装置でコロニーを拾いあげること により１×１０⁶と２×１０⁷との間の細胞が溶解用緩衝液中に送られた。 これらの毛細管の他のデザインの態様により有用性が付加される。長さおよび 直径の両方ともが小さなサイズであれば、ボルテックスミキサーでの震盪による 回収細胞の再懸濁のためには一本の試験管内に少なくとも１２本の毛細管を入れ ることができる。これは、個別の試料を取り扱う手作業による方法とは異なり、 複数の試料の迅速な処理および細胞を再懸濁させる際の再現性が一層大きくなる ことを考慮している。それに加え、この拾いあげ過程により、必要とされる数の 細胞を送り込むために生化学アッセイの際に一般的に用いられる光学密度測定の ような定量法の必要が除去される。また、毛細管の直径は、あるコロニーが必要 数の細胞を生じるのに十分に大きいかどうかを決定する際に用いられるゲージと して作用する。最終的にはガラスの不活性な特性が、拾いあげ用装置からＰＣＲ 阻害性化学物質が放出しないよう防御することとなる。標的ＤＮＡのプライマーで制御された増幅 標的ＤＮＡは、ある特別な生物に独特であるか、またはある特異的な遺伝子的 特性を特定している二本鎖核酸断片の存在を識別するための価値を有するいずれ かの資源からのものであってよい。本発明のある態様 では標的ＤＮＡを増幅して、食品に混入することが知られている病原性細菌生物 から標的増幅産物を製造する。以下の属、すなわち：リステリア（Ｌｉｓｔｅｒ ｉａ ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、クロストリディウム（Ｃｌｏｓ ｔｒｉｄｉｕｍ ）、およびエスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）のメンバー のような生物から単離されたＤＮＡが特別な目的となるであろう。 本出願人は、増幅は限定される訳ではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、もしくは鎖置換増幅(ＳＤＡ）を含む、当該 技術分野に知られる幾つかのスキームの内のいずれかにより達成されてよいこと を企図する。もしＰＣＲ法が選択されれば、この増幅組成物は例えばヌクレオチ ド三リン酸、適切な配列を有する２本のプライマー、適切な緩衝液、ＤＮＡポリ メラーゼ、および蛋白質を含むであろう。これらの試薬、ならびに核酸を増幅さ せる際のそれらの使用についての詳細を記載している手順は、米国特許第４，６ ８３，２０２号および米国特許第４，６８３，１９５号に提供されている。 ＴＯＴＯ（１，１’−（４，４，７，７−テトラメチル−４，７−ジアザウンデ カメチレン）−ビス−４−［３−メチル−２，３−ジヒドロ−（ベンゾ−１，３ −チアゾール）−２−メチリデン］−四ヨウ化キノリニウム）すなわちチアゾー ルオレンジのホモ二量体（Ａｘｉｔｏｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ（ １９９４）、８（３）、２４５−５０）、オキザゾールオレンジ（ＹＯＹＯ；Ｓ ｒｉｎｉｖａｓａｎら、Ａｐｐｌ．Ｔｈｅｏｒ．Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒ．（１ ９９３）、３（５）、２３５−９）、ならびにシアニン染料（米国特許第５，５ ６３，０３７号）のような多種多様の適切なインターカレーティング剤が当該技 術分野において知られている。本発明において好ましいのは、米国特許第５，５ ６３，０３７号、米国特許第５，５３４，４１６号、および米国特許第５，３２ １，１３０号において論議されるもののような非対称シアニン染料である。 シアニン染料は本方法における使用には特に適切であり、なぜならそれらは大 半のプライマーで制御された増幅による増幅を阻害しない定度に十分低く、しか しながら検出可能なシグナルを依然として生じるのに十分なほど高い、ＤＮＡに ついての結合定数を有するためである。本発明において有用なシアニン染料につ いての好ましい結合定数は、約１×１０⁴〜約５×１０⁵（モル^-1）である。 最も好ましいのは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ．Ｉｎｃ．社（Ｅｕｇ ｅｎｅ、ＯＲ、ＵＳＡ）から入手することができるシアニン染料ＹＯ−ＰＲＯ− １（商標）（４−［（３−メチル−２（３Ｈ）−ベンズオキサゾリリデン）メチ ル］−１−［３−（トリメチルアンモニオ）−プロピル］−二ヨウ化キノリニウ ムである。ＹＯ−ＰＲＯ−１（商標） は、高い吸光係数、結合しない際のほぼゼロに近い蛍光、二本鎖ＤＮＡに対する 適切な親和性、および適度な光安定性のため、本発明における使用に特に適する 。ＹＯ−ＰＲＯ−１（商標）は、一般的に行われている効果的シグナルを提供す るのに用いられる時間間隔での高い処理温度に対して十分な耐性を示す。 インターカレーティング剤は、蛍光検出前のこの方法のいずれかの段階におい て提供することができる。例えばインターカレーティング剤は、拾いあげてきた 細菌コロニーに含まれる細胞を分散させる緩衝液中に存在してよい。他の態様で はインターカレーティング剤は、溶解用試薬を含む緩衝液中に存在し得る。更に 別の態様では、インターカレーティング剤は増幅組成物の内のある構成成分とし てこの方法内に導入され得る。最終的にはインターカレーティング剤は、蛍光検 出により分析直前に増幅産物混合物に添加することができる。 本方法における使用のために選択されたインターカレーティング剤は温度感受 性であってよく、すなわちｄｓＤＮＡに対するそのインターカレーティング剤の 結合親和性およびそれ故発せられる蛍光の程度が温度と共に変化してよい。従っ て当業者には、器具のキャリブレーション、陽性および陰性対照、ならびに試料 は全て、制御された温度条件下でアッセイしなければならないことが容易に明ら かとなる。別法では数学的計算法が、周囲の温度およびキャリブレーション温度 における変動についての補正を行う目的で開発されてよい。 請求の範囲 １． 試料分析物中の標的細菌を同定するための方法であって、該試料分析物 は標的細菌を含む疑いがありかつ少なくとも一つのコロニーを産生するように培 養されており、 （ｉ）個別の毛細管により細菌コロニーの少なくとも一部分を拾いあげる段階 ； （ｉｉ）段階（ｉ）のコロニーを含む細胞を適切な分散用緩衝液中に分散させ る段階； （ｉｉｉ）段階（ｉｉ）の分散させた細胞を、その分散させた細胞を有効量の 溶解用緩衝液と接触させることにより溶解してその分散させた細胞内に含まれる ＤＮＡを放出させる段階； （ｉｖ）段階（ｉｉｉ）において放出させた細胞性ＤＮＡを含む溶解用緩衝液 を標的ＤＮＡの増幅に有用な増幅用プライマーを含む核酸増幅組成物と接触させ ることにより増幅反応混合物を産生する段階； （ｖ）増幅産物混合物を産生するために、段階（ｉｉｉ）の放出されたＤＮＡ についてのプライマーで制御された増幅を行う段階；ならびに （ｖｉ）標的増幅産物の存在について該増幅産物混合物を分析する段階、ここ で該標的増幅産物はインターカレーティング剤を含むものであり、該インターカ レーティング剤は段階（ｖｉ）以前のいずれかの時点で添加されている、からな る方法。 ２． 毛細管が５マイクロリットルの管である、請求の範囲１の方法。 ３． 毛細管が約０６６ミリメーター〜約２．４５ミリメーターの外径を有す る、請求の範囲２の方法。 ４． 毛細管が約０．９５２ミリメーターの外径を有する、請求の範 囲３の方法。 ５． 拾いあげによりコロニーからの約１×１０⁶〜２×１０⁷の細胞の取り出 しがもたらされる、請求の範囲１の方法。 ６． プライマー特異的増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、 および鎖置換増幅からなる群から選択される一つのメンバーである、請求の範囲 １の方法。 ７． 増幅プライマーが細菌属のゲノムの非反復部分を増幅し、その属が、サ ルモネラ(Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、エスケ リキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ）、およびクロストリディウム（Ｃｌｏｓｔｒｉ ｄｉｕｍ ）からなる群から選択される、請求の範囲１の方法。 ８． インターカレーティング剤が非対称シアニン染料である、請求の範囲１ の方法。 ９． 非対称シアニン染料がＹＯ−ＰＲＯ−１（商標）である、請求の範囲８ の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:185） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 試料分析物中の標的細菌を同定するための方法であって、該分析物は標 的細菌を含む疑いがありかつ少なくとも一つのコロニーを産生するように培養さ れており、 （ｉ）個別の毛細管により細菌コロニーの少なくとも一部分を拾いあげる段階 ； （ｉｉ）段階（ｉ）のコロニーを含む細胞を適切な分散用緩衝液中に分散させ る段階； （ｉｉｉ）段階（ｉｉ）の分散させた細胞を、その分散させた細胞を有効量の 溶解用緩衝液と接触させることにより溶解してその分散させた細胞内に含まれる ＤＮＡを放出させる段階； （ｉｖ）段階（ｉｉｉ）において放出させたＤＮＡを標的ＤＮＡの増幅に有用 な増幅用プライマーを含む核酸増幅組成物と接触させることにより増幅反応混合 物を産生する段階； （ｖ）増幅産物混合物を産生するために、段階（ｉｉｉ）の放出されたＤＮＡ についてのプライマーで制御された増幅を行う段階；ならびに （ｖｉ）標的増幅産物の存在について該増幅産物混合物を分析する段階、ここ で該標的増幅産物はインターカレーティング剤を含むものであり、該インターカ レーティング剤は段階（ｖｉ）以前のいずれの時点で添加される、からなる方法 。 ２． 毛細管が５マイクロリットルの管である、請求の範囲１の方法。 ３． 毛細管が約０．０２６インチ〜約０．０９６５インチのＯ．Ｄ．を有す る、請求の範囲２の方法。 ４． 毛細管が約０．０３７５インチのＯ．Ｄ．を有する、請求の範 囲３の方法。 ５． 拾いあげによりコロニーからの約１×１０⁶〜２×１０⁷の細胞の取り出 しがもたらされる、請求の範囲１の方法。 ６． プライマー特異的増幅が、ポリメラーゼ連鎖反応、リガーゼ連鎖反応、 および鎖置換増幅からなる群から選択される一つのメンバーである、請求の範囲 １の方法。 ７． 増幅プライマーが細菌属のゲノムの非反復部分を増幅し、その属が、サ ルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、エスケ リキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ）、およびクロストリディウム（Ｃｌｏｓｔｒｉ ｄｉｕｍ ）からなる群から選択される、請求の範囲１の方法。 ８． インターカレーティング剤が非対称シアニン染料である、請求の範囲１ の方法。 ９． 非対称シアニン染料がＹＯ−ＰＲＯ−１（商標）である、請求の範囲８ の方法。