CN107058517B - 一种用于结核分枝杆菌感染检测的试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于结核分枝杆菌感染检测的试剂盒，包括如下部分：由检测引物、10倍环介导等温扩增反应液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照、显色剂和菌体扩培液组成；所述的检测引物是由一对外引物F3/B3和一对内引物FIP/BIP组成。该试剂盒能够高效、快速、准确、灵敏的得到血液中结核分枝杆菌感染的检测结果，且检测结果特异性高、敏感性强，结果判断不需要使用电泳、眼易判断，非常适用于结核分枝杆菌的快速检测。

Description

一种用于结核分枝杆菌感染检测的试剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种用于结核分枝杆菌感染检测的试剂盒及检测方法。
背景技术
由人结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)所引起的结核病是严重危害人类健康的传染病。近几十年来由于人口流动，耐药结核菌传播，已成为所有传染病中的重要原因。如果得不到有效控制，在未来可能有更多的人发生结核病。
新型免疫学方法中的γ-干扰素(IFN-γ)释放实验(interferon-gammareleaseassay，IGRA)是现阶段检测结核分枝杆菌感染准确性较高的方法，现有的商用试剂盒有T-SPOT.TB和QuantiFERON-TBGoldIn-Tube(QFT-IT)，这两个试剂盒的敏感性和特异性分别为80-90％之间，尚有待改进。
环介导等温基因扩增(LAMP)是新型的基因扩增法，具有以下特点：简便、快速、不需要昂贵的仪器设备，适合现场使用，不需要对模板进行热变性过程，退火和延伸在同一温度(等温)条件下进行，大大减少了反应时间，能在短时间内获得结果。LAMP的灵敏度高，能从极低微量的拷贝中扩增出目的基因，扩增效率高达109-1010拷贝，比传统PCR技术高出2-3个数量级，具有与Real-Time TaqManPCR同样的敏感性。
然而，目前的大多数结核分枝杆菌的检测样品针对的是痰标本，痰标本取样多为病人自取，人为误差容易造成标本感染，影响检测的准确率。又因为结核病感染初期，血液中的结核分枝杆菌难以被精确的检测出，容易造成诊断不及时，影响结核病患者的诊断和有效治疗。所以，有必要开发一种依赖于LAMP技术、准确、快速检测结核分枝杆菌的新型试剂盒。
发明内容
本发明提供的一种用于结核分枝杆菌感染检测的试剂盒及检测方法，该试剂盒能够高效、快速、准确、灵敏的得到血液中结核分枝杆菌感染的检测结果，且检测结果特异性高、敏感性强。
本发明的目的是提供一种用于结核分枝杆菌感染检测的试剂盒，包括如下部分：
由检测引物、10倍环介导等温扩增反应液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照、显色剂和菌体扩培液组成；所述的检测引物是由一对外引物F3/B3和一对内引物FIP/BIP组成，
外引物F3的序列为：5’-CTGGGCCTCAAGCAAGG-3’
外引物B3的序列为：5’-CGACGTCGCTGACCACTT-3’
内引物FIP的序列为：
5’-CGGGCGACGGTTTCGAAGTCGGAAGACGGGGTCAACGGT-3’
内引物BIP的序列为：
5’-CGGCTGCAAGAGATGGCGTCTTGGGTCACCCTCTCGT-3’
其中，所述的一对外引物F3/B3与一对内引物FIP/BIP的摩尔数之比为1：6；所述的DNA聚合酶为BstDNA聚合酶，活力为8U/微升；所述的阴性对照为灭菌双蒸水；
每升所述菌体扩培液由以下组分制成：5-10g的葡萄糖、5-10g的鸡蛋清、6.7μmol的EDTA、100mL的甘油、30mmoL的二硫苏糖醇、8-12g的PEG-4000，余量为双蒸水；
每毫升所述显色剂由以下组分制备而成：950-960μL的20倍SYBR Green I、10-15mg的KCl，余量为双蒸水。
优选的，所述阳性对照为含有结核分枝杆菌的人血清。
优选的，上述用于结核分枝杆菌感染检测的试剂盒中，所述10倍环介导等温扩增反应液是由200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、40-100mmol/L硫酸镁、4-10mol/L甜菜碱、5-18mmol/L的dNTPs和质量百分浓度0.1％的TritonX-100组成，溶剂为双蒸水。
优选的，上述用于结核分枝杆菌感染检测的试剂盒中，每升所述菌体扩培液由以下组分制成：5g的葡萄糖、8g的鸡蛋清、6.7μmol的EDTA、100mL的甘油、30mmoL的二硫苏糖醇、10g的PEG-4000，余量为双蒸水。
优选的，上述用于结核分枝杆菌感染检测的试剂盒中，每毫升所述显色剂由以下组分制备而成：950μL的20倍SYBR Green I、15mg的KCl，余量为双蒸水。
本发明还提供了一种利用上述试剂盒的检测结核分枝杆菌的方法，包括以下步骤：
步骤1，取3个反应管，分别标记为测试管、阴性对照管和阳性对照管，分别向测试管、阴性对照管和阳性对照管内加入所述2μL的检测引物、1μL的DNA聚合酶、3μL的显色剂、17μL的10倍环介导等温扩增反应液；
步骤2，向测试管中加入2μL的待测样本；向阴性对照管中加入2μL的阴性对照；向阳性对照管内加入2μL的阳性对照，之后分别向测试管、阴性对照管和阳性对照管内加入15μL甘油；
步骤3，将步骤2的测试管、阴性对照管和阳性对照管置于65℃水浴60分钟，然后置于90℃水浴5分钟，终止反应，得到LAMP扩增产物；
步骤4，将所述LAMP扩增产物置于紫外灯下显色；若检测管呈现绿色荧光，则结合分枝杆菌的检测结果为阳性，若检测管不呈现绿色荧光，则结合分枝杆菌的检测结果为阴性。
与现有技术相比，本发明的用于结核分枝杆菌感染检测的试剂盒，具有以下有益效果：
(1)结果判断不需要使用电泳，显色方法特异性高、敏感性强、肉眼易判断，非常适用于结核分枝杆菌的快速检测。
(2)试剂盒中增加了菌体扩培液，潜伏期或者前期结核分枝杆菌感染者的血清或者痰液中结核分枝杆菌浓度较低，无法准确检测，定性检测我们增加了菌体扩培步骤，菌体扩培液中含有的鸡蛋清能够刺激结核分枝杆菌的细胞分裂，短时间内迅速增加菌体浓度，提高了检测精度。
(3)本发明使用的显色剂中添加了KCl，作为SYBR Green I与DNA的结合助剂，是更多的染料与DNA相结合，进行增加了目的DNA在紫外光下的显色强度。
附图说明
图1为利用本发明的试剂盒检测不同材料的结果对照图。
图1中，1号管为阳性对照，2号管为阴性对照，3号管为阳性检测样本，4号管为阴性检测样本。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，如Sambrook等主编的《分子克隆实验指南》中所述条件，或按照试剂盒陈述的步骤进行操作，由于不涉及发明点，故不对其步骤进行详细描述。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
下述结核分枝杆菌标准菌株H37Rv与《广泛耐药结核分枝杆菌与标准菌株H37Rv菌体差异蛋白的比较》(宗兆婧，《贵州医药》，2012年11月，36(11)：963-965。)中记载的结核分枝杆菌标准菌株H37Rv相同，由中国疾病预防控制中心提供，其只是起到对比检测结果的作用，并不涉及发明点。
实施例1
本发明提供了一种用于结核分枝杆菌感染检测的试剂盒，包括如下部分：
由检测引物、10倍环介导等温扩增反应液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照、显色剂和菌体扩培液组成；所述的检测引物是由一对外引物F3/B3和一对内引物FIP/BIP组成，：
外引物F3的序列为：5’-CTGGGCCTCAAGCAAGG-3’(SEQ ID NO.1)
外引物B3的序列为：5’-CGACGTCGCTGACCACTT-3’(SEQ ID NO.2)
内引物FIP的序列为(SEQ ID NO.3)：
5’-CGGGCGACGGTTTCGAAGTCGGAAGACGGGGTCAACGGT-3’
内引物BIP的序列为(SEQ ID NO.4)：
5’-CGGCTGCAAGAGATGGCGTCTTGGGTCACCCTCTCGT-3’
其中，所述的一对外引物F3/B3与一对内引物FIP/BIP的摩尔数之比为1：6；所述的DNA聚合酶为BstDNA聚合酶，活力为8U/微升；所述的阴性对照为灭菌双蒸水，所述阳性对照为含有结核分枝杆菌的人血清，优选的，阳性对照中的结核分枝杆菌为结核分枝杆菌标准菌株H37Rv；
所述10倍环介导等温扩增反应液(其中，数字“10”表示的是使用时稀释的倍数)是由200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、40mmol/L硫酸镁、4mol/L甜菜碱、5mmol/L的dNTPs和质量百分浓度0.1％的TritonX-100组成，溶剂为双蒸水，所述的mmol/L是摩尔浓度的单位，指的是每升溶液中所含有溶质的摩尔数；
其中，每升所述菌体扩培液由以下组分制成：5g的葡萄糖、8g的鸡蛋清、6.7μmol的EDTA、100mL的甘油、30mmoL的二硫苏糖醇、10g的PEG-4000，余量为双蒸水；
每毫升所述显色剂由以下组分制备而成：950μL的20倍SYBR Green I、15mg的KCl，余量为双蒸水。
需要说明的是，所述的dNTPs为含有四种dNTP的等量混合物。
实施例2
本发明提供了一种用于结核分枝杆菌感染检测的试剂盒，包括如下部分：
由检测引物、10倍环介导等温扩增反应液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照、显色剂和菌体扩培液组成；所述的检测引物是由一对外引物F3/B3和一对内引物FIP/BIP组成，
外引物F3的序列为：5’-CTGGGCCTCAAGCAAGG-3’(SEQ ID NO.1)
外引物B3的序列为：5’-CGACGTCGCTGACCACTT-3’(SEQ ID NO.2)
内引物FIP的序列为(SEQ ID NO.3)：
5’-CGGGCGACGGTTTCGAAGTCGGAAGACGGGGTCAACGGT-3’
内引物BIP的序列为(SEQ ID NO.4)：
5’-CGGCTGCAAGAGATGGCGTCTTGGGTCACCCTCTCGT-3’
其中，所述的一对外引物F3/B3和一对内引物FIP/BIP的摩尔数之比为1：6；所述的DNA聚合酶为BstDNA聚合酶，活力为8U/微升；所述的阴性对照为灭菌双蒸水，所述阳性对照为含有结核分枝杆菌的人血清，优选的，阳性对照中的结核分枝杆菌为结核分枝杆菌标准菌株H37Rv；
所述10倍环介导等温扩增反应液(其中，数字“10”表示的是使用时稀释的倍数)是由200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、100mmol/L硫酸镁、10mol/L甜菜碱、18mmol/L的dNTPs和质量百分浓度0.1％的TritonX-100组成，溶剂为双蒸水，所述的mmol/L是摩尔浓度的单位，指的是每升溶液中所含有溶质的摩尔数；
其中，每升所述菌体扩培液由以下组分制成：10g的葡萄糖、10g的鸡蛋清、6.7μmol的EDTA、100mL的甘油、30mmoL的二硫苏糖醇、12g的PEG-4000，余量为双蒸水；
每毫升所述显色剂由以下组分制备而成：960μL的20倍SYBR Green I、10mg的KCl，余量为双蒸水。
需要说明的是，所述的dNTPs为含有四种dNTP的等量混合物。
实施例3
本发明提供了一种用于结核分枝杆菌感染检测的试剂盒，包括如下部分：
由检测引物、10倍环介导等温扩增反应液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照、显色剂和菌体扩培液组成；所述的检测引物是由一对外引物F3/B3和一对内引物FIP/BIP组成，
外引物F3的序列为：5’-CTGGGCCTCAAGCAAGG-3’(SEQ ID NO.1)
外引物B3的序列为：5’-CGACGTCGCTGACCACTT-3’(SEQ ID NO.2)
内引物FIP的序列为(SEQ ID NO.3)：
5’-CGGGCGACGGTTTCGAAGTCGGAAGACGGGGTCAACGGT-3’
内引物BIP的序列为(SEQ ID NO.4)：
5’-CGGCTGCAAGAGATGGCGTCTTGGGTCACCCTCTCGT-3’
其中，所述的一对外引物F3/B3和一对内引物FIP/BIP的摩尔数之比为1：6；所述的DNA聚合酶为BstDNA聚合酶，活力为8U/微升；所述的阴性对照为灭菌双蒸水，所述阳性对照为含有结核分枝杆菌的人血清，优选的，阳性对照中的结核分枝杆菌为结核分枝杆菌标准菌株H37Rv；
所述10倍环介导等温扩增反应液(其中，数字“10”表示的是使用时稀释的倍数)是由200mmol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、80mmol/L硫酸镁、8mol/L甜菜碱、10mmol/L的dNTPs和质量百分浓度0.1％的TritonX-100组成，溶剂为双蒸水，所述的mmol/L是摩尔浓度的单位，指的是每升溶液中所含有溶质的摩尔数；
其中，每升所述菌体扩培液由以下组分制成：8g的葡萄糖、8g的鸡蛋清、6.7μmol的EDTA、100mL的甘油、30mmoL的二硫苏糖醇、8g的PEG-4000，余量为双蒸水；
每毫升所述显色剂由以下组分制备而成：950μL的20倍SYBR Green I、10mg的KCl，余量为双蒸水。
需要说明的是，所述的dNTPs为含有四种dNTP的等量混合物。
本发明所述的用于结核分枝杆菌感染检测的试剂盒的使用该方法如下：
步骤1，取3个反应管，分别标记为测试管、阴性对照管和阳性对照管，分别向测试管、阴性对照管和阳性对照管内加入所述2μL的检测引物、1μL的DNA聚合酶、3μL的显色剂、17μL的10倍环介导等温扩增反应液；
步骤2，向测试管中加入2μL的待测样本；向阴性对照管中加入2μL的阴性对照；向阳性对照管内加入2μL的阳性对照，之后分别向测试管、阴性对照管和阳性对照管内加入15μL甘油；
步骤3，将步骤2的测试管、阴性对照管和阳性对照管置于65℃水浴60分钟，然后置于90℃水浴5分钟，终止反应，得到LAMP扩增产物；
步骤4，将所述LAMP扩增产物置于紫外灯下显色；若检测管呈现绿色荧光，则结合分枝杆菌的检测结果为阳性，若检测管不呈现绿色荧光，则结合分枝杆菌的检测结果为阴性。
需要说明的是，为了节约成本，或者达到定性快检的目的，本发明的试剂盒及上述实施例中，可以不使用阳性对照；如果为了提高方法的检测精度，可以使用阳性对照，阳性对照的检测方法同上述测试管的检测方法。本发明的试剂盒及上述实施例中，所述结核分枝杆菌标准菌株H37Rv采用的培养基为苏通(Sauton)培养基；
其中苏通(Sauton)培养基的配方如下：
在100ml蒸馏水中加入：0.4g的天门冬素、0.2g的枸橼酸盐、0.05g的磷酸氢二钾0.05g的MgSO4.7H2O、0.05g的枸橼酸铁铵、6ml的甘油。
需要说明的是，如果针对的是定性检测，以快速、准确检测为目的，则检测之前还包括菌体扩培步骤，具体如下：
取1mg检测样本，置于2mL所述菌体扩培液中，37±1℃条件下培养2h，得到待测样本；所述检测样本可以是痰标本也可以是血清，如果是痰液检测样本，37±1℃条件下培养2h后应吸取除痰液之外的液体作为待测样本，如果是血清检测样本，将37±1℃条件下培养2h的液体直接作为待测样本。
本发明试剂盒的工作原理是：LAMP的整个反应分三步完成，即起初反应物模板的合成、循环扩增阶段、延伸和再循环。在一小时内该循环反应可使靶DNA累积到109拷贝，电泳后可见扩增终产物由大小不等的DNA片段组成，呈梯状条带，也可通过荧光染料来观察扩增结果。LAMP的整个反应分三步完成，即起初反应物模板的合成、循环扩增阶段、延伸和再循环。所述的SYBR Green I为高灵敏度的DNA荧光染料，SYBR Green I与双链DNA的亲和力非常高，对分子生物学中常用的酶没有抑制作用。
为了验证本发明试剂盒的效果，我们利用本发明的试剂盒检测不同样本，结果如图1所示，图1中，1号管为阳性对照，2号管为阴性对照，3号管为阳性检测样本，4号管为阴性检测样本。从图1中我们可以明显看出不同样本的颜色变化，其中，阳性样本与阳性对照的颜色相同，阴性检测样本与阴性对照管的颜色相同，且肉眼可明确观察到颜色的变化，增强了原显色剂SYBR Green I的显色效果，结果明显。
另外，为了比较不同检测方法的结果准确率，我们采用健康人血清作为研究对象，人为添加结核分枝杆菌，共制作20份样本，并同时使用常规方法和本发明实施例1试剂盒检测样本中的结核分枝杆菌，结果如表1所示。由表1可以看出，使用现有市售的结核杆菌检测试剂盒检测结果中，有4份样本并未检测出阳性结果，20份样本的阳性检测出率仅为80％；而使用本发明的试剂盒进行检测，其阳性检出率为100％。
表1两种试剂盒检测血清样本的结果
Figure BDA0001244096280000111
再者，我们以确诊为结核分枝杆菌感染患者作为检测对象，并同时使用常规方法和本发明实施例1试剂盒检测样本中的结核分枝杆菌，分别收集20例患者的痰液样本和血清样本进行检测，结果如表1所示。由表2可以看出，对于血清样本，使用现有市售的结核杆菌检测试剂盒检测结果中，有4份样本并未检测出阳性结果，20份样本的阳性检测出率仅为80％；对于痰液样本，使用现有市售的结核杆菌检测试剂盒检测结果中，有5份样本并未检测出阳性结果，20份样本的阳性检测出率仅为75％。
而使用本发明的试剂盒进行检测，对于血清样本，使用本发明的试剂盒进行检测，其阳性检出率为100％；对于痰液样本，使用本发明的试剂盒进行检测，有1份样本并未检测出阳性结果，20份样本的阳性检测出率为95％。
表2两种试剂盒检测痰液、血清样本的结果
Figure BDA0001244096280000121
此外，我们还比较了不同显色剂的显色效果，以阳性血清样本为检测对象，利用实施例1的试剂盒和实验组试剂盒进行检测，其中，两个试剂盒的唯一区别在于，实验组试剂盒使用的显色剂为20倍SYBR Green I，没有添加KCl。
我们采用相同的方法对阳性血清样本进行检测，并利用同一仪器检测荧光强度，结果如下：实施例1的试剂盒荧光强度信号响应值为4376，而实验组试剂盒的荧光强度信号响应值为2945。结果表明，KCl可以有效提高SYBR Green I的荧光强度信号响应值。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
序列表
<110> 新乡医学院第一附属医院
<120> 一种用于结核分枝杆菌感染检测的试剂盒及检测方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ctgggcctca agcaagg 17
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgacgtcgct gaccactt 18
<210> 3
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgggcgacgg tttcgaagtc ggaagacggg gtcaacggt 39
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cggctgcaag agatggcgtc ttgggtcacc ctctcgt 37

Claims (4)

1.鸡蛋清和KCl在制备检测结核分枝杆菌试剂盒中的用途，其特征在于，所述试剂盒由检测引物、10倍环介导等温扩增反应液、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照、显色剂和菌体扩培液组成；所述的检测引物是由一对外引物F3/B3和一对内引物FIP/BIP组成，
所述外引物F3的序列为：5’-CTGGGCCTCAAGCAAGG-3’
所述外引物B3的序列为：5’-CGACGTCGCTGACCACTT -3’
所述内引物FIP的序列为：5’-CGGGCGACGGTTTCGAAGTCGGAAGACGGGGTCAACGGT -3’
所述内引物BIP的序列为：
5’-CGGCTGCAAGAGATGGCGTCTTGGGTCACCCTCTCGT -3’
其中，所述的一对外引物F3/B3与一对内引物FIP/BIP的摩尔数之比为1：6；所述的DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，活力为8U/微升；所述的阴性对照为灭菌双蒸水；
每升所述菌体扩培液由以下组分制成：5 g的葡萄糖、8 g的鸡蛋清、6.7 µmol的EDTA、100 mL的甘油、30 mmol的二硫苏糖醇、10 g的PEG-4000，余量为双蒸水；每毫升所述显色剂由以下组分制备而成：950-960 µL的20倍SYBR Green I、10-15 mg的KCl，余量为双蒸水。
2.根据权利要求1所述的鸡蛋清和KCl在制备检测结核分枝杆菌试剂盒中的用途，其特征在于，所述阳性对照为含有结核分枝杆菌的人血清。
3.根据权利要求1所述的鸡蛋清和KCl在制备检测结核分枝杆菌试剂盒中的用途，其特征在于，所述10倍环介导等温扩增反应液是由200 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、100mmol/L 氯化钾、100 mmol/L 硫酸铵、40-100 mmol/L 硫酸镁、4-10 mol/L甜菜碱、5-18mmol/L的dNTPs和质量百分浓度0.1%的Triton X-100组成，溶剂为双蒸水。
4.根据权利要求1所述的鸡蛋清和KCl在制备检测结核分枝杆菌试剂盒中的用途，其特征在于，每毫升所述显色剂由以下组分制备而成：950 µL的20倍SYBR Green I、15 mg的KCl，余量为双蒸水。
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