CN110527734A - 一组可视化检测结核分枝杆菌的引物和试剂盒 - Google Patents

一组可视化检测结核分枝杆菌的引物和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一组可视化检测结核分枝杆菌的引物和试剂盒，涉及分子检测技术领域。本发明提供的可视化检测结核分枝杆菌的引物包括外引物对F3和B3、内引物对FIP和BIP和环引物对LF和LB；所述F3的序列如SEQ ID NO.1所示，所述B3的序列如SEQ ID NO.2所示；所述FIP的序列如SEQ ID NO.3所示，所述BIP的序列如SEQ ID NO.4所示；所述LF的序列如SEQ ID NO.5所示，所述LB的序列SEQ ID NO.6所示。本发明提供的引物能够实现结核分枝杆菌高特异性、高灵敏度的可视化检测。

Description

一组可视化检测结核分枝杆菌的引物和试剂盒
技术领域
本发明涉及分子检测技术领域，具体涉及一组可视化检测结核分枝杆菌的引物和试剂盒。
背景技术
结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacterium.tuberculosis)引起的严重影响人类健康的慢性传染病，是至今仍然困扰人类的古老疾病之一，在古埃及木乃伊中就已发现结核分枝杆菌的存在，即使在最近几年，每年还大约有900万人感染结核。随着耐药与多重耐药菌株的出现，结核病的控制难度不断增加，而建立快速、灵敏度高、特异性强的诊断方法，对于结核病的防治工作具有重要意义，也是进行早期隔离、诊治的前提。
目前，结核病的诊断方法主要是痰涂片抗酸染色法、罗氏固体培养法、液体快速培养、核酸扩增等方法。染色涂片虽然简单易行，但敏感性差，检出率低。罗氏固体培养法培养周期长，需要4～8周，改进后液体快速培养系统将时间缩短到10天左右，但花费昂贵且容易受到污染。以扩增核酸为基础的实验技术，具有快速、灵敏、特异强等特点，但因PCR技术需要的热循环设备格昂贵而很难得到推广，且常规PCR方法的检测结果判定通常依据凝胶电泳和专业凝胶成像系统观测结果，而不能直接通过肉眼判定。目前结核分枝杆菌的检测需要一种准确、便捷、低成本和易于推广使用的高效方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一组可视化检测结核分枝杆菌的引物和试剂盒。本发明提供的引物能够实现结核分枝杆菌高特异性、高灵敏度的可视化检测。
本发明提供了一组可视化检测结核分枝杆菌的引物，包括外引物对F3和B3、内引物对FIP和BIP和环引物对LF和LB；所述F3的序列如SEQ ID NO.1所示，所述B3的序列如SEQID NO.2所示；所述FIP的序列如SEQ ID NO.3所示，所述BIP的序列如SEQ ID NO.4所示；所述LF的序列如SEQ ID NO.5所示，所述LB的序列SEQ ID NO.6所示。
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述引物的试剂盒，包括上述技术方案所述引物、dNTP、BstDNA聚合酶和含阴阳指示剂的反应缓冲液。
优选的是，所述阴阳指示剂包括phenolsulfonphthalein。
优选的是，所述外引物的使用终浓度各为0.2μM。
优选的是，所述内引物的使用终浓度各为1.6μM。
优选的是，所述环引物的使用终浓度各为0.8μM。
优选的是，每25μL检测体系包括上述技术方案所述引物F3和B3各0.5μL，LF和LB各1.5μL，FIP和BIP各1μL，dNTP 3μL，BstDNA聚合酶1μL和2×含阴阳指示剂的反应缓冲液12.5μL。
本发明提供了一组可视化检测结核分枝杆菌的引物。本发明提供的引物能够实现结核分枝杆菌高特异性、高灵敏度的检测。试验结果表明，本发明对于结核分枝杆菌的检测特异性高，灵敏度可达5pg结核分枝杆菌基因组，完全可以满足结核分枝杆菌诊断要求。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的特异性检测结果图；
图2为本发明实施例1提供的灵敏度检测结果图；
图3为本发明实施例2提供的结核患者和健康人检测结果示意图；
图4为本发明实施例3提供的不同反应温度检测结果图；
图5为本发明实施例4提供的不同反应时间检测结果图。
具体实施方式
本发明提供了一组可视化检测结核分枝杆菌的引物，包括外引物对F3和B3、内引物对FIP和BIP和环引物对LF和LB；所述外引物对的序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示；所述内引物对的序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述环引物对的序列如SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示。在本发明中，所述可视化检测优选基于环介导等温扩增反应。本发明所述引物特异性强，基于所述引物的试剂盒检测特异性强、灵敏度高，且操作方便。本发明对所述引物的合成方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规引物合成公司进行合成即可。
在本发明中，所述引物的核苷酸序列具体为：
F3:5’-GCCGGTGTAGCTGGCT-3’(SEQ ID NO.1)；
B3:5’-CCAGGCGACATAGACAACAG-3’(SEQ ID NO.2)；
FIP:5’-CAAACCGGCAAGCGTCAGAGAAGCGGCCGGAGTTGA-3’(SEQ IDNO.3)；
BIP:5’-CGTCACTGTCGTCCCCTGTCCAAGCGTGCGGAAGCAAG-3’(SEQ IDNO.4)；
LF:5’-TCGGTCGCATCCGACAGT-3’(SEQ ID NO.5)；
LB:5’-AAACGCGCAATAAGAGACTGCA-3’(SEQ ID NO.6)。
本发明还提供了一种基于上述技术方案所述引物的试剂盒，包括上述技术方案所述引物、dNTP、BstDNA聚合酶和含阴阳指示剂的反应缓冲液。在本发明中，所述反应缓冲液优选为LAMPbuffer。在本发明中，所述阴阳指示剂包括Phenolsulfonphthalein(PSP)，所述PSP能够感知环介导等温扩增反应中阳离子的数量的变化，而使反应体系颜色变化，阴阳指示剂在反应缓冲液中的浓度为0.1mM。在本发明中，所述外引物的终浓度各为0.2μM。在本发明中，所述内引物的终浓度各为1.6μM。在本发明中，所述环引物的终浓度各为0.8μM。具体地，为了更好地进行效果对比，本发明所述试剂盒优选还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照优选为结核分枝杆菌的混合液；所述阴性对照优选为非结核分枝杆菌，本发明对所述非结核分枝杆菌的种类没有具体限定。本发明所述试剂盒通过上述组分的组合，能够实现结核分枝杆菌的可视化检测，检测结果颜色差异明显，无需借助其它辅助设备，直接通过肉眼即可观察出扩增结果，颜色差异的灵敏度高。
在本发明中，每25μL检测体系包括上述技术方案所述引物F3和B3各0.5μL，LF和LB各1.5μL，FIP和BIP各1μL，dNTP 3μL，BstDNA聚合酶1μL和2×含阴阳指示剂的反应缓冲液12.5μL。在本发明中，所述dNTP的浓度优选为1.2mM。在本发明中，所述反应体系在具体检测时，优选添加2μL的模板DNA，水用于补足。本发明对所述水的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规PCR用水即可，如ddH2O。
本发明所述试剂盒在使用时，优选按照上述配比将各组分与样品混合后进行等温扩增。在本发明中，所述待测样品来自结核分枝杆菌DNA。所述试剂盒在用于结核分枝杆菌的检测时，所述检测的扩增程序优选为在恒温60～64℃反应40～70min，更优选为62℃反应50min。在本发明中，所述反应优选在恒温水浴装置中进行。在本发明中，用于终止反应的条件优选为80℃反应5min。
得到扩增产物后，本发明直接肉眼观测检测结果，当检测结果的颜色为黄色时，检测结果为阳性；当检测结果的颜色为红色或粉红时，检测结果为阴性。本发明无需对反应产物进行进一步处理，直接通过观察反应液的颜色即可得到检测结果，且本发明检测灵敏度高，能够检测极限为5pg结核分枝杆菌基因组。本申请提供的引物和试剂盒在检测过程中，不需昂贵的设备，不需要荧光染料以及特殊设备，仅仅需要金属浴或水浴锅，肉眼就可以判断结果，具有明显优势。
下面结合具体实施例对本发明所述的一组可视化检测结核分枝杆菌的引物和试剂盒做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
结核分枝杆菌可视化检测方法
本发明提供的可视化检测结核分枝杆菌的试剂盒在检测过程中包括如下组分：
反应管中含有引物F3和B3的终浓度各为0.2μM，LF和LB的终浓度为0.8μM，FIP和BIP的终浓度各为1.6μM，dNTP 3μL，BstDNA聚合酶1μL，模板DNA2μL，2×LAMPbuffer 12.5μL(含阴阳性结果指示剂)，用ddH2O补充至总体积25μL。反应的条件为62℃反应50min。在具体的试验中，为了进行效果对比，试剂盒有阳性对照和阴性对照，阳性对照为结核分枝杆菌的混合液；阴性对照为非结核分枝杆菌。反应完成后，反应体系呈黄色则为阳性，呈红色是为阴性。
可视化检测方法的特异性检测结果如图1所示，其中，图1a为结核分枝杆菌，图1b为牛分枝杆菌，图1c为幽门螺杆菌，图1d为ddH2O。图1可知，唯有结核分枝杆菌基因组为模板的检测过程中，反应体系终点呈现黄色，而其他微生物基因组为模板，则该检测过程结束后，体系呈现红色，表明，本方法对于结核分枝杆菌具有很高的特性性。
可视化检测方法的灵敏度检测结果如图2所示，其中，图2-1至图2-5中结核分枝杆菌基因组浓度依次为5ng、500pg、50pg、5pg和1fg。图2可知，随着反应体系中结核分枝杆菌基因组浓度的降低，该反应体系颜色由刚开始的黄色(阳性结果)最终变成红色(阴性结果)。这说明，当模板浓度低到1fg时，该检测方法无法正确辨别出检测模板是结核分枝杆菌，然而，当模板浓度大于等于5pg时，该检测方法能够正确鉴别出现样品含有结核分枝杆菌，这说明本检测方法的最低检测线为5pg结核分枝杆菌基因组。本实施实例提供的可视化检测试剂盒，特异性强、灵敏度高，操作方便，可通过肉眼观察扩增结果，简便、易于操作。
实施例2
结核分枝杆菌可视化检测
本实施例在检测的过程中使用实施例1所提供的试剂盒，具体的检测方法如下：
(1)本实施例中的待检提取液取自确诊肺结核的就诊者的痰液，即将该痰液作为痰标本，用2倍体积2％N-乙酰-L-半胱氨酸NaOH溶液进行消化，旋紧盖子，在涡旋振荡器上涡旋震荡2min，直至痰标本充分液化，利用基因组提取试剂盒按现有的提取手段，提取样品DNA。
(2)在反应管中加入试剂盒中扩增反应液并将反应管置于62℃恒温水浴箱内，反应50min；
(3)将步骤(2)的反应管置于80℃恒温水浴箱内5min，终止反应，根据反应管中液体的颜色变化判断扩增结果。
反应完成后，反应体系呈黄色则为阳性，呈红色是为阴性，检测结果如图3所示，其中图3-1为结核患者甲痰液，图3-2为结核患者乙痰液，图3-3为阳性质控对照，图3-1至图3-3均为黄色，呈阳性；图3-4为健康人丙痰液，图3-5为健康人丁痰液，图3-6为ddH2O，图3-4至图3-6均为红色，呈阴性。
本实施实例提供的用于检测结核分枝杆菌的检测方法，过程简单，灵敏度高，检测过程便捷，扩增反应快，节省时间，50min内即可完成扩增，扩增结果通过肉眼即可观察，能特异性检测结核分枝杆菌。
实施例3
本实施例在检测的过程中使用实施例1所提供的试剂盒，设置不同的反应温度(58℃、60℃、62℃、64℃和66℃)，反应时间均为50min。对10pg/μL结核分子杆菌DNA进行检测，检测结果如图4所示，其中图4-1为58℃的检测结果，图4-2为60℃的检测结果，图4-3为62℃的检测结果，图4-4为64℃的检测结果，图4-5为66℃的检测结果。图4的电泳图谱和可视化图谱表明，反应温度在60～64℃对应的亮度很强，62℃时观测效果最好，而在58℃和66℃则无电泳图谱条出现。
实施例4
本实施例在检测的过程中使用实施例1所提供的试剂盒，反应温度设为62℃，设置不同的反应时间(40min、50min、60min和70min)。对10pg/μL结核分子杆菌DNA进行检测，检测结果如图5所示，其中图5-1为反应40min的检测结果，图5-2为反应50min的检测结果，图5-3为反应60min的检测结果，图5-4为反应70min的检测结果。图5的电泳图谱和可视化图谱表明，反应时间在40～60min亮度强，结果易观测，其中，50min时观测效果最好，而在70min则电泳图谱条带亮度不如其他反应时间的亮度。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海奥奈特生物科技有限责任公司
<120> 一组可视化检测结核分枝杆菌的引物和试剂盒
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gccggtgtag ctggct 16
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccaggcgaca tagacaacag 20
<210> 3
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caaaccggca agcgtcagag aagcggccgg agttga 36
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgtcactgtc gtcccctgtc caagcgtgcg gaagcaag 38
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcggtcgcat ccgacagt 18
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaacgcgcaa taagagactg ca 22

Claims (7)

1.一组可视化检测结核分枝杆菌的引物，其特征在于，包括外引物对F3和B3、内引物对FIP和BIP和环引物对LF和LB；所述F3的序列如SEQ ID NO.1所示，所述B3的序列如SEQ IDNO.2所示；所述FIP的序列如SEQ ID NO.3所示，所述BIP的序列如SEQ ID NO.4所示；所述LF的序列如SEQ ID NO.5所示，所述LB的序列SEQ ID NO.6所示。
2.一种基于权利要求1所述引物的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物、dNTP、BstDNA聚合酶和含阴阳指示剂的反应缓冲液。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述阴阳指示剂包括Phenolsulfonphthalein。
4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述外引物的使用终浓度各为0.2μM。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述内引物的使用终浓度各为1.6μM。
6.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述环引物的使用终浓度各为0.8μM。
7.根据权利要求2～6任意一项所述的试剂盒，其特征在于，每25μL检测体系包括权利要求1所述引物F3和B3各0.5μL，LF和LB各1.5μL，FIP和BIP各1μL，dNTP 3μL，BstDNA聚合酶1μL和2×含阴阳指示剂的反应缓冲液12.5μL。
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