WO2007020708A1 - Ｄｎａが有する標的塩基を判別する方法およびそれに用いられるアレル特異性プライマー - Google Patents

Ｄｎａが有する標的塩基を判別する方法およびそれに用いられるアレル特異性プライマー Download PDF

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allele
dna
specific primer
target
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PCT/JP2005/015146
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Hidenobu Yaku
Hiroaki Oka
Tetsuo Yukimasa
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Matsushita Electric Industrial Co., Ltd.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays

Definitions

  • the present invention relates to a method for discriminating a target base of DNA and an allele-specific primer used therefor.
  • SNP is the most frequently occurring polymorphism among genetic polymorphisms, and is about
  • An allele-specific primer refers to a primer that exhibits a significant difference in primer extension reaction efficiency depending on the target SNP base species.
  • a target SNP base species can be easily identified by performing a PCR reaction using an allele-specific primer and analyzing the amount of the PCR product.
  • an allele-specific primer is simply an oligo DNA, especially without any modification.
  • the analysis method is not limited to the electrophoresis method described above, but can be detected by QCM or SPR if a solid-phase reaction is performed.
  • the 3 'terminal base corresponds to the target SNP base (ie, is complementary to one of the expected target SNP base species), and the other sequence is the target DN. This is an example of being completely complementary to the A sequence.
  • the allele-specific primer proposed in Patent Document 1 has a 3 'terminal base that is a SNP-compatible base, a third base from the 3' end, and two bases 3 'from the target SNP base.
  • the second base from the 3 'end is a SNP-compatible base
  • the third base from the 3' end is compared to the base adjacent to the 3 'side from the target SNP base.
  • Allele-specific primers that have been intentionally non-complementary have been proposed. In this case, it is characteristic to use KOD polymerase which is 3 ′ ⁇ 5 ′ exo + polymerase.
  • the 3 'terminal base is an SNP-compatible base, and the second and third bases from the 3' end are already adjacent to the base adjacent to the 3 'side from the target SNP base.
  • An allele-specific primer has been proposed that is intentionally non-complementary to the base next to it. Among these, the allele-specific primer proposed in Patent Document 3 is particularly unlikely to be false positive.
  • the polymerase binds efficiently and performs a primer extension reaction.
  • Patent Document 4 for the rice variety identification, the 3 'end corresponds to the SNP site to be identified, and the 3rd base from the 3' end is a sequence complementary to the annealed cocoon sequence.
  • PCR primers are disclosed in which the substitution is a G force A, A force C, T force G, or C to A substitution.
  • paragraph number 0040 of Patent Document 4 states that "in one aspect, the present invention provides a primer in which the first, second, third, or fourth base from the end is substituted. This substitution may be only one or a combination of two or more, preferably only the third base from the 3 ′ end is substituted. Preferably, however, G to T, ⁇ ⁇ to C, T force et al. 0, or C force is also a substitution of A. ”
  • Patent Document 1 US Patent Publication No. 2003Z0049628
  • Patent Document 2 US Patent Publication No. 2003Z0148301 Specification
  • Patent Document 3 US Patent Publication No. 2004Z0197803
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 2004-248635
  • the allele-specific primer proposed in Patent Document 3 has extremely poor primer extension efficiency when the SNP-corresponding base located at the 3 'end thereof is non-complementary to the target SNP base. As a result, the false positive problem is solved and accurate SNP discrimination becomes possible.
  • the primer extension reaction efficiency is the second and third base species from the 3' end and the corresponding target.
  • the base type conditions on the DNA side more specifically, the base type conditions of the base adjacent to the target SNP base strength 3 'side and the base next to the base.
  • the target SNP base type in the target DNA sequence is A (adenine) or G (guanine), and the base type immediately adjacent to the 3 'side of the SNP base is C (cytosine).
  • the base type next to the base is T (thymine)
  • the 3 'terminal base of the allele-specific primer proposed in Patent Document 3 is a SNP-compatible base.
  • C if it is complementary to G).
  • the second and third bases from the 3 'end must be non-complementary to the target DNA sequence, so the second is either A, T, or C, and 3 The second is T, G, or C.
  • the allele-specific primer proposed in Patent Document 3 has a total of 9 combinations of the second and third base types from the 3 'end to one target D ⁇ sequence. Become.
  • the present inventors among these nine types of allele-specific primers, have a very high SNP discrimination as compared to specific allele-specific primer and other allele-specific primers.
  • the present inventors have found the knowledge of showing efficiency and completed the present invention.
  • the possibility of false positive is small and can be clearly determined.
  • the present invention for solving the above problems is a method for discriminating a target base possessed by DNA
  • the efficiency of the DNA extension step is examined. If the efficiency is high, the target base is determined to be the same as the expected base, and if the efficiency is low, the target base is the predicted base. Discrimination process that is discriminated as different from
  • the base immediately adjacent to the 3 ′ end of the target base is A, and the base adjacent to the other base is T.
  • the 3 ′ terminal base of the allele-specific primer is complementary to the base expected to be the target base
  • the second base from the 3 ′ end of the allele-specific primer is C
  • the third base from the 3 'end of the allele-specific primer is either T or G force C, and
  • the base sequence between the 4th base and the 5 'base of the 3' end force of the allele specific primer corresponds to the 4th base of the 3 'end force of the allele specific primer. It binds complementarily to the base sequence between the base and the base on the DNA side corresponding to the base at the 5 ′ end of the allele-specific primer.
  • the DNA extension reaction is preferably a primer extension reaction.
  • the DNA extension reaction is more preferably a primer extension reaction from only the allele-specific primer.
  • the DNA extension reaction is also preferably a PCR reaction. More preferably, the DNA extension reaction is a PCR reaction comprising the allele-specific primer and another different primer.
  • the present invention provides a method for discriminating a target SNP base possessed by DNA having a very low possibility of false positive and capable of distinct SNP discrimination.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing the relationship between template DNA and allele-specific primers in the prior art.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing the relationship between template DNA and allele-specific primers in the present invention.
  • FIG. 3 is a flowchart of the SNP discrimination method of the second embodiment.
  • FIG. 4 is a flowchart of the SNP discrimination method of the third embodiment.
  • FIG. 5 is a graph showing the experimental results of Example 1.
  • FIG. 6 is a graph showing the experimental results of Comparative Example 1.
  • FIG. 7 is a graph showing the experimental results of Example 2.
  • FIG. 8 is a graph showing the experimental results of Comparative Example 2.
  • Embodiment 1 the base species conditions of the allele-specific primer in the present invention will be described with reference to FIG.
  • target base sequence (hereinafter referred to as “target SN”) is used as the target DNA sequence.
  • P base is present at the 5 ′ end, the second base from the 5 ′ end is A, and the third base from the 5 ′ end is T.
  • FIG. 2 assumes that the target SNP base is present at the 5 ′ end. In general, however, the target SNP base need not be at the 5 ′ end of the target DNA sequence as long as it exists somewhere in the target DNA sequence, as shown in FIG.
  • the 3 'terminal base of the allele-specific primer is a SNP-compatible base, if there are two expected target SNP base types (shown as Sl and S2 in Fig. 2), either Design to be complementary. In Fig. 2, this SNP-corresponding base is S1 'and is complementary to S1.
  • the second base from the 3 'end of the allele-specific primer is C
  • the third base from the 3' end is T or G force C !.
  • 3 'end force of allele-specific primer Base sequence between the 4th base and the 5' end base (hereinafter referred to as “residual base sequence” or “residual base sequence of allele-specific primer”)
  • the 3 'end force of the allele-specific primer also corresponds to the 4th base between the base on the target DNA side and the base on the target DNA side corresponding to the 5' end base of the allele-specific primer.
  • are complementary to each other hereinafter sometimes referred to as “residual base sequence” or “residual base sequence on the target DNA side”).
  • the base sequence from the 4th base to the 5 'end of the 3' end force of the allele-specific primer is the same as the base sequence from the 5 'end to the 4' base from the 4th base. It is complementary to the base sequence up to.
  • the remaining nucleotide sequence of the allele-specific primer and the remaining nucleotide sequence on the target DNA side be completely complementary, but this does not adversely affect SNP discrimination. As long as they do not have to be perfectly complementary.
  • the symbol “X” means that the two bases sandwiching the symbol X are not bonded.
  • a DNA extension reaction ie, typically a primer extension reaction or PCR
  • a polymerase without 3 ' ⁇ 5' exonuclease activity.
  • the difference in efficiency can also determine the target SNP base of DNA.
  • the efficiency of the DNA extension step is examined. If the efficiency is high, the target SNP base is determined to be the same as the predicted base, and if the efficiency is low, the target SNP base is the predicted It is determined that it is different from the base.
  • Embodiment 2 a method for discriminating SNPs by performing a primer extension reaction using the allele-specific primer in the present invention will be described.
  • a double-stranded DNA containing a target DNA sequence is prepared so that a primer extension reaction can be performed.
  • the target DNA sequence condition is that the same target SNP base as in Embodiment 1 is present at the 5 'end, the second base from the 5' end is A, and the 5 'end.
  • the third base from is T.
  • a double-stranded DNA satisfying such a sequence condition is prepared so that a primer extension reaction can be performed as described above, and an allele-specific primer satisfying the sequence condition described in the first embodiment and a DNA Add the polymerase, dNTPs, buffer, and the desired salt as necessary to perform the primer extension reaction!
  • the double-stranded DNA is placed in a high-temperature state to denature it, and then the temperature is lowered so that the allele-specific primer and the target DNA sequence in the present invention can bind.
  • the temperature condition may be set such that the DNA polymerase can perform an extension reaction.
  • the efficiency of the primer extension reaction may be examined by measuring the amount of pyrophosphate released as a result of the primer extension reaction during or after the primer extension reaction.
  • the means for examining the efficiency of the primer extension reaction is not limited to the method for measuring the amount of pyrophosphate.
  • the primer extension reaction is performed with the 5 ′ end of the allele-specific primer in the present invention fixed on a crystal oscillator, and the primer extension reaction is monitored by analyzing the change in frequency. By doing so, you can check the efficiency of the primer extension reaction.
  • a certain anchor performs the primer extension reaction with the 5 'end of the allele-specific primer of the present invention fixed to the gold surface to solve the surface plasmon resonance (SPR) phenomenon.
  • the efficiency of the primer extension reaction may be investigated by praying and monitoring the primer extension reaction.
  • the DNA polymerase is preferably 3 ⁇ 5, weak or no exonuclease activity. This makes SNP discrimination more accurate.
  • the DNA polymerase may be exposed to high temperature depending on the procedure of the primer extension reaction.
  • the double-stranded DNA containing the target DNA sequence is first prepared so as to allow PCR reaction.
  • the target DNA sequence condition is the same as the target SN as in the first embodiment.
  • P base is present at the 5 'end, and the second base from the 5' end is A, and the 5
  • 'T is the third base from the end.
  • the 3 'terminal base is complementary to the target SNP base, the second base from the 3' end is T, and the 3 'end The third base is A.
  • a double-stranded DNA satisfying such a sequence condition is prepared so that a PCR reaction can be performed as described above, and an allele-specific primer that satisfies the sequence condition described in the first embodiment and the allele-specific primer.
  • the second primer, PCR DNA polymerase, dNTPs, Mg ion, buffer, and if necessary, the desired salt is added to perform the PCR reaction. For example.
  • the template DNA in the region between the allele-specific primer and the second primer is efficiently amplified.
  • this template is obtained by a method such as electrophoresis.
  • the amount of pyrophosphate released as a result of the PCR reaction may be measured during or after the PCR reaction.
  • the above DNA polymerase for PCR has a weak 3 ′ ⁇ 5 ′ exonuclease activity!
  • the method for measuring the amount of amplification of the template DNA is not particularly limited, and may be other than the above-described electrophoresis method.
  • an SNP discrimination kit including an allele-specific primer in the present invention will be described.
  • the SNP discrimination kit according to the fourth embodiment is applied to the target DNA sequence.
  • An allele-specific primer reagent tube containing the allele-specific primer in the present invention shown in FIG. 1 a DNA polymerase reagent tube containing a DNA polymerase, and a buffer reagent tube containing a buffer to which a desired salt is added if necessary, It consists of a dNTPs reagent tube containing dNTPs and a pyrophosphate reagent tube containing pyrophosphate measurement reagents.
  • the users first prepared a single-stranded DNA containing their target DNA sequence and prepared a sample of double-stranded DNA in a state in which primer extension reaction can be performed, and then the allele-specific primer reagent described above.
  • the method described in Embodiment 2 using the allele-specific primer contained in the tube and the DNA polymerase and buffer reagent contained in the DNA polymerase reagent tube.
  • the primer extension reaction may be performed according to
  • Pyrophosphate released into the reaction solution during the primer extension reaction is the above pyrophosphate It can be measured using a pyrophosphate measuring reagent contained in a reagent tube.
  • the target SNP base species is extremely unlikely to be false positive based on the measurement result, and can be accurately discriminated.
  • the reagent for measuring pyrophosphate is not particularly limited as long as it can measure pyrophosphate, as long as it uses a luminescence reaction by luciferase as shown in Nucleic Acids Research, 2001, Vol. 29, No. 19 e93.
  • ATP sulfurylase for converting pyrophosphate into ATP luciferin that reacts with ATP to perform a luminescence reaction (wavelength 520 nm)
  • luciferase that catalyzes the reaction are included.
  • the users can use the pyrophosphoric acid released during the primer extension reaction using these pyrophosphate measuring reagents, Nucleic Acids Research, 2001,
  • dATP remaining unreacted in the primer extension reaction reacts with luciferin.
  • a tube containing an enzyme for decomposing these unreacted dATP is also part of the kit.
  • This enzyme is preferably subjected to the dATP decomposition reaction by adding the pre-reaction force by the luciferase or the pyrophosphate force to the primer extension reaction solution before the conversion reaction to ATP.
  • pyrophosphate is hydrolyzed to phosphoric acid and H + is converted. It contains a membrane containing transported H + —PPase (H + —pyrophosphatase) and a dye whose optical properties change depending on the H + concentration.
  • the pyrophosphate measurement reagent is not limited to those listed here, but may be configured to include all or part of the reagents necessary for pyrophosphate measurement.
  • a fluorescent indicator that binds to double-stranded DNA such as Cyber Green I, may be included in the kit of Embodiment 4.
  • a fluorescent indicator that binds to double-stranded DNA typified by Cyber Green I is contained alone in a single tube, or may be contained in a buffer reagent tube or the like.
  • a kit structure that can mix this fluorescent indicator with the primer extension reaction solution may be used.
  • a TaqMan probe may be included in the kit of Embodiment 4 instead of the pyrophosphate measurement reagent.
  • the primer extension reaction process can be analyzed in real time by monitoring the fluorescence dependent on this TaqMan probe. SNP discrimination can be performed from this analysis result.
  • the TaqMan probe designed as such may be included in a single tube alone, or may be included in a buffer reagent tube, etc. What is necessary is just to make it the kit structure which can be mixed with a liquid.
  • the DNA polymerase has weak or no 3 ' ⁇ 5' exonuclease activity. This makes SNP discrimination more accurate. Furthermore, the DNA polymerase is more preferably heat-resistant.
  • an SNP discrimination kit including an allele-specific primer in the present invention will be described.
  • the SNP discrimination kit is the target DNA sequence of the allele-specific primer according to the present invention shown in the first embodiment and the relationship between the allele-specific primer and the forward primer / reverse primer.
  • dNTPs reagent tubes containing dNTPs are the target DNA sequence of the allele-specific primer according to the present invention shown in the first embodiment and the relationship between the allele-specific primer and the forward primer / reverse primer.
  • the users first prepared a double-stranded DNA sample containing their target DNA sequence so that they can perform a PCR extension reaction, and then the allele-specific primer and the first primer contained in the primer reagent tube.
  • the DNA polymerase for PCR contained in the PCR DNA polymerase reagent tube, the buffer contained in the knofer reagent tube, and the dNTPs contained in the dNTPs reagent tube.
  • the kit according to the fifth embodiment includes a reagent for examining the PCR reaction efficiency. Examples of reagents for examining the PCR reaction efficiency include reagents for measuring pyrophosphate, fluorescent indicators that bind to double-stranded DNA, such as Cyber Green I, and TaqMan probes, as in the third embodiment.
  • the pyrophosphate measurement reagent can measure pyrophosphate released into the reaction solution during the PCR reaction. Therefore, the measurement result makes it possible to determine the target SNP base species accurately and with a very low possibility of false positives.
  • the kind of reagent for measuring pyrophosphate is the same as that of Embodiment 4, so long as it includes all or part of the reagent required for measuring pyrophosphate.
  • the PCR reaction process can be monitored in real time by performing the PCR reaction in the presence of these indicators.
  • the target SNP base species can be identified accurately with a very low possibility of false positives.
  • these may be included in a single tube alone, or may be included in a buffer reagent tube or the like, so that these reagents can be mixed with a PCR reaction solution. If so,
  • Example 1 the target base type in ⁇ DNA was determined by a primer extension reaction using the allele-specific primer in the present invention.
  • the above three kinds of primers are called ⁇ -TCT, ⁇ -GCT, and ⁇ -CCT in this order.
  • the 3'-terminal base T of the above three types of primers is the double-strand DNA 681-6894 of the wild-type DNA IJ5,-GCGATGTGGCCATCGTCGTGTATT — 3, / 5,- Of AATAC ACG ACG ATGGCC AC ATCGC-3, 5, -AATA CACGACGATGGCCACATCGC-3, 5, Complementary to terminal base A.
  • the second base C from the 3 'end of the above three types of primers is similarly in a non-complementary relationship between the 5th base of 5'-AATACA CGACGATGGCCACATCGC-3, and the second base A from the end and CZA. is there.
  • the third and third base types of the above three types of primers are all different ( ⁇ for ⁇ -TCT, G for ⁇ -GCT, C for ⁇ -CCT), 5, -AATACA CGACGATGGCCACATCGC—This is a non-complementary relationship with the third base T from the end of 5.
  • sequence from the 3rd to the 4th base to the 5th base of the above three types of primers is the same as that of the 5, 5th AATACACGACGATGGCCACATCGC-3, 3 'from the 4th base from the end. It is completely complementary to the sequence up to the terminal base.
  • the three bases at the 3 'end of the above three types of primers are the double-stranded DNA sequence 5, which is the 6871st to 6894th power of the mutant DNA-6894-GC, and one GCG ATGTGGCCATCGT CGTGTATG-3' / Of 5'-CATACACGACG ATGGCC AC ATCGC 3, 5— £ ATACACGACGATGGCCACATCGC—3, non-complementary to the 3 bases at the end (underlined portion is the site of mutagenesis).
  • This reaction solution was incubated at 95 ° C for 1 minute using the DNA engine, a thermal cycler manufactured by MJ Reserch, then incubated at 58 ° C for 5 minutes, and finally incubated at 72 ° C for 10 minutes. .
  • Figure 5 shows the analysis results.
  • Example 1 The same experiment as in Example 1 was performed using the three types of primers.
  • the remaining sequence is completely complementary to the remaining sequence of 5, —AATACACGACGATGGCCACATCGC—3 ′.
  • mutant ⁇ DNA-6876-AT was prepared by artificially replacing the 6876th GZC base pair in ⁇ DNA (Takara Bio Inc.) with an AZT base pair.
  • the above three kinds of primers are called ⁇ -TCG, ⁇ -GCG, and ⁇ -CCG in order.
  • the 3'-end base G of the above three types of primers is the double-stranded DNA that is the 6849th to 68th 76th power of wild type DNA IJ5,-GTGTCCTATAAGGGGATGTATGGC GATG-3, / 5, 1) CATCGCCATACATCCCCTTATAGGACAC—3 out of 5, 5—CATCGCCATACATCCCCTTATAGGACAC—3, complementary to terminal base C.
  • the third base C from the 3 'end of the above three types of primers is the same as 5'-CATCGC CATACATCCCCTTATAGGACAC—3, the second base from the end A and C / A non-complementary relationship It is.
  • the third and third base types of the above three types of primers are all different ( ⁇ for ⁇ -TCG, G for ⁇ -GCG, C for ⁇ -CCG), 5, one CATCGC CATACATCCCCTTATAGGACAC—3, non-complementary relationship with the third base T from the end.
  • the three bases at the 3 ′ end of the above three types of primers are double-stranded DNA sequence 5, which is the 6849th to 6686th strongest mutant DNA—6876—TA,-GTGTCCTATAAGGGGA TGTATGGCG ATT-3, / 5,-AATCGCCATACATCCCCTTATAGGAC Of AC-3, 5′-AATCGCC ATAC ATCCCCTTATAGG AC AC-3 ′ (non-complementary to the 3 ′ base at the 5 ′ end (underlined portion is the site of mutagenesis).
  • This reverse primer is a double-stranded DNA sequence that also has the 7406th to 7430th power of DNA 5, -TCAGCGCAGCCGGATACCGTGATTC-3 '/ 5' One GAATCACGG
  • a reaction solution containing 20 ⁇ L was prepared.
  • This reaction solution was subjected to denaturation step: 94 ° C for 10 seconds, annealing step: 58 ° C for 10 seconds, extension step: 72 ° C using a LightCycler, a thermal cycler manufactured by Roche Diagno Status.
  • the PCR reaction was carried out for 10 seconds with a cycle number of 20 cycles.
  • the target DNA fragment was ⁇ or more.
  • the second and third bases from the 3 'end are non-complementary to the second and third bases from the 5' end of the 5'- CATCGCCATACATCCCC TTATAGGACAC— 3 '
  • the remaining sequence is completely complementary to the remaining sequence of 5, — CATCGCCATACATCCCCTTATAGGACAC—3.
  • Figure 8 shows the analysis results.
  • the concentration of the target DNA fragment (note the size of the vertical axis in Fig. 7 and Fig. 8) in the case of the combination of these three types of primers and wild-type ⁇ DNA is ⁇ TCG, E -GCG Compared to the wild-type DNA combination, it is about one-tenth, which is clearly smaller and has better discrimination ability for ⁇ -TCG, ⁇ -GCG, and ⁇ CCG. Power.
  • the present invention provides a method for discriminating a target SNP base possessed by a DN A that has a very low possibility of false positive and can be clearly discriminated by SNP.

Abstract

　標的ＳＮＰ塩基の３’側にすぐ隣接する塩基がＡであり、もう一塩基隣の塩基がＴであるときに、擬陽性の可能性が極めて低く、かつ明確にＳＮＰ判別が可能なアレル特異性プライマーを提供することを目的とする。 　３’末端塩基をＳＮＰ対応塩基とし、かつ３’末端から２番目の塩基はＣとし、かつ３’末端から３番目の塩基はＴかＣかＧのいずれかとし、かつ３’末端から４番目の塩基から５’末端の塩基までの塩基配列を、標的ＳＮＰ塩基から３’側に対して三塩基隣の塩基から所望の塩基までの配列に対して相補的に設計する。    

Description

明 細 書
DNAが有する標的塩基を判別する方法およびそれに用いられるアレル 特異性プライマー 技術分野
[0001] 本発明は、 DNAが有する標的塩基を判別する方法およびそれに用いられるァレ ル特異性プライマーに関する。
背景技術
[0002] SNPは遺伝子多型の中で最も高頻度で現れる多型であり、ヒトゲノム中において約
0. 1%の頻度で現れると考えられている。
[0003] 実際、これまでに 300万を超える数の SNPの存在が明らかになつてきており、この ことは SNPが遺伝子検査のマーカーとして非常に有用であることを示している。
[0004] これまでの SNPと疾病の関連付けの研究によって、糖尿病や高血圧症などの疾病 と SNP力深く関連して!/、ることが明らかになつてきて！/、る。
[0005] SNP判別を行う技術として、アレル特異性プライマーによるプライマー伸長反応 (P
CR反応を含む）を利用する技術が知られて ヽる。
[0006] アレル特異性プライマーとは、標的とする SNPの塩基種に依存してプライマー伸長 反応効率に著し 、差が生じるプライマーのことを言う。
[0007] 従って、例えばアレル特異性プライマーを用いて PCR反応を行 、、その PCR産物 量を解析することで簡単に標的 SNP塩基種を特定できる。
[0008] 通常、アレル特異性プライマーは特に何の修飾もされて ヽな 、単なるオリゴ DNA である。
[0009] PCR産物量の解析にはいわゆる通常の電気泳動法を用いればよいため、アレル 特異性プライマーによる SNP判別技術は、コストや反応時間、操作の簡便性といつ た面において非常に有利と言える。
[0010] 解析方法については、上記の電気泳動法のみならず、固相系の反応を行えば QC Mや SPRによって検出することも可能である。
[0011] さらに近年では、プライマー伸長反応の副産物である PPi (ピロリン酸）を、ルシフエ ラーゼ反応を利用して検出する方法も開発されており、アレル特異性プライマーによ る SNP判別の簡便化や迅速化は世界中にお 、て精力的に取り組まれて 、る。
[0012] アレル特異性プライマーの配列設計は、その SNP判別能にぉ 、て非常に重要なフ アクターである。
[0013] 最も古典的な例は、 3'末端塩基が標的 SNP塩基に対応しており（すなわち予想さ れる標的 SNP塩基種のいずれかに相補的となる）、かつそれ以外の配列は標的 DN A配列に対して完全に相補的であるという例である。
[0014] し力し、この場合においては、その反応時間や温度、あるいは反応に用いる dNTP s濃度、また PCR法を用いるのであればサイクル数などの反応条件を厳密に規定し なければ、擬陽性の問題が生じる。
[0015] すなわち、本来であれば、プライマー 3'末端の SNP対応塩基がサンプルの標的 S NP塩基と非相補的である場合は、そこ力ものプライマー伸長反応は起きては 、けな いのだが、多くの場合において起きてしまう。
[0016] 上述の擬陽性の問題を解決するために、これまでに幾つかの新規アレル特異性プ ライマーが開発されている。
[0017] 特許文献 1にて提案されたアレル特異性プライマーは、 3'末端塩基が SNP対応塩 基であり、かつ 3'末端から 3番目の塩基を、標的 SNP塩基から 3'側に二塩基隣の塩 基に対して意図的に非相補的にしたアレル特異性プライマーを開発している。
[0018] 特許文献 2では、 3'末端から 2番目の塩基が SNP対応塩基であり、かつ 3'末端か ら 3番目の塩基を、標的 SNP塩基から 3'側に隣接している塩基に対して意図的に非 相補的にしたアレル特異性プライマーが提案されている。この場合、 3 '→5' exo + ポリメラーゼである KODポリメラーゼを用いるのが特徴である。
[0019] 特許文献 3では、 3'末端塩基が SNP対応塩基であり、かつ 3'末端から 2番目およ び 3番目の塩基をそれぞれ、標的 SNP塩基から 3'側に隣接する塩基と、もう一塩基 隣の塩基に対して意図的に非相補的にしたアレル特異性プライマーが提案されてい る。これらの中で、特許文献 3で提案されたアレル特異性プライマーは特に擬陽性の 可能性が低い。
[0020] すなわち、上記のとおり設計された特許文献 3のアレル特異性プライマーは、図 1に 示すように、その 3 '末端に位置する SNP対応塩基（図中では「S '」と示した）が標的 SNP塩基（図中では「S」と示した）と相補的である場合、 3，末端から 2番目および 3 番目の塩基のみが標的 DNA配列に対して非相補的となり（図中では、非相補的な 塩基対を Xと示した)、ループのような構造をとり得る（図 1 (a) )。
[0021] その結果、ポリメラーゼは効率良く結合し、プライマー伸長反応を行う。
[0022] 逆に、その 3'末端に位置する SNP対応塩基が標的 SNP塩基と非相補的である場 合、 3'末端の三塩基全てが非相補的となり、枝分かれのような構造になると考えられ る（図 l (b) )。
[0023] この場合、プライマー伸長反応はほとんど起こらない。
[0024] ポリメラーゼの結合効率が極めて低くなるためと考えられるからである。
[0025] したがって特許文献 3で提案されたアレル特異性プライマーは、上述のとおり擬陽
'性の可能'性は極めて低くなる。
[0026] その他、本発明に関連する文献として、以下の文献を挙げることができる。
[0027] 特許文献 4には、イネの品種識別のために、 3'末端が判別すべき SNP部位に対応 し、 3'末端から 3番目の塩基が、ァニールする铸型配列と相補的な配列から置換さ れており、当該置換が G力 A、 A力 Cへ、 T力 Gへ、または Cから Aへの置換であ る PCRプライマーが開示されている。
[0028] さらに、この特許文献 4の段落番号 0040には、「1つの局面において、本発明は、 3 ，末端から 1番目、 2番目、 3番目、または 4番目の塩基が置換されたプライマーを提 供する。この置換は、 1つのみであっても、 2つ以上の組み合わせでもよい。好ましく は、 3'末端から 3番目の塩基のみが置換される。このプライマーの置換は、任意の置 換であってよいが、好ましくは、 Gから T、 Αから Cへ、 T力ら0、または C力も Aの置換 である。」と開示されている。
特許文献 1：米国特許公開第 2003Z0049628号明細書
特許文献 2 :米国特許公開第 2003Z0148301号明細書
特許文献 3 :米国特許公開第 2004Z0197803号明細書
特許文献 4：特開 2004— 248635号公報
発明の開示 発明が解決しょうとする課題
[0029] 特許文献 3で提案されたアレル特異性プライマーは、その 3 '末端に位置する SNP 対応塩基が標的 SNP塩基と非相補的である場合のプライマー伸長反応効率は極め て悪い。その結果、擬陽性の問題が解消されるため正確な SNP判別が可能となる。
[0030] しかし、 3 '末端に位置する SNP対応塩基が標的 SNP塩基と相補的である場合の プライマー伸長反応効率は、 3'末端から 2番目および 3番目の塩基種および、それ に対応する標的 DNA側の塩基種条件 (より具体的には、標的 SNP塩基力 3'側に 隣接する塩基と、もう一塩基隣の塩基の塩基種条件）によってばらつく問題があった
[0031] より具体的には、例えば、標的 DNA配列中の標的 SNP塩基種が A (アデニン)か G (グァニン)であり、その SNP塩基の 3'側にすぐ隣接する塩基種を C (シトシン）、も う一塩基隣の塩基種を T (チミン)とした場合、特許文献 3で提案されたアレル特異性 プライマーの 3'末端塩基は SNP対応塩基であるため、 T(Aと相補的とする場合)か C (Gと相補的とする場合)とすれば良 、。
[0032] 一方、その 3'末端から 2番目および 3番目の塩基は、標的 DNA配列に対して非相 補的でないといけないため、 2番目は A、 T、 Cのいずれかであり、また 3番目は T、 G 、 Cのいずれ力となる。
[0033] したがって、特許文献 3で提案されたアレル特異性プライマーは、一種類の標的 D ΝΑ配列に対して、その 3'末端から 2番目および 3番目の塩基種の組み合わせは合 計 9通りとなる。
[0034] いずれも非相補的であるという観点から、これらの 9種類のアレル特異性プライマー は、 SNP判別に際してほぼ同じ効率を示すと思われる。
[0035] しかし、本発明者らは、これらの 9種類のアレル特異性プライマーのうち、特定のァ レル特異性プライマーカ、他のアレル特異性プライマーと比較して、 SNP判別に際し て非常に高い効率を示すという知見を見出し、本発明を完成させた。
[0036] すなわち、本発明は、擬陽性の可能性が少なぐかつ明確に判別することができる
DNAが有する標的塩基を判別する方法およびそれに用いられるアレル特異性ブラ イマ一を提供することを目的とする。 課題を解決するための手段
[0037] 上記課題を解決する本発明は、 DNAが有する標的塩基を判別する方法であって この方法は、
(1) A (アデニン）、 T (チミン）、 G (グァニン）、および C (シトシン）の 4種類の塩基 の中から前記標的塩基として予想される塩基と相補的な塩基を 3'末端に有するァレ ル特異性プライマーを前記 DNAに結合させて DNA伸長反応を生じさせる DNA伸 長工程、および
(2) 前記 DNA伸長工程の効率を調べ、高効率であれば前記標的塩基は前記予 想された塩基と同一であると判別され、低効率であれば前記標的塩基は前記予想さ れた塩基とは異なると判別される判別工程
を有し、
前記 DNAにおいて、前記標的塩基の 3'末端側にすぐ隣接する塩基が Aであり、も う一塩基隣の塩基が Tであり、
前記アレル特異性プライマーの 3'末端塩基が前記標的塩基であると予想される塩 基と相補的であり、
前記アレル特異性プライマーの 3'末端から 2番目の塩基が Cであり、
前記アレル特異性プライマーの 3 '末端から 3番目の塩基が Tか G力 Cの 、ずれか であり、かつ
前記アレル特異性プライマーの 3'末端力 4番目の塩基と 5'末端の塩基との間の 塩基配列が、前記アレル特異性プライマーの 3'末端力 4番目の塩基に対応する前 記 DNA側の塩基と前記アレル特異性プライマーの 5 '末端の塩基に対応する前記 D NA側の塩基との間の塩基配列に相補的に結合する。
[0038] DNA伸長反応はプライマー伸長反応であることが好ましい。 DNA伸長反応は、上 記アレル特異性プライマーのみからのプライマー伸長反応であることがより好ましい。
[0039] プライマー伸長反応により産生されるピロリン酸の濃度を調べることによって効率を 調べることが好ましい。なお、ピロリン酸の濃度を発光強度として検出することが好ま しい。 [0040] DNA伸長反応は PCR反応であることも好ましい。 DNA伸長反応が、前記アレル 特異性プライマーともう一つの異なるプライマーからなる PCR反応であることがより好 ましい。
[0041] この場合、 PCR反応により産生された増幅 DNAの濃度を、電気泳動法により測定 することによって効率を調べることが好ま 、。
[0042] 上記方法に用いられるアレル特異性プライマーもまた、本発明の趣旨に包含される
[0043] 本発明の上記目的、他の目的、特徴及び利点は、添付図面参照の下、以下の好 適な実施態様の詳細な説明から明らかにされる。
発明の効果
[0044] 本発明により、擬陽性の可能性が極めて低ぐかつ明確に SNP判別などが可能な DNAが有する標的 SNP塩基を判別する方法が提供される。
図面の簡単な説明
[0045] [図 1]図 1は、従来技術におけるテンプレート DNAとアレル特異性プライマーの関係 を模式的に示した図である。
[図 2]図 2は、本発明におけるテンプレート DNAとアレル特異性プライマーの関係を 模式的に示した図である。
[図 3]図 3は、実施の形態 2の SNP判別方法のフローチャート図である。
[図 4]図 4は、実施の形態 3の SNP判別方法のフローチャート図である。
[図 5]図 5は、実施例 1の実験結果を表したグラフである。
[図 6]図 6は、比較例 1の実験結果を表したグラフである。
[図 7]図 7は、実施例 2の実験結果を表したグラフである。
[図 8]図 8は、比較例 2の実験結果を表したグラフである。
符号の説明
[0046] 1：従来技術におけるアレル特異性プライマー
2：従来技術におけるテンプレート DNA
3：本発明におけるアレル特異性プライマー
4：本発明におけるテンプレート DNA 発明を実施するための最良の形態
[0047] 以下本発明の実施の形態について図 2〜図 4を用いて説明する。
[0048] (実施の形態 1)
本実施の形態 1では、本発明におけるアレル特異性プライマーの塩基種条件につ いて、図 2を用いて説明する。
[0049] 本発明では、図 2に示すように、標的 DNA配列として、標的塩基 (以下、「標的 SN
P塩基」という）が 5'末端に存在し、かつ 5'末端から 2番目の塩基が Aであり、かつ 5' 末端から 3番目の塩基が Tであるときを対象として 、る。
[0050] 本発明の理解を容易にするために、図 2では、標的 SNP塩基が 5'末端に存在する と仮定している。しかし、一般的には、図 1に示すように、標的 SNP塩基は標的 DNA 配列のどこかに存在すれば良ぐ標的 DNA配列の 5'末端に存在する必要はない。
[0051] アレル特異性プライマーの 3'末端塩基は SNP対応塩基であるため、予想される標 的 SNP塩基種が二種類（図 2では Sl、 S2と示した)である場合、そのいずれ力と相 補的であるように設計する。図 2では、この SNP対応塩基を S1 'とし、 S1と相補的で あるとしている。
[0052] さらにアレル特異性プライマーの 3'末端から 2番目の塩基は Cであり、かつ 3'末端 から 3番目の塩基は Tか G力 Cの!、ずれかである。
[0053] アレル特異性プライマーの 3'末端力 4番目の塩基と 5'末端の塩基との間の塩基 配列（以下、「残余の塩基配列」または「アレル特異性プライマーの残余の塩基配列」 ということがある）は、アレル特異性プライマーの 3'末端力も 4番目の塩基に対応する 標的 DNA側の塩基とアレル特異性プライマーの 5 '末端の塩基に対応する標的 DN A側の塩基との間の塩基配列（以下、「残余の塩基配列」または「標的 DNA側の残 余の塩基配列」ということがある）と相補的であり、これらは結合する。
[0054] 図 2では、アレル特異性プライマーの 3'末端力も 4番目の塩基から 5'末端の塩基ま での塩基配列は、標的 DNA配列中の 5'末端から 4番目の塩基から 3'末端の塩基ま での塩基配列に対して相補的である。
[0055] なお、アレル特異性プライマーの残余の塩基配列と標的 DNA側の残余の塩基配 列との間は、完全に相補的であることが望ましいが、 SNP判別に悪影響を与えない 限り、完全に相補的である必要はない。
[0056] 本発明にお 、て、アレル特異性プライマーの SNP対応塩基が標的 SNP塩基と相 補的な場合は、図 2 (a)のような関係になり、逆に、アレル特異性プライマーの SNP 対応塩基が標的 SNP塩基と非相補的な場合は、図 2 (b)のような関係になる。
[0057] なお、図 2 (および図 1)において、符号「X」は、当該符号 Xを間に挟む 2つの塩基 が結合しな 、ことを意味する。
[0058] 符号「X」が間に挟まれない 2つの塩基（例えば、図 l (a)、図 2 (a)の塩基 SIおよび 塩基 S1 ' )は結合する。
[0059] このようなアレル特異性プライマーと標的 DNAの配列条件下で、 3 '→5 'ェキソヌク レアーゼ活性のな 、ポリメラーゼを用いて DNA伸長反応 (すなわち、代表的にはプ ライマー伸長反応または PCR反応)を行うと、図 2 (a)の場合は非常に効率良く反応 が進むのに対して、図 2 (b)の場合はほとんど進まない。
[0060] このような効率の差力も DNAが有する標的 SNP塩基を判別することができる。
[0061] すなわち、 DNA伸長工程の効率を調べ、高効率であれば前記標的 SNP塩基は 前記予想された塩基と同一であると判別され、低効率であれば前記標的 SNP塩基 は前記予想された塩基とは異なると判別される。
[0062] その結果、擬陽性の可能性が極めて低ぐかつ明確な SNP判別が可能となる。
[0063] (実施の形態 2)
本実施の形態 2では、本発明におけるアレル特異性プライマーを用いてプライマー 伸長反応を行うことで SNPを判別する方法について説明する。
[0064] 図 3に示すように、まず標的 DNA配列を含む二本鎖 DNAについて、プライマー伸 長反応を行えるように調製する。
[0065] ここで標的 DNA配列条件は、実施の形態 1と同じぐ標的 SNP塩基が 5'末端に存 在し、かつその 5'末端から 2番目の塩基が Aであり、かつその 5'末端から 3番目の塩 基が Tである。
[0066] したがって、標的 DNA配列の相補鎖においては、その 3'末端塩基が標的 SNP塩 基と相補的であり、かつその 3'末端から 2番目の塩基が Tであり、かつその 3'末端か ら 3番目の塩基が Aである。 [0067] このような配列条件を満たす二本鎖 DNAを、上記のとおりプライマー伸長反応が 行える状態に調製して、実施の形態 1で示した配列条件を満たすアレル特異性ブラ イマ一と、 DNAポリメラーゼと、 dNTPsと、バッファーと、必要に応じて所望の塩を加 えてプライマー伸長反応を行えばよ!、。
[0068] プライマー伸長反応の工程についてはこれまで知られている手順で良ぐ具体的に は下記のとおりである。
[0069] すなわち、まず上記二本鎖 DNAを変性させるために高温状態に置 、た後、本発 明におけるアレル特異性プライマーと標的 DNA配列が結合できるように温度を下げ る。
[0070] その後、 DNAポリメラーゼが伸長反応を行うことが可能な温度条件に設定すれば よい。
[0071] この結果、アレル特異性プライマーの 3'末端に位置する SNP対応塩基が標的 SN P塩基と相補的であれば、このアレル特異性プライマーからのプライマー伸長反応は 効率良く行われる。
[0072] 逆に、アレル特異性プライマーの 3'末端に位置する SNP対応塩基が標的 SNP塩 基と非相補的であれば、このアレル特異性プライマーからのプライマー伸長反応効 率は著しく悪い。
[0073] したがって、このプライマー伸長反応の最中、あるいは反応後に、プライマー伸長 反応の結果放出されるピロリン酸量を測定するなどしてそのプライマー伸長反応効率 を調べればよい。
[0074] これによつて、擬陽性の可能性が極めて低ぐかつ明確な SNP判別が可能となる。
プライマー伸長反応効率を調べる手段としてはピロリン酸量を測定する方法に限られ ない。
[0075] 例えば、本発明におけるアレル特異性プライマーの 5'末端側を水晶発振子上に固 定した状態で、上記プライマー伸長反応を行い、その振動数変化を解析してプライ マー伸長反応をモニタリングすることで、プライマー伸長反応効率を調べてもよ 、。
[0076] ある ヽは本発明におけるアレル特異性プライマーの 5 '末端側を金表面に固定した 状態で、上記プライマー伸長反応を行い、その表面プラズモン共鳴 (SPR)現象を解 祈してプライマー伸長反応をモニタリングすることで、プライマー伸長反応効率を調 ベてもよい。
[0077] V、ずれにしてもプライマー伸長反応効率を調べることができればよ!/、。
[0078] ここで、プライマー伸長反応を行う具体的手順は上記の手順に限られることはな!/ヽ
[0079] すなわち、上記の手順では予め必要な試薬類を全て反応液中に混合した上でブラ イマ一伸長反応を行わせるが、例えば、まず標的 DNA配列を含む二本鎖 DNAおよ びアレル特異性プライマーを溶かしたバッファー液 (必要に応じて所望の塩を加えれ ばよい）を用意し、高温による変性工程およびアレル特異性プライマーによる標的 D NA配列への結合を行った後、 DNAポリメラーゼ、 dNTPsを順次カ卩えることで反応 を行わせてもよ!/、。 V、ずれにしてもプライマー伸長反応を行える工程とすればょ 、。
[0080] またここで、標的 DNA配列を含む DNAがもともと一本鎖の場合、上記した二本鎖 の場合と異なり、二本鎖 DNAを変性させるという意味での高温条件下におく工程は 必要ない。
[0081] しかし、この一本鎖 DNAとアレル特異性プライマーの結合反応を制御する意味に おいて、これら両者がまず十分解離した状態を調整する必要があるので、そのため の高温条件下におく工程が、アレル特異性プライマーと標的 DNA配列との結合ェ 程の前にあることがより好まし 、。
[0082] ここで、上記 DNAポリメラーゼは 3，→5，ェキソヌクレアーゼ活性が弱!、か無!、こと 力 り好ましい。その方がより SNP判別が正確となる。
[0083] さらに、上記 DNAポリメラーゼは、上記プライマー伸長反応の手順によっては高温 にさらされる場合がある。
[0084] その場合は、例えば PCRに用いられるような耐熱性のものを用いる必要があるが、 そのような高温にさらされることがない手順でプライマー伸長反応を行う場合は特に その必要はない。
[0085] ピロリン酸量を測定する方法については、 Nucleic Acids Research, 2001,
Vol. 29, No. 19 e93や WO 03,078655八1ゃ特開2004—141158号公 報などで提案されている方法がある。しかしこれらに限られることはなぐピロリン酸量 が測定できればよい。
[0086] (実施の形態 3)
本実施の形態 3では、本発明におけるアレル特異性プライマーを用いて PCRを行う ことで SNPを判別する方法にっ 、て説明する。
[0087] 図 4に示すように、まず標的 DNA配列を含む二本鎖 DNAにつ!/、て、 PCR反応を 行えるように調製する。ここで標的 DNA配列条件は、実施の形態 1と同じぐ標的 SN
P塩基が 5'末端に存在し、かつその 5'末端から 2番目の塩基が Aであり、かつその 5
'末端から 3番目の塩基が Tである。
[0088] したがって、標的 DNA配列の相補鎖においては、その 3'末端塩基が標的 SNP塩 基と相補的であり、かつその 3'末端から 2番目の塩基が Tであり、かつその 3'末端か ら 3番目の塩基が Aである。
[0089] このような配列条件を満たす二本鎖 DNAを、上記のとおり PCR反応が行える状態 に調製して、実施の形態 1で示した配列条件を満たすアレル特異性プライマーと、こ のアレル特異性プライマーとフォワードプライマー Zリバースプライマーの関係になる 第二のプライマーと、 PCR用 DNAポリメラーゼと、 dNTPsと、 Mgイオンと、バッファ 一、また必要であれば所望の塩をカ卩えて PCR反応を行えばょ 、。
[0090] この結果、アレル特異性プライマーの 3'末端に位置する SNP対応塩基が標的 SN
P塩基と相補的であれば、このアレル特異性プライマーと第二のプライマーによって 挟まれた領域のテンプレート DNAは効率良く増幅される。
[0091] 逆に、アレル特異性プライマーの 3'末端に位置する SNP対応塩基が標的 SNP塩 基と非相補的であれば、このアレル特異性プライマーと第二のプライマーによって挟 まれた領域のテンプレート DNAはほとんど増幅されない。
[0092] したがって、上記 PCR反応の後に、電気泳動などの方法によってこのテンプレート
DNAの増幅量を調べれば、擬陽性の可能性が極めて低ぐかつ明確な SNP判別 が可能となる。
[0093] あるいは、上記 PCR反応の最中、あるいは後に、 PCR反応の結果放出されるピロリ ン酸量を測定してもよい。
[0094] この場合においても、擬陽性の可能性が極めて低ぐかつ明確な SNP判別が可能 である。
[0095] 上記 PCR用 DNAポリメラーゼは 3 '→5 'ェキソヌクレアーゼ活性が弱!、か無!、こと 力 り好ましい。
[0096] テンプレート DNAの増幅量を測定する方法は特に限られず、上記の電気泳動法 以外でもよい。
[0097] ピロリン酸量を測定する方法については、 Nucleic Acids Research, 2001,
Vol. 29, No. 19 e93や WO 03/078655 Alゃ特開 2004— 141158号 公報などで提案されている方法がある。しかしこれらに限られることはなぐピロリン酸 量が測定できればよい。
[0098] (実施の形態 4)
本実施の形態 4では、本発明におけるアレル特異性プライマーを含む SNP判別用 キットについて説明する。
[0099] 使用者らは、ここで説明する SNP判別用キットを用いてプライマー伸長反応および ピロリン酸測定反応を行うことで、各自のサンプル中の標的 SNP塩基種を擬陽性の 可能性が極めて低ぐかつ正確に判別可能となる。
[0100] 本実施の形態 4における SNP判別用キットは、標的 DNA配列に対して実施の形態
1に示した本発明におけるアレル特異性プライマーを含むアレル特異性プライマー 試薬チューブと、 DNAポリメラーゼを含む DNAポリメラーゼ試薬チューブと、必要に 応じて所望の塩が添加されたバッファーを含むバッファー試薬チューブと、 dNTPsを 含む dNTPs試薬チューブと、ピロリン酸測定用試薬を含むピロリン酸試薬チューブ からなる。
[0101] したがって使用者らは、まず各自の標的 DNA配列を含む一本鎖 DNAある ヽはニ 本鎖 DNAのサンプルについて、プライマー伸長反応を行える状態に調製した後、上 記アレル特異性プライマー試薬チューブに含まれたアレル特異性プライマーおよび DNAポリメラーゼ試薬チューブに含まれた DNAポリメラーゼおよびバッファー試薬 チューブに含まれたバッファーおよび dNTPs試薬チューブに含まれた dNTPsを用 いて、実施の形態 2で説明した方法に従ってプライマー伸長反応を行えばよい。
[0102] プライマー伸長反応の過程で反応液中に放出されたピロリン酸は、上記ピロリン酸 試薬チューブに含まれたピロリン酸測定用試薬を用いて測定することができる。
[0103] したがってその測定結果によって標的 SNP塩基種を擬陽性の可能性が極めて低く 、かつ正確に判別可能となる。
[0104] ピロリン酸測定用試薬は、ピロリン酸測定ができるものであれば特に限定されない 力 Nucleic Acids Research, 2001, Vol. 29, No. 19 e93で示されたよ うにルシフェラーゼによる発光反応を用いるのであれば、ピロリン酸を ATPに変換す るための ATPスルフリラーゼおよび、 ATPと反応して発光反応（波長 520nm)を行う ルシフェリンおよび、その反応を触媒するルシフェラーゼを含む。
[0105] これらは一本のチューブに混合された状態であってもよいし、それぞれ別々のチュ ーブに含まれて 、てもよ 、。
[0106] いずれにしても使用者らは、上記プライマー伸長反応の過程で放出されるピロリン 酸をこれらのピロリン酸測定用試薬を用い、 Nucleic Acids Research, 2001,
Vol. 29, No. 19 e93で示された方法に準じて光学的にピロリン酸を測定するこ とがでさる。
[0107] さらにこの場合、プライマー伸長反応で未反応のまま残った dATPがルシフェリンと 反応してしまうため、より好ましくは、これら未反応 dATPを分解するための酵素を含 むチューブもキットの一部として含まれる。
[0108] この酵素は、上記のルシフェラーゼによる反応の前力、あるいはピロリン酸力も ATP への変換反応の前において、プライマー伸長反応液に加えられ dATP分解反応が 行われることが好ましい。
[0109] ピロリン酸測定用試薬については、 WO 03Z078655A1で示されたピロリン酸の 電気化学的測定法を用いるのであれば、ピロリン酸をリン酸に加水分解するためのピ 口ホスファターゼおよび、このリン酸と反応する GAP (グリセルアルデヒド 3—リン酸）と NADおよび、このリン酸 GAP— NADの反応を触媒する GAPDH (グリセルアル デヒド 3—リン酸デヒドロゲナーゼ）および、このリン酸 GAP— NADの反応より得ら れる NADHと反応する電子メディエータ（酸化型）および、この NADHと電子メディ エータとの反応を触媒するジァホラーゼを含む。
[0110] これらは一本のチューブに混合された状態であってもよいし、それぞれ別々のチュ ーブに含まれていてもよい。いずれにしても使用者らは、上記プライマー伸長反応の 過程で放出されるピロリン酸をこれらのピロリン酸測定用試薬を用い、 WO 03/07 8655 A1で示された方法に準じて電気化学的にピロリン酸を測定することができる
[0111] ピロリン酸測定用試薬については、特開 2004— 141158号公報で示されたピロリ ン酸の電気化学的測定法を用いるのであれば、ピロリン酸をリン酸に加水分解すると ともに、 H+を輸送する H+— PPase (H+—ピロホスファターゼ）を含む膜および、 H+ 濃度に依存して光学的特性が変わる色素を含む。
[0112] これらは一本のチューブに混合された状態であってもよいし、それぞれ別々のチュ ーブに含まれていてもよい。いずれにしても使用者らは、上記プライマー伸長反応の 過程で放出されるピロリン酸をこれらのピロリン酸測定用試薬を用い、特開 2004— 1 41158号公報で示された方法に準じて光学的にピロリン酸を測定することができる。
[0113] ピロリン酸を測定する方法に関しては、ここで挙げたもの以外にも数多くの方法が知 られている。したがって、もちろんピロリン酸測定用試薬についてもここに挙げたもの に限られることなぐピロリン酸測定に必要な試薬全てあるいは一部を含む構成となつ ていればよい。
[0114] ピロリン酸測定用試薬の代わりに、サイバーグリーン Iのように二本鎖 DNAに結合 する蛍光指示薬が本実施の形態 4のキットに含まれる構成としてもよい。
[0115] すなわち、サイバーグリーン Iに代表される二本鎖 DNAに結合する蛍光指示薬存 在下でプライマー伸長反応を行わせると、その蛍光をモニタリングすることでプライマ 一伸長反応過程をリアルタイムで解析することが可能であり、この解析結果力 SNP 判別を行うことができる。
[0116] サイバーグリーン Iに代表される二本鎖 DNAに結合する蛍光指示薬は、単独で一 本のチューブに含まれて 、てもよ 、し、ある 、はバッファー試薬チューブなどに含ま れている構成としてもよぐこの蛍光指示薬をプライマー伸長反応液に混合できるキッ ト構成とすればよい。
[0117] 同様に、ピロリン酸測定用試薬の代わりに、 TaqManプローブが実施の形態 4のキ ットに含まれる構成としてもよい。 [0118] すなわちプライマー伸長反応が進む配列中の所望の領域に結合するように TaqM anプローブを設計しておけば、この TaqManプローブに依存した蛍光をモニタリング することでプライマー伸長反応過程をリアルタイムで解析することが可能であり、この 解析結果から SNP判別を行うことができる。
[0119] そのように設計された TaqManプローブは、単独で一本のチューブに含まれていて もよいし、あるいはバッファー試薬チューブなどに含まれている構成としてもよぐ Taq Manプローブをプライマー伸長反応液に混合できるキット構成とすればよい。
[0120] またここで、上記 DNAポリメラーゼは 3'→5 'ェキソヌクレアーゼ活性が弱いか無い ことがより好ましい。その方がより SNP判別が正確となる。またさらに、上記 DNAポリ メラーゼは、耐熱性のものである方がより好ま 、。
[0121] (実施の形態 5)
本実施の形態 5では、本発明におけるアレル特異性プライマーを含む SNP判別用 キットについて説明する。
[0122] 使用者らは、ここで説明する SNP判別用キットを用いることで、各自のサンプル中 の標的 SNP塩基種を擬陽性の可能性が極めて低ぐかつ正確に判別するための P CR反応を行うことができる。
[0123] 本実施の形態 5における SNP判別用キットは、標的 DNA配列に対して実施の形態 1に示した本発明におけるアレル特異性プライマーおよびこのアレル特異性プライマ 一とフォワードプライマー/リバースプライマーの関係になる第二のプライマーを含む プライマー試薬チューブと、 PCR用 DNAポリメラーゼを含む PCR用 DNAポリメラー ゼ試薬チューブと、 Mgイオンと必要に応じて所望の塩が添加されたバッファーを含 むバッファー試薬チューブと、 dNTPsを含む dNTPs試薬チューブからなる。
[0124] したがって使用者らは、まず各自の標的 DNA配列を含む二本鎖 DNAのサンプル について、 PCR伸長反応を行える状態に調製した後、上記プライマー試薬チューブ に含まれたアレル特異性プライマーと第二のプライマーおよび、 PCR用 DNAポリメラ ーゼ試薬チューブに含まれた PCR用 DNAポリメラーゼおよび、ノ ッファー試薬チュ ーブに含まれたバッファーおよび、 dNTPs試薬チューブに含まれた dNTPsを用い て、実施の形態 3で説明した方法に従って PCR反応を行えばょ ヽ。 [0125] 本実施の形態 5におけるキットは、 PCR反応効率を調べるための試薬を含んでいる ことがより好ましい。 PCR反応効率を調べるための試薬としては、実施の形態 3同様 に、ピロリン酸測定用試薬や、サイバーグリーン Iのように二本鎖 DNAに結合する蛍 光指示薬や、 TaqManプローブが挙げられる。
[0126] ピロリン酸測定用試薬は、 PCR反応の過程で反応液中に放出されたピロリン酸を 測定することができる。したがってその測定結果によって標的 SNP塩基種を擬陽性 の可能性が極めて低ぐかつ正確に判別可能となる。ピロリン酸測定用試薬の種類 については、実施の形態 4と同じであり、ピロリン酸測定に必要な試薬全てあるいは 一部を含む構成となって 、ればよ 、。
[0127] サイバーグリーン Iのように二本鎖 DNAに結合する蛍光指示薬や、 TaqManプロ一 ブについては、これらの存在下で PCR反応を行うことで、 PCR反応の過程をリアルタ ィムでモニタリングでき、その結果によって標的 SNP塩基種を擬陽性の可能性が極 めて低ぐかつ正確に判別できる。
[0128] したがって、これらは単独で一本のチューブに含まれていてもよいし、あるいはバッ ファー試薬チューブなどに含まれている構成としてもよぐこれらの試薬を PCR反応 液に混合できるキット構成とすればょ 、。
[0129] 以上、上記実施の形態 1〜5を通じて、本発明におけるアレル特異性プライマーお よび、このアレル特異性プライマーを用いた SNP判別方法および、このアレル特異 性プライマーを含む SNP判別用キットについて説明した。
[0130] これらは特に SNPに限られることなぐ突然変異による一塩基の違いの判別や、あ る!ヽは人工的にある特定の塩基に変異を起こさせた場合の一塩基の違!、の判別に っ 、ても全く同様の効果を示すことは言うまでもな 、。
実施例
[0131] 本発明のより具体的な実施例について以下に記す。
[0132] (実施例 1)
本実施例 1では、本発明におけるアレル特異性プライマーを用いたプライマー伸長 反応によって λ DNA中の標的塩基種判別を行った。
[0133] すなわち、まずえ DNA (タカラバイオ株式会社製）中の 6894番目の TZA塩基対 につ 、て人工的に GZC塩基対に置換した変異 λ DNA 6894— GCを作成した。
[0134] そしてこれら塩基対の置換の判別を、
5， - GCGATGTGGCCATCGTCGTGTTCT- 3 ' ( λ TCT)、
5，一 GCGATGTGGCCATCGTCGTGTGCT— 3' ( λ— GCT)、および
5， - GCGATGTGGCCATCGTCGTGTCCT- 3' ( λ -CCT)
力もなる三種類のプライマーを用いて行うこととした。
[0135] 上記三種類のプライマーを順に、 λ -TCT, λ— GCT、 λ— CCTと呼ぶ。
[0136] ここで、上記三種類のプライマーの 3'末端塩基 Tは、野生型え DNAの 6871〜68 94番目力らなる二本鎖 DNA酉己歹 IJ5， - GCGATGTGGCCATCGTCGTGTATT — 3， /5， - AATAC ACG ACG ATGGCC AC ATCGC— 3，のうち、 5， -AATA CACGACGATGGCCACATCGC— 3，の 5，末端塩基 Aと相補的である。
[0137] 上記三種類のプライマーの 3 '末端から 2番目の塩基 Cは、同様に 5' -AATACA CGACGATGGCCACATCGC— 3，の 5，末端から 2番目の塩基 Aと CZAの非相 補的な関係である。
[0138] 上記三種類のプライマーの 3，末端から 3番目の塩基種は全て異なるが（ λ -TCT の場合は Τ、 λ— GCTの場合は G、 λ— CCTの場合は C)、同様に 5， -AATACA CGACGATGGCCACATCGC— 3，の 5，末端から 3番目の塩基 Tと非相補的な関 係である。
[0139] 上記三種類のプライマーの 3，末端から 4番目の塩基から 5，末端の塩基までの配列 は、同様に 5，— AATACACGACGATGGCCACATCGC— 3，の 5，末端から 4番 目の塩基から 3 '末端の塩基までの配列に対して完全に相補的である。
[0140] 一方、上記三種類のプライマーの 3'末端の三塩基は、変異え DNA— 6894— GC の 6871〜6894番目力らなる二本鎖 DN A配列 5，一 GCG ATGTGGCCATCGT CGTGTATG- 3' /5 ' -CATACACGACG ATGGCC AC ATCGC 3，のうち 、 5，— £ATACACGACGATGGCCACATCGC— 3，の 5，末端の三塩基に対し て非相補的である (下線部が変異導入部位)。
[0141] 実験は下記のとおりであった。
[0142] まず、 20 μ Mの上記野生型 λ DNAあるいは変異型 λ DNA-6894-GC,
10 Μのえ一 TCTあるいはえ一 GCTあるいはえ一 CCTのいずれか、 0. 5UZ μ Lの TaKaRa Taq (タカラバイオ株式会社製）、
10mMの Tris— HCl(pH8. 3)、
50mMの KC1、
1. 5mMの MgC12および、
各 ImMの dNTPs
を含む反応溶液 10 μ Lを調製した。
[0143] この反応溶液を MJ Reserch社製サーマルサイクラ一である DNA engineを用い て 95°Cで 1分間インキュベートした後、 58°Cで 5分間インキュベートし、最後に 72°C で 10分間インキュベートした。
[0144] インキュベート後の反応液については、ルシフェラーゼの反応系を利用することで 含まれて 、るピロリン酸量を解析した。
[0145] より具体的には Kambaraらの方法（Nucleic Acids Research, 2001, Vol.
29, No. 19 e93)に準じて、ピロリン酸量を発光強度に変換して解析した。
[0146] 解析結果を図 5に示す。
[0147] これらの結果は、野生型 λ DNAにつ!/、て λ— TCTによってプライマー伸長反応 を行った場合の発光強度を 100%としたときの、それぞれの場合における比較発光 強度を示している。
[0148] 図 5より、上記え— TCT、 λ— GCT、 λ—CCTのいずれに関しても、変異型え D NA— 6894— GCの場合より野生型え DNAの場合のほうが、明らかに発光強度が 大きいことが分力る。
[0149] すなわち、上記え—TCT、 λ—GCT、 λ—CCTによって明確に本実施例におけ る一塩基の違 、を判別できたと言える。
[0150] (比較例 1)
本比較例 1では、上記実施例 1の比較実験として、上記実施例 1の野生型え DNA と変異型え DNA— 6894— GCの一塩基の違いについて、以下の三種類のプライマ 一を用いて判別を試みた。 [0151] すなわち、
5， - GCGATGTGGCCATCGTCGTGTTAT- 3 ' ( λ -TAT)、
5，一 GCGATGTGGCCATCGTCGTGTGAT— 3' ( λ— GAT)、および 5， - GCGATGTGGCCATCGTCGTGTCGT- 3' ( λ -CGT)
の配列カゝらなる三種類のプライマーを用いて、実施例 1と同様の実験を行った。
[0152] これら三種類のプライマーを順に、 λ -TAT, λ -GAT, λ—CGTと呼ぶ。
[0153] これらは、 λ— TCT、 λ— GCT、 λ— CCTと同じぐその 3'末端塩基 (T)が 5 ' - AATACACG ACGATGGCCACATCGC— 3，の 5，末端塩基 ( Α)と相補的であ る。
[0154] これらの 3，末端から 2番目および 3番目の塩基は、 5，一 AATACACG ACGATG GCCACATCGC— 3'の 5'末端から 2番目および 3番目の塩基と非相補的である。
[0155] その残りの配列が 5，—AATACACGACGATGGCCACATCGC— 3'の残りの 配列と完全に相補的である。
[0156] 解析結果を図 6に示す。
[0157] これらの結果は、図 5と同様に野生型 λ DNAにつ!/、て λ—TCTによってプライマ 一伸長反応を行った場合の発光強度を 100%としたときの、それぞれの場合におけ る比較発光強度を示して ヽる。
[0158] これら三種類のプライマーと野生型 λ DNAの組み合わせの場合における発光強 度は、図 5に示されているえ TCTやえ—GCTやえ—CCTと野生型え DNAの組 み合わせの場合に比べると明らかに小さく（図 5および図 6の縦軸の大きさに注意）、 これにより λ—TCTやえ GCTやえ CCTの判別能がより優れていることが分かる
[0159] これらの実施例 1および比較例 1から理解されるように、標的 SNP塩基の 3'末端側 にすぐ隣接する塩基が Aであり、もう一塩基隣の塩基が Tである場合には、アレル特 異性プライマーの 3'末端から 2番目の塩基力 であり、 3番目の塩基が Tか G力じの V、ずれかであれば、非常に高 、判別能を得ることができる。
[0160] (実施例 2)
本実施例 2では、本発明におけるアレル特異性プライマーを用いた PCR反応によ つて λ DNA中の標的塩基種判別を行った。
[0161] まず、 λ DNA (タカラバイオ株式会社製）中の 6876番目の GZC塩基対にっ 、て 人工的に AZT塩基対に置換した変異型 λ DNA— 6876— ATを作成した。
[0162] そしてこれら塩基対の置換の判別を、
5， - GTGTCCTATAAGGGGATGTATGGCGTCG - 3 ' ( λ TCG)、 5， - GTGTCCTATAAGGGGATGTATGGCGGCG - 3 ' ( λ GCG)、 5， - GTGTCCTATAAGGGGATGTATGGCGCCG- 3' ( λ -CCG) 力 なる三種類のプライマーをフォワードプライマーとして用いた PCR反応によって 行うこととした。
[0163] 上記三種類のプライマーを順に、 λ -TCG, λ -GCG, λ— CCGと呼ぶ。
[0164] ここで、上記三種類のプライマーの 3'末端塩基 Gは、野生型え DNAの 6849〜68 76番目力らなる二本鎖 DNA酉己歹 IJ5， - GTGTCCTATAAGGGGATGTATGGC GATG— 3， /5，一 CATCGCCATACATCCCCTTATAGGACAC— 3，のうち 、 5，— CATCGCCATACATCCCCTTATAGGACAC— 3，の 5，末端塩基 Cと相 補的である。
[0165] 上記三種類のプライマーの 3 '末端から 2番目の塩基 Cは、同様に 5' -CATCGC CATACATCCCCTTATAGGACAC— 3，の 5，末端から 2番目の塩基 Aと C/A の非相補的な関係である。
[0166] 上記三種類のプライマーの 3，末端から 3番目の塩基種は全て異なるが（ λ -TCG の場合は Τ、 λ—GCGの場合は G、 λ— CCGの場合は C)、同様に 5，一 CATCGC CATACATCCCCTTATAGGACAC— 3，の 5，末端から 3番目の塩基 Tと非相補 的な関係である。
[0167] 上記三種類のプライマーの 3，末端から 4番目の塩基から 5，末端の塩基までの配列 は、同様に 5，— CATCGCCATACATCCCCTTATAGGACAC— 3，の 5，末端 力 4番目の塩基から 3'末端の塩基までの配列に対して完全に相補的である。
[0168] 一方、上記三種類のプライマーの 3'末端の三塩基は、変異え DNA— 6876— TA の 6849〜6876番目力らなる二本鎖 DN A配列 5， - GTGTCCTATAAGGGGA TGTATGGCG ATT - 3， /5， - AATCGCCATACATCCCCTTATAGGAC AC— 3，のうち、 5 ' - AATCGCC ATAC ATCCCCTTATAGG AC AC - 3 ' ( 5 ' 末端の三塩基に対して非相補的である（下線部が変異導入部位)。
[0169] リバースプライマーとしては、 5' -GAATCACGGTATCCGGCTGCGCTGA-
3'からなる DNAを用いた。
[0170] このリバースプライマーは、 DNAの 7406〜7430番目力もなる二本鎖 DNA配 列 5， -TCAGCGCAGCCGGATACCGTGATTC - 3 ' /5 ' 一 GAATCACGG
TATCCGGCTGCGCTGA—3^ 、 5， 一 TCAGCGCAGCCGGATACCG
TGATTC - 3，と完全に相補的である。
[0171] 仮に上記え一 TCG、 λ— GCG、 λ—CCGとの PCR反応によって良好に反応が 進めば、 58 lbpの DNA増幅産物が得られるはずである。
[0172] 実験は下記のとおりである。
[0173] まず、
Light Cycler -FastStart DNA Master SYBER Green Iキット（ロシュ 'ダ ィァグノステイクス社製)の酵素ミクスチヤ一を 2 μ L
10 gZmLの上記野生型 λ DNAあるいは変異型 λ DNA- 6876 -AT,
1 Mのえ一 TCGあるいはえ一 GCGあるいはえ一 CCGのいずれか
1 μ Μの上記リバースプライマー
1. 6mMの MgC12
を含む反応溶液 20 μ Lを調製した。
この反応溶液をロシュ ·ダイァグノステイタス社製サーマルサイクラ一である LightCyc lerを用いて、変性工程： 94°C、 10秒間、アニーリング工程： 58°C、 10秒間、伸長ェ 程： 72°C、 10秒間、サイクル数： 20サイクルとして PCR反応を行った。
[0174] 各 PCR反応結果については、アジレント'テクノロジーズ社製の DNA電気泳動用 システムである Bioanalyzer2100を用 、て解析した。
[0175] 解析結果を図 7に示す。
[0176] これらの結果は、各 PCR反応後における目的の DNA断片の濃度 (nM)を示して いる。
[0177] この結果より、上記え一 TCG、 λ— GCG、 λ—CCGのいずれをフォワードプライ マーとして用いた場合も、変異型え DNA— 6876— ATの場合においては目的の D
NA断片は検出されなカゝつた。
[0178] 一方、野生型 λ DNAの場合は全て、目的の DNA断片は ΙΟηΜ以上であった。
[0179] すなわち、上記え TCG、 λ—GCG、 λ CCGをフォワードプライマーとして用 いて PCR反応を行うことによって明確に本実施例における一塩基の違いを判別でき たと言える。
[0180] (比較例 2)
本比較例 2では、上記実施例 2の比較実験として、上記実施例 2の野生型え DNA と変異型 λ DNA— 6876— ATの一塩基の違いにつ!、て、以下の三種類のプライマ 一を用いて判別を試みた。
[0181] すなわち
5， - GTGTCCTATAAGGGGATGTATGGCGTAG - 3 ' ( λ -TAG)、 5， - GTGTCCTATAAGGGGATGTATGGCGGAG - 3 ' ( λ -GAG)、 5， - GTGTCCTATAAGGGGATGTATGGCGCGG- 3' ( λ -CGG) の配列カゝらなる三種類のプライマーを用いて、実施例 2と同様の実験を行った。
[0182] これら三種類のプライマーを順に、 λ -TAG, λ -GAG, λ—CGGと呼ぶ。
[0183] これらは、実施例 2で用いた λ—TCG、 λ—GCG、 λ—CCGと同じく、その 3，末 端塩基（G)が 5，— CATCGCC ATACATCCCCTTATAGGACAC— 3，の 5，末 端 (C)と相補的である。
[0184] その 3'末端から 2番目および 3番目の塩基が 5'— CATCGCCATACATCCCC TTATAGGACAC— 3'の 5'末端から 2番目および 3番目の塩基と非相補的である
[0185] その残りの配列が 5，— CATCGCCATACATCCCCTTATAGGACAC— 3，の 残りの配列と完全に相補的である。
[0186] 解析結果を図 8に示す。
[0187] これらの結果は、図 7と同様に各 PCR反応後における目的の DNA断片の濃度 (n M)を示している。
[0188] これより、まずえ -TAG, λ -GAG, λ—CGGのいずれにおいても、野生型え D NAの場合は 1. 5nM以上の目的 DNA断片がわずかながら検出されているのに対 して、変異型 λ DNA- 6876 ATの場合は全く検出されて!、な!/、。
[0189] これら三種類のプライマーと野生型 λ DNAの組み合わせの場合における目的の D NA断片の濃度（図 7および図 8の縦軸の大きさに注意）は、 λ TCGやえ -GCG やえ CCGと野生型え DNAの組み合わせの場合に比べると約 10分の 1ほどであり 、明ら力に小さく、これより λ—TCG、 λ—GCG、 λ CCGの判別能がより優れて 、ることが分力る。
[0190] 上記説明から、当業者にとっては、本発明の多くの改良や他の実施の形態が明ら かである。したがって、上記説明は例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実 行する最良の態様を当業者に教示する目的で提供されたものである。本発明の精神 を逸脱することなぐその構造および Zまたは機能の詳細を実質的に変更できる。 産業上の利用可能性
[0191] 本発明により、擬陽性の可能性が極めて低ぐかつ明確に SNP判別が可能な DN Aが有する標的 SNP塩基を判別する方法が提供される。

Claims

請求の範囲 [1] DNAが有する標的塩基を判別する方法であって、 前記方法は、
(1) A、 T、 G、および Cの 4種類の塩基の中力も前記標的塩基として予想される塩 基と相補的な塩基を 3 '末端に有するアレル特異性プライマーを前記 DNAに結合さ せて DNA伸長反応を生じさせる DNA伸長工程、および
(2) 前記 DNA伸長工程の効率を調べ、高効率であれば前記標的塩基は前記予 想された塩基と同一であると判別され、低効率であれば前記標的塩基は前記予想さ れた塩基とは異なると判別される判別工程
を有し、
前記 DNAにおいて、前記標的塩基の 3'末端側にすぐ隣接する塩基が Aであり、も う一塩基隣の塩基が Tであり、
前記アレル特異性プライマーの 3'末端塩基が前記標的塩基であると予想される塩 基と相補的であり、
前記アレル特異性プライマーの 3'末端から 2番目の塩基が Cであり、
前記アレル特異性プライマーの 3 '末端から 3番目の塩基が Tか G力 Cの 、ずれか であり、かつ
前記アレル特異性プライマーの 3'末端力 4番目の塩基と 5'末端の塩基との間の 塩基配列が、前記アレル特異性プライマーの 3'末端力 4番目の塩基に対応する前 記 DNA側の塩基と前記アレル特異性プライマーの 5 '末端の塩基に対応する前記 D NA側の塩基との間の塩基配列に相補的に結合する、方法。
[2] 前記 DNA伸長反応がプライマー伸長反応である、請求項 1に記載の方法。
[3] 前記 DNA伸長反応が、前記アレル特異性プライマーのみからのプライマー伸長反 応である、請求項 1に記載の方法。
[4] 前記プライマー伸長反応により産生されるピロリン酸の濃度を調べることによって前 記効率を調べる、請求項 2に記載の方法。
[5] 前記ピロリン酸の濃度を発光強度として検出する、請求項 4に記載の方法。
[6] 前記 DNA伸長反応が PCR反応である、請求項 1に記載の方法。
[7] 前記 DNA伸長反応が、前記アレル特異性プライマーともう一つの異なるプライマ 一からなる PCR反応である、請求項 1に記載の方法。
[8] 前記 PCR反応により産生された増幅 DNAの濃度を、電気泳動法により測定するこ とによって前記効率を調べる、請求項 6に記載の方法。
[9] DNAが有する標的塩基を判別するためのアレル特異性プライマーであって、 前記 DNAにおいて、前記標的塩基の 3'末端側にすぐ隣接する塩基が Aであり、も う一塩基隣の塩基が Tであり、
前記アレル特異性プライマーの 3'末端塩基力 A、 T、 G、および Cの 4種類の塩基 の中から前記標的塩基として予想される塩基と相補的であり、
前記アレル特異性プライマーの 3'末端から 2番目の塩基が Cであり、
前記アレル特異性プライマーの 3 '末端から 3番目の塩基が Tか G力 Cの 、ずれか であり、かつ
前記アレル特異性プライマーの 3'末端力 4番目の塩基と 5'末端の塩基との間の 塩基配列が、前記標的塩基力 3'末端側に 3塩基隣の塩基力 3'末端側の塩基配 列に対して相補的に結合する、アレル特異性プライマー。
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