CN104212914B - 埃博拉五重荧光pcr快速超敏检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了在单个PCR反应容器中五重检测核酸提取液中靶核酸的实时PCR方法，用于同时检测是否存在埃博拉-扎伊尔型(EBO-Zaire)、埃博拉-苏丹型(EBO-Sudan)、埃博拉-本迪布焦型(EBO-Bundibugyo)、埃博拉-塔伊森林型(EBO-Taiforest)和埃博拉-莱斯顿型(EBO-Restor)等埃博拉病毒亚型。该方法能有效避免假阴性和假阳性结果的产生，对于埃博拉病毒检测来说是非常有实际意义的。本发明还提供了用于实施上述方法的检测试剂盒及其应用等。

Description

埃博拉五重荧光PCR快速超敏检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明属于核酸检测技术领域，具体而言，本发明涉及能同时对多型埃博拉病毒进行快速检测的多重实时PCR方法，能够快速、灵敏且一步完成对埃博拉-扎伊尔型(EBO-Zaire)、埃博拉-苏丹型(EBO-Sudan)、埃博拉-本迪布焦型(EBO-Bundibugyo)、埃博拉-塔伊森林型(EBO-Taiforest)和埃博拉-莱斯顿型(EBO-Restor)等五种致病病原体的检测。另外，本发明还涉及上述PCR方法中所涉及的试剂，如互不相干绕的引物、探针等，以及用于上述方法的检测试剂盒和相应检测试剂盒的制备应用等。
背景技术
埃博拉病毒(Ebolavirus)是一种严重威胁人类生命的病毒，其生物安全等级为4级(而艾滋病和SARS仅为3级)。埃博拉病毒主要通过患者的血液和排泄物传播，临床主要表现为急性起病发热、肌痛出血皮疹和肝肾功能损害，死亡率高达50％至90％。该病毒自1976年首次于扎伊尔发现后，几十年间在多个西非国家陆续爆发感染，传播区域不断扩大并北移。尤其是，2014年发生在西非国家几内亚、利比里亚和塞拉利昂的疫情已经造成数千人死亡，至本发明完成之日还没有得到有效控制。
埃博拉病毒潜伏期通常为2至21天，目前还没有有效的药物和疫苗治疗和预防该病毒的感染。埃博拉病毒已经发现有埃博拉-扎伊尔型(EBO-Zaire)、埃博拉-苏丹型(EBO-Sudan)、埃博拉-本迪布焦型(EBO-Bundibugyo)、埃博拉-塔伊森林型(EBO-Taiforest，也称科特迪瓦型)和埃博拉-莱斯顿型(EBO-Restor)等亚型。不同亚型具有不同的特性，其中埃博拉-扎伊尔型和埃博拉-苏丹型对人类和非人类灵长动物的致病性和致死率均很高；埃博拉-莱斯顿型虽然对人类不致病，但对非人类灵长动物却具有致死性作用，仍旧是必须严防的病毒亚型。
由于感染埃博拉病毒的患者血液中会产生病毒特异性抗体，其中IgM在发病后2～9天出现，持续存在到发病后1～6个月；而IgG在发病后6～18天出现，如果患者幸存，甚至可以持续存在到发病后2年以上，所以目前建立的检测埃博拉病毒的方法多为基于检测患者血液中抗体(尤其是IgG)的ELISA方法。
近来也有报道利用聚合酶链反应(PCR)来检测病毒的技术，尤其可以利用多重实时PCR来检测，例如中国专利CN101624629A公开了(在单个PCR反应容器中)多重检测样品中靶核酸的实时PCR方法，可以同时用于检测HBV、HCV和HIV等三种靶核酸，然而如何设计互不干扰并且保持检测特异性(假阳性和假阴性的排除)的引物对和探针，则没有理论上指引，只能依赖于专业人员的经验来设计。
部分出于研究危险性的原因，部分出于防范信息落入生物恐怖分子手中的原因，埃博拉病毒的遗传背景(包括完整的基因组序列等)并没有完全向公众公开，尤其是埃博拉-扎伊尔型(EBO-Zaire)、埃博拉-苏丹型(EBO-Sudan)、埃博拉-本迪布焦型(EBO-Bundibugyo)、埃博拉-塔伊森林型(EBO-Taiforest)和埃博拉-莱斯顿型(EBO-Restor)这五种病毒亚型之间的病毒基因组的同源性，使得要设计出针对这些病毒亚型的五重互不干扰的特异性引物对和探针，尤为困难。
由于本发明人所在的课题组在设计多重实时PCR检测方面有着独到之处，受有关方面委托，经过艰苦的努力并且凭借了一些运气，针对这五种病毒亚型，设计出了互相干扰程度在实时PCR检测中可接受的引物对和探针，使得同时检测获得的曲线都能清晰分辨(曲线相互分离)，并使得检测灵敏度达到了超敏级，可以在不使用内对照的情况下，有效抑制假阴性结果，更可以在实践中有效防止会引起不必要恐慌的假阳性结果。
发明内容
本发明的要解决的问题在于提供新的五重实时PCR检测方法，用于五重检测样品中是否存在埃博拉-扎伊尔型(EBO-Zaire)、埃博拉-苏丹型(EBO-Sudan)、埃博拉-本迪布焦型(EBO-Bundibugyo)、埃博拉-塔伊森林型(EBO-Taiforest)和埃博拉-莱斯顿型(EBO-Restor)。另外，本发明还涉及提供上述方法的检测试剂盒和应用等。
具体而言，在第一方面，本发明提供了在单个PCR反应容器中五重检测核酸提取液中靶核酸的实时PCR方法，所述靶核酸来自埃博拉-扎伊尔型(EBO-Zaire)、埃博拉-苏丹型(EBO-Sudan)、埃博拉-本迪布焦型(EBO-Bundibugyo)、埃博拉-塔伊森林型(EBO-Taiforest)和埃博拉-莱斯顿型(EBO-Restor)，其包括，
(1)在所述单个PCR反应容器中混合核酸提取液、DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物对和靶核酸探针，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，其中，
靶核酸引物对包括
EBV-Z-F:GCCACTCACGGACAATGACA，
EBV-Z-R:GCATGCGAGGGCTGGTT，
EBV-S-F:GGCAGCTCTTGGCTCACTTG，
EBV-S-R:TGAGGAGACGTGCAAATGGA，
EBV-B-F:ACCTCCGACGCGGTACAC，
EBV-B-R:TGTGGGTGAACAGGAACATCA，
EBV-T-F:GACCCGGATGATGGCAGAT，
EBV-T-R:GGCATTCGCCGTCTCACTA，
EBV-R-F:GCACCGAGGCCCAGAAC，和
EBV-R-R:CTTCGTGCACTGGTGAGAGTCT，
靶核酸探针包括：
EBV-Z-P:AAGAAATGAACCCTCCGGC，
EBV-S-P:CAAGCATGGAGAATAT，
EBV-B-P:CAAGACAGGCAACCTA，
EBV-T-P:CAACAATTATGGAGACTATC，和
EBV-R-P:TACGACCGCCAATCG；
(2)进行PCR反应，并实时检测不同波长的荧光；和，
(3)根据荧光检测结果判断是否有靶核酸存在于核酸提取液中。
可以对样品进行直接检测，但是优选对样品进行处理后获得核酸提取液后再进行检测。所以，优选核酸提取液是提取样品中的核酸而获得的提取液，如是采用磁珠提取法提取的。非特异性的磁珠提取法采用表面涂有非特异性核酸吸附类物质的顺磁性颗粒，在低pH(如，pH值5～7)和高盐浓度的情况下核酸可以吸附到顺磁性颗粒表面，在进行磁分离和充分洗涤后，在高pH(如，pH值8～9)、低盐浓度的条件下可将核酸洗脱下来，由此富集了核酸(如靶核酸)的样品可用于PCR试验；另外还可以采用特异性吸附(如杂交吸附和免疫吸附)的磁珠提取法。这些处理过程对于本领域技术人员来说是熟知的，也可参见郑秀芬等，模板DNA磁珠提取法.中国法医学杂志，18(3)：107-108；中国专利200610030229.5、200710118802.2和201110105181.0等。
优选采用本发明人进一步优化的磁珠提取法，其对于同时提取埃博拉-扎伊尔型(EBO-Zaire)、埃博拉-苏丹型(EBO-Sudan)、埃博拉-本迪布焦型(EBO-Bundibugyo)、埃博拉-塔伊森林型(EBO-Taiforest)和埃博拉-莱斯顿型(EBO-Restor)中的核酸，更为可靠，步骤也方便。优选的提取受试品中的核酸的过程是：向样品加入核酸萃取液(优选核酸萃取液包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸钠、吐温-20、高氯酸钠、乙醇和pH缓冲液(如，Tris-HCl))，保温后加入磁珠，混合均匀后，施加磁场后，弃去其中液体，然后洗涤(优选洗涤两次，更优选其中第一次洗涤所用的洗涤液包含高氯酸钠和乙醇，也更优选其中第二次洗涤所用的洗涤液包含乙醇)，并洗脱(优选洗脱所用的洗脱液包含pH缓冲液(如，Tris-HCl))。所以，本发明第一方面的方法还可以在步骤(1)前包括：步骤(A)：提取样品中的核酸，获得核酸提取液。采用本发明具体实施方式优选的核酸提取的方法，可以消除在PCR检测中出现具有感染性的埃博拉病毒，这可能与埃博拉病毒的本身性质有关。当然，步骤(A)也可以不出现在第一方面的方法中，因为直接对已知或有很大概率存在埃博拉病毒的样品的操作有着严格指引的环境。
在本文中，所检测的“样品”是潜在可能含有靶核酸或病毒的离体样品，如食品、血液、血液制品、尿液、唾液、医疗用品或药品等。本发明的方法优选不是诊断方法，如可用于公共卫生领域的血液样品检测(如，输血前血液样品检测，其直接目的是判断是否可以使用该血液样品，而非对患者进行诊断)，以及检验检疫领域的产品安全检测(如，衣物、水源中是否污染有上述病毒，其直接目的是检测产品安全/质量)。本发明的方法优选仅限于对离体样品的检测，检测的直接结果是靶核酸或病毒的存在性与否。即使对于利用本发明的检测方法检测人或动物的血液样品中病原体(如，病毒)上的靶核酸，也只能直接得出靶核酸的存在与否，还需要有经验的医生或取样人员判断检测出的靶核酸是来自于血液中的病原体还是取样时不慎污染的病原体，而不能直接得到疾病的诊断结果或健康状况；即使靶核酸来自于血液中的病原体，也只能说明相应人或动物是相应病原体的携带者，还需要有经验的医生根据相应人或动物的体质、病史、临床症状等综合情况才能判断出是否会造成疾病或对健康状况有影响。
在本文中，“单个PCR反应容器”指所述实时PCR方法在技术上是在同一个容器中进行的，没有必要更换容器。最优选其中所述容器是PCR反应管，其它可以进行PCR反应并可进行实时荧光检测的容器也在本发明的保护范围内。在本发明第一方面的实时PCR方法中，在同一个容器中就可以完成PCR扩增和实时检测的步骤，整个过程不必更换容器，因而方便了操作者。操作者只需要向容器中加入样品与各种试剂即可，就可以通过市售的普通实时荧光PCR仪来自动完成，整个过程操作者只需添加样品和试剂即可，非常方便。尤其是，整个过程只需添加样品和试剂的步骤干预，便于实现全自动操作，如使用中国专利申请2007100030261公开的自动微量加液系统(即，吸取和分配实验液体的移液装置及带有该装置的PCR仪)，即可完成本发明检测方法的全过程自动化，从而节约了人力成本并最大程度降低了人为失误的可能性，因此本发明的检测方法便于自动化所带来的成本和可靠性优势是可以预期的。
在本文中，“五重”检测指的是同时能检测并分辨的核酸有五种，即来自埃博拉-扎伊尔型(EBO-Zaire)、埃博拉-苏丹型(EBO-Sudan)、埃博拉-本迪布焦型(EBO-Bundibugyo)、埃博拉-塔伊森林型(EBO-Taiforest)和埃博拉-莱斯顿型(EBO-Restor)的病毒核酸。
尽管由于大量引物和探针同处一个体系，相互干扰使得部分检测曲线的阈值被压低，但是所有检测曲线仍旧有指数扩增期清晰可辨，籍此可以判断结果，当然更量化可以考虑通过Ct值来判断。在实时荧光PCR反应中，Ct值表示每个PCR反应管内荧光信号到达实时荧光PCR仪所默认设定的阈值时所经历的循环数，其具有良好的再现性，因此可以用于作为判读结果的优良指标。在本发明的第一方面的方法中，对于步骤(3)的检测结果判断，其中一种靶核酸的荧光检测结果计算出的Ct值<45，则这种靶核酸存在于样品中；一种靶核酸的荧光检测结果计算出的Ct值>45，则这种靶核酸不存在于样品中。这是我们经过长期大量试验摸索出来的经验，可靠性和重复性俱佳。因此也优选在本发明的第一方面的方法中，优选不采用内对照核酸。
本发明人发现，如果采用合适的探针的浓度，可以进一步提高本发明的第一方面的方法的检测灵敏度。所以，优选在本发明的第一方面的方法中，每种靶核酸探针在在所述单个PCR反应容器中的浓度大于5pmol/ml，优选为6～12pmol/ml，更优选为7～10pmol/ml，最优选为8pmol/ml。另外，优选在本发明的第一方面的方法中，在步骤(1)中所述单个PCR反应容器中还进一步混合有PCR反应所需的其他试剂，如盐。还优选了甘油浓度，用以延长PCR条件下酶活耐久力。在本发明的具体实施方式中，盐优选是Mg盐。本领域技术人员还可以容易地选择出其他pH缓冲剂(如磷酸缓冲液等)来调节到合适的pH，也可以容易地选择出其他可溶性盐(如KCl等)来调节离子强度。另外，还可以进一步混合有抗氧化剂(还原剂)、蛋白(酶)保护剂(如，牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)等)。这些成分的选择对于本领域技术人员来说都是熟知的。
在本文中，核酸按照本领域所常用的表示方法表示，其序列如未特别指出，均为5’端到3’端方向。其中，探针上标记有荧光标记物。荧光标记物可以位于探针的5’端、内部和/或3’端，优选位于5’端和/或3’端。在本发明的第一方面的方法中，不同种探针(之间所标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，这样能够同时或快速地顺序扫描不同的检测波长，分别记录下各种荧光基团的荧光变化，从而能够进行同时检测。在本文中，探针具有本领域技术人员所熟知的含义，其由为能与扩增出的靶核酸单链结合的单链DNA。通常，在每种探针的核苷酸序列的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。优选其中各种探针标记有不同的荧光基团。优选荧光基团及其淬灭基团是市售的，如可以采用FAMTM/GreenI、/JOE/HEX、NEDTM/TAMRATM/ROXTM/Texas和等常规产品，它们的检测波长互不相同，也可以委托公司合成标记有荧光标记的探针。在本发明的具体实施方式中，其中采用的标记有不同检测波长的荧光标记的探针都是委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成的，纯度达到HPLC纯，不含杂带。优选在本发明的第一方面的方法中，各种探针标记有不同的荧光基团。在本发明的具体实施方式中，优选的荧光基团是FAM、VIC、NED、TexasRed和CY5。
本领域技术人员能够根据引物及相应需要PCR扩增的核酸来设计PCR反应条件。对于本发明的五重检测，为了平衡不同种核酸的扩增条件，本发明人经过长期摸索，优化出的条件为：PCR反应的每个循环的条件为94℃10秒、55℃15秒以及65℃45秒。在本发明的具体实施方式中，PCR反应优选先25℃保温5分钟42℃反转录35分钟并94℃变性10分钟，然后进行上述条件的45个循环。
在第二方面，本发明提供了用于在单个PCR反应容器中五重检测核酸提取液中靶核酸的实时PCR方法的检测试剂盒，其包括DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物对和靶核酸探针，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，其中，
靶核酸引物对包括
EBV-Z-F:GCCACTCACGGACAATGACA，
EBV-Z-R:GCATGCGAGGGCTGGTT，
EBV-S-F:GGCAGCTCTTGGCTCACTTG，
EBV-S-R:TGAGGAGACGTGCAAATGGA，
EBV-B-F:ACCTCCGACGCGGTACAC，
EBV-B-R:TGTGGGTGAACAGGAACATCA，
EBV-T-F:GACCCGGATGATGGCAGAT，
EBV-T-R:GGCATTCGCCGTCTCACTA，
EBV-R-F:GCACCGAGGCCCAGAAC，和
EBV-R-R:CTTCGTGCACTGGTGAGAGTCT，
靶核酸探针包括：
EBV-Z-P:AAGAAATGAACCCTCCGGC，
EBV-S-P:CAAGCATGGAGAATAT，
EBV-B-P:CAAGACAGGCAACCTA，
EBV-T-P:CAACAATTATGGAGACTATC，和
EBV-R-P:TACGACCGCCAATCG。
在试剂盒中，不同的试剂可以分装在不同容器中，也可以选择几种长期保存而不发生化学反应的试剂合并保存在相同的容器中。容器可以是瓶、盒、注射器等能容纳上述试剂的容器，例如常规用于装PCR、酶或核酸试剂的容器。检测试剂盒中还可以有标签或说明书，用以指示按照本发明第一方面所述方法进行操作。标签可以贴在上述容器上，或者直接打印到上述容器上，也可以提供独立的说明书。根据需要，如方便运输、存放的需要，试剂盒还可以进一步包装进更大的包装中，这样的产品也在本发明的范围内。
对于本发明第二方面的检测试剂盒，其中优选的各成分如本发明第一方面所述的那样优选。优选诸如，其中各种探针标记有不同的荧光基团，更优选荧光基团是FAM、VIC、NED、TexasRed和CY5；其中每种靶核酸探针在在所述单个PCR反应容器中的浓度大于5pmol/ml，优选为6～12pmol/ml，更优选为7～10pmol/ml，最优选为8pmol/ml。也优选其中不含有内对照核酸。
试剂盒中还可以包含提取样品中的核酸获得核酸提取液所用的试剂。因此本发明第二方面的试剂盒还可以包括磁珠提取法所需试剂。优选其中磁珠提取法所需试剂包括：
核酸萃取液，优选核酸萃取液包含异硫氰酸胍、乙二胺四乙酸钠、吐温-20、高氯酸钠、乙醇和pH缓冲液(如，Tris-HCl)；
第一次洗涤所用的洗涤液，优选其包含高氯酸钠和乙醇；
第二次洗涤所用的洗涤液，优选其包含乙醇；和，
洗脱所用的洗脱液，优选其包含pH缓冲液(如，Tris-HCl)。
在第三方面，本发明提供了本发明第二方面所述的试剂盒在制备用于在单个PCR反应容器中五重检测核酸提取液中靶核酸的实时PCR方法的检测试剂产品中的应用，优选提供了本发明第二方面所述的检测试剂盒在制备用于本发明第一方面所述方法的检测试剂产品中的应用。在本文中，检测试剂产品可以是检测试剂盒本身，也可以是合并装有多个检测试剂盒的更大包装产品。根据前文所述，本领域技术人员很容易理解其中检测试剂盒的成分以及其中方法的流程。
相应地，在第四方面，本发明提供了本发明第二方面所述的试剂盒在制备用于五重检测样品中埃博拉-扎伊尔型(EBO-Zaire)、埃博拉-苏丹型(EBO-Sudan)、埃博拉-本迪布焦型(EBO-Bundibugyo)、埃博拉-塔伊森林型(EBO-Taiforest)和埃博拉-莱斯顿型(EBO-Restor)的检测试剂中的应用。
在第五方面，本发明提供了互不干扰实时PCR的核酸混合物，其是引物或探针的混合物，所述引物或探针选自
EBV-Z-F:GCCACTCACGGACAATGACA，
EBV-Z-R:GCATGCGAGGGCTGGTT，
EBV-S-F:GGCAGCTCTTGGCTCACTTG，
EBV-S-R:TGAGGAGACGTGCAAATGGA，
EBV-B-F:ACCTCCGACGCGGTACAC，
EBV-B-R:TGTGGGTGAACAGGAACATCA，
EBV-T-F:GACCCGGATGATGGCAGAT，
EBV-T-R:GGCATTCGCCGTCTCACTA，
EBV-R-F:GCACCGAGGCCCAGAAC，
EBV-R-R:CTTCGTGCACTGGTGAGAGTCT，
EBV-Z-P:AAGAAATGAACCCTCCGGC，
EBV-S-P:CAAGCATGGAGAATAT，
EBV-B-P:CAAGACAGGCAACCTA，
EBV-T-P:CAACAATTATGGAGACTATC，和
EBV-R-P:TACGACCGCCAATCG。
该混合物可以用于本发明的第一方面的方法中，也可以用于制备本发明第二的试剂盒。
本发明的有益效果在于：本发明的方法能够五重检测样品中是否存在埃博拉-扎伊尔型(EBO-Zaire)、埃博拉-苏丹型(EBO-Sudan)、埃博拉-本迪布焦型(EBO-Bundibugyo)、埃博拉-塔伊森林型(EBO-Taiforest)和埃博拉-莱斯顿型(EBO-Restor)，五重引物/探针无交叉干扰，保证了的准确性、可靠性、特异性、灵敏度和重复性，尤其是除了能有效抑制假阴性结果，还能在实践中消除更易于引起恐慌的假阳性结果，所以更适合实践推广使用；而且，本发明的方法使用目前常规的市售实时荧光PCR设备，无需改造，操作方便并节省成本，并且可以不使用内对照监控，进一步节约了成本。
为了便于理解，以下将通过具体的附图、实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
附图说明
图1显示了示例性的本发明实施例中对埃博拉-扎伊尔型(EBO-Zaire)、埃博拉-苏丹型(EBO-Sudan)、埃博拉-本迪布焦型(EBO-Bundibugyo)、埃博拉-塔伊森林型(EBO-Taiforest)和埃博拉-莱斯顿型(EBO-Restor)进行五重实时PCR的检测图谱，其结果曲线能够清晰区分。
具体实施方式
以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子可隆实验指南》(第三版)(ColdSpringHarborlaboratoryPress)、《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《RNA实验技术手册》(科学出版社,北京,中国,2004年)、《免疫检测技术》(科学出版社,北京,中国,1991)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列方法来实施。其中，所用的探针、引物可以委托上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
实施例1核酸的提取
在国家卫生部临检中心的许可和监管下，对以下埃博拉病毒标准品的核酸进行了提取：埃博拉-扎伊尔型(EBO-Zaire)、埃博拉-苏丹型(EBO-Sudan)、埃博拉-本迪布焦型(EBO-Bundibugyo)、埃博拉-塔伊森林型(EBO-Taiforest)和埃博拉-莱斯顿型(EBO-Restor)。
核酸的提取按照磁珠提取法进行提取，为了同时适应上述五种病毒的核酸提取，改进如下：向1uL各种稀释度的标准品中加入90uL核酸萃取液(配方及终浓度为：异硫氰酸胍1.2M、乙二胺四乙酸钠(pH8.0)10mM、吐温-202％(W/W)、高氯酸钠1M、乙醇40％(V/V)、Tris-HCl(pH8.0)10mM)，于42℃保温10min，然后加入10uLD-BeadsDNA磁珠悬浮液(50mg/mL，可购自北京艾比根生物技术有限公司)，振荡混合均匀后，套在磁架上施加磁场，弃去其中液体，然后加入200uL洗涤液A(配方及终浓度为：高氯酸钠1M、乙醇30％(V/V))，洗涤后弃去洗涤液A，再加入200uL洗涤液B(配方及终浓度为：乙醇70％(V/V))，洗涤后弃去洗涤液B，最后加入洗脱液(配方及终浓度为：Tris-HCl(pH8.0)10mM)，于42℃保温10min，吸出并保留液体，即为核酸提取液。经国家卫生部临检中心授权测试，在所有的核酸提取液中均未检出具有感染性的埃博拉病毒。
实施例2五重实时PCR测试
1，引物及探针序列
委托合成如下引物对和探针：
检测埃博拉-扎伊尔型(EBO-Zaire)的引物对：
EBV-Z-F:GCCACTCACGGACAATGACA，
EBV-Z-R:GCATGCGAGGGCTGGTT，
检测埃博拉-扎伊尔型(EBO-Zaire)的探针：
EBV-Z-P:AAGAAATGAACCCTCCGGC，
检测埃博拉-苏丹型(EBO-Sudan)的引物对：
EBV-S-F:GGCAGCTCTTGGCTCACTTG，
EBV-S-R:TGAGGAGACGTGCAAATGGA，
检测埃博拉-苏丹型(EBO-Sudan)的探针：
EBV-S-P:CAAGCATGGAGAATAT，
检测埃博拉-本迪布焦型(EBO-Bundibugyo)的引物对：
EBV-B-F:ACCTCCGACGCGGTACAC，
EBV-B-R:TGTGGGTGAACAGGAACATCA，
检测埃博拉-本迪布焦型(EBO-Bundibugyo)的探针：
EBV-B-P:CAAGACAGGCAACCTA，
检测埃博拉-塔伊森林型(EBO-Taiforest)的引物对：
EBV-T-F:GACCCGGATGATGGCAGAT，
EBV-T-R:GGCATTCGCCGTCTCACTA，
检测埃博拉-塔伊森林型(EBO-Taiforest)的探针：
EBV-T-P:CAACAATTATGGAGACTATC，
检测埃博拉-莱斯顿型(EBO-Restor)的引物对：
EBV-R-F:GCACCGAGGCCCAGAAC，和
EBV-R-R:CTTCGTGCACTGGTGAGAGTCT，
检测埃博拉-莱斯顿型(EBO-Restor)的探针：
EBV-R-P:TACGACCGCCAATCG；
2，荧光标记
在上述探针EBV-Z-P、EBV-S-P、EBV-B-P、EBV-T-P和EBV-R-P的5’端分别委托合成标记荧光标记FAM、VIC、NED、TexasRed和CY5，并在3’端标记相应的淬灭基团。
3，PCR反应条件
PCR反应体系总体积为20μl，其中各组分的终浓度分别为：核酸提取液(相对于样品，100倍稀释)1uL，上述5对引物对中的每一种引物含量为15pmol/ml，上述5种探针中的每一种含量增加至8pmol/ml，Mg2+(MgCl2)浓度为3.75mmol/ml，dNTP浓度各为0.2mmol/ml，UNG酶含量为0.05U，2×PCRbuffer(可购自TaKaRa公司，pH8.3，无Mg2+)为10ul，TaqDNA聚合酶为2U，甘油15％(V/V)，余量为去离子水。
反应流程如下：
25℃5分钟42℃35分钟94℃10分钟顺序进行
94℃10秒，55℃15秒，65℃45秒×45个循环
使用ABI7500实时荧光PCR仪，荧光采集FAM、VIC、NED、TexasRed和CY5检测波长。
4，结果判断
用ABI7500荧光仪进行上述PCR检测，基线和阈值设定为ABI7500荧光仪默认设定值。荧光(FAM、VIC、NED、TexasRed或CY5)层Ct值大于45，则判定为相应病毒的核酸检测阴性；小于等于45，则判定相应病毒的核酸检测阳性。如图1所示，本发明的方法能够在同一个PCR反应管中一次性同时检测极低浓度(10copies/ml)样品中的上述各亚型病毒的靶核酸，而且对5种亚型的检测互相不干扰，均达到了超敏的检测灵敏度，对于埃博拉这种增殖迅速的病毒来说，已经完全够用。
以上测试重复120次(包括样品中只添加一、二、三或四种病毒标准品的核酸提取液，或者未添加任何提取液的情况，但是其他检测条件不变)，结果均正确，表明本发明准确性和可靠性好，无需内对照。
5，临床检测
在知情同意的情况下，对从始发地为西非国家进入我国国境的73名成人(其中有11名有发烧症状的病人)的血样进行上述PCR的快速检测，每人等待检测结果时间不超过一小时。经检测，无一人感染埃博拉病毒的这五种亚型。
另外，用ELISA法分别检测这五种亚型的埃博拉病毒，结果与上述PCR方法的检测结果一致；并且，11名有发烧症状的病人经额外诊断，有2人患有登革热，1人患有黄热病，其余均为普通病毒性上呼吸道感染而引起的发烧，均已妥善治疗。这些确诊工作表明，上述PCR方法能够有效消除对埃博拉病毒检测的假阳性结果，尤其是不受西非其他常见传染病的病原体的干扰，在实践中可以避免引起不必要的恐慌。
。

Claims (14)

1.在单个PCR反应容器中五重检测核酸提取液中靶核酸的实时PCR方法，其是非诊断方法，所述靶核酸来自埃博拉-扎伊尔型、埃博拉-苏丹型、埃博拉-本迪布焦型、埃博拉-塔伊森林型和埃博拉-莱斯顿型，其包括：
(1)在所述单个PCR反应容器中混合核酸提取液、DNA聚合酶、逆转录酶、RNA保护剂、dNTP、靶核酸引物对和靶核酸探针，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，其中，
靶核酸引物对包括
GCCACTCACGGACAATGACA，
GCATGCGAGGGCTGGTT，
GGCAGCTCTTGGCTCACTTG，
TGAGGAGACGTGCAAATGGA，
ACCTCCGACGCGGTACAC，
TGTGGGTGAACAGGAACATCA，
GACCCGGATGATGGCAGAT，
GGCATTCGCCGTCTCACTA，
GCACCGAGGCCCAGAAC，和
CTTCGTGCACTGGTGAGAGTCT，
靶核酸探针包括：
AAGAAATGAACCCTCCGGC，
CAAGCATGGAGAATAT，
CAAGACAGGCAACCTA，
CAACAATTATGGAGACTATC，和
TACGACCGCCAATCG；
(2)进行PCR反应，并实时检测不同波长的荧光；和，
(3)根据荧光检测结果判断是否有靶核酸存在于核酸提取液中。
2.权利要求1所述的方法，其中荧光基团是FAM、VIC、NED、TexasRed和CY5。
3.权利要求1所述的方法，其中PCR反应的每个循环的条件为94℃10秒、55℃15秒以及65℃45秒。
4.权利要求1所述的方法，其中每种靶核酸探针在在所述单个PCR反应容器中的浓度大于5pmol/ml。
5.权利要求4所述的方法，其中每种靶核酸探针在在所述单个PCR反应容器中的浓度为6～12pmol/ml。
6.权利要求5所述的方法，其中每种靶核酸探针在在所述单个PCR反应容器中的浓度为7～10pmol/ml。
7.权利要求6所述的方法，其中每种靶核酸探针在在所述单个PCR反应容器中的浓度为8pmol/ml。
8.权利要求1所述的方法，其中核酸提取液是对样品采用磁珠提取法提取的。
9.用于在单个PCR反应容器中五重检测核酸提取液中靶核酸的实时PCR方法的检测试剂盒，其包括DNA聚合酶、逆转录酶、RNA保护剂、dNTP、靶核酸引物对和靶核酸探针，其中所述探针标记有荧光基团和淬灭基团，而且各种探针标记的荧光基团的荧光检测波长互不相同，其中，
靶核酸引物对包括
GCCACTCACGGACAATGACA，
GCATGCGAGGGCTGGTT，
GGCAGCTCTTGGCTCACTTG，
TGAGGAGACGTGCAAATGGA，
ACCTCCGACGCGGTACAC，
TGTGGGTGAACAGGAACATCA，
GACCCGGATGATGGCAGAT，
GGCATTCGCCGTCTCACTA，
GCACCGAGGCCCAGAAC，和
CTTCGTGCACTGGTGAGAGTCT，
靶核酸探针包括：
AAGAAATGAACCCTCCGGC，
CAAGCATGGAGAATAT，
CAAGACAGGCAACCTA，
CAACAATTATGGAGACTATC，和
TACGACCGCCAATCG。
10.权利要求9所述的试剂盒，其中荧光基团是FAM、VIC、NED、TexasRed和CY5。
11.权利要求9所述的试剂盒，其还包括磁珠提取法所需试剂。
12.权利要求9～11之任一所述的试剂盒在制备用于在单个PCR反应容器中五重检测核酸提取液中靶核酸的实时PCR方法的检测试剂产品中的应用。
13.权利要求12所述的应用，其中所述检测试剂产品是用于权利要求1-8之任一所述的方法的检测试剂产品。
14.互不干扰实时PCR的核酸混合物，其是引物或探针的混合物，所述引物或探针是
GCCACTCACGGACAATGACA，
GCATGCGAGGGCTGGTT，
GGCAGCTCTTGGCTCACTTG，
TGAGGAGACGTGCAAATGGA，
ACCTCCGACGCGGTACAC，
TGTGGGTGAACAGGAACATCA，
GACCCGGATGATGGCAGAT，
GGCATTCGCCGTCTCACTA，
GCACCGAGGCCCAGAAC，
CTTCGTGCACTGGTGAGAGTCT，
AAGAAATGAACCCTCCGGC，
CAAGCATGGAGAATAT，
CAAGACAGGCAACCTA，
CAACAATTATGGAGACTATC，和
TACGACCGCCAATCG。
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