JP2015532593A

JP2015532593A - ｐＨ感受性色素を使用する増幅反応産物の検出

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Publication number: JP2015532593A
Application number: JP2015528635A
Authority: JP
Inventors: タナー，ネイサン; ジャン，インホワ; エバンス，トーマス・シー
Original assignee: ニユー・イングランド・バイオレイブス・インコーポレイテツド
Priority date: 2012-08-23
Filing date: 2013-08-21
Publication date: 2015-11-12
Anticipated expiration: 2033-08-21
Also published as: EP2888374A4; EP2888374B1; US20150240293A1; US9034606B2; CN104937108B; EP2888374A1; US20140057268A1; US9580748B2; CN104937108A; WO2014031783A1; JP6831628B2

Abstract

増幅反応をモニターするための迅速で低費用のアプローチのための方法が、提供される。この方法は、有色または蛍光であるｐＨ感受性色素を使用して、終了まで、等温増幅反応またはＰＣＲ増幅反応の進行をモニターするステップを含む。ＤＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオチド三リン酸および１ｍＭ未満のＴｒｉｓもしくは等価物の弱いバッファーまたはバッファーなしの混合物を含む組成物が記載される。

Description

配列特異的等温ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）核酸増幅技術は、分子診断学の急速に成長している分野に相当し、ＤＮＡサンプルの急速で高感度な検出を提供する。

電気泳動法は、労働集約型の手動のプロセシングおよび機器を利用する増幅後ステップにおいてＤＮＡ産物を検出する従来の方法である。等温増幅における最近の発展は、代わりとなる検出方法、例えば、挿入フルオロフォアまたはマグネシウム感受性フルオロフォアによる二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の蛍光検出（Ｎｏｔｏｍｉ，ｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２８：Ｅ６３（２０００）；Ｔｏｍｉｔａ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ，３：８７７−８２（２００８）；Ｇｏｔｏ，ｅｔａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４６：１６７−７２，（２００９））；ピロりん酸変換を通しての生物発光（Ｇａｎｄｅｌｍａｎ，ｅｔａｌ．，ＰＬｏＳＯｎｅ，５：ｅｌ４１５５（２０１０）；または沈殿したピロりん酸マグネシウムの混濁度検出（Ｍｏｒｉｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２８９：１５０−４（２００１））をもたらした。しかしながら、これらの視覚的な方法は、典型的に、長いインキュベーション時間（＞６０分間）を必要とする、検出のための特異的な機器を必要とするまたは研究所外での安定な（ｒｏｂｕｓｔ）検出について変化に敏感すぎる。リアルタイムＰＣＲ機器および化学における進歩は、ＰＣＲ反応の間に多くのサンプルを同時にモニターすることを可能にした。検出原理は、典型的に、挿入色素によるｄｓＤＮＡの蛍光検出の使用または配列特異的蛍光プローブの使用に基づき、費用のかかる機器を必要とする。この代わりに、ポリメラーゼ依存性の増幅の間に放出される水素イオンを検出するための機器が、開発された。これらの水素イオンの検出は、ハイスループット次世代シークエンシング（ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔ（商標）Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹ）において使用するために、例えば米国特許第７，８８８，０１５号明細書において実証されるように、最先端の電子検出およびマイクロ流体デバイスを使用して実現された。

ポイントオブケア（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）診断法および現場での診断法は、迅速で簡単な試験を必要とし、理想的には、３０分未満で標的核酸を検出し、最先端で費用のかかる機器を伴わない。

米国特許第７，８８８，０１５号明細書

Ｎｏｔｏｍｉ，ｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２８：Ｅ６３（２０００）Ｔｏｍｉｔａ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ，３：８７７−８２（２００８）Ｇｏｔｏ，ｅｔａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，４６：１６７−７２，（２００９）Ｇａｎｄｅｌｍａｎ，ｅｔａｌ．，ＰＬｏＳＯｎｅ，５：ｅｌ４１５５（２０１０）Ｍｏｒｉｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２８９：１５０−４（２００１）

本発明の一実施形態において、１ｍＭ未満のＴｒｉｓもしくは等価物の量で弱い緩衝剤を含有するまたは緩衝剤なしの調合物中に、ｐＨ感受性色素、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰを含む調製物が、提供される。

一態様において、調製物が、１つ以上のプライマーおよび鋳型ＤＮＡを含む。他の態様において、ｐＨ感受性色素が、視覚的に検出可能な有色色素または蛍光色素のいずれかである。

本発明の一実施形態において、核酸の増幅を検出するための方法であって、弱緩衝または非緩衝液中に鋳型ＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼおよびｐＨ感受性色素を含有する増幅反応混合物を提供するステップならびに標的ＤＮＡの増幅から結果として生じる色素のスペクトル特性における変化を検出するステップを含む方法が、提供される。

一態様において、核酸増幅が、等温増幅または等温ＰＣＲである。

他の態様において、等温核酸増幅が、ループ媒介性等温増幅（ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄｉｓｏｔｈｅｒｍａｌａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＬＡＭＰ）、ヘリカーゼ置換増幅（ｈｅｌｉｃａｓｅｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＨＤＡ）、鎖置換増幅（ｓｔｒａｎｄｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＤＡ）、レコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｓｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＲＰＡ）およびニッキング酵素増幅反応（ｎｉｃｋｉｎｇｅｎｚｙｍｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅａｃｔｉｏｎ）（ＮＥＡＲ）からなる群から選択される。

一態様において、ｐＨ感受性色素が、可溶性であり、他の態様において、可溶性色素が、可視光線において検出可能な有色色素である。適した色素の例は、クレゾールレッド、フェノールレッド、ｍ−クレゾールパープル、ブロモクレゾールパープル、ニュートラルレッド、ナフトールフタレイン、チモールブルー、ナフトールフタレインである。

他の態様において、ｐＨ感受性色素が、蛍光色素、例えば２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（および−６）−カルボキシフルオレセインまたはカルボキシルセミナフトロダフルオル（ｓｅｍｉｎａｐｈｔｈｏｒｈｏｄａｆｌｕｏｒ）である。

他の態様において、弱緩衝液が、１ｍＭ未満のＴｒｉｓバッファーまたは等価なバッファーを含有する。

方法の他の態様において、増幅の検出が、増幅が起こった前および後の色素のスペクトルまたは蛍光特性における変化を比較することに依存する。

本発明の一実施形態において、標的配列がサンプル中に存在する場合に、標的配列の核酸増幅をモニターするための方法が提供され、増幅がサイクルの閾値数を超えて進むにつれて、ｐＨの変化が標的配列の存在化において決定され、モニターは、ｐＨ感受性の有色色素または蛍光色素を反応混合物に追加し、増幅前と比較した、増幅が起こった場合の色の変化を決定することによって実現される。

特許または出願書類は、カラーで制作された少なくとも１つの図を含有する。色のついた図を有するこの特許または特許出願刊行物のコピーは、依頼および必要な料金の支払いと同時に特許庁によって提供されるであろう。

図１Ａおよび１Ｂは、様々な指標色素を使用する、終了した増幅反応の可視色変化検出を示す図である。ここで、ＬＡＭＰは、ｐＨ９の低バッファー溶液においてラムダファージＤＮＡ標的配列を増幅するために使用され、増幅の終了時に、ｐＨが低下し、色変化が起こる。図１Ａは、５０μΜまたは１００μΜのフェノールレッド、クレゾールレッド、ニュートラルレッドおよびｍ−クレゾールパープルの存在下における反応の開始時のサンプルの色を示す。図１Ｂは、Ｂｓｔ２．０（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）ＤＮＡポリメラーゼを省いた場合ではなく、反応混合物中に含んだ場合の増幅から結果として生じるｐＨの減少に応じた、６５℃での３０分間のＬＡＭＰ反応後のサンプルの色を示す。サンプルは、フェノールレッドおよびクレゾールレッドの存在下において赤色から黄色に；ニュートラルレッドを使用すると無色から赤色に；ｍ−クレゾールパープルにより青紫色から黄色に変わった。図２Ａおよび２Ｂは、増幅反応前後の色素の色の比較を示す図である。ラムダファージＤＮＡ標的は、色変化が増幅反応の終了時に起こるように、示されるように、初期ｐＨ１０またはｐＨ７．５の低バッファー溶液においてＬＡＭＰを使用して増幅した。図２Ａは、反応の開始時のサンプルの色を示す。ここで使用される色素は、ｐＨ１０でよりアルカリ性の指示薬（チモールブルー、ナフトールフタレイン、フェノールフタレイン）またはｐＨ７．５でより中性の指示薬（ブロモクレゾールパープル）であり、すべて、示されるように５０μΜまたは１００μΜで含まれた。図２Ｂは、Ｂｓｔ２．０ＤＮＡポリメラーゼを省いた場合ではなく、反応混合物中に含んだ場合の増幅から結果として生じるｐＨの減少に応じた、６５℃での６０分間のＬＡＭＰ反応後のサンプルの色を示す。Ｂｓｔ２．０を含有するサンプルは、チモールブルーの存在下において青色から黄色に；ナフトールフタレインの存在下において青色から無色（５０ｕＭ）または淡青色（１００ｕＭ）に；フェノールフタレインの存在下において淡紅色から無色（５０ｕＭ）または紅梅色（１００ｕＭ）に；ブロモクレゾールパープルの存在下において青紫色から黄色に変わった。図３Ａから３Ｃは、増幅反応における色変化検出が、標的ＤＮＡの増幅に対して特異的であることを示す図である。ここで、２つの異なるＤＮＡが、増幅された場合に同様に応答することが示された。ＬＡＭＰ反応は、示されるように、線虫ｌｅｃ−１０またはヒトＢＲＣＡ１配列標的のいずれかについてのプライマーにより低バッファー反応溶液中で実行した。Ｂｓｔ２．０ＤＮＡポリメラーゼおよび標的ゲノムＤＮＡ（＋Ｔｅｍｐ）または非鋳型コントロール（ＮＴＣ）および１００μΜの指標色素（フェノールレッド、クレゾールレッド、ニュートラルレッドまたはｍ−クレゾールパープル）を含有した反応液を６５℃で、０分間インキュベートした。図３Ａは、特定の指示薬についてのすべてのチューブが、時間＝０分間に同じ色で開始されたことを示す。図３Ｂは、鋳型ＤＮＡを含有するサンプルのみが、増幅の開始の１５分後に色を変化させたことを示し、標的ＤＮＡのポジティブな増幅を表す。図３Ｃは、鋳型ＤＮＡを含有する、増幅されたサンプルの色変化が、増幅の開始の６０分後に強まったことを示す。幾つかのＮＴＣは、ポジティブな（標的）増幅と時間的に明らかに区別されたが、非特異的増幅により中程度のレベルの色変化を示した。図４Ａから４Ｃは、４つのｐＨ感受性色素による、増幅の間の、鋳型量に応じた、反応時間にわたる色変化の感受性を示す図である。ＬＡＭＰ反応は、示されるように、鋳型ＤＮＡ（ＨｅＬａ）（１００ｎｇから０．１ｎｇまたは０．０１ｎｇ）の連続的な１０倍の用量設定を使用して、ヒトＣＦＴＲ配列についてのプライマーにより低バッファー反応溶液中で実行した。図４Ａは、時間＝０分間での指標色素（それぞれ１００μΜ）の色を示す。図４Ｂは、フェノールレッドおよびニュートラルレッドの色素を使用する１００ｎｇから０．１ｎｇ標的ＤＮＡならびにクレゾールレッドおよびｍ−クレゾールパープルの色素については１００ｎｇから０．０１ｎｇＤＮＡの増幅後、時間＝１５分間での色変化を示す。図４Ｃは、時間＝３０分間での、図４Ａおよび４Ｂと同じ反応を示し、完全な色変化が、すべての色素について、すべての鋳型量について観察されたが、すべての非鋳型コントロールは、初期の色を保持した。図５は、低バッファー反応において１００μΜフェノールレッドを使用するＰＣＲ増幅反応の検出を示す図である。ＤＮＡ鋳型を含有した三通りの反応のみ（１、２および３と標識）が淡紅色から黄色に色を変化させたが、ＤＮＡ鋳型なしの反応液（４、５および６）は、淡紅色のままであった。図６は、１００μΜフェノールレッドを含有するＰＣＲ反応液の使用による細菌コロニー中の特異的なプラスミドＤＮＡの同定を示す図である。ＰＣＲの後に、標的プラスミドを含有した３つのコロニー由来の細菌を有するポジティブサンプル（１から３）は、淡紅色から黄色に色を変化させた。無関係なプラスミドを含有するコロニー由来の細菌を有した３つのネガティブコントロール（ａからｃ）は、変化させなかった。これは、プラスミドＤＮＡを有するポジティブ（＋）反応液および水のみを有するネガティブコントロール（−）の結果と一致し、特定のプラスミドの存在について細菌コロニーをスクリーニングするための色変化検出の適用可能性を実証した。図７Ａおよび７Ｂは、Ｂｓｔ２．０ポリメラーゼの存在下および非存在下において１００μΜ可視ｐＨ指示薬を使用する、ヒトＤＮＡおよびＢＲＣＡ１遺伝子についてのプライマーについてのＳＤＡ反応液の検出を示す図である。色変化は、Ｂｓｔ２．０を含有するサンプルにおいて観察され、色変化は、Ｂｓｔ２．０が存在しないサンプルにおいて観察されなかった。図７Ａは、反応の開始時のＢｓｔ２．０の存在下および非存在下における反応液の色を示す。図７Ｂは、６５℃での１時間のインキュベーション後のＢｓｔ２．０の存在下および非存在下における反応液の色を示す。色変化は、ポリメラーゼの存在下でのみ起こり、増幅の検出を示した。図８Ａから８Ｃは、蛍光ｐＨ指示薬のリアルタイム測定を使用する、ＬＡＭＰ反応の検出を示す図である。データは、差し引いたＲＦＵとしてプロットし、ベースライン（０ＲＦＵ）を生成するために、バックグラウンド値を最終ＲＦＵから差し引いた。ＤＮＡポリメラーゼなしでは、蛍光変化は、ほとんど観察されず（点線）、検出が増幅に対して特異的であり、ｐＨの動きは、等温条件下で最小限であったことを示す。図８Ａは、Ｂｓｔ２．０ＤＮＡポリメラーゼの存在下において、ＢＣＥＣＦ−ＡＭについて蛍光の著しい低下を示し（ＣＦＸ９６（商標）蛍光計（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＨｅｒｃｕｌｅｓＣＡ）のＦＡＭチャネルで測定）、ＤＮＡ増幅反応に対応する。図８Ｂは、ＤＮＡ増幅に応じたＳＮＡＲＦ−１（Ｒ）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹ）の高ｐＨ形態についての蛍光における低下を示す（ＲＯＸチャネル）。図８Ｃは、ＤＮＡ増幅に応じたＳＮＡＲＦ−１の低ｐＨ形態についての蛍光における増加を示す（ＨＥＸチャネル）。図９Ａから９Ｃは、ＬＡＭＰ反応におけるｐＨ変化の蛍光検出の感受性を示す図である。反応は、示されるように、ヒトＣＦＴＲについてのプライマーおよび様々な量の鋳型ＨｅＬａＤＮＡを含有した。ｐＨ変化は、鋳型濃度依存性の形をしていることが観察され、蛍光変化に必要とされる時間は、反応液中に存在する鋳型ＤＮＡの量と相関した。鋳型量が多いほど、より急速なｐＨ変化、従って蛍光変化がもたらされ、鋳型量が少ないほど、より遅いｐＨ変化がもたらされたが、ＮＴＣは、初期のｐＨおよび蛍光値で安定したままであった。図９Ａは、ＤＮＡ増幅の間のＢＣＥＣＦ−ＡＭについてのｐＨにおける低下に対応する蛍光の低下を示す。図９Ａから９Ｃは、ＬＡＭＰ反応におけるｐＨ変化の蛍光検出の感受性を示す図である。反応は、示されるように、ヒトＣＦＴＲについてのプライマーおよび様々な量の鋳型ＨｅＬａＤＮＡを含有した。ｐＨ変化は、鋳型濃度依存性の形をしていることが観察され、蛍光変化に必要とされる時間は、反応液中に存在する鋳型ＤＮＡの量と相関した。鋳型量が多いほど、より急速なｐＨ変化、従って蛍光変化がもたらされ、鋳型量が少ないほど、より遅いｐＨ変化がもたらされたが、ＮＴＣは、初期のｐＨおよび蛍光値で安定したままであった。図９Ｂは、ＤＮＡ増幅の間のＳＮＡＲＦ−１（高ｐＨ）についてのｐＨにおける低下に対応する蛍光の低下を示す。図９Ａから９Ｃは、ＬＡＭＰ反応におけるｐＨ変化の蛍光検出の感受性を示す図である。反応は、示されるように、ヒトＣＦＴＲについてのプライマーおよび様々な量の鋳型ＨｅＬａＤＮＡを含有した。ｐＨ変化は、鋳型濃度依存性の形をしていることが観察され、蛍光変化に必要とされる時間は、反応液中に存在する鋳型ＤＮＡの量と相関した。鋳型量が多いほど、より急速なｐＨ変化、従って蛍光変化がもたらされ、鋳型量が少ないほど、より遅いｐＨ変化がもたらされたが、ＮＴＣは、初期のｐＨおよび蛍光値で安定したままであった。図９Ｃは、ＤＮＡ増幅の間のＳＮＡＲＦ−１の低ｐＨ形態の蛍光の増加を示す。図１０Ａおよび１０Ｂは、ＳＮＡＲＦ−１を使用する、異なるサイズの標的ＤＮＡを増幅するＰＣＲ反応の検出を示す図である。異なるサイズ（１１４ｂｐ、３０８ｂｐ、１２７８ｂｐ）を有する３つの断片を増幅した。反応における鋳型ＤＮＡの存在は、ＰＣＲの間の蛍光測定値の有意な変化に至った（バックグラウンド変化よりも＞５０００ＲＦＵ）。シグナル低下のレベルは、アンプリコンサイズに比例し、１１４ｂｐについて５０００ＲＦＵまで、３００ｂｐについて６０００ＲＦＵおよび１２７８ｂｐアンプリコンについて８０００ＲＦＵ減少した。すべてのアンプリコンは、２０サイクルまでのバックグラウンド補正した蛍光低下についての閾値時間をもたらした。図１０Ａは、ＰＣＲサイクリングにわたって記録した生の非補正ＲＦＵを示す。図１０Ａおよび１０Ｂは、ＳＮＡＲＦ−１を使用する、異なるサイズの標的ＤＮＡを増幅するＰＣＲ反応の検出を示す図である。異なるサイズ（１１４ｂｐ、３０８ｂｐ、１２７８ｂｐ）を有する３つの断片を増幅した。反応における鋳型ＤＮＡの存在は、ＰＣＲの間の蛍光測定値の有意な変化に至った（バックグラウンド変化よりも＞５０００ＲＦＵ）。シグナル低下のレベルは、アンプリコンサイズに比例し、１１４ｂｐについて５０００ＲＦＵまで、３００ｂｐについて６０００ＲＦＵおよび１２７８ｂｐアンプリコンについて８０００ＲＦＵ減少した。すべてのアンプリコンは、２０サイクルまでのバックグラウンド補正した蛍光低下についての閾値時間をもたらした。図１０Ｂは、ＰＣＲ反応の熱サイクルによるバックグラウンドのｐＨおよび蛍光の低下について補正するためにＴａｑＤＮＡポリメラーゼなしのチューブからシグナルを差し引いた後のＰＣＲサイクリングの間の正味ＲＦＵ変化を示す。

ＤＮＡ合成の間のヌクレオシド三リン酸組み込み事象は、ＤＮＡポリメラーゼによって触媒される反応の間にピロりん酸基および水素イオンを生成する。

バッファー条件がないと、プロトンはＤＮＡ増幅反応液中に蓄積し、溶液は、ＤＮＡ増幅の増加と共にますます酸性になる。

大きなかさ高い有機分子であるｐＨ指標色素が増幅反応に干渉するかもしれないまたは増幅の間のプロトン濃度の増加がｐＨ指示薬における色もしくは蛍光の検出可能な変化を可能にするのに十分ではないという初期の懸念にもかかわらず、これらの分子がＤＮＡ増幅をモニターするために使用できることが示された。ｄＮＴＰ、核酸、酵素および保存溶液から持ち越される緩衝剤由来のバッファー効果による溶液のバッファー能力にもかかわらず、ｐＨ変化は、ＬＡＭＰ反応において４ｐＨ単位くらいの高さになることが観察された。増幅反応をモニターするための化学色素および蛍光色素の実用性は、限定されることが意図されない一連の実施例によって支持される。好ましくは眼によって可視であるｐＨ指標色素を含む蛍光色素およびまた化学色素は、様々な時点；様々な濃度の色素およびＤＮＡ標的；異なるタイプの標的ＤＮＡならびに例えば、定性的におよび定量的にの両方で分析されるＳＤＡ、ＬＡＭＰおよびＰＣＲなどのような、ポリメラーゼおよびヌクレオチドを利用する任意のタイプの増幅プロトコールで、増幅産物の形成の検出において有効である。有意に、増幅エンドポイントの検出は、曖昧さを伴うことなく達成することができた。

本発明の実施形態は、ＤＮＡ増幅を検出するための手段として果たす、広範囲のｐＨ感受性可視色素または蛍光色素を個々にまたは一緒に使用して、低費用および安定した能率で、増幅産物の形成および任意選択で数量を迅速におよび確実に検出する組成物および方法を提供する。ポリメラーゼは典型的に５から１０のｐＨで働くので、色素の選択は、この範囲内の変化を反映する。可視色素については、色の変化は、異なるｐＨで同定されるのに対して、蛍光色素については、ｐＨが蛍光色素のよく知られている特性に依存して低下するので、蛍光の増加または減少が、検出されてもよい（例えばＢＣＥＣＦ−ＡＭ対ＳＮＡＲＦ−１を参照されたい。）。

増幅反応のｐＨは、反応バッファーの非存在下においておよびまた酵素保存バッファーから持ち越された場合に生じるかもしれないなどのような、幾つかの残存しているバッファーの存在下においても（例えば、少なくとも約１ｍＭのバッファーまで、例えば１５０μΜ Ｔｒｉｓ）、指標色素を使用して確実に測定されてもよい。一実施形態において、ＰＣＲ反応が、反応バッファーの非存在下においてまたは残存しているバッファー（１５０μΜ Ｔｒｉｓ）の存在下において標準的な条件を使用して実行され、同様の結果を伴った。

少なくともｐＨ５から１０のｐＨ範囲に対して耐性の鎖置換ポリメラーゼを使用して、ＬＡＭＰは、≦１ｍＭ緩衝剤を有する溶液において実行された。中性のｐＨ範囲移行指示薬の存在下においてアルカリ性条件（ｐＨ８から１０）において反応を開始することによって、初期の高ｐＨ色が、観察された（例えば表１を参照されたい。）。増幅が進むにつれて、溶液ｐＨは１０分間ほどで第２の酸性ｐＨ（ｐＨ５から７）まで実質的に減少し、検出可能な色変化をもたらした。この色差は、容易に目に見えた。

様々な色を有する広範囲のｐＨ色指示薬があり、いずれも、本発明の実施形態における使用に適している（例えば、青紫色から黄色、赤色から黄色、黄色から赤色）。異なるｐＨで色を変化させる８つの異なるｐＨ感受性色素についての実施例が、本明細書において提供される。これらの実施例は、限定するようには意図されない。

指標色素のスペクトル特性における変化の検出は、例えば、オペレーターの眼、蛍光計または分光光度計を使用して、これらの光化学的特性によって実現することができる。用語「検出する」は、用語「モニターする」と区別なく使用されてもよい。

適した可視色素は、ｐＨが８よりも高い場合、真黄色の色、ｐＨが６．８未満である場合、赤色の色を有するニュートラルレッド；ｐＨが８よりも高い場合、赤色の色、ｐＨが６．４未満である場合、黄色の色を有するフェノールレッド；ｐＨが８．８よりも高い場合、赤みがかっている紫色の色、ｐＨが７．２未満である場合、黄色の色を有するクレゾールレッド；ｐＨが９．６よりも高い場合、青色の色、ｐＨが８．０未満である場合、黄色の色を有するチモールブルー；ｐＨが１０よりも高い場合、フクシア色、ｐＨが８．３未満である場合、無色を有するフェノールフタレイン；およびｐＨが８．７よりも高い場合、緑がかっている色、ｐＨが７．３未満である場合、蒼白色の赤みがかっている色を有するナフトールフタレインを含む。本明細書において使用される色素についてのこれらの特性は、表１に掲げる。

ｐＨ指示薬の他の例は、メチルイエロー、メチルオレンジ、ブロモフェノールブルー、ナフチルレッド、ブロモクレゾールグリーン、メチルレッド、アゾリトミン、ナイルブルー、チモールフタレイン、アリザリンイエロー、サリチルエロー、ニトロアミンを含む。これらの指示薬は、従来のＤＮＡポリメラーゼ耐性の範囲の外側に移行し得るが、増幅検出の原理は、所望のｐＨ範囲に適切な指示薬による代替の検出方法に適用され得る。

検出デバイスを必要とするあるクラスの色素は、蛍光色素である。上記に言及される視覚的な色素のように、ｐＨ感受性蛍光色素は、異なるｐＨで、異なるレベルの蛍光放出またはピーク放出波長のシフトを有する。光度における変化およびピーク吸収におけるシフトの両方は、適切なフィルターセットを装備したシステムを使用して容易に検出することができる。

本発明の実施形態における使用のための蛍光色素は、ｐＨに基づく蛍光のシフトを特色とする５−（および−６）カルボキシＳＮＡＲＦ−１を含む。高ｐＨ（ｐＨ９）ＳＮＡＲＦ−１で、Ａ_ｍａｘ５７５ｎｍ／Ｅｍ_ｍａｘ６５０ｎｍの最大の吸収／放出。これらの値は、ｐＨが低下すると、Ａ_ｍａｘ５２５／Ｅｍ_ｍａｘ５９０まで有意にブルーシフトする。この蛍光シフトは、色素の２つの状態の同時のモニターを可能にし、一方の蛍光チャネルは、高ｐＨ形態（増幅と共に蛍光減少を示す、図５）に対応し、もう一つのチャネルは、低ｐＨ形態（蛍光増加）に対応する。発明者らは、ｐＨ１０からｐＨ６へのキャリブレーション溶液（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎｓｏｌｕｔｉｏｎ）のｐＨ低下と同時に、高ｐＨ形態について蛍光の９０％の損失（ＣＦＸ９６機器のＲＯＸチャネルにおいて測定したまたは蛍光の２００％の増加（ＨＥＸチャネル）を測定した。ＳＮＡＲＦ−１と関係する他の適した蛍光色素は、ｐＨ変化をモニターするために開発されており、ＳＮＡＲＦ−４ＦおよびＳＮＡＲＦ−５Ｆ、ＳＮＡＦＲ、ＳＮＡＦＬ、５−（および−６）−カルボキシナフトフルオレセイン、６−ＪＯＥ、ＯｒｅｇｏｎＧｒｅｅｎ（Ｒ）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹ）を含む。他の蛍光ｐＨ指示薬は、ｐＨ９でＡ_ｍａｘ５００ｎｍ／Ｅｍ_ｍａｘ５３５ｎｍの吸収／放出プロファイルを有する２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（および−６）−カルボキシフルオレセイン，アセトキシメチルエステル（ＢＣＥＣＦ−ＡＭ）（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＧｒａｎｄＩｓｌａｎｄ、ＮＹ）を含む。このＢＣＥＣＦ−ＡＭもまた、ｐＨが低下するにつれてスペクトルの青色シフトを特色とするが、低ｐＨ形態は、励起においてこれほど効率的ではなく、有効な読み取りは、高ｐＨ形態からの蛍光の減少に限られる。蛍光のおよそ８０％の低下は、ｐＨ１０からｐＨ６で、ＢＣＥＣＦ−ＡＭ（ＣＦＸ９６のＦＡＭチャネル）について測定された。ＢＣＥＣＦはフルオレセインに由来し、フルオレセインと関係する多くの色素は、ｐＨ変化に対して同様の感受性を示す。

上記に言及されるものを含む視覚的なおよび蛍光色素は、ｐＨに応じた、改変された比色定量特性を有するように、化学的に修飾することができる。これらの修飾は、より明るいまたはより狭いｐＨ範囲で色を変化させ、従って、より好適な検出を可能にする色素を作成することができる。

ＬＡＭＰおよびＳＤＡ、ＨＤＡ、ＲＰＡならびにＮＥＡＲなどのような等温ポリメラーゼ依存性増幅反応は、可視および蛍光色素を使用して、ｐＨ変化を測定することによって容易にモニターすることができる。例えば、共通してＢｓｔ２．０ポリメラーゼを利用するＬＡＭＰ増幅、例えばＧｉｌｌ，ｅｔａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓ．ＮｕｃｌｅｏｔＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ，２７：２２４−４３（２００８）；Ｋｉｍ，ｅｔａｌ，Ｂｉｏａｎａｌｙｓｉｓ，３：２２７−３９（２０１１）；Ｎａｇａｍｉｎｅｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．Ｐｒｏｂｅｓ，１６：２２３−９（２００２）；Ｎｏｔｏｍｉｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．，２８：Ｅ６３（２０００）；およびＮａｇａｍｉｎｅｅｔａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，４７：１７４２−３（２００１）を参照されたい、は、化学物質または蛍光色素を使用して視覚的に検出可能な付随するｐＨ変化を測定することによってモニターすることができる。

ＰＣＲなどのような温度サイクリング増幅プロトコールは、どのポリメラーゼが増幅において使用されるかに関係なく、化学物質または蛍光色素を使用して、ｐＨ変化によってモニターすることができる。ＰＣＲは、Ｑ５（Ｒ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（Ｒ）ＤＮＡポリメラーゼ、ＯｎｅＴａｑ（Ｒ）などのようなポリメラーゼを利用してもよい（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ（Ｐｈｕｓｉｏｎは、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡの登録商標である。））。例外を伴うことなくこれらのポリメラーゼは、ＤＮＡを増幅し、色素によって検出される付随するｐＨ変化を伴う。実際に、任意の適したポリメラーゼが、ＤＮＡを増幅するために使用されてもよく、ｐＨ感受性指標色素を使用して次いで検出することができるプロトンの放出がもたらされる。

このＤＮＡ増幅検出方法の多くの適用がある。このＤＮＡ増幅検出方法は、標準的な分子生物学プロトコールにおいて増幅反応の成功を示す手段として使用することができ、ゲル電気泳動法の実行の必要性を不要にする。この検出は、プラスミド中に適正な挿入物を持つことについてコロニーをスクリーニングする際のように、所望のＤＮＡ種の存在または非存在の表示を含むことができる。種の検出は、特異的なＤＮＡまたはＲＮＡ標的種の存在または非存在を、サイクリングまたはインキュベーション時間の後の色変化によって示すことができるので、診断適用まで及ぶ。これは、特に、現場またはポイントオブケア試験において、ＬＡＭＰなどのような等温増幅方法に適する。色変化の迅速さおよびロバスト性（ｒｏｂｕｓｔｎｅｓｓ）は、最先端の機器を伴うことなく、素速く、診断標的の効率的な検出を可能にする。色または蛍光変化は、リアルタイムでモニターすることができ、このような情報が必要とされる標的核酸の量の定量化、例えばシークエンシングライブラリー調製、転写プロファイリングおよび装填物測定を可能にする。

このｐＨ依存性検出方法は、ＤＮＡシークエンシングなどのようなＤＮＡ合成を必要とする他の適用において使用することができる。それぞれのヌクレオチドの追加は、プロトンを生成し得、また、ＤＮＡのプールにおいて生成される全プロトンは、反応液を酸性にする要因となる。ｐＨにおけるこの変化は、ｐＨ感受性色素を使用して検出することができる。４つのｄＮＴＰのうちの１つについて順番に調べることにより、どの塩基を追加することができるかを決定し、従って、複数回の反応の後に配列の構築を可能にすると思われる。

緩衝剤は、典型的に、保存に向けて、反応混合物および構成成分に安定性をもたらす。本明細書において記載される検出方法は、増幅の間の適切な色変化のために、緩衝剤だけではなく、所望のｐＨ（典型的にアルカリ性）の維持を最小限しか必要としない、もしくは全く必要としない。酵素保存バッファーまたは反応溶液に存在する少量の緩衝剤は、この目的のために十分となり得、あるいはこの代わりに、反応混合物は、長期間の保存の間、安定性を維持するために凍結乾燥されてもよい。

本発明の実施形態は、核酸増幅の視覚的な検出のための、簡単で、安定な、迅速、高感度、費用効果的な手段を提供する。

本明細書において引用される参考文献はすべて、参照によって組み込まれる。

［実施例１］
ｐＨ感受性視覚的色素を使用するＬＡＭＰ増幅の検出
ＬＡＭＰ反応は、バッファーなし反応溶液：１０ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、５０ｍＭＫＣｌ、８ｍＭＭｇＳＯ_４、１．４ｍＭｄＮＴＰ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．５から１０、により実行した。最終バッファー濃度は、酵素保存バッファーキャリーオーバー由来の０．０２６ｍＭから０．４ｍＭＴｒｉｓであった。

反応は、ラムダファージＤＮＡアンプリコンについてのプライマーおよび５ｎｇのラムダＤＮＡにより実行した（図１Ａおよび図１Ｂ、図２Ａおよび図２Ｂ；ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）。反応は、ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ２．０）の存在下または非存在下において、示されるように５０μΜまたは１００μΜ ｐＨ指示薬と共に６５℃で３０から６０分間、インキュベートした。色変化は、ＤＮＡポリメラーゼの存在下においてのみ起こり、増幅が、視覚的な同定に十分なｐＨ低下をもたらしたことを示した。

図３Ａから図３Ｃにおいて、ＬＡＭＰ反応は、線虫ｌｅｃ−１０またはヒトＢＲＣＡ１配列標的のいずれかについてのプライマーによりバッファーなし反応溶液中で実行した。反応液は、８２．５ｎｇ線虫ＤＮＡ、１００ｎｇＨｅＬａＤＮＡ（＋Ｔｅｍｐ）を含有したまたはＤＮＡを含有しなかった（ＮＴＣ）。反応液は、ｐＨ指示薬の存在下において３０分間、６５℃でインキュベートし、鋳型ＤＮＡを含有するサンプルのみが、眼によって観察される色変化を示した。

図４Ａから図４Ｃにおいて、反応液は、ヒトＣＦＴＲについてのプライマーおよび様々な量の鋳型ＨｅＬａゲノムＤＮＡ（１００ｎｇから０．０１ｎｇ；２９０００から２．９コピー）を含有した。安定な色変化が、１５分間で、すべての指示薬で１００ｎｇから０．１ｎｇについてならびにクレゾールレッドおよびｍ−クレゾールパープル鋳型濃度についてすべての濃度で観察された。３０分後、すべての指示薬が、すべての鋳型濃度について色を変化させたが、ネガティブコントロール（鋳型ＤＮＡなし）は、初期高ｐＨ色のままであった。使用したＬＡＭＰプライマー配列は、以下の通りであった。

［実施例２］
ｐＨ感受性視覚的色素を使用するＰＣＲ増幅の検出
ＰＣＲ反応は、２５μｌ中、５００ｎＭのそれぞれｐＡＩＩ１７プラスミドＤＮＡ由来の１．２８７ｋｂ断片を増幅するフォワードおよびリバースプライマー、４００μΜのそれぞれの４つのｄＮＴＰ、１００μΜフェノールレッド、０．０２５μｌの１ＭＫＯＨ、１．８７５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用して、５０ｍＭＫＣｌおよび２．２５ｍＭＭｇＣｌ_２中で実行した。ＰＣＲ反応は、２分間９５℃、３６サイクルの１０秒間９５℃、１５秒間６２℃、３０秒間６８℃で実行した。ＰＣＲサイクリング前に、ＤＮＡ鋳型ありまたはなしのチューブはすべて、同じ淡紅色を有した。ＰＣＲ反応の終了時に、ＤＮＡ鋳型を有した三通りの反応（１、２および３と標識；図５）が淡紅色から黄色に色を変化させたが、ＤＮＡ鋳型なしの反応液（４、５および６と標識；図５）は、淡紅色のままであった。鋳型を含有する反応におけるＤＮＡ合成は、リアルタイムＰＣＲマシンおよびアガロースゲル電気泳動法を使用して確認した。従って、色変化は、ＰＣＲ反応の成功についての信頼できる視覚的な指示薬をもたらした。プライマー配列は、以下の通りであった。

［実施例３］
細菌コロニーにおけるプラスミドＤＮＡの視覚的な検出
ＰＣＲ反応は、特異的なプラスミドＤＮＡを持つように形質転換された大腸菌コロニーを同定するために、フェノールレッドの存在下において実行した。それぞれのコロニーのほんの一部を１０μｌ水中に懸濁し、１μｌをＰＣＲ反応に追加し、ＰＣＲ反応を実施例２において記載されるように実行した。６つのコロニーについて、ポジティブコントロール（＋）において使用されるものと同じプラスミドを持つプレート由来の３つのコロニー（１から３）および無関係なプラスミドを含有する細菌プレート由来の３つのコロニー（ａからｃ）で試験した。ポジティブコントロールにおいてのように、標的プラスミドＤＮＡを含有したチューブは、淡紅色から黄色に色を変化させた（図６）。無関係なプラスミドを含有するチューブは、ちょうど、いかなる鋳型も有していないチューブ（−）のように淡紅色のままであった。従って、これらのＰＣＲ反応における色変化は、特異的なプラスミドＤＮＡを含有するコロニーの決定を可能にした。このアプローチは、厄介で、時間のかかる、ＰＣＲ増幅を決定するためにアガロースゲル電気泳動法を使用する従来のステップを回避した。

［実施例４］
ｐＨ感受性視覚的色素を使用するＳＰＡ増幅の検出
ＳＤＡ反応は、バッファーなし反応溶液：８ｍＭＭｇＳＯ_４、５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．４ｍＭｄＡＴＰ、０．４ｍＭｄＧＴＰ、０．４ｍＭｄＴＴＰ、０．８ｍＭ２’−デオキシシチジン−５’−Ｏ−（１−チオトリホスフェート）（ｄＣＴＰ−αＳ；ＴｒｉＬｉｎｋＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）、０．５μΜ ＳＤＡプライマー、０．２Ｕ／μｌＢｓｏＢＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）、０．３２Ｕ／μｌＢｓｔ２．０、ｐＨ８．８中で実行した。最終バッファー濃度は、酵素保存バッファーキャリーオーバー由来の０．２３ｍＭＴｒｉｓであった。プライマー配列は、ヒトＢＲＣＡ１について設計し、ＢｓｏＢＩ制限部位を含有した。反応は、図７Ａおよび図Ｂにおいて示されるように、１００μΜ ｐＨ感受性色素の存在下において６５℃で６０分間、インキュベートし、Ｂｓｔ２．０ＤＮＡポリメラーゼを含有する反応のみが色を変化させた。これは、ｐＨ減少に基づく増幅の検出の成功を示した。プライマー配列は、以下の通りであった。

［実施例５］
ｐＨ感受性蛍光色素を使用するＬＡＭＰ増幅の検出
ＬＡＭＰ反応は、ラムダ（図８Ａから図８Ｃ）またはＣＦＴＲ（図９Ａから図９Ｃ）プライマーを使用して、実施例１におけるように、バッファーなし溶液中で実行した。ｐＨ感受性蛍光色素ＢＣＥＣＦ−ＡＭ（２μΜ）およびＳＮＡＲＦ−１（１０μΜ）を、ｐＨの減少を介して増幅をレポートするために使用した。蛍光測定は、ＦＡＭチャネル、ＢＣＥＣＦ−ＡＭ；ＲＯＸチャネル、ＳＮＡＲＦ−１高ｐＨ形態；ＨＥＸチャネル、ＳＮＡＲＦ−１低ｐＨ形態に対応する色素スペクトルによりＣＦＸ−９６リアルタイム蛍光計を使用して実行した。蛍光の損失（ＢＣＥＣＦ−ＡＭおよびＳＮＡＲＦ−１高ｐＨ形態）または蛍光の増加（ＳＮＡＲＦ−１低ｐＨ形態）によって測定されるｐＨの減少は、図８Ａから図８Ｃにおいて示されるように、増幅反応に対して特異的であり、ＤＮＡポリメラーゼを欠く反応は、バックグラウンドにおける有意な変化を示さなかった。蛍光変化までの時間は、急速であり（＜１０分間）、ＬＡＭＰ反応の能率およびスピードを示した。検出はまた、図９Ａから図９Ｃにおいて示されるように定量的でもあり、段階希釈ＨｅＬａ標的ＤＮＡ量の間で明らかな差異があった。

［実施例６］
ｐＨ感受性蛍光色素を使用するＰＣＲ増幅の検出
３つのペアのプライマーを、異なるサイズのアンプリコンを増幅するために使用した。３０９ｂｐおよび１２８７ｂｐ（ｐＡＩＩ１７プラスミドＤＮＡ由来）ならびに１１４ｂｐ（大腸菌ゲノムＤＮＡ由来）のアンプリコンは、１０μΜ ｐＨ感受性蛍光色素ＳＮＡＲＦ−１を視覚的色素フェノールレッドの代わりに反応に含めた以外は、実施例２におけるように実行したＰＣＲ反応において使用した。蛍光測定値は、ＣＦＸ９６マシンのＲＯＸチャネルで記録した。記録されたシグナルの著しい低下は、ＰＣＲサイクリングの間にＤＮＡ鋳型を含有する反応において観察された（図１０Ａ）。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡ鋳型を含有しなかった反応（ネガティブコントロール）は、熱サイクル由来のｐＨ変化と同じ速度でゆっくりと減少した。ネガティブコントロールからシグナルを差し引いた後に、鋳型を有する反応は、図１０Ｂにおける劇的なシグナル減少を示した。シグナル低下のレベルは、アンプリコンサイズに比例した。この実施例は、ｐＨ感受性蛍光色素が、リアルタイムでＰＣＲ反応をモニターするために使用することができることを実証した。上記に列挙される１２８７ｂｐプライマーに加えて、プライマー配列は以下の通りであった。

Claims

１ｍＭ未満のＴｒｉｓもしくは等価物の量で弱い緩衝剤を含有するまたは緩衝剤なしの調合物中に、ｐＨ感受性色素、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰを含む調製物。
プライマーをさらに含む、請求項１に記載の調製物。
鋳型ＤＮＡをさらに含む、請求項１または２に記載の調製物。
ｐＨ感受性色素が、視覚的に検出可能な有色色素または蛍光色素のいずれかである、請求項１から３のいずれかに記載の調製物。
核酸の増幅を検出するための方法であって、
弱緩衝または非緩衝液中に鋳型ＤＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼおよびｐＨ感受性色素を含有する増幅反応混合物を提供するステップならびに
標的ＤＮＡの増幅から結果として生じる色素のスペクトルまたは蛍光特性における変化を検出するステップ
を含む、方法。
増幅が、等温核酸増幅またはポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項５に記載の方法。
等温核酸増幅が、ループ媒介性等温増幅、ヘリカーゼ置換増幅、鎖置換増幅、レコンビナーゼポリメラーゼ増幅またはニッキング酵素増幅反応である、請求項５または６に記載の方法。
色素が、可溶性である、請求項７に記載の方法。
可溶性色素が、可視光線において検出可能な有色色素である、請求項７または８に記載の方法。
色素が、クレゾールレッド、フェノールレッド、ｍ−クレゾールパープル、ブロモクレゾールパープル、ニュートラルレッド、ナフトールフタレイン、チモールブルー、ナフトールフタレインから選択される、請求項７から９のいずれかに記載の方法。
色素が、蛍光色素である、請求項８に記載の方法。
蛍光色素が、２’，７’−ビス−（２−カルボキシエチル）−５−（および−６）−カルボキシフルオレセインまたはカルボキシルセミナフトロダフルオルである、請求項１１に記載の方法。
弱緩衝液が、１ｍＭ未満のＴｒｉｓバッファーまたは等価なバッファーを含む、請求項５から１２のいずれかに記載の方法。
増幅反応の前から後まで、ｐＨ感受性色素のスペクトルまたは蛍光特性における変化を比較するステップをさらに含む、請求項５から１３のいずれかに記載の方法。
標的配列がサンプル中に存在する場合に、標的配列の核酸増幅をモニターするための方法であって、増幅がサイクルの閾値数を超えて進むにつれて、標的配列の存在化においてｐＨの変化をモニターするステップを含み、モニターするステップが、ｐＨ感受性の有色色素または蛍光色素を反応混合物に追加することと、増幅前と比較した、増幅が起こった場合の色の変化を決定することによって達成される、方法。