JP2004248635A - イネゲノムの１塩基多型判別法の開発とイネ品種識別への応用 - Google Patents
イネゲノムの１塩基多型判別法の開発とイネ品種識別への応用 Download PDFInfo
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Abstract
【課題】本発明の課題は、簡便、かつ再現性の高いゲノムＤＮＡの多型性の識別方法を提供することにある。本発明の方法は、例えば、イネの品種識別、さらにはイネの育種選抜におけるＤＮＡマーカーに使用することが可能である。
【解決手段】１塩基多型を判別するためのＰＣＲプライマーによって上記課題を解決する。プライマーの３’末端は、判別すべき１塩基多型の位置に対応し、プライマーの３’末端から３番目の塩基はプライマーがアニールする鋳型配列と相補的な塩基から置換されている。この置換はＧからＴ、ＡからＣへ、ＴからＧ、またはＣからＡの置換である。
【選択図】なし
【解決手段】１塩基多型を判別するためのＰＣＲプライマーによって上記課題を解決する。プライマーの３’末端は、判別すべき１塩基多型の位置に対応し、プライマーの３’末端から３番目の塩基はプライマーがアニールする鋳型配列と相補的な塩基から置換されている。この置換はＧからＴ、ＡからＣへ、ＴからＧ、またはＣからＡの置換である。
【選択図】なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、主にイネの品種識別方法に属する。加えて、本発明の技術は、イネの育種選抜において有用形質を選抜するためのＤＮＡマーカーとしても応用可能である。本発明の方法は、一粒の米飯またはイネの植物体より抽出したＤＮＡから、ゲノムＤＮＡ中の１塩基レベルの差を簡便に判別して、イネの品種を識別する方法に関する。
【０００２】
さらに、本発明は、イネの品種識別のみならず、例えば、選抜用ＤＮＡマーカーとして、１塩基レベルの差の判別能を利用して、ＤＮＡマーカー部位の遺伝子型決定を行う方法に属する。
【０００３】
【従来の技術】
近年、ゲノムＤＮＡの多型性に基づく品種の識別法が開発されている。
【０００４】
ＰＣＲ法を使用しないＤＮＡ多型の検出方法としては、ＡＦＬＰ（Ａｍｐｌｉｆｉｌｅｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）が挙げられる。ＡＦＬＰ法は、１９９０年代に開発された、個体間、品種間のゲノムＤＮＡの相同性を検出するゲノムフィンガープリント法であり（Ｖｏｓら（１９９５）ＡＦＬＰ：ａ ｎｅｗ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ＤＮＡ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３、４４０７〜４４１４）、現在は、ＡＦＬＰのためのキットも市販されている（例えば、ＡＦＬＰ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）。この方法は、（１）ゲノムＤＮＡを２種の制限酵素で処理し、アダプターを連結する、（２）アダプター配列に基づくプライマーを使用してＰＣＲを行う（このプライマーは、アダプター配列の３’末端に特定の鋳型のみを増幅するための選択塩基を加えた配列を有する）、（３）増幅産物を、電気泳動によって分離し、特異的な増幅産物の有無を検出する、という工程を包含する方法である。この方法は、反応に必要なＤＮＡが大量に必要であり、ＰＣＲと比較して工程が複雑であり、しかも、制限酵素認識部位以外での１塩基レベルの変化を判別することができないという欠点を有する。
【０００５】
近年、ＰＣＲ法を用いた多型の判別法が開発されている。ＰＣＲ法の原理を使用した、ゲノムＤＮＡの多型の識別法としては、マイクロサテライト法、ＲＡＰＤ法（ｒａｎｄｏｍ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ ｍｅｔｈｏｄ）、ＲＡＰＤ由来ＳＴＳ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｇｅｄ ｓｉｔｅ）法などが用いられている。しかし、これら従来法には、以下の欠点がある。
【０００６】
マイクロサテライト法は、ゲノムＤＮＡ中に存在する数塩基の反復配列（マイクロサテライト）を増幅して、その反復配列の繰り返しの数の違いという多型性を判別する方法である。この方法は、数塩基の反復配列の反復数の差異というわずかなＰＣＲ増幅フラグメント長の差異を検出する方法であるため、増幅産物の解析の際に、高濃度のゲルを作成し、かつ慎重に長時間電気泳動をする必要がある。また、１塩基多型を判別できないという欠点を有する。
【０００７】
ＲＡＰＤ法は、一般に１２塩基程度のランダムプライマーを使用して、ゲノムＤＮＡを増幅し、増幅されたバンドのパターンを電気泳動によって検出することによる、多型の判別方法である。ＲＡＰＤ法は、プライマーの調製は簡便ではあるものの、ＰＣＲの条件を厳密に設定する必要があり、しかも、わずかな条件（例えば、温度）の差異によって異なる結果が生じる。従って、ＲＡＰＤ法では、ＰＣＲ条件の設定が困難であり、かつ条件を設定しても、再現性に乏しく、安定的な判別が困難である。また、ＲＡＰＤ法は、鋳型ＤＮＡの純度の影響を受け、さらに、複数回のＰＣＲと電気泳動が必要であるという欠点もある。
【０００８】
ＲＡＰＤ由来ＳＴＳ法は、ＲＡＰＤ法によって同定された特異的なバンドの配列決定を行い、その配列情報に基づいてプライマーを設計して、ＰＣＲを行う方法である。この方法は、ＲＡＰＤ法によって同定されたバンドに基づく方法であるため、塩基配列がかなり異なる多型を有するゲノム部分でのみ使用可能であり、１塩基置換を判別することが困難である。
【０００９】
ＳＮＰｓ法は１塩基多型の遺伝子型を判別することができる方法ではあるが、安定的な判別のためには、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）のマルチラベルカウンターのような高価な装置を使用する必要がある。
【００１０】
本発明は、これら従来法の欠点を克服し、簡便かつ再現性の高い１塩基レベルの多型を判別するためのＰＣＲプライマーを提供するものである。
【００１１】
ＤＮＡ多型判別方法の適用例として、ゲノムＤＮＡ配列の多型性に基づく品種識別も、近年重要になっている。例えば、イネの場合、古典的な品種識別は、交配させた場合の稔実性、イネの草型、米の粒型、酵素多型等の比較により行われてきた。しかし、これらの古典的な技術は、インディカとジャポニカの識別や、インディカ同士あるいはジャポニカ同士でも遠縁のイネの識別には有効である一方で、近縁の米の識別に供するには不十分であった。近年のように「コシヒカリ」を中心として開発された近縁良食味米同士の識別に用いることは不可能であるという問題がある。
【００１２】
食糧法の施行に伴って、精米の品種、産地、産年を精米の包装に表示することが義務づけられた。これらの表示は品種識別の指標の一つとなりうるが、これらの他に植物体や籾、玄米の情報がない場合には、近縁の良食味米の品種を識別することは極めて困難である。
【００１３】
最近では、コンビニエンスストア、業務用炊飯サービス、外食産業等で米飯として供給される米についても、品種の特定が必要とされている。しかし、炊飯による澱粉の糊化、タンパク質の変性等が起こるため、古典的な技術によって、ＤＮＡの抽出や品種の識別を行うことは不可能である。
【００１４】
しかしながら、ゲノムＤＮＡの多型性を識別する従来方法には、上記のような欠点がある。そのため、簡便、かつ再現性の高い多型性の識別方法が求められている。
【００１５】
ゲノム分析による品種識別と原理を同じくする、ＤＮＡマーカー選抜育種におけるゲノム上の多型判別技術も、現行技術は同様な欠点を持ち、簡易で、かつ信頼のおける多型の識別技術が必要である。
【００１６】
【特許文献１】
公開特許公報 特開平６−１１３８５０号
【特許文献２】
公開特許公報 特開平６−１１３８５１号
【特許文献３】
公開特許公報 特開平６−１１３８５２号
【特許文献４】
公開特許公報 特開平７−３９４００号
【特許文献５】
公開特許公報 特開２００１−９５５８９号
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、簡便、かつ再現性の高いゲノムＤＮＡの多型性の識別方法を提供することにある。本発明の方法は、例えば、イネの品種識別、さらにはイネの育種選抜におけるＤＮＡマーカーに使用することが可能である。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
上記課題は、ＳＮＰｓ判別法において使用するプライマーを検討し、簡便、かつ再現性の高い、ゲノムＤＮＡの多型性の識別に使用可能なプライマーをはじめて見出したことによって達成された。
【００１９】
具体的には、プライマーの３’末端から３番目の塩基を他の塩基に置換して、人工的なミスマッチを作り、ＰＣＲの選択性を高めた。このミスマッチを作る際は、例えば元の塩基がＧの場合はＴへ、Ａの場合はＣへ、Ｔの場合はＧへ、Ｃの場合はＡへ、置換すると最も高い確率で選択性のあるマーカーができる。
【００２０】
プライマーのＴｍは、５０℃以上、好ましくは、５５℃以上、より好ましくは、６０℃以上であり、そして、６５℃以上、７０℃以上のＴｍを有するプライマーも使用可能である。
【００２１】
従って、本発明は以下を提供する。
１． １塩基多型の遺伝子型を判別するためのＰＣＲプライマーであって、該プライマーの３’末端から１番目の塩基は判別すべき該１塩基多型の位置に対応し、該プライマーの３’末端から３番目の塩基は該プライマーがアニールする鋳型配列と相補的な塩基から置換されており、該置換はＧからＴ、ＡからＣへ、ＴからＧ、またはＣからＡの置換である、プライマー。
２． ５０℃以上のＴｍを有する、項目１に記載のプライマー。
３． ６０℃以上のＴｍを有する、項目１に記載のプライマー。
４． ６５℃以上のＴｍを有する、項目１に記載のプライマー。
５． 以下のプライマー対からなる群から選択されるプライマー対：
（１）配列番号１および２；
（２）配列番号３および４；
（３）配列番号５および６；
（４）配列番号７および８；ならびに
（５）配列番号９および１０。
６． 項目５に記載のプライマー対を少なくとも２つ含む、プライマーのセット。
７． 配列番号１〜１２からなる群から選択されるプライマーを２つ以上含む、項目６に記載のプライマーセット。
８． 項目１に記載のプライマーを使用する、１塩基多型の遺伝子型の判別方法。
９． 項目１に記載のプライマーを含む、１塩基多型の遺伝子型を判別するためのキット。
１０． １塩基多型の遺伝子型を判別する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）判別対象となる１塩基多型の遺伝子型を選択する工程；
ｂ）多型判別用プライマーを調製する工程であって、ここで、該多型判別用プライマーの３’末端から１番目の塩基は判別すべき該１塩基多型の位置に対応し、該多型判別用プライマーの３’末端から３番目の塩基は該多型判別用プライマーがアニールする鋳型配列と相補的な塩基から置換されており、該置換はＧからＴ、ＡからＣへ、ＴからＧ、またはＣからＡの置換である、多型判別用プライマーを調製する工程；
ｃ）該多型判別用プライマーと、少なくとも１つの別のプライマーを用いて、ＰＣＲを行う工程；および
ｄ）ＰＣＲ産物の増幅の有無から、１塩基多型の遺伝子型を判別する工程；
を包含する、方法。
１１． 少なくとも２つ以上のプライマー対を用いる、項目１０に記載の方法。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００２３】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００２４】
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。必要に応じて、プライマーは、デオキシイノシン残基で置換された塩基を含む。
【００２５】
用語「核酸」はまた、本明細書において、遺伝子、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を暗黙に包含する。その名が示唆するように「スプライス改変体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス改変体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。
【００２６】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２７】
本件明細書においてヌクレオチドを１文字表記する場合、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを、Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを示す。
【００２８】
本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。
【００２９】
本明細書において使用する場合、用語「プライマー」とは、適切な条件下（例えば、４つの異なるヌクレオシド三リン酸およびポリメライゼーション剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素）の存在下）で、適切な緩衝液中で、そして適切な温度において、鋳型指向性のＤＮＡ合成を開始する点として作用する一本鎖オリゴヌクレオチドをいう。プライマーの適切な長さは、プライマーの意図される使用に依存するが、代表的には、１５〜３０ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は、鋳型との十分に安定なハイブリッド複合体を形成するために、一般により低い温度を必要とする。プライマーは、鋳型の正確な配列に完全にマッチする必要はないが、鋳型とハイブリダイズするのに十分相補的であるべきである。用語「プライマー部位」とは、プライマーがハイブリダイズする標的である鋳型核酸の配列をいう。用語「プライマー対」とは、増幅される核酸配列の５’末端とハイブリダイズする５’（上流）プライマーおよび増幅されるその配列の３’末端の相補物とハイブリダイズする３’（下流）プライマーを含む一組のプライマーをいう。
【００３０】
本明細書において使用する場合、「１塩基多型」とは、遺伝子の塩基配列が一ヶ所だけ異なる状態、およびその部位をいう。本明細書において、「１塩基多型」は、「ＳＮＰ」および「ＳＮＰｓ」と互換可能に使用される。
【００３１】
本明細書において使用する場合、「多型判別用プライマー」とは、そのプライマーを用いたＰＣＲなどの核酸増幅反応によって、その増幅産物の有無から多型部位の遺伝子型を判別するために使用されるプライマーを意味する。本明細書において用語「多型判別用プライマー」は、「ＳＮＰ判別プライマー」および「ＳＮＰｓ判別プライマー」と互換可能に使用される。
【００３２】
また、本明細書においては、核酸増幅反応として、例示的に用語「ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）」を用いているが、本発明の実施のためにＰＣＲ以外の核酸増幅反応も使用可能である。従って、本発明のプライマーが使用されるのは、ＰＣＲに限定されない。
【００３３】
本明細書において、「プライマー」の３’末端から塩基を数える場合、「プライマーの３’末端から１番目の塩基」とは、３’末端の塩基をいう。従って、例えば、配列番号１の配列（５’−ＣＣＡＡＣＴＧＣＴＧＣＡＡＴＡＡＴＧＣＣ−３’）を有するプライマーにおいて、「プライマーの３’末端から１番目の塩基」は「Ｃ」であり、「プライマーの３’末端から３番目の塩基」は「Ｇ」である。
【００３４】
本明細書において、「プライマーの３’末端から１番目の塩基に対応する塩基」とは、プライマーが鋳型核酸とハイブリダイズした場合に、そのプライマーの３’末端から１番目の塩基がハイブリダイズする位置に存在する塩基をいう。
【００３５】
本発明のプライマーを用いるＰＣＲにおける鋳型ＤＮＡの調製は、周知の種々の方法（例えば、ＣＴＢＡ法、ボイル法など）によって、細胞および組織などからゲノムＤＮＡを調製することによって、行われ得る。
【００３６】
鋳型核酸としてＤＮＡフラグメントを使用する場合、鋳型核酸は、例えば、ゲノムＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡを消化することによって、あるいはＰＣＲの使用によって、調製され得る。プライマーまたはプローブとしての使用のためのオリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの化学合成の分野において公知の方法（非限定的例として、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２２：１８５９〜１８６２（１９８１））によって記載されるホスホロアミダイト法、およびＭａｔｔｅｕｃｃｉら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０３：３１８５（１９８１））によって提供されるトリエステル法（両方を本明細書において参考として援用する）によって化学的に合成される。これらの合成は、Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ，Ｄ．Ｒ．ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：６１５９〜６１６８（１９８４）において記載されるような自動合成機を使用し得る。オリゴヌクレオチドの精製は、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．およびＲｅｇｎｉｅｒ，Ｆ．Ｅ．（Ｊ．Ｃｈｒｏｍ、２５５：１３７〜１４９（１９８３））に記載されるように、ネイティブのアクリルアミドゲル電気泳動またはアニオン交換ＨＰＬＣのいずれかによって行われ得る。次に、所望される場合、二本鎖フラグメントは、適切な相補的な一本鎖の対を適切な条件下でアニールすることによってか、または適切なプライマー配列とともにＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖を合成することによって、得られ得る。核酸プローブのための特定の配列が与えられる場合、相補的鎖もまた同定され、そして含まれることが理解される。その相補的鎖は、標的が二本鎖核酸である場合、同等に良く作用する。
【００３７】
合成オリゴヌクレオチドの配列または任意の核酸フラグメントの配列は、ジデオキシチェーンターミネーション法またはマクサム−ギルバート法のいずれかを使用して得られ得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（１９８９）、本明細書において参考として援用する）。このマニュアルを、本明細書において、「Ｓａｍｂｒｏｏｋら」という；「Ｚｙｓｋｉｎｄら（１９８８）」。Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ）。
【００３８】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトとマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子とβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。
【００３９】
本発明において利用され得る一般的な分子生物学的手法としては、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、 Ｗｉｌｅｙ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら （１９８７） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹなどを参酌して当業者であれば容易に実施をすることができる。
【００４０】
（好ましい実施形態の説明）
１つの局面において、本発明は、３’末端から１番目、２番目、３番目、または４番目の塩基が置換されたプライマーを提供する。この置換は、１つのみであっても、２つ以上の組み合わせでもよい。好ましくは、３’末端から３番目の塩基のみが置換される。このプライマーの置換は、任意の置換であってよいが、好ましくは、ＧからＴ、ＡからＣへ、ＴからＧ、またはＣからＡの置換である。
【００４１】
１つの局面において、本発明のプライマーのＴｍは、好ましくは５０℃以上、なお好ましくは、５５℃以上、より好ましくは、６０℃以上であり、そして、６５℃以上、７０℃以上のＴｍを有するプライマーも使用可能である。
【００４２】
本発明のプライマーの３’は、判別する１塩基変異の位置に対応する。従って、１塩基変異の位置の塩基と、本発明のプライマーの３’末端から１番目の塩基はアニールし得る位置にある。本発明のプライマーを使用する場合、３’末端から１番目の塩基は、ＳＮＰの１つの遺伝子型の塩基と相補的であっても、そのＳＮＰの他の遺伝子型と相補的であってもよい。本発明のプライマーを複数使用する場合は、好ましくは、３’末端から１番目の塩基がＳＮＰの１つの遺伝子型の塩基に相補的であるプライマーと、３’末端の塩基がＳＮＰの他の遺伝子型の塩基に相補的であるプライマーとを組み合わせて使用する。
【００４３】
好ましくは、本発明のプライマーは、プライマーの３’末端の塩基と相補的な塩基を有する鋳型のみを増幅し得る。従って、本発明のプライマーを用いたＰＣＲ反応において、増幅産物が検出される場合には、鋳型中の、プライマー３’末端に対応する位置の塩基は、プライマー３’末端と相補的な塩基である。
【００４４】
本発明におけるＰＣＲ反応において使用される鋳型としては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡが挙げられるがこれらに限定されない。本発明において使用されるゲノムＤＮＡとしては、細菌の染色体ＤＮＡ、真核生物の核ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、ならびにウイルスＤＮＡが挙げられるがこれらに限定されない。本発明において使用される鋳型は、天然から単離された状態であっても、単離された後に酵素などによって処理されたものあってもよい。鋳型を処理する酵素としては、逆転写酵素、制限酵素、ポリメラーゼなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４５】
本発明において使用されるプライマーは、例えば、放射性物質、蛍光物質などによって標識されていてもよい。また、本発明のプライマーを使用するＳＮＰ判別方法において、同時に、ＳＴＳプライマーを使用してもよい。
【００４６】
ＰＣＲ産物を検出する方法としては、電気泳動、リアルタイムＰＣＲ検出装置が挙げられるがこれに限定されない。
【００４７】
ＰＣＲ反応のためには、周知または市販の種々の酵素を使用しうる。また、ＰＣＲ反応の条件は周知である。
【００４８】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。
【００４９】
【実施例】
（実施例１：ゲノムＤＮＡの調製）
種々の生物からゲノムＤＮＡを調製する方法は周知である。例えば、イネの精米、あるいは玄米からゲノムＤＮＡを調製する場合は、以下の方法を用いた。
【００５０】
精米、あるいは玄米を１粒とり（籾のついている米の場合は、藤原製作所（東京）の籾擦り機で玄米へ、玄米を精米にする場合は、ケット製（東京）の試験用パーレストを用いる）、薬包紙に包み、金槌で粉々にし、１．５ｍＬのエッペンチューブ（試験用ポリプロピレン製小型試験管）に入れた。 ４００μＬのＤＮＡ抽出液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．０， １０ｍＭ ＥＤＴＡ， １Ｍ ＫＣｌ）を添加し、攪拌した。１０分室温で静置後、トミー遠心器ＭＸ−１００で１５０００ｒｐｍ，１０分遠心し、上澄みをとり、４００μＬの２−プロパノールを加え、攪拌、１５０００ｒｐｍ，１０分遠心し、ＤＮＡを沈殿させた。上澄みを捨て、沈殿を乾燥させ、２０μＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， １ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ ８．０） に溶かし、鋳型ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）として使用した。
【００５１】
（実施例２：ＳＮＰ判別プライマーの最適化）
ＰＣＲ反応においてＳＮＰの異なる遺伝子型を特異的に増幅するプライマーを作成し、その特異性を検討し、プライマーを最適化した。
【００５２】
プライマーを最適化する際の候補プライマーとして、配列番号１３（Ａ１プライマー）と同様に、「Ｔ」塩基を「プライマーの３’末端から１番目の塩基に対応する塩基」として有する核酸配列を特異的に増幅するプライマーとして、Ａ２〜Ａ６プライマーを合成した（図１）。Ａ２〜Ａ６プライマー（配列番号１４〜１８）は、プライマーの３’末端から３〜５番目の塩基に対応する塩基が各種塩基に置換されたプライマーである。Ｂ１プライマー（配列番号１９）は、Ａ１プライマーの３’末端の「Ｔ」を「Ｃ」に置換したプライマーである。Ｂ２〜Ｂ６プライマー（配列番号２０〜２４）も同様に、Ａ２〜Ａ６プライマーの３’末端の「Ｔ」を「Ｃ」に置換したプライマーである。
【００５３】
これらの各プライマーを、配列番号２５に記載される配列（５’−ｇｃｔｇｇｔｇｃｔａｔａｇｃｔｇｔｔａｔｃｃｔｃ−３’）を有するプライマーとともに、鋳型ＤＮＡとしてコシヒカリから調製したＤＮＡを用いて、以下の条件下でＰＣＲを行った。
（ＰＣＲ溶液）
鋳型ＤＮＡ １．０μＬ
１０×Ｔａｑ ポリメラーゼ反応用緩衝液 ２．０μＬ
ｄＮＴＰｓ （各２．５ｍＭ） １．６μＬ
滅菌水 １４．５μＬ
Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ） ０．１μＬ
プライマー（正方向）（５０μＭ） ０．４μＬ
プライマー（逆方向）（５０μＭ） ０．４μＬ
合計 ２０．０μＬ
今回の実験では、６０℃以上のＴｍ（融点）を有するプライマーを設計した。ＰＣＲ用のポリメラーゼとして、ＨｏｔＳｔａｒｔ用のＴａｑポリメラーゼであるタカラのＥＸ Ｔａｑ ポリメラーゼを使用した。ＰＣＲ増幅器はタカラのＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＳＰを用いているが、とくにこれらのものに限定されない。
【００５４】
ＰＣＲ条件は以下のとおりである：
９４℃ ２分
の後、以下を３０サイクル
９４℃ １０秒
６０℃ １０秒
７２℃ ２０秒
最後に４℃に保温して、ＰＣＲ産物を保存した。
【００５５】
ゲル電気泳動によるＰＣＲ増幅、非増幅の確認を行った結果を、図１に示す。図１の各レーンに示す実験に使用したプライマーは、以下のとおりである：
レーンＡ１（配列番号１３および配列番号２５）、
レーンＢ１（配列番号１９および配列番号２５）、
レーンＡ２（配列番号１４および配列番号２５）、
レーンＢ２（配列番号２０および配列番号２５）、
レーンＡ３（配列番号１５および配列番号２５）、
レーンＢ３（配列番号２１および配列番号２５）、
レーンＡ４（配列番号１６および配列番号２５）、
レーンＢ４（配列番号２２および配列番号２５）、
レーンＡ５（配列番号１７および配列番号２５）、
レーンＢ５（配列番号２３および配列番号２５）、
レーンＡ６（配列番号１８および配列番号２５）、
レーンＢ６（配列番号２４および配列番号２５）。
【００５６】
使用したプライマーの配列は以下のとおりである：
Ａ１プライマー：配列番号１３：ｇｃｇｇｃｔｃｔａｇｇｃｃｇｇｃｃｔｇｇｔａｔ
Ａ２プライマー：配列番号１４：ｇｃｇｇｃｔｃｔａｇｇｃｃｇｇｃｃｔｇｇａａｔ
Ａ３プライマー：配列番号１５：ｇｃｇｇｃｔｃｔａｇｇｃｃｇｇｃｃｔｇｃｔａｔ
Ａ４プライマー：配列番号１６：ｇｃｇｇｃｔｃｔａｇｇｃｃｇｇｃｃｔｃｇａａｔ
Ａ５プライマー：配列番号１７：ｇｃｇｇｃｔｃｔａｇｇｃｃｇｇｃｃｔｇｇｇａｔ
Ａ６プライマー：配列番号１８：ｇｃｇｇｃｔｃｔａｇｇｃｃｇｇｃｃｔｇｔｔａｔ
Ｂ１プライマー：配列番号１９：ｇｃｇｇｃｔｃｔａｇｇｃｃｇｇｃｃｔｇｇｔａｃ
Ｂ２プライマー：配列番号２０：ｇｃｇｇｃｔｃｔａｇｇｃｃｇｇｃｃｔｇｇａａｃ
Ｂ３プライマー：配列番号２１：ｇｃｇｇｃｔｃｔａｇｇｃｃｇｇｃｃｔｇｃｔａｃ
Ｂ４プライマー：配列番号２２：ｇｃｇｇｃｔｃｔａｇｇｃｃｇｇｃｃｔｃｇａａｃ
Ｂ５プライマー：配列番号２３：ｇｃｇｇｃｔｃｔａｇｇｃｃｇｇｃｃｔｇｇｇａｃ
Ｂ６プライマー：配列番号２４：ｇｃｇｇｃｔｃｔａｇｇｃｃｇｇｃｃｔｇｔｔａｃ
ＡＢ−ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：配列番号２５：ｇｃｔｇｇｔｇｃｔａｔａｇｃｔｇｔｔａｔｃｃｔｃ。
【００５７】
図１の電気泳動の結果に示されるように、３’末端のみが異なるプライマーは、ＳＮＰを特異的に判別することができなかった（レーンＡ１およびＢ１）。具体的には、使用したＡ１プライマーおよびＢ１プライマーの３’末端に対応する塩基は、コシヒカリでは「Ｔ」であるため、Ｂ１プライマーを用いた場合の増幅は、擬陽性の増幅である。従って、３’末端のみが異なるプライマーを使用しても、ＳＮＰを特異的に判別することはできなかった。
【００５８】
次に、Ａ１プライマーおよびＢ１プライマーの３’末端から３〜５番目の塩基に対応する塩基が各種塩基に置換されたプライマーＡ２〜Ａ６およびＢ２〜Ｂ６を用いて、ＰＣＲおよびゲル電気泳動を行った。その結果、Ａ５プライマーおよびＢ５プライマーを用いた場合にのみ、擬陽性も儀陰性も観察されたなかった。従って、最適なＳＮＰ判別プライマーを設計するためには、プライマーの３’末端から３番目の塩基を、プライマーがアニールする鋳型配列と相補的な塩基から置換することが好ましいことが理解できる。
【００５９】
図１に示される結果（レーンＡ２、Ｂ２、Ａ５およびＢ５）は、プリン−プリン塩基対のミスマッチが核酸二重鎖を不安定にするという予測と一致するものである。しかし、驚くべきことに、Ａ／Ａミスマッチを形成させるプライマーの場合よりも（レーンＡ２およびＢ２）、Ｇ／Ａミスマッチを形成させるプライマーを用いた場合に（レーンＡ５およびＢ５）、１塩基多型判別におけるプライマーの特異性が顕著に向上し、実際に、Ｇ／Ａミスマッチを形成させるプライマーを用いた場合には、擬陽性が検出されなかった。
【００６０】
この結果は、（１）Ａ／Ａミスマッチを形成させることによって、異なる鎖のアデニンの６位のアミノ基の間で立体障害を生じるさせる場合と、（２）Ｇ／Ａミスマッチを形成させて、グアニン環とアデニン環との間で水素結合を形成し得る場合、を比較すると、（２）の場合の方が、プライマーの塩基対形成に対してより大きな影響を与え、その結果、１塩基多型判別におけるプライマーの特異性を向上させたものと予測される。従って、ただ単に、プリン−プリンミスマッチ塩基対を形成させるだけでなく、水素結合を形成し得るＧ／Ａミスマッチ塩基対を形成させることが、１塩基多型判別におけるプライマーの特性の向上に好ましい。
【００６１】
同様に、ピリミジンの場合には、ただ単に、ピリミジン−ピリミジンミスマッチ塩基対を形成させるだけでなく、水素結合を形成し得るＴ／Ｃミスマッチ塩基対を形成させることが、１塩基多型判別におけるプライマーの特性の向上に好ましいと考えられる。
【００６２】
以上の結果から、１塩基多型の遺伝子型を判別するためのＰＣＲプライマーの設計においては、プライマーの３’末端から３番目の塩基をそのプライマーがアニールする鋳型配列と相補的な塩基から置換し、さらにその置換が、（１）Ｇ／Ａ塩基対を形成するように、ＣからＡの置換、またはＴからＧへの置換であるか、または（２）Ｔ／Ｃ塩基対を形成するように、ＧからＴの置換、またはＡからＣへの置換であることが好ましい。
【００６３】
（実施例３：プライマーの３’末端から１番目の塩基が判別すべきＳＮＰの位置に対応するプライマーを用いるＰＣＲ増幅反応）
イネの品種識別を行うために、配列番号９および１０のプライマー対を用いた。これらのプライマー対は、イネの第１染色体上にあるＳＮＰを含む塩基配列（領域３１Ｐ２）に基づいて以下のように設計した。
【００６４】
３１Ｐ２領域で、コシヒカリでは「Ａ」塩基であるが、日本晴では「Ｔ」塩基であるＳＮＰを同定した。このＳＮＰの遺伝子型を判別するために、プライマーの３’末端から１番目の塩基を、このＳＮＰ部位の位置に対応させ、そしてコシヒカリのゲノムＤＮＡを増幅するプライマーとして、配列５’−ｃｔａｔｃａｇａａａｔａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｇａｃａａｇｃａａ−３’（配列番号１０）を有するプライマーを設計した。ＰＣＲにおいて、このプライマーとともに使用するプライマーとして、配列５’−ｇａｇｃｃｔｇｔｔｇａｔｇｇｔｇａａｇｃ−３’（配列番号９）を有するプライマーを設計し、ＰＣＲ増幅反応を行った。
【００６５】
反応液の組成は以下のとおりである：
今回の実験では、Ｔａｑ ポリメラーゼはタカラのＥｘ Ｔａｑ ポリメラーゼ、ＰＣＲ増幅器はタカラのＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＳＰを用いているが、とくにこれらのものに限定されない。
ＰＣＲ条件は以下のとおりである：
９４℃ ２分
の後、以下を３０サイクル
９４℃ １０秒
６０℃ １０秒
７２℃ ２０秒
最後に４℃に保温して、ＰＣＲ産物を保存した。
【００６６】
上記以外のＰＣＲ反応を使用することは当業者に周知であるので、通常のＤＮＡを増やすためのＰＣＲ増幅であれば、上の反応サイクルには限定されず、他のサイクルも同様に利用可能である。
【００６７】
（ゲル電気泳動によるＰＣＲ増幅、非増幅の確認）
本実施例における品種識別では、任意に選択したイネのゲノムＤＮＡを用いて、ＰＣＲによる増幅反応によって核酸が増幅されるか否かを指標として、ゲノムの多型性に基づくイネの品種識別を行った。
【００６８】
ゲル電気泳動をする増幅核酸の確認方法は以下のとおりに行った。
０．８から２．０％のアガロースゲルを用い、ＰＣＲ産物の一部をとり（２μＬ以上）、電気泳動する。電気泳動装置としては、コスモバイオ（東京）のミニゲル（商品名ミューピッド）を用いた。１５分程度の泳動後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、ＵＶランプでＤＮＡを確認した（図２）。
【００６９】
その結果、コシヒカリのゲノムＤＮＡを鋳型に用いた場合には、ＰＣＲ法によって核酸フラグメントが増幅された。コシヒカリと同じ遺伝子型をもつＳＮＰを有する「ひとめぼれ」、「ヒノヒカリ」、「あきたこまち」、「きらら３９７」、「はえぬき」、「ササニシキ」、「どんとこい」、および「アキヒカリ」においても同様に、核酸フラグメントが増幅された。
【００７０】
一方、日本晴のゲノムＤＮＡを鋳型に用いた場合には、ＰＣＲによって、核酸フラグメントが増幅されなかった。日本晴型のＳＮＰを有する、「キヌヒカリ」、「ゆきの精」、「こしいぶき」、「ハナエチゼン」、「ほほほの穂」および「五百万石」においても同様に、核酸フラグメントが増幅されなかった。
【００７１】
従って、配列番号９および１０のプライマー対を使用するＰＣＲでの核酸フラグメントの増幅を指標にして、配列番号１０のプライマーの３’末端から１番目の核酸に対応する塩基が「Ｔ」ではなく「Ａ」であることを判別可能である。
【００７２】
また、上記のプライマーを用いた場合に増幅された核酸が確認された場合には、ＰＣＲに用いた鋳型ＤＮＡを調整した品種が、例えば、「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」、「ヒノヒカリ」、「あきたこまち」、「きらら３９７」、「はえぬき」、「ササニシキ」、「どんとこい」、または「アキヒカリ」ではあるが、「キヌヒカリ」でも、「ゆきの精」でも、「こしいぶき」でも、「ハナエチゼン」でも、「ほほほの穂」でも、「五百万石」でもないことも、識別可能である。
【００７３】
（実施例４：マルチプレックスＰＣＲ）
イネの品種識別を行うためには、複数のプライマー対を組み合わせ、各プライマー対それぞれでの、増幅されたバンドの有無を調べる。そのため、通常は、複数のチューブでのＰＣＲ反応が必要である。
【００７４】
そこで、この作業を簡便にするため、幾つかのプライマー対を混合し、１回のＰＣＲ（１つのチューブ）で反応を行うことも可能である。この方法は、マルチプレックス法と呼ばれている。この場合の反応液組成の例を示す。
【００７５】
４種類のＰＣＲマーカーの場合
鋳型ＤＮＡ １．０μＬ
１０Ｘ ＰＣＲ反応緩衝液 ２．０μＬ
ｄＮＴＰｓ （各２．５ｍＭ） １．６μＬ
滅菌水 １３．８６μＬ
Ｔａｑ ポリメラーゼ （５Ｕ／μＬ） ０．１ μＬ
プライマー（配列番号１〜８） 各５０μＭ
合計 ２０μＬ
上記の反応において使用したプライマーは、以下のとおりである：
６Ｐ１Ｎ−５２２プライマー：配列番号１：ＣＣＡＡＣＴＧＣＴＧＣＡＡＴＡＡＴＧＣＣ
６Ｐ１Ｎ−３２２プライマー：配列番号２：ＣＧＴＡＧＣＡＡＣＴＣＡＡＴＡＴＡＡＣＡＴＣＡＧＣＴＡＡ
２６Ｐ１Ｋ−５プライマー：配列番号３：ＴＴＧＴＴＴＡＧＡＣＡＡＡＧＴＡＡＡＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＴ
２６Ｐ１−３−１プライマー：配列番号４：ＧＡＴＡＴＣＴＴＡＧＧＧＣＣＣＧＴＴＴＧＧ
１７Ｐ１Ｋ−５１プライマー：配列番号５：ＴＧＡＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＴＡＧＧＴＴＴＣＴＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＣ
１７Ｐ１Ｋ−３２プライマー：配列番号６：ＡＣＡＡＴＣＣＴＧＴＴＴＧＴＣＧＣＡＧＧ
４Ｐ１Ｋ−５−２プライマー：配列番号７：ＴＴＧＴＡＴＣＣＡＡＡＴＡＡＡＴＣＡＧＧＡＣＣＡＣＴＣＴＧ
４Ｐ１−３−１１プライマー：配列番号８：ＧＧＴＣＴＧＴＡＧＧＣＴＧＣＴＣＡＣ。
【００７６】
マルチプレックスＰＣＲの場合、ＰＣＲ産物の確認のためのゲル電気泳動では、３％のアガロースゲルを用い、バンド間の分離をはっきりさせるために４０分程度の電気泳動を行なった。結果を図３に示す。
【００７７】
（実施例５：マーカーによる品種識別）
本発明のプライマー対とＳＴＳ型プライマーを用いて、日本で流通している代表的品種と、北陸地域で育成された品種の品種識別を行った。品種判別のためのＰＣＲ条件は、実施例２のとおりである。
【００７８】
本発明のプライマーとして、配列番号１〜１０のプライマーに加えて、以下のプライマーを使用した：
３７Ｐ２−５−Ｈプライマー：配列番号１１：ＧＧＧＴＡＴＣＡＴＧＣＣＴＴＴＡＣＴＧＧ
３７Ｐ２−Ｎ３プライマー：配列番号１２：ＧＣＧＡＣＡＧＧＡＧＴＡＧＣＣＴＴＣ。
【００７９】
１２組のＳＴＳ型プライマーとして以下のプライマーを使用した：
１８Ｐ１−５−１プライマー：配列番号２６：ＧＧＣＴＧＣＴＡＧＣＧＴＣＡＴＣＡＧＧ
１８Ｐ１−３−１プライマー：配列番号２７：ＴＴＣＴＣＡＴＣＡＴＡＡＣＡＴＡＴＴＧＡＴＣＴＴＧＣ
１８Ｐ１２−５２プライマー：配列番号２８：ＡＴＧＧＣＣＧＴＧＣＴＣＴＧＴＴＴＣＣ
１８Ｐ１２−３２プライマー：配列番号２９：ＣＡＧＣＡＧＴＴＴＧＧＡＡＡＣＣＡＡＣＧ
１８Ｐ１４−５１プライマー：配列番号３０：ＡＡＧＡＣＡＴＡＧＧＣＣＴＣＧＧＴＴＧＣ
１８Ｐ１４−３１プライマー：配列番号３１：ＴＧＴＴＧＡＡＣＴＴＧＧＧＧＧＴＡＴＧＣ
２７Ｐ１−５−１プライマー：配列番号３２：ＣＡＴＧＣＧＣＣＴＴＣＡＣＡＣＡＣＣ
２７Ｐ１−３−１プライマー：配列番号３３：ＣＡＡＴＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＣＡＡＧＡＴＧＣ
２９Ｐ１−５プライマー：配列番号３４：ＡＡＧＣＡＡＴＣＡＣＴＴＣＣＴＧＣＡＡＣＣ
２９Ｐ１−３プライマー：配列番号３５：ＴＧＣＴＧＣＴＣＡＧＣＡＡＴＡＣＴＴＣＧ
３３Ｐ１−５プライマー：配列番号３６：ＡＧＴＧＣＴＣＡＡＧＡＡＡＴＣＡＴＡＧＣＴＧＡ
３３Ｐ１−３プライマー：配列番号３７：ＧＡＡＧＣＴＴＧＴＧＡＧＴＡＡＣＧＧＣ
３４Ｐ１−５−Ｈプライマー：配列番号３８：ＴＣＴＣＣＣＡＧＡＴＣＡＡＧＡＡＣＴＡＧＣ
３４Ｐ１Ａ−３プライマー：配列番号３９：ＣＧＧＣＡＡＧＣＡＣＡＧＣＧＴＴＣ
３４Ｐ２−５プライマー：配列番号４０：ＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＡＡＣＣＧＣＴＴＧＣ
３４Ｐ２−３プライマー：配列番号４１：ＴＧＴＧＡＴＣＣＡＴＴＡＴＴＧＴＣＣＧＴＡＡＣＣ
３４Ｐ３−５−１プライマー：配列番号４２：ＴＣＣＣＴＣＣＴＴＣＴＣＡＣＧＡＣＴＣＣ
３４Ｐ３−３−１プライマー：配列番号４３：ＧＡＣＡＣＣＡＧＣＴＴＣＣＣＴＴＧＴＣＣ
３５Ｐ１−５プライマー：配列番号４４：ＴＣＴＧＡＣＡＣＴＣＴＴＡＴＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＡＴＧＡＣ
３５Ｐ１−３プライマー：配列番号４５：ＴＧＣＡＡＧＡＡＧＧＡＡＣＧＡＡＧＡＧＣ
３７Ｐ１−５プライマー：配列番号４６：ＧＣＡＣＡＣＴＡＴＴＡＴＣＣＴＴＧＣＴＣＴＡＡＴＧＣ
３７Ｐ１−３プライマー：配列番号４７：ＣＡＴＧＧＣＧＣＴＣＡＣＡＣＡＧＧ
３８Ｐ１−５プライマー：配列番号４８：ＡＣＣＧＡＧＡＴＣＡＴＴＧＴＴＧＴＣＴＧＴＣ
３８Ｐ１−３プライマー：配列番号４９：ＴＴＴＧＡＧＣＣＣＡＴＡＡＡＴＧＡＡＴＡＡＴＣＴＧ。
【００８０】
上記のプライマーを使用した比較結果を図４に示す。ＰＣＲでの増幅産物が確認された場合には「１」、ＰＣＲでの増幅産物が確認されなかった場合には「０」を記載した。
【００８１】
上記のＳＴＳプライマー（配列番号２６〜４９）では識別できなかったイネ品種はお互いに遺伝的に近縁なものが多いが（例えば、コシヒカリ、キヌヒカリ、どんとこい）、本発明のプライマーを使用した場合は識別することができた。
【００８２】
具体的には、従来から用いられている１２組のＳＴＳ型プライマーでは識別することができなかったコシヒカリ、ひとめぼれ、キヌヒカリ、はえぬき、どんとこい、ゆきの精、こしいぶき、ハナエチゼンについて、本発明の方法で作成した４組のＳＮＰ判別マーカー（配列番号１〜８）を用いることによって、識別することが可能となった。
【００８３】
以上の結果から、本発明において最適化されたプライマーを用いることによって、擬陽性および擬陰性を生じることなく、１塩基多型判別することが可能となった。また、ＳＴＳ型プライマーを用いる従来の方法では識別できるマーカーを設定するに大きな労力が必要であった遺伝的に近縁なイネ品種を識別するマーカーも、容易に作成可能となった。
【００８４】
また、本発明のプライマーと従来のＳＴＳ型プライマーを組み合わせることにより、さらに多くの近縁のイネを識別していくことが可能となる。
【００８５】
【発明の効果】
本発明のプライマーを使用することにより、従来法よりも高精度に、１塩基レベルの変異を判別することが可能となった。また、ＳＮＰｓ遺伝子型の判別において、本発明のプライマーを使用する判別方法を用いた場合、従来のような特に高額な機械を使用する必要がない。従って、本発明のプライマーによって、簡易で安定的な品種識別が可能である。
【００８６】
本発明のプライマーは１塩基置換を擬陽性の問題を生じることなく判定するので、従来法よりも多くのゲノム上の部位での変異を安定的に判別可能である。
【００８７】
また、本発明のプライマーは、イネなどの育種において、選抜育種用のＤＮＡマーカーとしても、有用である。
【００８８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１の上図は、コシヒカリと他品種のゲノム部分配列を示す。コシヒカリと他品種のゲノム部分配列を比較した場合のＳＮＰの位置を、矢印で示す。
図１の中図は、上図に示したゲノム部分配列周辺領域を増幅するＳＮＰ判別用プライマーＡ１〜Ａ６およびＢ１〜Ｂ６の部分配列を示す。ＳＮＰ判別用プライマーの配列中、ゲノムＤＮＡ配列に対応する部分についてのみを図１に示した。「−」は、ゲノムＤＮＡ配列と同一の塩基を示す。ゲノムＤＮＡ配列と異なる塩基を、一文字表記で示した。ＳＮＰ判別用プライマーＡ１〜Ａ６全ての３’末端塩基は「Ｔ」である。一方、ＳＮＰ判別用プライマーＢ１〜Ｂ６全ての３’末端塩基は「Ｃ」である。そのため、図１では、ＳＮＰ判別用プライマーの３’末端の配列を「Ｔ／Ｃ」で示した。
図１の下図：ＳＮＰ判別用プライマーを使用したＰＣＲの結果を示す。
【図２】図２は、配列番号９および１０に記載される配列を有するＳＮＰ判別用プライマーを用いたＰＣＲの結果を示す。ゲルの写真の下に示した品種名は、鋳型ＤＮＡとして使用したゲノムＤＮＡを調製したイネの品種名である。
【図３】図３は、配列番号１〜８に記載される配列を有するＳＮＰ判別用プライマーを用いたＰＣＲの結果を示す。ゲルの写真の下に示した品種名は、鋳型ＤＮＡとして使用したゲノムＤＮＡを調製したイネの品種名である。
【図４】図４は、ＳＮＰ判別プライマーおよびＳＴＳプライマーを使用し、各イネ品種から調製したゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲを行った結果を示す図である。使用したプライマーを、配列番号で記載する。ＳＴＳプライマーを使用した場合には判別できないが、ＳＮＰ判別プライマーを使用した場合にのみ識別可能となった品種名に「＊」を付した。
【発明の属する技術分野】
本発明は、主にイネの品種識別方法に属する。加えて、本発明の技術は、イネの育種選抜において有用形質を選抜するためのＤＮＡマーカーとしても応用可能である。本発明の方法は、一粒の米飯またはイネの植物体より抽出したＤＮＡから、ゲノムＤＮＡ中の１塩基レベルの差を簡便に判別して、イネの品種を識別する方法に関する。
【０００２】
さらに、本発明は、イネの品種識別のみならず、例えば、選抜用ＤＮＡマーカーとして、１塩基レベルの差の判別能を利用して、ＤＮＡマーカー部位の遺伝子型決定を行う方法に属する。
【０００３】
【従来の技術】
近年、ゲノムＤＮＡの多型性に基づく品種の識別法が開発されている。
【０００４】
ＰＣＲ法を使用しないＤＮＡ多型の検出方法としては、ＡＦＬＰ（Ａｍｐｌｉｆｉｌｅｄ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｌｅｎｇｔｈ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）が挙げられる。ＡＦＬＰ法は、１９９０年代に開発された、個体間、品種間のゲノムＤＮＡの相同性を検出するゲノムフィンガープリント法であり（Ｖｏｓら（１９９５）ＡＦＬＰ：ａ ｎｅｗ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｆｏｒ ＤＮＡ ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｉｎｇ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２３、４４０７〜４４１４）、現在は、ＡＦＬＰのためのキットも市販されている（例えば、ＡＦＬＰ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）。この方法は、（１）ゲノムＤＮＡを２種の制限酵素で処理し、アダプターを連結する、（２）アダプター配列に基づくプライマーを使用してＰＣＲを行う（このプライマーは、アダプター配列の３’末端に特定の鋳型のみを増幅するための選択塩基を加えた配列を有する）、（３）増幅産物を、電気泳動によって分離し、特異的な増幅産物の有無を検出する、という工程を包含する方法である。この方法は、反応に必要なＤＮＡが大量に必要であり、ＰＣＲと比較して工程が複雑であり、しかも、制限酵素認識部位以外での１塩基レベルの変化を判別することができないという欠点を有する。
【０００５】
近年、ＰＣＲ法を用いた多型の判別法が開発されている。ＰＣＲ法の原理を使用した、ゲノムＤＮＡの多型の識別法としては、マイクロサテライト法、ＲＡＰＤ法（ｒａｎｄｏｍ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ ｍｅｔｈｏｄ）、ＲＡＰＤ由来ＳＴＳ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｇｅｄ ｓｉｔｅ）法などが用いられている。しかし、これら従来法には、以下の欠点がある。
【０００６】
マイクロサテライト法は、ゲノムＤＮＡ中に存在する数塩基の反復配列（マイクロサテライト）を増幅して、その反復配列の繰り返しの数の違いという多型性を判別する方法である。この方法は、数塩基の反復配列の反復数の差異というわずかなＰＣＲ増幅フラグメント長の差異を検出する方法であるため、増幅産物の解析の際に、高濃度のゲルを作成し、かつ慎重に長時間電気泳動をする必要がある。また、１塩基多型を判別できないという欠点を有する。
【０００７】
ＲＡＰＤ法は、一般に１２塩基程度のランダムプライマーを使用して、ゲノムＤＮＡを増幅し、増幅されたバンドのパターンを電気泳動によって検出することによる、多型の判別方法である。ＲＡＰＤ法は、プライマーの調製は簡便ではあるものの、ＰＣＲの条件を厳密に設定する必要があり、しかも、わずかな条件（例えば、温度）の差異によって異なる結果が生じる。従って、ＲＡＰＤ法では、ＰＣＲ条件の設定が困難であり、かつ条件を設定しても、再現性に乏しく、安定的な判別が困難である。また、ＲＡＰＤ法は、鋳型ＤＮＡの純度の影響を受け、さらに、複数回のＰＣＲと電気泳動が必要であるという欠点もある。
【０００８】
ＲＡＰＤ由来ＳＴＳ法は、ＲＡＰＤ法によって同定された特異的なバンドの配列決定を行い、その配列情報に基づいてプライマーを設計して、ＰＣＲを行う方法である。この方法は、ＲＡＰＤ法によって同定されたバンドに基づく方法であるため、塩基配列がかなり異なる多型を有するゲノム部分でのみ使用可能であり、１塩基置換を判別することが困難である。
【０００９】
ＳＮＰｓ法は１塩基多型の遺伝子型を判別することができる方法ではあるが、安定的な判別のためには、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）のマルチラベルカウンターのような高価な装置を使用する必要がある。
【００１０】
本発明は、これら従来法の欠点を克服し、簡便かつ再現性の高い１塩基レベルの多型を判別するためのＰＣＲプライマーを提供するものである。
【００１１】
ＤＮＡ多型判別方法の適用例として、ゲノムＤＮＡ配列の多型性に基づく品種識別も、近年重要になっている。例えば、イネの場合、古典的な品種識別は、交配させた場合の稔実性、イネの草型、米の粒型、酵素多型等の比較により行われてきた。しかし、これらの古典的な技術は、インディカとジャポニカの識別や、インディカ同士あるいはジャポニカ同士でも遠縁のイネの識別には有効である一方で、近縁の米の識別に供するには不十分であった。近年のように「コシヒカリ」を中心として開発された近縁良食味米同士の識別に用いることは不可能であるという問題がある。
【００１２】
食糧法の施行に伴って、精米の品種、産地、産年を精米の包装に表示することが義務づけられた。これらの表示は品種識別の指標の一つとなりうるが、これらの他に植物体や籾、玄米の情報がない場合には、近縁の良食味米の品種を識別することは極めて困難である。
【００１３】
最近では、コンビニエンスストア、業務用炊飯サービス、外食産業等で米飯として供給される米についても、品種の特定が必要とされている。しかし、炊飯による澱粉の糊化、タンパク質の変性等が起こるため、古典的な技術によって、ＤＮＡの抽出や品種の識別を行うことは不可能である。
【００１４】
しかしながら、ゲノムＤＮＡの多型性を識別する従来方法には、上記のような欠点がある。そのため、簡便、かつ再現性の高い多型性の識別方法が求められている。
【００１５】
ゲノム分析による品種識別と原理を同じくする、ＤＮＡマーカー選抜育種におけるゲノム上の多型判別技術も、現行技術は同様な欠点を持ち、簡易で、かつ信頼のおける多型の識別技術が必要である。
【００１６】
【特許文献１】
公開特許公報 特開平６−１１３８５０号
【特許文献２】
公開特許公報 特開平６−１１３８５１号
【特許文献３】
公開特許公報 特開平６−１１３８５２号
【特許文献４】
公開特許公報 特開平７−３９４００号
【特許文献５】
公開特許公報 特開２００１−９５５８９号
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の目的は、簡便、かつ再現性の高いゲノムＤＮＡの多型性の識別方法を提供することにある。本発明の方法は、例えば、イネの品種識別、さらにはイネの育種選抜におけるＤＮＡマーカーに使用することが可能である。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
上記課題は、ＳＮＰｓ判別法において使用するプライマーを検討し、簡便、かつ再現性の高い、ゲノムＤＮＡの多型性の識別に使用可能なプライマーをはじめて見出したことによって達成された。
【００１９】
具体的には、プライマーの３’末端から３番目の塩基を他の塩基に置換して、人工的なミスマッチを作り、ＰＣＲの選択性を高めた。このミスマッチを作る際は、例えば元の塩基がＧの場合はＴへ、Ａの場合はＣへ、Ｔの場合はＧへ、Ｃの場合はＡへ、置換すると最も高い確率で選択性のあるマーカーができる。
【００２０】
プライマーのＴｍは、５０℃以上、好ましくは、５５℃以上、より好ましくは、６０℃以上であり、そして、６５℃以上、７０℃以上のＴｍを有するプライマーも使用可能である。
【００２１】
従って、本発明は以下を提供する。
１． １塩基多型の遺伝子型を判別するためのＰＣＲプライマーであって、該プライマーの３’末端から１番目の塩基は判別すべき該１塩基多型の位置に対応し、該プライマーの３’末端から３番目の塩基は該プライマーがアニールする鋳型配列と相補的な塩基から置換されており、該置換はＧからＴ、ＡからＣへ、ＴからＧ、またはＣからＡの置換である、プライマー。
２． ５０℃以上のＴｍを有する、項目１に記載のプライマー。
３． ６０℃以上のＴｍを有する、項目１に記載のプライマー。
４． ６５℃以上のＴｍを有する、項目１に記載のプライマー。
５． 以下のプライマー対からなる群から選択されるプライマー対：
（１）配列番号１および２；
（２）配列番号３および４；
（３）配列番号５および６；
（４）配列番号７および８；ならびに
（５）配列番号９および１０。
６． 項目５に記載のプライマー対を少なくとも２つ含む、プライマーのセット。
７． 配列番号１〜１２からなる群から選択されるプライマーを２つ以上含む、項目６に記載のプライマーセット。
８． 項目１に記載のプライマーを使用する、１塩基多型の遺伝子型の判別方法。
９． 項目１に記載のプライマーを含む、１塩基多型の遺伝子型を判別するためのキット。
１０． １塩基多型の遺伝子型を判別する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）判別対象となる１塩基多型の遺伝子型を選択する工程；
ｂ）多型判別用プライマーを調製する工程であって、ここで、該多型判別用プライマーの３’末端から１番目の塩基は判別すべき該１塩基多型の位置に対応し、該多型判別用プライマーの３’末端から３番目の塩基は該多型判別用プライマーがアニールする鋳型配列と相補的な塩基から置換されており、該置換はＧからＴ、ＡからＣへ、ＴからＧ、またはＣからＡの置換である、多型判別用プライマーを調製する工程；
ｃ）該多型判別用プライマーと、少なくとも１つの別のプライマーを用いて、ＰＣＲを行う工程；および
ｄ）ＰＣＲ産物の増幅の有無から、１塩基多型の遺伝子型を判別する工程；
を包含する、方法。
１１． 少なくとも２つ以上のプライマー対を用いる、項目１０に記載の方法。
【００２２】
【発明の実施の形態】
以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。
【００２３】
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
【００２４】
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。必要に応じて、プライマーは、デオキシイノシン残基で置換された塩基を含む。
【００２５】
用語「核酸」はまた、本明細書において、遺伝子、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を暗黙に包含する。その名が示唆するように「スプライス改変体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス改変体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。
【００２６】
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体ヌクレオチド」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのような誘導体ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２７】
本件明細書においてヌクレオチドを１文字表記する場合、Ｇはグアニンを、Ｔはチミンを、Ａはアデニンを、Ｃはシトシンを示す。
【００２８】
本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。
【００２９】
本明細書において使用する場合、用語「プライマー」とは、適切な条件下（例えば、４つの異なるヌクレオシド三リン酸およびポリメライゼーション剤（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素）の存在下）で、適切な緩衝液中で、そして適切な温度において、鋳型指向性のＤＮＡ合成を開始する点として作用する一本鎖オリゴヌクレオチドをいう。プライマーの適切な長さは、プライマーの意図される使用に依存するが、代表的には、１５〜３０ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は、鋳型との十分に安定なハイブリッド複合体を形成するために、一般により低い温度を必要とする。プライマーは、鋳型の正確な配列に完全にマッチする必要はないが、鋳型とハイブリダイズするのに十分相補的であるべきである。用語「プライマー部位」とは、プライマーがハイブリダイズする標的である鋳型核酸の配列をいう。用語「プライマー対」とは、増幅される核酸配列の５’末端とハイブリダイズする５’（上流）プライマーおよび増幅されるその配列の３’末端の相補物とハイブリダイズする３’（下流）プライマーを含む一組のプライマーをいう。
【００３０】
本明細書において使用する場合、「１塩基多型」とは、遺伝子の塩基配列が一ヶ所だけ異なる状態、およびその部位をいう。本明細書において、「１塩基多型」は、「ＳＮＰ」および「ＳＮＰｓ」と互換可能に使用される。
【００３１】
本明細書において使用する場合、「多型判別用プライマー」とは、そのプライマーを用いたＰＣＲなどの核酸増幅反応によって、その増幅産物の有無から多型部位の遺伝子型を判別するために使用されるプライマーを意味する。本明細書において用語「多型判別用プライマー」は、「ＳＮＰ判別プライマー」および「ＳＮＰｓ判別プライマー」と互換可能に使用される。
【００３２】
また、本明細書においては、核酸増幅反応として、例示的に用語「ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）」を用いているが、本発明の実施のためにＰＣＲ以外の核酸増幅反応も使用可能である。従って、本発明のプライマーが使用されるのは、ＰＣＲに限定されない。
【００３３】
本明細書において、「プライマー」の３’末端から塩基を数える場合、「プライマーの３’末端から１番目の塩基」とは、３’末端の塩基をいう。従って、例えば、配列番号１の配列（５’−ＣＣＡＡＣＴＧＣＴＧＣＡＡＴＡＡＴＧＣＣ−３’）を有するプライマーにおいて、「プライマーの３’末端から１番目の塩基」は「Ｃ」であり、「プライマーの３’末端から３番目の塩基」は「Ｇ」である。
【００３４】
本明細書において、「プライマーの３’末端から１番目の塩基に対応する塩基」とは、プライマーが鋳型核酸とハイブリダイズした場合に、そのプライマーの３’末端から１番目の塩基がハイブリダイズする位置に存在する塩基をいう。
【００３５】
本発明のプライマーを用いるＰＣＲにおける鋳型ＤＮＡの調製は、周知の種々の方法（例えば、ＣＴＢＡ法、ボイル法など）によって、細胞および組織などからゲノムＤＮＡを調製することによって、行われ得る。
【００３６】
鋳型核酸としてＤＮＡフラグメントを使用する場合、鋳型核酸は、例えば、ゲノムＤＮＡまたはプラスミドＤＮＡを消化することによって、あるいはＰＣＲの使用によって、調製され得る。プライマーまたはプローブとしての使用のためのオリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの化学合成の分野において公知の方法（非限定的例として、ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｒｕｔｈｅｒｓ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２２：１８５９〜１８６２（１９８１））によって記載されるホスホロアミダイト法、およびＭａｔｔｅｕｃｃｉら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、１０３：３１８５（１９８１））によって提供されるトリエステル法（両方を本明細書において参考として援用する）によって化学的に合成される。これらの合成は、Ｎｅｅｄｈａｍ−ＶａｎＤｅｖａｎｔｅｒ，Ｄ．Ｒ．ら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：６１５９〜６１６８（１９８４）において記載されるような自動合成機を使用し得る。オリゴヌクレオチドの精製は、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．およびＲｅｇｎｉｅｒ，Ｆ．Ｅ．（Ｊ．Ｃｈｒｏｍ、２５５：１３７〜１４９（１９８３））に記載されるように、ネイティブのアクリルアミドゲル電気泳動またはアニオン交換ＨＰＬＣのいずれかによって行われ得る。次に、所望される場合、二本鎖フラグメントは、適切な相補的な一本鎖の対を適切な条件下でアニールすることによってか、または適切なプライマー配列とともにＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖を合成することによって、得られ得る。核酸プローブのための特定の配列が与えられる場合、相補的鎖もまた同定され、そして含まれることが理解される。その相補的鎖は、標的が二本鎖核酸である場合、同等に良く作用する。
【００３７】
合成オリゴヌクレオチドの配列または任意の核酸フラグメントの配列は、ジデオキシチェーンターミネーション法またはマクサム−ギルバート法のいずれかを使用して得られ得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版）、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、（１９８９）、本明細書において参考として援用する）。このマニュアルを、本明細書において、「Ｓａｍｂｒｏｏｋら」という；「Ｚｙｓｋｉｎｄら（１９８８）」。Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、（Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹｏｒｋ）。
【００３８】
本明細書において、「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトとマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子とβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。
【００３９】
本発明において利用され得る一般的な分子生物学的手法としては、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、 Ｗｉｌｅｙ、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら （１９８７） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹなどを参酌して当業者であれば容易に実施をすることができる。
【００４０】
（好ましい実施形態の説明）
１つの局面において、本発明は、３’末端から１番目、２番目、３番目、または４番目の塩基が置換されたプライマーを提供する。この置換は、１つのみであっても、２つ以上の組み合わせでもよい。好ましくは、３’末端から３番目の塩基のみが置換される。このプライマーの置換は、任意の置換であってよいが、好ましくは、ＧからＴ、ＡからＣへ、ＴからＧ、またはＣからＡの置換である。
【００４１】
１つの局面において、本発明のプライマーのＴｍは、好ましくは５０℃以上、なお好ましくは、５５℃以上、より好ましくは、６０℃以上であり、そして、６５℃以上、７０℃以上のＴｍを有するプライマーも使用可能である。
【００４２】
本発明のプライマーの３’は、判別する１塩基変異の位置に対応する。従って、１塩基変異の位置の塩基と、本発明のプライマーの３’末端から１番目の塩基はアニールし得る位置にある。本発明のプライマーを使用する場合、３’末端から１番目の塩基は、ＳＮＰの１つの遺伝子型の塩基と相補的であっても、そのＳＮＰの他の遺伝子型と相補的であってもよい。本発明のプライマーを複数使用する場合は、好ましくは、３’末端から１番目の塩基がＳＮＰの１つの遺伝子型の塩基に相補的であるプライマーと、３’末端の塩基がＳＮＰの他の遺伝子型の塩基に相補的であるプライマーとを組み合わせて使用する。
【００４３】
好ましくは、本発明のプライマーは、プライマーの３’末端の塩基と相補的な塩基を有する鋳型のみを増幅し得る。従って、本発明のプライマーを用いたＰＣＲ反応において、増幅産物が検出される場合には、鋳型中の、プライマー３’末端に対応する位置の塩基は、プライマー３’末端と相補的な塩基である。
【００４４】
本発明におけるＰＣＲ反応において使用される鋳型としては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡが挙げられるがこれらに限定されない。本発明において使用されるゲノムＤＮＡとしては、細菌の染色体ＤＮＡ、真核生物の核ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、葉緑体ＤＮＡ、ならびにウイルスＤＮＡが挙げられるがこれらに限定されない。本発明において使用される鋳型は、天然から単離された状態であっても、単離された後に酵素などによって処理されたものあってもよい。鋳型を処理する酵素としては、逆転写酵素、制限酵素、ポリメラーゼなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４５】
本発明において使用されるプライマーは、例えば、放射性物質、蛍光物質などによって標識されていてもよい。また、本発明のプライマーを使用するＳＮＰ判別方法において、同時に、ＳＴＳプライマーを使用してもよい。
【００４６】
ＰＣＲ産物を検出する方法としては、電気泳動、リアルタイムＰＣＲ検出装置が挙げられるがこれに限定されない。
【００４７】
ＰＣＲ反応のためには、周知または市販の種々の酵素を使用しうる。また、ＰＣＲ反応の条件は周知である。
【００４８】
以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、上記発明の詳細な説明にも下記実施例にも限定されるものではなく、請求の範囲によってのみ限定される。
【００４９】
【実施例】
（実施例１：ゲノムＤＮＡの調製）
種々の生物からゲノムＤＮＡを調製する方法は周知である。例えば、イネの精米、あるいは玄米からゲノムＤＮＡを調製する場合は、以下の方法を用いた。
【００５０】
精米、あるいは玄米を１粒とり（籾のついている米の場合は、藤原製作所（東京）の籾擦り機で玄米へ、玄米を精米にする場合は、ケット製（東京）の試験用パーレストを用いる）、薬包紙に包み、金槌で粉々にし、１．５ｍＬのエッペンチューブ（試験用ポリプロピレン製小型試験管）に入れた。 ４００μＬのＤＮＡ抽出液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．０， １０ｍＭ ＥＤＴＡ， １Ｍ ＫＣｌ）を添加し、攪拌した。１０分室温で静置後、トミー遠心器ＭＸ−１００で１５０００ｒｐｍ，１０分遠心し、上澄みをとり、４００μＬの２−プロパノールを加え、攪拌、１５０００ｒｐｍ，１０分遠心し、ＤＮＡを沈殿させた。上澄みを捨て、沈殿を乾燥させ、２０μＬのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， １ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ ８．０） に溶かし、鋳型ＤＮＡ（ゲノムＤＮＡ）として使用した。
【００５１】
（実施例２：ＳＮＰ判別プライマーの最適化）
ＰＣＲ反応においてＳＮＰの異なる遺伝子型を特異的に増幅するプライマーを作成し、その特異性を検討し、プライマーを最適化した。
【００５２】
プライマーを最適化する際の候補プライマーとして、配列番号１３（Ａ１プライマー）と同様に、「Ｔ」塩基を「プライマーの３’末端から１番目の塩基に対応する塩基」として有する核酸配列を特異的に増幅するプライマーとして、Ａ２〜Ａ６プライマーを合成した（図１）。Ａ２〜Ａ６プライマー（配列番号１４〜１８）は、プライマーの３’末端から３〜５番目の塩基に対応する塩基が各種塩基に置換されたプライマーである。Ｂ１プライマー（配列番号１９）は、Ａ１プライマーの３’末端の「Ｔ」を「Ｃ」に置換したプライマーである。Ｂ２〜Ｂ６プライマー（配列番号２０〜２４）も同様に、Ａ２〜Ａ６プライマーの３’末端の「Ｔ」を「Ｃ」に置換したプライマーである。
【００５３】
これらの各プライマーを、配列番号２５に記載される配列（５’−ｇｃｔｇｇｔｇｃｔａｔａｇｃｔｇｔｔａｔｃｃｔｃ−３’）を有するプライマーとともに、鋳型ＤＮＡとしてコシヒカリから調製したＤＮＡを用いて、以下の条件下でＰＣＲを行った。
（ＰＣＲ溶液）
鋳型ＤＮＡ １．０μＬ
１０×Ｔａｑ ポリメラーゼ反応用緩衝液 ２．０μＬ
ｄＮＴＰｓ （各２．５ｍＭ） １．６μＬ
滅菌水 １４．５μＬ
Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μＬ） ０．１μＬ
プライマー（正方向）（５０μＭ） ０．４μＬ
プライマー（逆方向）（５０μＭ） ０．４μＬ
合計 ２０．０μＬ
今回の実験では、６０℃以上のＴｍ（融点）を有するプライマーを設計した。ＰＣＲ用のポリメラーゼとして、ＨｏｔＳｔａｒｔ用のＴａｑポリメラーゼであるタカラのＥＸ Ｔａｑ ポリメラーゼを使用した。ＰＣＲ増幅器はタカラのＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＳＰを用いているが、とくにこれらのものに限定されない。
【００５４】
ＰＣＲ条件は以下のとおりである：
９４℃ ２分
の後、以下を３０サイクル
９４℃ １０秒
６０℃ １０秒
７２℃ ２０秒
最後に４℃に保温して、ＰＣＲ産物を保存した。
【００５５】
ゲル電気泳動によるＰＣＲ増幅、非増幅の確認を行った結果を、図１に示す。図１の各レーンに示す実験に使用したプライマーは、以下のとおりである：
レーンＡ１（配列番号１３および配列番号２５）、
レーンＢ１（配列番号１９および配列番号２５）、
レーンＡ２（配列番号１４および配列番号２５）、
レーンＢ２（配列番号２０および配列番号２５）、
レーンＡ３（配列番号１５および配列番号２５）、
レーンＢ３（配列番号２１および配列番号２５）、
レーンＡ４（配列番号１６および配列番号２５）、
レーンＢ４（配列番号２２および配列番号２５）、
レーンＡ５（配列番号１７および配列番号２５）、
レーンＢ５（配列番号２３および配列番号２５）、
レーンＡ６（配列番号１８および配列番号２５）、
レーンＢ６（配列番号２４および配列番号２５）。
【００５６】
使用したプライマーの配列は以下のとおりである：
Ａ１プライマー：配列番号１３：ｇｃｇｇｃｔｃｔａｇｇｃｃｇｇｃｃｔｇｇｔａｔ
Ａ２プライマー：配列番号１４：ｇｃｇｇｃｔｃｔａｇｇｃｃｇｇｃｃｔｇｇａａｔ
Ａ３プライマー：配列番号１５：ｇｃｇｇｃｔｃｔａｇｇｃｃｇｇｃｃｔｇｃｔａｔ
Ａ４プライマー：配列番号１６：ｇｃｇｇｃｔｃｔａｇｇｃｃｇｇｃｃｔｃｇａａｔ
Ａ５プライマー：配列番号１７：ｇｃｇｇｃｔｃｔａｇｇｃｃｇｇｃｃｔｇｇｇａｔ
Ａ６プライマー：配列番号１８：ｇｃｇｇｃｔｃｔａｇｇｃｃｇｇｃｃｔｇｔｔａｔ
Ｂ１プライマー：配列番号１９：ｇｃｇｇｃｔｃｔａｇｇｃｃｇｇｃｃｔｇｇｔａｃ
Ｂ２プライマー：配列番号２０：ｇｃｇｇｃｔｃｔａｇｇｃｃｇｇｃｃｔｇｇａａｃ
Ｂ３プライマー：配列番号２１：ｇｃｇｇｃｔｃｔａｇｇｃｃｇｇｃｃｔｇｃｔａｃ
Ｂ４プライマー：配列番号２２：ｇｃｇｇｃｔｃｔａｇｇｃｃｇｇｃｃｔｃｇａａｃ
Ｂ５プライマー：配列番号２３：ｇｃｇｇｃｔｃｔａｇｇｃｃｇｇｃｃｔｇｇｇａｃ
Ｂ６プライマー：配列番号２４：ｇｃｇｇｃｔｃｔａｇｇｃｃｇｇｃｃｔｇｔｔａｃ
ＡＢ−ｒｅｖｅｒｓｅプライマー：配列番号２５：ｇｃｔｇｇｔｇｃｔａｔａｇｃｔｇｔｔａｔｃｃｔｃ。
【００５７】
図１の電気泳動の結果に示されるように、３’末端のみが異なるプライマーは、ＳＮＰを特異的に判別することができなかった（レーンＡ１およびＢ１）。具体的には、使用したＡ１プライマーおよびＢ１プライマーの３’末端に対応する塩基は、コシヒカリでは「Ｔ」であるため、Ｂ１プライマーを用いた場合の増幅は、擬陽性の増幅である。従って、３’末端のみが異なるプライマーを使用しても、ＳＮＰを特異的に判別することはできなかった。
【００５８】
次に、Ａ１プライマーおよびＢ１プライマーの３’末端から３〜５番目の塩基に対応する塩基が各種塩基に置換されたプライマーＡ２〜Ａ６およびＢ２〜Ｂ６を用いて、ＰＣＲおよびゲル電気泳動を行った。その結果、Ａ５プライマーおよびＢ５プライマーを用いた場合にのみ、擬陽性も儀陰性も観察されたなかった。従って、最適なＳＮＰ判別プライマーを設計するためには、プライマーの３’末端から３番目の塩基を、プライマーがアニールする鋳型配列と相補的な塩基から置換することが好ましいことが理解できる。
【００５９】
図１に示される結果（レーンＡ２、Ｂ２、Ａ５およびＢ５）は、プリン−プリン塩基対のミスマッチが核酸二重鎖を不安定にするという予測と一致するものである。しかし、驚くべきことに、Ａ／Ａミスマッチを形成させるプライマーの場合よりも（レーンＡ２およびＢ２）、Ｇ／Ａミスマッチを形成させるプライマーを用いた場合に（レーンＡ５およびＢ５）、１塩基多型判別におけるプライマーの特異性が顕著に向上し、実際に、Ｇ／Ａミスマッチを形成させるプライマーを用いた場合には、擬陽性が検出されなかった。
【００６０】
この結果は、（１）Ａ／Ａミスマッチを形成させることによって、異なる鎖のアデニンの６位のアミノ基の間で立体障害を生じるさせる場合と、（２）Ｇ／Ａミスマッチを形成させて、グアニン環とアデニン環との間で水素結合を形成し得る場合、を比較すると、（２）の場合の方が、プライマーの塩基対形成に対してより大きな影響を与え、その結果、１塩基多型判別におけるプライマーの特異性を向上させたものと予測される。従って、ただ単に、プリン−プリンミスマッチ塩基対を形成させるだけでなく、水素結合を形成し得るＧ／Ａミスマッチ塩基対を形成させることが、１塩基多型判別におけるプライマーの特性の向上に好ましい。
【００６１】
同様に、ピリミジンの場合には、ただ単に、ピリミジン−ピリミジンミスマッチ塩基対を形成させるだけでなく、水素結合を形成し得るＴ／Ｃミスマッチ塩基対を形成させることが、１塩基多型判別におけるプライマーの特性の向上に好ましいと考えられる。
【００６２】
以上の結果から、１塩基多型の遺伝子型を判別するためのＰＣＲプライマーの設計においては、プライマーの３’末端から３番目の塩基をそのプライマーがアニールする鋳型配列と相補的な塩基から置換し、さらにその置換が、（１）Ｇ／Ａ塩基対を形成するように、ＣからＡの置換、またはＴからＧへの置換であるか、または（２）Ｔ／Ｃ塩基対を形成するように、ＧからＴの置換、またはＡからＣへの置換であることが好ましい。
【００６３】
（実施例３：プライマーの３’末端から１番目の塩基が判別すべきＳＮＰの位置に対応するプライマーを用いるＰＣＲ増幅反応）
イネの品種識別を行うために、配列番号９および１０のプライマー対を用いた。これらのプライマー対は、イネの第１染色体上にあるＳＮＰを含む塩基配列（領域３１Ｐ２）に基づいて以下のように設計した。
【００６４】
３１Ｐ２領域で、コシヒカリでは「Ａ」塩基であるが、日本晴では「Ｔ」塩基であるＳＮＰを同定した。このＳＮＰの遺伝子型を判別するために、プライマーの３’末端から１番目の塩基を、このＳＮＰ部位の位置に対応させ、そしてコシヒカリのゲノムＤＮＡを増幅するプライマーとして、配列５’−ｃｔａｔｃａｇａａａｔａｃｔｔｇｃｔｔｔｇｇａｃａａｇｃａａ−３’（配列番号１０）を有するプライマーを設計した。ＰＣＲにおいて、このプライマーとともに使用するプライマーとして、配列５’−ｇａｇｃｃｔｇｔｔｇａｔｇｇｔｇａａｇｃ−３’（配列番号９）を有するプライマーを設計し、ＰＣＲ増幅反応を行った。
【００６５】
反応液の組成は以下のとおりである：
ＰＣＲ条件は以下のとおりである：
９４℃ ２分
の後、以下を３０サイクル
９４℃ １０秒
６０℃ １０秒
７２℃ ２０秒
最後に４℃に保温して、ＰＣＲ産物を保存した。
【００６６】
上記以外のＰＣＲ反応を使用することは当業者に周知であるので、通常のＤＮＡを増やすためのＰＣＲ増幅であれば、上の反応サイクルには限定されず、他のサイクルも同様に利用可能である。
【００６７】
（ゲル電気泳動によるＰＣＲ増幅、非増幅の確認）
本実施例における品種識別では、任意に選択したイネのゲノムＤＮＡを用いて、ＰＣＲによる増幅反応によって核酸が増幅されるか否かを指標として、ゲノムの多型性に基づくイネの品種識別を行った。
【００６８】
ゲル電気泳動をする増幅核酸の確認方法は以下のとおりに行った。
０．８から２．０％のアガロースゲルを用い、ＰＣＲ産物の一部をとり（２μＬ以上）、電気泳動する。電気泳動装置としては、コスモバイオ（東京）のミニゲル（商品名ミューピッド）を用いた。１５分程度の泳動後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、ＵＶランプでＤＮＡを確認した（図２）。
【００６９】
その結果、コシヒカリのゲノムＤＮＡを鋳型に用いた場合には、ＰＣＲ法によって核酸フラグメントが増幅された。コシヒカリと同じ遺伝子型をもつＳＮＰを有する「ひとめぼれ」、「ヒノヒカリ」、「あきたこまち」、「きらら３９７」、「はえぬき」、「ササニシキ」、「どんとこい」、および「アキヒカリ」においても同様に、核酸フラグメントが増幅された。
【００７０】
一方、日本晴のゲノムＤＮＡを鋳型に用いた場合には、ＰＣＲによって、核酸フラグメントが増幅されなかった。日本晴型のＳＮＰを有する、「キヌヒカリ」、「ゆきの精」、「こしいぶき」、「ハナエチゼン」、「ほほほの穂」および「五百万石」においても同様に、核酸フラグメントが増幅されなかった。
【００７１】
従って、配列番号９および１０のプライマー対を使用するＰＣＲでの核酸フラグメントの増幅を指標にして、配列番号１０のプライマーの３’末端から１番目の核酸に対応する塩基が「Ｔ」ではなく「Ａ」であることを判別可能である。
【００７２】
また、上記のプライマーを用いた場合に増幅された核酸が確認された場合には、ＰＣＲに用いた鋳型ＤＮＡを調整した品種が、例えば、「コシヒカリ」、「ひとめぼれ」、「ヒノヒカリ」、「あきたこまち」、「きらら３９７」、「はえぬき」、「ササニシキ」、「どんとこい」、または「アキヒカリ」ではあるが、「キヌヒカリ」でも、「ゆきの精」でも、「こしいぶき」でも、「ハナエチゼン」でも、「ほほほの穂」でも、「五百万石」でもないことも、識別可能である。
【００７３】
（実施例４：マルチプレックスＰＣＲ）
イネの品種識別を行うためには、複数のプライマー対を組み合わせ、各プライマー対それぞれでの、増幅されたバンドの有無を調べる。そのため、通常は、複数のチューブでのＰＣＲ反応が必要である。
【００７４】
そこで、この作業を簡便にするため、幾つかのプライマー対を混合し、１回のＰＣＲ（１つのチューブ）で反応を行うことも可能である。この方法は、マルチプレックス法と呼ばれている。この場合の反応液組成の例を示す。
【００７５】
４種類のＰＣＲマーカーの場合
鋳型ＤＮＡ １．０μＬ
１０Ｘ ＰＣＲ反応緩衝液 ２．０μＬ
ｄＮＴＰｓ （各２．５ｍＭ） １．６μＬ
滅菌水 １３．８６μＬ
Ｔａｑ ポリメラーゼ （５Ｕ／μＬ） ０．１ μＬ
プライマー（配列番号１〜８） 各５０μＭ
合計 ２０μＬ
上記の反応において使用したプライマーは、以下のとおりである：
６Ｐ１Ｎ−５２２プライマー：配列番号１：ＣＣＡＡＣＴＧＣＴＧＣＡＡＴＡＡＴＧＣＣ
６Ｐ１Ｎ−３２２プライマー：配列番号２：ＣＧＴＡＧＣＡＡＣＴＣＡＡＴＡＴＡＡＣＡＴＣＡＧＣＴＡＡ
２６Ｐ１Ｋ−５プライマー：配列番号３：ＴＴＧＴＴＴＡＧＡＣＡＡＡＧＴＡＡＡＧＧＡＧＣＡＡＴＧＣＴ
２６Ｐ１−３−１プライマー：配列番号４：ＧＡＴＡＴＣＴＴＡＧＧＧＣＣＣＧＴＴＴＧＧ
１７Ｐ１Ｋ−５１プライマー：配列番号５：ＴＧＡＣＡＡＣＧＴＡＧＡＴＴＡＧＧＴＴＴＣＴＡＴＣＡＡＴＡＡＴＡＣ
１７Ｐ１Ｋ−３２プライマー：配列番号６：ＡＣＡＡＴＣＣＴＧＴＴＴＧＴＣＧＣＡＧＧ
４Ｐ１Ｋ−５−２プライマー：配列番号７：ＴＴＧＴＡＴＣＣＡＡＡＴＡＡＡＴＣＡＧＧＡＣＣＡＣＴＣＴＧ
４Ｐ１−３−１１プライマー：配列番号８：ＧＧＴＣＴＧＴＡＧＧＣＴＧＣＴＣＡＣ。
【００７６】
マルチプレックスＰＣＲの場合、ＰＣＲ産物の確認のためのゲル電気泳動では、３％のアガロースゲルを用い、バンド間の分離をはっきりさせるために４０分程度の電気泳動を行なった。結果を図３に示す。
【００７７】
（実施例５：マーカーによる品種識別）
本発明のプライマー対とＳＴＳ型プライマーを用いて、日本で流通している代表的品種と、北陸地域で育成された品種の品種識別を行った。品種判別のためのＰＣＲ条件は、実施例２のとおりである。
【００７８】
本発明のプライマーとして、配列番号１〜１０のプライマーに加えて、以下のプライマーを使用した：
３７Ｐ２−５−Ｈプライマー：配列番号１１：ＧＧＧＴＡＴＣＡＴＧＣＣＴＴＴＡＣＴＧＧ
３７Ｐ２−Ｎ３プライマー：配列番号１２：ＧＣＧＡＣＡＧＧＡＧＴＡＧＣＣＴＴＣ。
【００７９】
１２組のＳＴＳ型プライマーとして以下のプライマーを使用した：
１８Ｐ１−５−１プライマー：配列番号２６：ＧＧＣＴＧＣＴＡＧＣＧＴＣＡＴＣＡＧＧ
１８Ｐ１−３−１プライマー：配列番号２７：ＴＴＣＴＣＡＴＣＡＴＡＡＣＡＴＡＴＴＧＡＴＣＴＴＧＣ
１８Ｐ１２−５２プライマー：配列番号２８：ＡＴＧＧＣＣＧＴＧＣＴＣＴＧＴＴＴＣＣ
１８Ｐ１２−３２プライマー：配列番号２９：ＣＡＧＣＡＧＴＴＴＧＧＡＡＡＣＣＡＡＣＧ
１８Ｐ１４−５１プライマー：配列番号３０：ＡＡＧＡＣＡＴＡＧＧＣＣＴＣＧＧＴＴＧＣ
１８Ｐ１４−３１プライマー：配列番号３１：ＴＧＴＴＧＡＡＣＴＴＧＧＧＧＧＴＡＴＧＣ
２７Ｐ１−５−１プライマー：配列番号３２：ＣＡＴＧＣＧＣＣＴＴＣＡＣＡＣＡＣＣ
２７Ｐ１−３−１プライマー：配列番号３３：ＣＡＡＴＴＧＡＣＴＴＴＴＧＧＣＡＡＧＡＴＧＣ
２９Ｐ１−５プライマー：配列番号３４：ＡＡＧＣＡＡＴＣＡＣＴＴＣＣＴＧＣＡＡＣＣ
２９Ｐ１−３プライマー：配列番号３５：ＴＧＣＴＧＣＴＣＡＧＣＡＡＴＡＣＴＴＣＧ
３３Ｐ１−５プライマー：配列番号３６：ＡＧＴＧＣＴＣＡＡＧＡＡＡＴＣＡＴＡＧＣＴＧＡ
３３Ｐ１−３プライマー：配列番号３７：ＧＡＡＧＣＴＴＧＴＧＡＧＴＡＡＣＧＧＣ
３４Ｐ１−５−Ｈプライマー：配列番号３８：ＴＣＴＣＣＣＡＧＡＴＣＡＡＧＡＡＣＴＡＧＣ
３４Ｐ１Ａ−３プライマー：配列番号３９：ＣＧＧＣＡＡＧＣＡＣＡＧＣＧＴＴＣ
３４Ｐ２−５プライマー：配列番号４０：ＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＡＡＣＣＧＣＴＴＧＣ
３４Ｐ２−３プライマー：配列番号４１：ＴＧＴＧＡＴＣＣＡＴＴＡＴＴＧＴＣＣＧＴＡＡＣＣ
３４Ｐ３−５−１プライマー：配列番号４２：ＴＣＣＣＴＣＣＴＴＣＴＣＡＣＧＡＣＴＣＣ
３４Ｐ３−３−１プライマー：配列番号４３：ＧＡＣＡＣＣＡＧＣＴＴＣＣＣＴＴＧＴＣＣ
３５Ｐ１−５プライマー：配列番号４４：ＴＣＴＧＡＣＡＣＴＣＴＴＡＴＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＡＴＧＡＣ
３５Ｐ１−３プライマー：配列番号４５：ＴＧＣＡＡＧＡＡＧＧＡＡＣＧＡＡＧＡＧＣ
３７Ｐ１−５プライマー：配列番号４６：ＧＣＡＣＡＣＴＡＴＴＡＴＣＣＴＴＧＣＴＣＴＡＡＴＧＣ
３７Ｐ１−３プライマー：配列番号４７：ＣＡＴＧＧＣＧＣＴＣＡＣＡＣＡＧＧ
３８Ｐ１−５プライマー：配列番号４８：ＡＣＣＧＡＧＡＴＣＡＴＴＧＴＴＧＴＣＴＧＴＣ
３８Ｐ１−３プライマー：配列番号４９：ＴＴＴＧＡＧＣＣＣＡＴＡＡＡＴＧＡＡＴＡＡＴＣＴＧ。
【００８０】
上記のプライマーを使用した比較結果を図４に示す。ＰＣＲでの増幅産物が確認された場合には「１」、ＰＣＲでの増幅産物が確認されなかった場合には「０」を記載した。
【００８１】
上記のＳＴＳプライマー（配列番号２６〜４９）では識別できなかったイネ品種はお互いに遺伝的に近縁なものが多いが（例えば、コシヒカリ、キヌヒカリ、どんとこい）、本発明のプライマーを使用した場合は識別することができた。
【００８２】
具体的には、従来から用いられている１２組のＳＴＳ型プライマーでは識別することができなかったコシヒカリ、ひとめぼれ、キヌヒカリ、はえぬき、どんとこい、ゆきの精、こしいぶき、ハナエチゼンについて、本発明の方法で作成した４組のＳＮＰ判別マーカー（配列番号１〜８）を用いることによって、識別することが可能となった。
【００８３】
以上の結果から、本発明において最適化されたプライマーを用いることによって、擬陽性および擬陰性を生じることなく、１塩基多型判別することが可能となった。また、ＳＴＳ型プライマーを用いる従来の方法では識別できるマーカーを設定するに大きな労力が必要であった遺伝的に近縁なイネ品種を識別するマーカーも、容易に作成可能となった。
【００８４】
また、本発明のプライマーと従来のＳＴＳ型プライマーを組み合わせることにより、さらに多くの近縁のイネを識別していくことが可能となる。
【００８５】
【発明の効果】
本発明のプライマーを使用することにより、従来法よりも高精度に、１塩基レベルの変異を判別することが可能となった。また、ＳＮＰｓ遺伝子型の判別において、本発明のプライマーを使用する判別方法を用いた場合、従来のような特に高額な機械を使用する必要がない。従って、本発明のプライマーによって、簡易で安定的な品種識別が可能である。
【００８６】
本発明のプライマーは１塩基置換を擬陽性の問題を生じることなく判定するので、従来法よりも多くのゲノム上の部位での変異を安定的に判別可能である。
【００８７】
また、本発明のプライマーは、イネなどの育種において、選抜育種用のＤＮＡマーカーとしても、有用である。
【００８８】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１の上図は、コシヒカリと他品種のゲノム部分配列を示す。コシヒカリと他品種のゲノム部分配列を比較した場合のＳＮＰの位置を、矢印で示す。
図１の中図は、上図に示したゲノム部分配列周辺領域を増幅するＳＮＰ判別用プライマーＡ１〜Ａ６およびＢ１〜Ｂ６の部分配列を示す。ＳＮＰ判別用プライマーの配列中、ゲノムＤＮＡ配列に対応する部分についてのみを図１に示した。「−」は、ゲノムＤＮＡ配列と同一の塩基を示す。ゲノムＤＮＡ配列と異なる塩基を、一文字表記で示した。ＳＮＰ判別用プライマーＡ１〜Ａ６全ての３’末端塩基は「Ｔ」である。一方、ＳＮＰ判別用プライマーＢ１〜Ｂ６全ての３’末端塩基は「Ｃ」である。そのため、図１では、ＳＮＰ判別用プライマーの３’末端の配列を「Ｔ／Ｃ」で示した。
図１の下図：ＳＮＰ判別用プライマーを使用したＰＣＲの結果を示す。
【図２】図２は、配列番号９および１０に記載される配列を有するＳＮＰ判別用プライマーを用いたＰＣＲの結果を示す。ゲルの写真の下に示した品種名は、鋳型ＤＮＡとして使用したゲノムＤＮＡを調製したイネの品種名である。
【図３】図３は、配列番号１〜８に記載される配列を有するＳＮＰ判別用プライマーを用いたＰＣＲの結果を示す。ゲルの写真の下に示した品種名は、鋳型ＤＮＡとして使用したゲノムＤＮＡを調製したイネの品種名である。
【図４】図４は、ＳＮＰ判別プライマーおよびＳＴＳプライマーを使用し、各イネ品種から調製したゲノムＤＮＡを用いてＰＣＲを行った結果を示す図である。使用したプライマーを、配列番号で記載する。ＳＴＳプライマーを使用した場合には判別できないが、ＳＮＰ判別プライマーを使用した場合にのみ識別可能となった品種名に「＊」を付した。
Claims (11)
- １塩基多型の遺伝子型を判別するためのＰＣＲプライマーであって、該プライマーの３’末端から１番目の塩基は判別すべき該１塩基多型の位置に対応し、該プライマーの３’末端から３番目の塩基は該プライマーがアニールする鋳型配列と相補的な塩基から置換されており、該置換はＧからＴ、ＡからＣへ、ＴからＧ、またはＣからＡの置換である、プライマー。
- ５０℃以上のＴｍを有する、請求項１に記載のプライマー。
- ６０℃以上のＴｍを有する、請求項１に記載のプライマー。
- ６５℃以上のＴｍを有する、請求項１に記載のプライマー。
- 以下のプライマー対からなる群から選択されるプライマー対：
（１）配列番号１および２；
（２）配列番号３および４；
（３）配列番号５および６；
（４）配列番号７および８；ならびに
（５）配列番号９および１０。 - 請求項５に記載のプライマー対を少なくとも２つ含む、プライマーのセット。
- 配列番号１〜１２からなる群から選択されるプライマーを２つ以上含む、請求項６に記載のプライマーセット。
- 請求項１に記載のプライマーを使用する、１塩基多型の遺伝子型の判別方法。
- 請求項１に記載のプライマーを含む、１塩基多型の遺伝子型を判別するためのキット。
- １塩基多型の遺伝子型を判別する方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）判別対象となる１塩基多型の遺伝子型を選択する工程；
ｂ）多型判別用プライマーを調製する工程であって、ここで、該多型判別用プライマーの３’末端から１番目の塩基は判別すべき該１塩基多型の位置に対応し、該多型判別用プライマーの３’末端から３番目の塩基は該多型判別用プライマーがアニールする鋳型配列と相補的な塩基から置換されており、該置換はＧからＴ、ＡからＣへ、ＴからＧ、またはＣからＡの置換である、多型判別用プライマーを調製する工程；
ｃ）該多型判別用プライマーと、少なくとも１つの別のプライマーを用いて、ＰＣＲを行う工程；および
ｄ）ＰＣＲ産物の増幅の有無から、１塩基多型の遺伝子型を判別する工程；
を包含する、方法。 - 少なくとも２つ以上のプライマー対を用いる、請求項１０に記載の方法。
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