CN111270010B - 一种检测SARS-CoV-2的环介导等温扩增检测引物组及其应用 - Google Patents

一种检测SARS-CoV-2的环介导等温扩增检测引物组及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测SARS‑CoV‑2的环介导等温扩增检测引物组及其应用，所述引物组包括SEQ ID NO.1所示的正向外引物NCP‑F3‑2，SEQ ID NO.2所示的反向外引物NCP‑B3‑2，NO.3所示的正向内引物NCP‑FIP‑2，SEQ ID NO.4所示的反向内引物NCP‑BIP‑2，SEQ ID NO.5所示的环引物NCP‑LB‑2。本发明对SARS‑CoV‑2的检测时间短、灵敏度高、特异性强，检测结果通过肉眼即可进行观察，极大的提高了SARS‑CoV‑2的检测效率。

Description

一种检测SARS-CoV-2的环介导等温扩增检测引物组及其应用
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测SARS-CoV-2的环介导等温扩增检测引物组及其应用。
背景技术
新型冠状病毒（SARS-CoV-2）属于是一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征（MERS）和严重急性呼吸综合征（SARS）等较严重疾病。新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株，人感染了冠状病毒后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭，甚至死亡。目前对于新型冠状病毒所致疾病没有特异治疗方法，对人类社会构成了很大的威胁。
目前，对于新型冠状病毒肺炎的诊断首先通过临床表现（发热和/或呼吸道症状；具有上述肺炎影像学特征；发病早期白细胞总数正常或降低，淋巴细胞计数减少）进行疑似病例的判定，最终再通过对新型冠状病毒的病原学阳性结果判定为确诊病例，因此，新型冠状病毒的检测的对新冠肺炎的诊断起到了重要的作用。
目前新型冠状病毒的检测方法主要有病毒分离培养技术及分子生物学技术。病毒分离培养技术局限性大，往往存在灵敏度低、操作繁琐耗时等缺点，不能适用于大规模病源筛查和检测等实际应用。分子生物学技术目前主要采用荧光定量PCR检测方法及测序法，该方法快速、灵敏、适合处理大规模的样品，在病毒检测中显示了很大的优越性，但该类方法从检测到结果的判读都需要专门的精密设备，操作程序比较复杂，需要相对数小时甚至一两天的时间，也具有一定的局限性。环介导等温扩增（Loop-mediated isothermalamplification, LAMP）方法自2000年Notomi等开发出来后，因其快速（1小时内）、简易（只需65℃温控设备）、灵敏、特异等特点，近年来被广泛用于病毒、细菌等微生物的检测，为微生物大规模快速检测做出了巨大贡献。
发明内容
本发明的目的在于建立一种灵敏度高、特异性强、简便快捷的SARS-CoV-2检测方法，该方法只需要一台简易水浴锅就可在一小时内完成实验，并且实验结果可以直接肉眼观察。结合前期RNA提取及逆转录cDNA实验，使之便于在简易环境下进行病毒诊断。
为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：
一种检测SARS-CoV-2的环介导等温扩增检测引物组，所述引物组包括SEQ ID NO.1所示的正向外引物NCP-F3-2，SEQ ID NO. 2所示的反向外引物NCP-B3-2，NO. 3所示的正向内引物NCP-FIP-2，SEQ ID NO. 4所示的反向内引物NCP-BIP-2，SEQ ID NO. 5所示的环引物NCP-LB-2。
一种环介导等温扩增检测SARS-CoV-2的方法，以样品cDNA 为模板，利用所述引物组进行环介导等温扩增反应。
进一步的，以上所述的检测方法中，环介导等温扩增的反应体系为：
2x反应缓冲液 6.25 μL
NCP-F3-2 10 μM 0.25 μL
NCP-B3-2 10 μM 0.25 μL
NCP-FIP-2 20 μM 1 μL
NCP-BIP-2 20 μM 1 μL
NCP-LB-2 10 μM 1 μL
荧光目视检测液 1 μL
Bst DNA聚合酶 0.5 μL
DNA样本 1 μL
H2O 补至12.5 μL。
进一步的，以上所述的检测方法中，所述检测方法使用的反应条件为：63℃恒温50min。
进一步的，检测结果可直接通过肉眼观察反应管中颜色变化，或通过琼脂糖凝胶电泳观察特异性阶梯状条带来判定检测结果。
一种检测SARS-CoV-2的环介导等温扩增试剂盒，包含以上所述的环介导等温扩增检测引物组。
有益效果：本发明提供了一种检测SARS-CoV-2的环介导等温扩增检测引物组及其应用，公开了SARS-CoV-2的环介导等温扩增检测试剂盒以及检测方法，本发明通过对SARS-CoV-2基因的保守序列设计5条引物，构建环介导等温扩增反应体系实现SARS-CoV-2的快速检测，其优势主要体现在以下几个方面：
（1）检测速度快，1小时即可完成检测过程，大大节省了检测时间；
（2）该方法仅仅在恒温水浴锅中即可完成检测操作，经济实用，不需要昂贵的PCR仪，并且通过颜色变化即可对检测结果进行判读，省略凝胶电泳、成像系的操作程序，极大提高了检测效率；
（3）检测灵敏度高，最低检测浓度达到50 copy/μL，特异性强，能更好对同源性较高的病毒进行区分；
（4）该方法污染小，对人体及环境更加安全，避免了常规PCR检测过程使用溴化乙锭等有毒化学药品。
综上所述，本发明采用的环介导等温扩增用于检测SARS-CoV-2的方法，对新冠肺炎的确诊起到重要的作用，适于SARS-CoV-2检测的普遍应用。
附图说明
图1 为SARS-CoV-2 DNA模板不同拷贝数时扩增反应结果图；
图2 为SARS-CoV-2特异性扩增反应检验结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1 引物的设计与合成
根据Genebank公开的新型冠状病毒测SARS-CoV-2的基因序列，以及与其同源性较高的冠状病毒（如SARS）的基因序列，利用序列比对软件Clustal X对所有序列进行比对分析，找到SARS-CoV-2的保守区域，利用在线引物设计软件Primer Explorer V4设计5条引物，所述引物组如表1所示，引物序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，合成后稀释成10μM或20μM置于-20℃冰箱避光保存备用。
表1
Figure 884991DEST_PATH_IMAGE001
实施例2 SARS-CoV-2环介导等温扩增检测方法的建立
以构建于PUC57载体的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）S基因（GeneBank ID: NC_045512.2）序列质粒（购自南京金斯瑞生物科技有限公司）为模板进行SARS-CoV-2环介导等温扩增检测方法的建立，反应体系如表2所示，Bst DNA聚合酶及配套反应缓冲液、荧光目视检测试剂均购自荣研生物科技有限公司。
表2
Figure 130027DEST_PATH_IMAGE002
反应条件为：63℃恒温反应50分钟，于沸水处理2分钟进行酶灭活处理，终止反应。
实施例3 试剂盒检测灵敏度的分析
以实施例2所述的质粒为模板，以0.5x105 copy/μL的初始浓度使用超纯水进行10倍梯度稀释，稀释成4个浓度梯度：0.5x105 copy/μL、0.5x104 copy/μL、0.5x103 copy/μL和0.5x102 copy/μL，以水代替模板作为阴性对照，按照以下步骤进行检测：
（1）按照实施例2的反应体系向不同的PCR管中进行加样，每个PCR管的模板浓度分别为0、0.5x105 copy/μL、 0.5x104 copy/μL、0.5x103 copy/μL和0.5x102 copy/μL；
（2）用手指轻轻弹试管底部使溶液充分混合，放入离心机离心数秒，使反应液沉到底部；
（3）将配置好的反应试管置于水浴锅中，63 ℃下恒温反应50分钟；
（4）将反应试管转移到沸水中2分钟进行酶灭活处理，终止反应；
（5）将反应管拿出置于白光下进行肉眼观察，或者使用紫外线照射装置照射反应管底部进行颜色观察，绿色荧光为阳性结果。
图1为SARS-CoV-2 DNA模板不同拷贝数时的扩增反应结果，从图1可以看到，当SARS-CoV-2 DNA模板只有50 copy/μL时，扩增反应仍然能成功进行，并且日光灯下基本能分辨反应效果，紫外灯下结果更加清晰。
实施例4 试剂盒检测特异性的分析
以构建于PUC57载体的SARS-S基因（GeneBank ID: NC_004718.3）序列质粒（购自南京金斯瑞生物科技有限公司）作为特异性检测的模板，使用实施例2的检测体系对其进行环介导等温扩增检测，其浓度为0.5x105 copy/μL。同时以0.5x105 copy/μL的目标质粒进行平行试验，以水代替模板作为阴性对照，按照与实施例3相同的步骤进行检测。检测结果如图2所示，从图2中得出，以SARS-S基因作为模板的实验组与阴性对照组颜色相同，而SARS-CoV-2组呈现出明显的颜色差异，因此，本发明的反应体系未能对SARS的DNA模板进行有效扩增，从而表明本发明的试剂盒对SARS-CoV-2的检测具有良好的特异性。
序列表
<110> 苏州卫生职业技术学院
<120> 一种检测2019-nCoV的环介导等温扩增检测引物组及其应用
<141> 2020-02-28
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 1
caattttgta atgatccatt tttgg 25
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 2
catcaatatt cttaaacaca aattcc 26
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 3
tcgcactaga ataaactctg aactcagtgt ttattaccac aaaaacaaca a 51
<210> 4
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 4
ttgcactttt gaatatgtct ctcagcctaa gatttttgaa attaccctgt t 51
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(化学合成)
<400> 5
cttttcttat ggaccttgaa gga 23

Claims (1)

1.一种检测SARS-CoV-2的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，包含引物组，所述引物组包括SEQ ID NO .1所示的正向外引物NCP-F3-2，SEQ ID NO .2所示的反向外引物NCP-B3-2，NO .3所示的正向内引物NCP-FIP-2，SEQ ID NO .4所示的反向内引物NCP-BIP-2，SEQID NO .5所示的环引物NCP-LB-2。
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