KR20230110288A - Lna-변형된 프라이머를 사용하는 루프 매개 등온 핵산 증폭 (lamp) 및 증폭 생성물을 검출하기 위한 금속-기반 비색 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 F3 뉴클레오티드 서열 및/또는 상기 B3 뉴클레오티드 서열이 각각 상기 F3 뉴클레오티드 서열 또는 상기 B3 뉴클레오티드 서열의 처음 3분의 1 내에 위치한 하나 이상의 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 루프 매개 등온 증폭 (LAMP) 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 금속착색 지시약, 바람직하게는 5-Br-PAPS, 및 금속 이온, 바람직하게는 Zn2+ 이온의 사용을 특징으로 하는 핵산 서열 증폭 생성물을 검출하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 본 발명의 방법을 실시하기 위한 키트 및 상기 키트의 용도에 관한 것이다.
Description
본 출원은 본원에 참조로 편입된 컴퓨터 판독 가능한 형태의 서열 목록을 포함한다.
본 발명의 기술 분야
본 발명은 F3 뉴클레오티드 서열 및/또는 상기 B3 뉴클레오티드 서열은 각각 상기 F3 뉴클레오티드 서열 또는 상기 B3 뉴클레오티드 서열의 처음 3분의 1 내에 위치하는 하나 이상의 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 루프 매개 등온 증폭 (LAMP) 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 금속착색 지시약, 바람직하게는 5-Br-PAPS, 및 금속 이온, 바람직하게는 Zn2+ 이온의 사용을 특징으로 하는 핵산 서열 증폭 생성물을 검출하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 본 발명의 방법을 실시하기 위한 키트 및 상기 키트의 용도에 관한 것이다.
1980년대에 중합효소 연쇄 반응 (PCR)의 혁신적인 개발 이후, 핵산 증폭 시험 (NAAT)은 전체 생명과학 분야 전반에서 필수적인 도구가 되었으며, 심지어 특히 임상 응용분야에서, 또한 식품 품질 제어 및 환경 모니터링을 위한 핵산 분석의 최적 표준으로 성장되었다. 1995년과 2005년 사이에 나타난 놀라운 추세는 또한 PCR의 한계로 인해 유발된 등온 NAAT의 개발에서도 볼 수 있다. PCR 과정에서 열 순환 및 실시간 검출을 위해 요구되는 복잡하고 고비용의 장치는 이러한 증폭 방법의 사용을 제한한다. 등온 NAAT는 일정하고 적절한 온도에서 증폭 반응을 가능하게 한다. PCR과 비교하여 간단하고 저비용의 장치뿐만 아니라 빠른 처리 시간은 등온 NAAT를 점점 더 유리하게 만들고 현장 진단 (point-of-care, POC)/현장 사용 (point-of-need, PON) 시험의 분야에서 새로운 응용 기회를 창출한다.
문헌 [Notomi et al. (2000), Nucleic Acids Res., 28(12):e63]에 최초로 기재되었고 EP 1020534 B2 (이 둘 모두는 본원에 참조로 편입됨)에 참조된 루프-매개 등온 증폭 (LAMP)은 NAAT를 수행하기 위한 방법 중 하나이다.
그러나, 특히 프라이머의 특이성을 증가시키는 것에 의해 LAMP를 개선하기 위한 지속적인 필요성이 존재한다. 추가로, NAAT에서 사용될 수 있는 개선된 검출 방법을 위한 지속적인 필요성이 존재한다. 따라서, 기술적 문제점은 이러한 필요성을 따르는 것이다.
발명의 요약
기술적 문제점은 청구항에 정의된 주제에 의해 해결된다.
따라서, 본 발명은 루프 매개 등온 증폭 (LAMP) 방법에 관한 것이고, 이는
(i) 제1 내부 프라이머 (FIP) 뉴클레오티드 서열 및 제2 내부 프라이머 (BIP) 뉴클레오티드 서열,
(ii) 제1 외부 프라이머 (F3) 뉴클레오티드 서열 및 제2 외부 프라이머 (B3) 뉴클레오티드 서열로서, 상기 F3 뉴클레오티드 서열 및/또는 상기 B3 뉴클레오티드 서열은 각각 상기 F3 뉴클레오티드 서열 또는 상기 B3 뉴클레오티드 서열의 처음 3분의 1 내에 위치하는 하나 이상의 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 제1 외부 프라이머 (F3) 뉴클레오티드 서열 및 제2 외부 프라이머 (B3) 뉴클레오티드 서열,
(iii) 상기 주형 핵산으로부터 상보적 핵산 가닥을 합성하는 가닥-변위-유형 반응을 촉매화하는 DNA 중합효소, 및
(iv) 상기 DNA 중합효소에 대한 기질로서 역할을 하는 뉴클레오티드
를 포함하는 반응 혼합물에서,
적어도 FIP 뉴클레오티드 서열 및 BIP 뉴클레오티드 서열이 상기 주형 핵산에 포함된 그것의 상보적 뉴클레오티드 서열과 안정한 염기쌍을 형성할 수 있으면서 한편 DNA 중합효소 활성이 유지될 수 있는 이러한 온도에서 주형 핵산 서열로부터 핵산 서열을 합성하는 단계를 포함하고, 이에 의해 핵산 서열을 합성한다.
본 발명은 추가로 핵산 서열 증폭 생성물을 검출하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이고, 이는
(a) 주형 핵산 서열, 프라이머 뉴클레오티드 서열, 뉴클레오티드 및 상기 핵산 분자를 증폭할 수 있는 중합 효소를 포함하는 반응 혼합물을 금속착색 지시약 및 전이 또는 전이후 금속 이온과 접촉시키는 단계로서, 상기 금속착색 지시약 및 상기 전이 또는 전이후 금속 이온은 착물을 구성하지만 마그네슘과 착물을 구성하지 않는 것인 단계;
(b) 핵산 서열 증폭 생성물을 얻기 위한 적합한 조건하에서 상기 핵산 서열을 증폭시키는 단계;
(c) 표적 DNA의 증폭으로부터 생성된 착물의 스펙트럼 또는 형광 특성의 변화를 검출하는 단계를 포함한다.
본 발명은 추가로 주형 핵산 서열에 대한 루프 매개 등온 증폭 (LAMP)에 의해 핵산 서열을 합성하기 위한 키트에 관한 것이고, 이는
(i) 각각 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오티드를 포함하는, 제1 외부 프라이머 (F3) 뉴클레오티드 서열 및 제2 외부 프라이머 (B3) 뉴클레오티드 서열, 및/또는 임의로
(ii) 제1 내부 프라이머 (FIP) 뉴클레오티드 서열 및 제2 내부 프라이머 (BIP) 뉴클레오티드 서열, 및/또는 임의로
(iii) 상기 주형 핵산으로부터 상보적 핵산 가닥을 합성하는 가닥-변위-유형 반응을 촉매화하는 DNA 중합효소, 및/또는 임의로
(iv) 상기 DNA 중합효소에 대한 기질로서 역할을 하는 뉴클레오티드, 및/또는 임의로
(v) 금속착색 지시약, 바람직하게는 5-Br-PAPS; 및/또는 임의로
(vi) 금속 이온, 바람직하게는 Zn2+ 이온을 포함한다.
본 발명은 추가로 LAMP 방법의 본 발명의 방법을 수행하기 위한 본 발명의 키트의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 각각 비제한적인 실시예 및 첨부된 도면과 함께 고려할 때 상세한 설명을 참조하여 더 잘 이해될 것이다. 도면은 하기를 나타낸다:
도 1은 바람직한 킬레이트 측정 염료 (chelatometric dye) (5-Br-PAPS, PAR, 진콘(zincon)) 및 Mg2+의 존재하에서 바람직한 금속 이온 (Co2+, Cu2+, Fe2+, Ni2+, Rh2+, Zn2+)과의 이의 착물 형성의 실현가능성 시험을 나타낸다. 염료 및 금속 이온의 거의 모든 조합에 대해 착물 형성을 나타내는 심한 색상 변화 (도 1a-b)가 관찰되었다. 분광광도법 분석은 추가로 바람직한 염료 5-Br-PAPS의 착물이 염료의 동일한 농도에 대해 가장 높은 평균 흡광도 값을 나타내는 것을 입증하였다 (도 1c).
도 2는 피로포스페이트 (PPi) 농도와 관련된 바람직한 금속 이온과의 5-Br-PAPS 착물의 안정성을 나타낸다. 시각적 (도 2a) 및 스펙트럼 (2b) 변화 둘 모두는 PPi의 점진적으로 증가하는 농도 (0-20 mM, 좌측에서 우측)가 착물을 불안정하게 할 수 있고 이는 관측가능한 색상 변화를 야기하는 것을 나타내었다. 5-Br-PAPS 및 Zn2+의 착물은 PPi에 대해 훨씬 가장 민감하였고 이는 진행 중인 핵산 증폭 반응 과정에서 PPi 검출에 있어서의 그것의 잠재력을 강조한다.
도 3은 증폭 반응 과정에서 Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약의 색상 변화에 대한 제안된 메커니즘 (도 3a)뿐만 아니라 지원 데이터를 나타낸다. 구체적으로, 분광광도법 (도 3b) 및 시각적 (도 3c) 데이터는 25 또는 50 μM의 시약이 피로포스페이트 (PPi) 농도-의존적 방식으로 자홍색으로부터 주황색-노란색 (좌측으로부터 우측까지/짙은 색에서 밝은 색으로) 색상이 변화되는 것을 나타내고, 이는 일반적으로 뉴클레오티드를 핵산 가닥에 혼입하는 DNA 중합효소의 작용에 의해 생성된다.
도 4는 LAMP 증폭 반응 전과 후에 Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약의 색상 전이를 나타낸다. LAMP 및 RT-LAMP는 반응 혼합물에서 25 또는 50 μM의 Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약을 사용하여 각각 인간 RPP30 이중-가닥 (ds) DNA (도 4a) 및 SARS-CoV-2 N 유전자 단일-가닥 (ss) RNA (도 4b)를 증폭시키기 위해 사용되었다. 30분 후, Bst 2.0 중합효소를 사용한 샘플에서의 분명한 색상 변화는 이용되는 주형 유형과 관계없이 관찰될 수 있고 이는 색상 변화가 핵산 주형의 증폭에 특이적이고 가열에 기인한 것이 아님을 입증한다.
도 5는 Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약 색상 전이의 시간 경과를 나타낸다. 여기서, LAMP는 90분 과정에 걸쳐 인간 RPP30 dsDNA를 증폭시키기 위해 사용되었다. 자홍색으로부터 적색을 거쳐 주황색-노란색으로의 점진적인 색상 변화가 유일하게 주형 dsDNA를 가진 샘플에서만 관찰되었다. 증폭에 양성인 샘플은 LAMP 반응이 완료에 도달되기 전에도 NTC 샘플로부터 쉽게 구별될 수 있었다. 색상 전이가 25분 표시까지 완료되었지만, 검출 시약은 전체 90분 기간에 걸쳐 NTC 및 주형-함유 샘플 모두에서 그것의 색상이 유지되었다.
도 6은 중요 LAMP 증폭 파라미터에 대한 Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약의 효과를 나타낸다. 여기서, 45-분 RT-LAMP 반응을 수행하여 Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약을 사용하거나 사용하지 않고 SARS-CoV-2 RdRP 유전자를 표적화하였다. 일정 범위의 출발 주형 양이 사용되었고, 증폭은 핵산-삽입 염료, SYTO 59를 사용하여 형광적으로 모니터링되었다. 50 μM의 Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약의 포함은 증폭 곡선을 상당하게 변화시키지 않았고 (도 6a), 한편 반응 시간(time-to-reaction, TTR)은 단지 약간 연장되었다 (도 6b).
도 7은 도 6a-b에 기재된 바와 같은 동일한 실험의 주석 표시된 이미지이다. LAMP 증폭 후, Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약을 사용한 반응에서, NTC 반응의 색상이 자홍색으로 유지되는 한편, 모든 샘플은 출발 주형 양과 관계없이 주황색-노란색으로 색상이 변화되었다.
도 8은 PCR 증폭 방법을 사용하는 Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약의 성능을 나타낸다. 45 사이클 후, 25 μM의 Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약을 함유하는 반응은 유일하게 인간 RPP30의 후속 증폭이 일어날 때 dsDNA 주형을 함유하는 샘플에서만 자홍색으로부터 주황색-노란색으로 색상이 변화되었다.
도 9는 Zn2+/5-Br-PAPS, 페놀 레드 (pH-민감성 염료) 또는 5-Br-PAPS만을 갖는 마스터 혼합물의 LAMP 증폭 성능을 나타낸다. 30-분 LAMP 반응은 증폭을 핵산-삽입 염료, SYTO 59를 사용하여 실시간으로 모니터링하면서 인간 RPP30을 증폭시키기 위해 사용되었다. 모든 변이체는 Tris-HCl 농도와 관계없이 증폭을 나타내었으나 (도 9a) 더 높은 Tris-HCl 농도는 Zn2+/5-Br-PAPS 및 페놀 레드 둘 모두에 대해 더 적은 반응 시간 (TTR, 도 9b)을 나타내었다.
도 10은 도 9a-b에 기재된 바와 동일한 실험의 주석 표시된 이미지이다. 비색 검출약 (금속착색 지시약)으로서 페놀 레드를 사용하는 것에 의해 예시되는 pH-의존적 검출과 달리, Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약은 여전히 최대 20 mM Tris-HCl pH=7.9의 존재하에서도 성공적인 LAMP 증폭시 주황색-노란색으로 색상을 변화시켰다. 이러한 색상 변화는 5-Br-PAPS 그 자체로 색상 변화에 실패하였기 때문에 Zn2+의 존재에 의존적이었다.
도 11은 Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약의 나트륨 피로포스페이트-유도 색상 전이가 심지어 상이한 pH 버퍼의 첨가에도 유지되는 것을 나타낸다. 여기서, 모의 LAMP 샘플은 피로포스페이트 (PPi)를 사용하지 않은 샘플이 음성/사전-증폭 샘플을 나타내는 한편 피로포스페이트를 사용한 것은 증폭이 발생하는 샘플을 모사하는 방식으로 준비되었다. 분광광도법 (도 11a) 및 시각적 (도 11b) 데이터 둘 모두는 Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약의 거동이 다양한 pH 값을 갖는 25 % (v/v)의 10 mM 버퍼의 첨가에 의해 변화되지 않는다는 것을 나타낸다.
도 12는 상이한 pH 수준으로 완충된 입력 샘플을 사용한 LAMP 증폭 반응에서의 Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약의 성능을 나타낸다. 30-분 LAMP 증폭 반응은 증폭이 핵산-삽입 염료, SYTO 59로 실시간 모니터링되면서 인간 RPP30 게놈 DNA (gDNA)를 표적화하는 프라이머 세트로 수행되었다. 상이한 pH 버퍼로 제조된 주형을 사용한 샘플은 증폭 (도 12a), 반응 시간(TTR, 도 12b) 또는 생성된 색상 변화 (도 12c)에 부정적인 영향을 미치지 않았다.
도 13은 LAMP에서 외부 F3/B3 프라이머의 LNA 변형이 LAMP 반응 성능에서의 보편적인 개선을 야기하는 것을 나타낸다. 3개의 별개의 SARS-CoV-2 유전자를 표적화하는 4개의 상이한 F3/B3 프라이머 세트는 더 빠른 반응 동역학 (더 짧은 반응 시간, TTR), 더 작은 증폭 분산 (표준 편차, SD; 데이터 포인트 스프레드) 및 증가된 감도 (더 많은 증폭된 복제)를 입증한다. 괄호 내의 숫자는 총 복제 수 중에서 증폭된 복제 수를 나타낸다. 점선은 LNA 프라이머 세트가 없는 평균 TTR을 나타내고; 점선 위 및 아래의 데이터 포인트는 각각 무 LNA 프라이머 세트의 평균 TTR의 것보다 더 느리고 더 빠르다. E1 및 E2, SARS-CoV-2 엔벨로프 유전자 프라이머 세트 1 및 2; R1, SARS-CoV-2 RNA-의존적 RNA 중합효소 유전자 프라이머 세트 1; N1, SARS-CoV-2 핵단백질 유전자 프라이머 세트 1; NTC, 무주형 대조군(no template control).
도 14는 상이한 변형된 F3/B3 프라이머의 복수의 조합들 모두는 더 빠른 반응 시간 (TTR), 감소된 증폭 분산 (표준 편차, SD), 및 일부 경우에서 향상된 감도에 의해 나타난 바와 같은 LAMP 증폭 개선을 야기하는 것을 나타낸다. RT-LAMP는 SARS-CoV-2 E 유전자에서의 영역을 증폭시키기 위해 사용되었다. 시험된 F3 및 B3 프라이머의 염기 서열은 동일하였고; 유일하게 LNA 치환의 위치/수만 상이하였다. E3, SARS-CoV-2 엔벨로프 유전자 프라이머 세트 3.
도 15는 LNA 변형의 도입에 대해 긍정적으로 반응하는 유일한 프라이머임을 나타낸다. FIP, BIP, LF 및 LB 프라이머는 F3/B3 프라이머와 유사하게 변형되었으며 이러한 변형된 세트는 SARS-CoV-2 E 유전자의 일부를 증폭하기 위해 사용되었다. 모든 시험된 세트 변이체는 증가된 분산 (표준 편차, SD), 더 느린 반응 시간 (TTR), 및 비특이적 증폭에 의해 입증되는 바와 같이 검정 성능의 저하를 보였다.
도 1은 바람직한 킬레이트 측정 염료 (chelatometric dye) (5-Br-PAPS, PAR, 진콘(zincon)) 및 Mg2+의 존재하에서 바람직한 금속 이온 (Co2+, Cu2+, Fe2+, Ni2+, Rh2+, Zn2+)과의 이의 착물 형성의 실현가능성 시험을 나타낸다. 염료 및 금속 이온의 거의 모든 조합에 대해 착물 형성을 나타내는 심한 색상 변화 (도 1a-b)가 관찰되었다. 분광광도법 분석은 추가로 바람직한 염료 5-Br-PAPS의 착물이 염료의 동일한 농도에 대해 가장 높은 평균 흡광도 값을 나타내는 것을 입증하였다 (도 1c).
도 2는 피로포스페이트 (PPi) 농도와 관련된 바람직한 금속 이온과의 5-Br-PAPS 착물의 안정성을 나타낸다. 시각적 (도 2a) 및 스펙트럼 (2b) 변화 둘 모두는 PPi의 점진적으로 증가하는 농도 (0-20 mM, 좌측에서 우측)가 착물을 불안정하게 할 수 있고 이는 관측가능한 색상 변화를 야기하는 것을 나타내었다. 5-Br-PAPS 및 Zn2+의 착물은 PPi에 대해 훨씬 가장 민감하였고 이는 진행 중인 핵산 증폭 반응 과정에서 PPi 검출에 있어서의 그것의 잠재력을 강조한다.
도 3은 증폭 반응 과정에서 Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약의 색상 변화에 대한 제안된 메커니즘 (도 3a)뿐만 아니라 지원 데이터를 나타낸다. 구체적으로, 분광광도법 (도 3b) 및 시각적 (도 3c) 데이터는 25 또는 50 μM의 시약이 피로포스페이트 (PPi) 농도-의존적 방식으로 자홍색으로부터 주황색-노란색 (좌측으로부터 우측까지/짙은 색에서 밝은 색으로) 색상이 변화되는 것을 나타내고, 이는 일반적으로 뉴클레오티드를 핵산 가닥에 혼입하는 DNA 중합효소의 작용에 의해 생성된다.
도 4는 LAMP 증폭 반응 전과 후에 Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약의 색상 전이를 나타낸다. LAMP 및 RT-LAMP는 반응 혼합물에서 25 또는 50 μM의 Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약을 사용하여 각각 인간 RPP30 이중-가닥 (ds) DNA (도 4a) 및 SARS-CoV-2 N 유전자 단일-가닥 (ss) RNA (도 4b)를 증폭시키기 위해 사용되었다. 30분 후, Bst 2.0 중합효소를 사용한 샘플에서의 분명한 색상 변화는 이용되는 주형 유형과 관계없이 관찰될 수 있고 이는 색상 변화가 핵산 주형의 증폭에 특이적이고 가열에 기인한 것이 아님을 입증한다.
도 5는 Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약 색상 전이의 시간 경과를 나타낸다. 여기서, LAMP는 90분 과정에 걸쳐 인간 RPP30 dsDNA를 증폭시키기 위해 사용되었다. 자홍색으로부터 적색을 거쳐 주황색-노란색으로의 점진적인 색상 변화가 유일하게 주형 dsDNA를 가진 샘플에서만 관찰되었다. 증폭에 양성인 샘플은 LAMP 반응이 완료에 도달되기 전에도 NTC 샘플로부터 쉽게 구별될 수 있었다. 색상 전이가 25분 표시까지 완료되었지만, 검출 시약은 전체 90분 기간에 걸쳐 NTC 및 주형-함유 샘플 모두에서 그것의 색상이 유지되었다.
도 6은 중요 LAMP 증폭 파라미터에 대한 Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약의 효과를 나타낸다. 여기서, 45-분 RT-LAMP 반응을 수행하여 Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약을 사용하거나 사용하지 않고 SARS-CoV-2 RdRP 유전자를 표적화하였다. 일정 범위의 출발 주형 양이 사용되었고, 증폭은 핵산-삽입 염료, SYTO 59를 사용하여 형광적으로 모니터링되었다. 50 μM의 Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약의 포함은 증폭 곡선을 상당하게 변화시키지 않았고 (도 6a), 한편 반응 시간(time-to-reaction, TTR)은 단지 약간 연장되었다 (도 6b).
도 7은 도 6a-b에 기재된 바와 같은 동일한 실험의 주석 표시된 이미지이다. LAMP 증폭 후, Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약을 사용한 반응에서, NTC 반응의 색상이 자홍색으로 유지되는 한편, 모든 샘플은 출발 주형 양과 관계없이 주황색-노란색으로 색상이 변화되었다.
도 8은 PCR 증폭 방법을 사용하는 Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약의 성능을 나타낸다. 45 사이클 후, 25 μM의 Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약을 함유하는 반응은 유일하게 인간 RPP30의 후속 증폭이 일어날 때 dsDNA 주형을 함유하는 샘플에서만 자홍색으로부터 주황색-노란색으로 색상이 변화되었다.
도 9는 Zn2+/5-Br-PAPS, 페놀 레드 (pH-민감성 염료) 또는 5-Br-PAPS만을 갖는 마스터 혼합물의 LAMP 증폭 성능을 나타낸다. 30-분 LAMP 반응은 증폭을 핵산-삽입 염료, SYTO 59를 사용하여 실시간으로 모니터링하면서 인간 RPP30을 증폭시키기 위해 사용되었다. 모든 변이체는 Tris-HCl 농도와 관계없이 증폭을 나타내었으나 (도 9a) 더 높은 Tris-HCl 농도는 Zn2+/5-Br-PAPS 및 페놀 레드 둘 모두에 대해 더 적은 반응 시간 (TTR, 도 9b)을 나타내었다.
도 10은 도 9a-b에 기재된 바와 동일한 실험의 주석 표시된 이미지이다. 비색 검출약 (금속착색 지시약)으로서 페놀 레드를 사용하는 것에 의해 예시되는 pH-의존적 검출과 달리, Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약은 여전히 최대 20 mM Tris-HCl pH=7.9의 존재하에서도 성공적인 LAMP 증폭시 주황색-노란색으로 색상을 변화시켰다. 이러한 색상 변화는 5-Br-PAPS 그 자체로 색상 변화에 실패하였기 때문에 Zn2+의 존재에 의존적이었다.
도 11은 Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약의 나트륨 피로포스페이트-유도 색상 전이가 심지어 상이한 pH 버퍼의 첨가에도 유지되는 것을 나타낸다. 여기서, 모의 LAMP 샘플은 피로포스페이트 (PPi)를 사용하지 않은 샘플이 음성/사전-증폭 샘플을 나타내는 한편 피로포스페이트를 사용한 것은 증폭이 발생하는 샘플을 모사하는 방식으로 준비되었다. 분광광도법 (도 11a) 및 시각적 (도 11b) 데이터 둘 모두는 Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약의 거동이 다양한 pH 값을 갖는 25 % (v/v)의 10 mM 버퍼의 첨가에 의해 변화되지 않는다는 것을 나타낸다.
도 12는 상이한 pH 수준으로 완충된 입력 샘플을 사용한 LAMP 증폭 반응에서의 Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약의 성능을 나타낸다. 30-분 LAMP 증폭 반응은 증폭이 핵산-삽입 염료, SYTO 59로 실시간 모니터링되면서 인간 RPP30 게놈 DNA (gDNA)를 표적화하는 프라이머 세트로 수행되었다. 상이한 pH 버퍼로 제조된 주형을 사용한 샘플은 증폭 (도 12a), 반응 시간(TTR, 도 12b) 또는 생성된 색상 변화 (도 12c)에 부정적인 영향을 미치지 않았다.
도 13은 LAMP에서 외부 F3/B3 프라이머의 LNA 변형이 LAMP 반응 성능에서의 보편적인 개선을 야기하는 것을 나타낸다. 3개의 별개의 SARS-CoV-2 유전자를 표적화하는 4개의 상이한 F3/B3 프라이머 세트는 더 빠른 반응 동역학 (더 짧은 반응 시간, TTR), 더 작은 증폭 분산 (표준 편차, SD; 데이터 포인트 스프레드) 및 증가된 감도 (더 많은 증폭된 복제)를 입증한다. 괄호 내의 숫자는 총 복제 수 중에서 증폭된 복제 수를 나타낸다. 점선은 LNA 프라이머 세트가 없는 평균 TTR을 나타내고; 점선 위 및 아래의 데이터 포인트는 각각 무 LNA 프라이머 세트의 평균 TTR의 것보다 더 느리고 더 빠르다. E1 및 E2, SARS-CoV-2 엔벨로프 유전자 프라이머 세트 1 및 2; R1, SARS-CoV-2 RNA-의존적 RNA 중합효소 유전자 프라이머 세트 1; N1, SARS-CoV-2 핵단백질 유전자 프라이머 세트 1; NTC, 무주형 대조군(no template control).
도 14는 상이한 변형된 F3/B3 프라이머의 복수의 조합들 모두는 더 빠른 반응 시간 (TTR), 감소된 증폭 분산 (표준 편차, SD), 및 일부 경우에서 향상된 감도에 의해 나타난 바와 같은 LAMP 증폭 개선을 야기하는 것을 나타낸다. RT-LAMP는 SARS-CoV-2 E 유전자에서의 영역을 증폭시키기 위해 사용되었다. 시험된 F3 및 B3 프라이머의 염기 서열은 동일하였고; 유일하게 LNA 치환의 위치/수만 상이하였다. E3, SARS-CoV-2 엔벨로프 유전자 프라이머 세트 3.
도 15는 LNA 변형의 도입에 대해 긍정적으로 반응하는 유일한 프라이머임을 나타낸다. FIP, BIP, LF 및 LB 프라이머는 F3/B3 프라이머와 유사하게 변형되었으며 이러한 변형된 세트는 SARS-CoV-2 E 유전자의 일부를 증폭하기 위해 사용되었다. 모든 시험된 세트 변이체는 증가된 분산 (표준 편차, SD), 더 느린 반응 시간 (TTR), 및 비특이적 증폭에 의해 입증되는 바와 같이 검정 성능의 저하를 보였다.
본 발명은 하기에 상세하게 기재되어 있고, 또한 첨부된 실시예 및 도면에 의해 예시된다.
이와 같은 LAMP는 예를 들어 이미 EP 1020534 B2에 기재되어 있고, 이는 본원에 참조로 편입되어 있다. 그러나, 선행 기술은 LAMP에서의 잠금 핵산 (LNA) 프라이머의 성공적인 응용을 나타내는 데 실패하였다. 그러나, 발명자들은 놀랍게도 F3/B3 프라이머에서의 잠금 핵산 (LNA)의 사용이 추가로 LAMP를 개선하는 것을 발견하였다. 실시예 5에 나타난 바와 같이, 3/B3 프라이머에서의 LNA의 사용은 반응 시간을 감소시키고, 재현가능성 및 감도를 개선한다. 흥미롭게도, 이러한 효과는 유일하게 LNA가 F3 또는 B3 프라이머의 처음 3분의 1 내에 위치할 때 나타난다.
따라서, 본 발명은 LAMP 방법에 관한 것이며, 이는
(i) 제1 내부 프라이머 (FIP) 뉴클레오티드 서열 및 제2 내부 프라이머 (BIP) 뉴클레오티드 서열,
(ii) 제1 외부 프라이머 (F3) 뉴클레오티드 서열 및 제2 외부 프라이머 (B3) 뉴클레오티드 서열로서, 상기 F3 뉴클레오티드 서열 및/또는 상기 B3 뉴클레오티드 서열은 각각 상기 F3 뉴클레오티드 서열 또는 상기 B3 뉴클레오티드 서열의 처음 3분의 1 내에 위치하는 하나 이상의 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 제1 외부 프라이머 (F3) 뉴클레오티드 서열 및 제2 외부 프라이머 (B3) 뉴클레오티드 서열,
(iii) 상기 주형 핵산으로부터 상보적 핵산 가닥을 합성하는 가닥-변위-유형 반응을 촉매화하는 DNA 중합효소, 및
(iv) 상기 DNA 중합효소에 대한 기질로서 역할을 하는 뉴클레오티드
를 포함하는 반응 혼합물에서,
적어도 FIP 뉴클레오티드 서열 및 BIP 뉴클레오티드 서열이 상기 주형 핵산에 포함된 그것의 상보적 뉴클레오티드 서열과 안정한 염기쌍을 형성할 수 있으면서 한편 DNA 중합효소 활성이 유지될 수 있는 이러한 온도에서 주형 핵산 서열로부터 핵산 서열을 합성하는 단계를 포함하고, 이에 의해 핵산 서열을 합성한다.
일 구현예에서, 상기 F3 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 LNA 뉴클레오티드를 포함한다. 추가의 구현예에서, 상기 B3 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 LNA 뉴클레오티드를 포함한다. 추가의 구현예에서, 상기 F3 뉴클레오티드 서열 및 상기 B3 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 LNA 뉴클레오티드를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은 "루프 매개 등온 증폭" (LAMP)은 핵산의 증폭을 위한 (단일-튜브) 기술에 관한 것이다. 역전사 루프-매개 등온 증폭 (RT-LAMP)은 LAMP와 (동시) 역전사를 조합하여 RNA의 검출이 가능하게 한다. LAMP는 등온 핵산 증폭 기술이다. 반응이 일련의 교대되는 온도 단계 또는 사이클로 실시되는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 기술과 대조적으로, 등온 증폭은 일정한 온도에서 실시되고, 열 사이클러(thermal cycler)를 필요로 하지 않는다. LAMP는 본 기술분야의 당업자에게 알려져 있다. 이 맥락에서, 본 발명자는 예시적으로 LAMP가 상세하게 기재된 EP 1 020 534 B2를 참조한다. 특히, 본 발명자는 단락 [0038] 내지 [0054]를 참조하고, 이는 EP 1 020 534 B2의 상기 단락에 언급된 도면을 포함하여 참조로 편입되어 있다.
본원에 사용되는 바와 같은 가교 핵산 (BNA)으로도 알려지고, 종종 비접근성 RNA로 지칭되는 잠금 핵산 (LNA)은 변형된 RNA 또는 DNA, 바람직하게는 DNA, 뉴클레오티드 (이의 리보오스 모이어티가 2' 산소와 4' 탄소를 연결하는 여분의 가교로 변형됨)와 관련될 수 있다. 가교는 3'-엔도 (노스) 구조에 리보오스를 "잠금다". 가교는 2' 산소 및 4' 산소에 공유적으로 결합되고, 이에 의해 두 산소 원자를 가교시키는 메틸기일 수 있다. LNA는 상업적으로 이용가능하고 그의 합성 방법은 문헌 [Obika et al. (1997), Tetrahedron Letters, 38(50):8735-8738]에 예시적으로 기재되어 있다. LNA-변형된 염기는 아데닌 (+A), 시토신 (+C), 구아닌 (+G), 티민 (+T), 및 우라실 (+U), 바람직하게는 +A 및 +T를 포함한다. 바람직하게는, 상기 F3 뉴클레오티드 서열은 1-5개, 바람직하게는 3개의 LNA 뉴클레오티드를 포함한다. 바람직하게는, 상기 B3 뉴클레오티드 서열은 1-5개, 바람직하게는 3개의 LNA 뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 LAMP 방법에 의해 합성된 핵산은 단일-가닥 사슬에서 교번되어 연결된 상보적 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 생성할 수 있다. 이러한 핵산은 단일-가닥 사슬에서 나란하게 연결된 상호 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 추가로, 본 발명에서, 이는 상보적 사슬 간에 루프를 형성하기 위한 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 본 발명에서, 이 서열은 루프-형성 서열로 지칭된다. 본 발명에 의해 합성된 핵산은 루프-형성 서열을 통해 연결된 상호 상보적인 사슬로 실질적으로 구성된다. 일반적으로, 염기쌍의 해리시 2개 이상의 분자로 분리되지 않는 가닥은 그것이 염기쌍을 부분적으로 수반하거나 수반하지 않는지 여부와 무관하게 단일-가닥 사슬로 지칭된다. 상보적 뉴클레오티드 서열은 동일한 사슬에 염기쌍을 형성할 수 있다. 본 발명에 따른 단일-가닥 사슬에서 교번되어 연결되는 상보적 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산이 동일한 사슬 내에 염기쌍을 이루게 함으로써 얻을 수 있는 분자내 염기쌍 생성물은 명백한 이중-가닥 사슬 및 염기쌍을 수반하지 않는 루프를 구성하는 영역을 제공한다.
즉, 본 발명에 따른 단일-가닥 사슬에서 교번되어 연결되는 상보적 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산은 동일한 사슬 내에서 어닐링될 수 있는 상보적 뉴클레오티드 서열을 함유하고, 그것의 어닐링된 생성물은 굽혀진 힌지 부분에서 염기쌍을 수반하지 않는 루프를 구성하는 단일-가닥 핵산으로서 정의될 수 있다. 이에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 뉴클레오티드는 염기쌍을 수반하지 않는 루프에 대해 어닐링될 수 있다. 루프-형성 서열은 임의의 뉴클레오티드 서열일 수 있다. 루프-형성 서열은 변위(displacement)를 위한 상보적 사슬의 합성을 개시하도록 염기쌍을 이룰 수 있고, 바람직하게는 특이적 어닐링을 달성하기 위해 다른 영역에 위치하는 뉴클레오티드 서열과 구별될 수 있는 서열을 제공한다. 예를 들어, 본 발명에서, 루프-형성 서열은 주형으로서 핵산으로부터 유도되는 동일한 사슬에서 어닐링되는 영역 (즉, F1c 또는 B1c)의 3'-측에 위치한 영역 F2c (또는 B2c)와 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 함유한다.
본 발명에서, 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열은 하기와 같이 정의된다. 즉, 주형으로서 특정 서열을 사용하여 합성된 상보적 사슬이 표적 뉴클레오티드 서열에 대해 어닐링되어 상보적 사슬의 합성의 기점을 제공하는 경우, 이러한 특정 서열은 표적 뉴클레오티드 서열과 실질적으로 동일하다. 예를 들어, F2와 실질적으로 동일한 서열은 F2와 완전하게 동일한 뉴클레오티드 서열뿐만 아니라 F2에 대해 어닐링될 수 있는 뉴클레오티드 서열을 제공하고 상보적 사슬의 합성의 기점으로서 작용하는 주형으로서 기능을 할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 발명에서 용어 "어닐링"은 왓슨-크릭 염기쌍(Watson-Crick base pairing) 형성 법칙에 기초하는 염기쌍 형성을 통한 핵산의 이중-가닥 구조의 형성을 의미한다. 따라서, 심지어 염기쌍을 구성하는 핵산 사슬이 단일-가닥 사슬일지라도, 어닐링은 분자내 상보적 뉴클레오티드 서열이 염기쌍을 이루는 경우에 일어난다. 본 발명에서, 어닐링 및 혼성화는 핵산이 염기쌍 형성을 통해 이중-가닥 구조를 구성한다는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 발명에 따른 핵산을 구성하는 상보적 뉴클레오티드 서열의 쌍의 수는 적어도 1이다. 본 발명의 요망되는 방식에 따라, 이는 2 이상일 수 있다. 이러한 경우, 핵산을 구성하는 상보적 뉴클레오티드 서열의 상의 수는 이론적으로 상한값이 없다. 본 발명의 합성 생성물로서의 핵산이 복수의 세트의 상보적 뉴클레오티드 서열로 구성되는 경우, 이 핵산은 반복되는 동일한 뉴클레오티드 서열로 구성된다.
본 발명에 의해 합성되는 핵산 (단일-가닥 사슬에서 교번되어 연결되는 상보적 뉴클레오티드 서열을 가짐)은 자연 발생 핵산과 동일한 구조를 가지지 않을 수 있다. 뉴클레오티드 유도체가 기질로서 사용된다면, 핵산이 DNA 중합효소의 작용에 의해 합성될 때, 핵산 유도체가 합성될 수 있는 것으로 알려져 있다. 사용되는 뉴클레오티드 유도체는 방사성동위원소로 표지된 뉴클레오티드 또는 결합 리간드 예컨대 비오틴 또는 디곡시제닌으로 표지된 뉴클레오티드 유도체를 포함할 수 있다. 이러한 뉴클레오티드 유도체는 생성물로서 핵산 유도체를 표지하기 위해 사용될 수 있다. 대안적으로, 형광성 뉴클레오티드가 기질로서 사용되는 경우, 생성물로서 핵산이 형광성 유도체일 수 있다. 추가로, 이러한 생성물은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 어느 것이 형성되는지 여부는 프라이머의 구조의 조합, 중합을 위한 기질의 유형, 및 핵산의 중합을 실시하기 위한 중합 시약의 조성물에 의해 결정된다.
상기 기재된 구조를 갖는 핵산의 합성은 가닥 변위 활성을 갖는 DNA 중합효소, 및 이의 3'-말단에서 동일한 사슬에 일부 F1c에 대해 어닐링될 수 있는 영역 F1이 제공되고, F1c에 대해 영역 F1의 어닐링시 염기쌍을 형성할 수 있는 영역 F2c를 함유하는 루프를 형성할 수 있는 핵산의 사용에 의해 개시될 수 있다. 상보적 사슬의 합성 반응에 대한 여러 보고들이 존재하며, 여기서 헤어핀 루프가 형성되고, 샘플 서열 자체는 주형으로서 사용되고, 한편 본 발명에서 헤어핀 루프의 일부에 염기쌍을 형성할 수 있는 영역이 제공되며, 상보적 사슬을 합성하는 데 있어서 이러한 영역의 이용에 대한 신규한 특징이 존재한다. 합성 기점으로서 이러한 영역을 사용함으로써, 주형으로서 샘플 서열 자체로 미리 합성된 상보적 사슬이 변위된다. 이후, 변위된 사슬의 3'-말단에 위치한 영역 B1c (임의의 영역)은 염기쌍 형성을 위해 준비된 상태로 존재한다. 이러한 B1c에 대한 상보적 서열을 갖는 영역은 이에 대해 어닐링되어, F1으로부터 B1c로 연장되는 뉴클레오티드 서열 및 루프-형성 서열을 통해 교번되어 연결되는 이의 상보적 사슬을 갖는 핵산 (2개 분자)의 형성이 이루어진다. 본 발명에서, 임의의 영역 예컨대 상기 B1c는 그것이 그 영역에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 대해 어닐링될 수 있고, 합성 기점으로서 폴리뉴클레오티드를 사용하여 합성된 상보적 사슬이 본 발명에 대한 필요한 기능을 갖는 경우에 임의로 선택될 수 있다.
본 발명에서, 용어 "핵산"이 사용된다. 본 발명에서의 핵산은 일반적으로 DNA 및 RNA 둘 모두를 포함한다. 그러나, 그의 뉴클레오티드가 인공적 유도체에 의해 대체되는 핵산 또는 천연 DNA 또는 RNA로부터의 변형된 핵산이 또한 그것이 상보적 사슬의 합성을 위한 주형으로 기능을 하는 한 본 발명의 핵산에 포함된다. 본 발명의 핵산은 생물학적 샘플에 함유될 수 있다. 생물학적 샘플은 동물, 식물 또는 미생물 조직, 세포, 배양물 및 배설물 또는 이들로부터의 추출물을 포함한다. 본 발명의 생물학적 샘플은 바이러스 또는 마이코플라스마와 같은 세포내 기생 게놈 DNA 또는 RNA를 포함할 수 있다. 예시적인 바이러스는 SAR-CoV-2일 수 있다. 본 발명의 핵산은 상기 생물학적 샘플에 함유된 핵산으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, mRNA로부터 합성된 cDNA, 또는 생물학적 샘플로부터 유래된 핵산에 기초하여 증폭된 핵산은 본 발명의 핵산의 전형적인 예이다. 핵산은 DNA일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "주형"은 상보적 사슬을 합성하기 위한 주형으로서 역할을 하는 핵산과 관련될 수 있다. 주형에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖는 상보적 사슬은 주형에 상응하는 사슬과 관련되지만, 둘 간의 관계는 단지 상대적일 뿐이다. 즉, 상보적 사슬로서 합성된 사슬은 마찬가지로 주형으로서 기능을 할 수 있다. 즉, 상보적 사슬은 주형이 될 수 있다. 바람직하게는, 주형 핵산 서열은 단일 가단 또는 이중 가닥이다. 바람직하게는, 주형 핵산 서열은 단일- 또는 이중-가닥 DNA, RNA 또는 DNA/RNA 키메라이다. RT-LAMP의 맥락에서, 주형은 바람직하게는 RNA이다.
바람직하게는, 상기 FIP 뉴클레오티드 서열은 적어도 2개의 영역 F2 및 F1c를 포함하고, 여기서 상기 F1c 영역은 F2 영역의 5'-측에 연결되고, 상기 F2 영역은 상기 주형 핵산 서열에서 임의의 영역 F2c에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가지며, 상기 F1c 영역은 상기 주형 핵산 서열에서 상기 F2c 영역의 5'-측에 위치하는 영역 F1c와 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
바람직하게는, 상기 BIP 뉴클레오티드 서열은 적어도 2개의 영역 B2 및 B1c를 포함하고, 여기서 상기 B1c 영역은 B2 영역의 5'-측에 연결되고, 상기 B2 영역은 상기 주형 핵산 서열 가닥에서 임의의 영역 B2c에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가지며, 상기 B1c 영역은 상기 주형 핵산 서열에서 상기 영역 B2c의 5'-측에 위치하는 영역 B1c와 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
바람직하게는, 상기 F3 뉴클레오티드 서열은 상기 주형 핵산 서열에서 영역 F3c에 대해 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가지며, 여기서 영역 F3c는 상기 주형 핵산 서열에서 영역 F2c의 3'-측에 위치하며, 영역 F2c는 상기 주형 핵산 서열에서 영역 F1c의 3'-측에 위치한다.
바람직하게는, 상기 B3 뉴클레오티드 서열은 주형 핵산 서열에서 영역 B3c에 대해 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 가지며, 여기서 영역 B3c는 상기 주형 핵산 서열에서 영역 B2c의 3'-측에 위치하며, 영역 B2c는 상기 주형 핵산 서열에서 영역 B1c의 3'-측에 위치한다.
바람직하게는, 상기 반응 혼합물은 추가로 루프 프라이머 뉴클레오티드 서열 F 및/또는 루프 프라이머 뉴클레오티드 서열 B를 포함한다. 문헌 [Nagamine et al. (2002), Mol. Cell. Probes 16(3): 223-229]은 예시적인 루프 프라이머 뉴클레오티드 서열을 기재하고 있다.
바람직하게는, 상기 반응 혼합물은 추가로 스템 프라이머 뉴클레오티드 서열 F 및/또는 스템 프라이머 뉴클레오티드 서열 B를 포함한다. 문헌 [Gandelman et al. (2011), Int. J. Mol. Sci. 12: 9108-9124]은 예시적인 스템 프라이머 뉴클레오티드 서열을 기재하고 있다.
바람직하게는, 상기 반응 혼합물은 추가로 스웜 프라이머 뉴클레오티드 서열 F1S 및/또는 스웜 프라이머 뉴클레오티드 서열 B1S를 포함한다. 문헌 [Martineau et al. (2017), Anal. Chem. 89(1): 625-632]은 예시적인 스웜 프라이머 뉴클레오티드 서열을 기재하고 있다.
바람직하게는, 상기 반응 혼합물은 적어도 추가의 제1 내부 프라이머 (FIP2) 뉴클레오티드 서열 및 추가의 제2 내부 프라이머 (BIP2) 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 이 둘 모두는 상기 FIP 및 BIP 뉴클레오티드 서열과 상이하다. 문헌 [Wang et al. (2015), Molecules 20: 21515-21531]은 예시적인 추가의 제1 또는 제2 내부 프라이머 뉴클레오티드 서열을 기재하고 있다.
바람직하게는, 상기 반응 혼합물은 다중 교차 변위 증폭 LAMP로서 상기 방법을 수행하기 위한 프라이머 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 문헌 [Wang et al. (2015), Sci Rep. 5: 11902]은 예시적인 다중 교차 변위 증폭 LAMP를 기재하고 있다.
바람직하게는, 상기 반응 혼합물은 역전사 등온 다중 셀프 매칭 LAMP(reverse transcription isothermal 다중 셀프 매칭 LAMP)로서 상기 방법을 수행하기 위한 프라이머 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 문헌 [Ding et al. (2014), J. Clin. Microbiol. 52(6): 1862-1870]은 예시적인 역전사 등온 다중 셀프 매칭 LAMP를 개시하고 있다.
본 발명에 따른 핵산을 합성하기 위한 방법은 상보적 사슬의 합성을 위한 가닥 변위-유형 반응을 촉매화하는 DNA 중합효소에 의해 지원된다. 하나의 종류의 DNA 중합효소를 사용하는 것이 유리하다. 예시적인 적합한 중합효소는 하기에 열거되어 있다. 추가로, 이러한 효소의 다양한 돌연변이체는 그것이 상보적 사슬의 합성을 위한 서열-의존적 활성 및 가닥 변위 활성 둘 모두를 가지는 한 본 발명에 이용될 수 있다. 본원에 언급되는 돌연변이체는 효소의 요구되는 촉매 활성을 일으키는 구조를 유일하게 갖는 것 또는 예를 들어 아미노산에서의 돌연변이에 의한 촉매 활성, 안정성 또는 열안정성에 대한 변형을 갖는 것을 포함한다. 예시적인 중합효소는 비제한적으로 Bst DNA 중합효소, Bst 2.0 WarmStart® DNA 중합효소 / Bst 3.0 DNA 중합효소 (New England Biolabs., Inc.), Saphir Bst2.0 중합효소 (Jena Bioscience GmbH), GspSSD LF DNA 중합효소 / GspSSD2.0 LF DNA 중합효소 / GspM3.0 LF DNA 중합효소 (OptiGene Ltd.), Bca (엑소-)DNA 중합효소, DNA 중합효소 I Klenow 단편, Vent DNA 중합효소, Vent (엑소-)DNA 중합효소 (엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 Vent DNA 중합효소), Deep Vent DNA 중합효소, Deep Vent(엑소-)DNA 중합효소 (엑소뉴클레아제 활성이 결핍된 Deep Vent DNA 중합효소), φ29 파아지 DNA 중합효소, MS-2 파아지 DNA 중합효소, Z-Taq DNA 중합효소 (Takara Shuzo Co., Ltd.), KOD DNA 중합효소 (Toyobo Co., Ltd.), OmniAmp® 및 LavaLAMPTM DNA/RNA 효소 (Lucigen Corp.), 및 SD 중합효소 (BIORON GmbH)를 포함한다.
이들 효소 중에서, GspSSD2.0 LF DNA 중합효소, LavaLAMPTM DNA/RNA 효소, SD 중합효소, 및 Bst DNA 중합효소, 보다 바람직하게는 Bst 2.0 WarmStart® DNA 중합효소는 특히 요망되는 효소이고 그 이유는 이들이 특정 정도의 열안정성 및 높은 촉매 활성을 가지기 때문이다. 본 발명의 반응은 바람직한 구현예에서 등온으로 실시될 수 있다. 바람직하게는, 상기 효소는 열안정성이다. 등온 반응이 실현될 수 있지만, 핵산을 제1 주형으로 제공하기 위해 열변성이 수행될 수 있으며, 이러한 관점에서도 열안정성 효소의 이용으로 검정 프로토콜의 선택 범위가 넓어진다.
Vent (엑소-)DNA 중합효소는 가닥 변위 활성 및 높은 정도의 열안정성 둘 모두를 갖는 효소이다. DNA 중합효소에 의한 가닥 변위를 수반하는 상보적 사슬 합성 반응은 단일 가닥 결합 단백질을 첨가함으로써 촉진되는 것이 알려져 있다 (Paul M. Lizardi et al., Nature Genetics, 19, 225-232, July, 1998). 이 작용은 본 발명에 적용되고, 단일 가닥 결합 단백질을 첨가함으로써, 상보적 사슬의 합성을 촉진하는 효과가 예상될 수 있다. 예를 들어, T4 유전자 32는 Vent (엑소-) DNA 중합효소에 대한 단일 가닥 결합 단백질으로서 효과적이다. 바람직하게는, 상기 DNA 중합효소는 DNA-의존적 DNA 중합효소 또는 RNA-의존적 DNA 중합효소이다. 바람직하게는, 상기 DNA 중합효소는 역전사 활성을 갖는다.
바람직하게는, 상기 F3 뉴클레오티드 서열은 15-30개, 바람직하게는 17-25개의 뉴클레오티드 길이를 갖는다.
바람직하게는, 상기 B3 뉴클레오티드 서열은 15-30개, 바람직하게는 17-25개의 뉴클레오티드 길이를 갖는다.
본 발명의 방법 LNA-LAMP 방법은 바람직하게는 효소 반응에 적합한 pH를 제공하는 버퍼, 어닐링을 위해 또는 효소의 촉매 활성을 유지하기 위해 필요한 염, 효소에 대한 보호제 및 필요에 따라 용융 온도 (Tm)를 위한 조절제의 존재하에 실시된다. 예시적인 버퍼는 본 기술분야의 당업자에게 알려져 있고, 예를 들어 Tris-HCl 또는 동등물을 포함한다. pH는 사용되는 DNA 중합효소에 따라 조정된다. 버퍼는 1 mM 이상, 예컨대 1 mM 초과 또는 1.5 mM 이상의 농도로 첨가될 수 있다. 예시적인 염 예컨대 KCl, NaCl, MgCl2, (NH4)2SO4 등은 효소의 활성을 유지하기 위해 그리고 핵산의 용융 온도 (Tm)를 조절하기 위해 적절하게 첨가된다. 효소 활성을 유지하기 위한 보호제는 예를 들어 소 혈성 알부민 (BSA), 환원제 예로서 Tris(2-카르복시에틸)포스핀 (TCEP), (2S,3S)-1,4-비스(설파닐)부탄-2,3-디올 (DTT), 및/또는 당을 포함한다. 추가로, 디메틸 설폭사이드 (DMSO) 또는 포름아미드는 용융 온도 (Tm)를 위한 조절제로서 사용될 수 있다. 용융 온도 (Tm)를 위한 조절제를 사용함으로써, 올리고뉴클레오티드의 어닐링은 제한 온도 조건하에서 조절될 수 있다. 추가로, 베타인 (N,N,N-트리메틸글리신) 또는 테트라알킬 암모늄염은 또한 그것의 이소안정화(isostabilization)에 의해 가닥 변위의 효능을 개선하는 데 효과적이다. 베타인은 0.2 내지 3.0 M, 바람직하게는 0.5 내지 1.5 M의 농도로 반응 용액에 첨가될 수 있다. 따라서, 바람직하게는 반응 혼합물은 용융 온도의 조절제, 예를 들어, 바람직하게는 0.2 내지 3.0 M의 농도의 베타인, 바람직하게는 20 내지 80 mM의 농도의 구아니딘 티오시아네이트 또는 하이드로클로라이드, 바람직하게는 5 mM 내지 80 mM의 농도의 단일-가닥 결합 단백질 (SSB), 및/또는 테트라메틸 암모늄 클로라이드 (TMAC)를 추가로 포함한다. 또한, 반응 혼합물은 안정화제, 예를 들어 바람직하게는 0.02 mg/ml 내지 2 mg/ml의 농도의 BSA, 바람직하게는 0.02 % 내지 0.2% v/v의 농도의 비이온성 계면활성제 예컨대 Tween-20/Triton X-100 및/또는 바람직하게는 0.5 mM 내지 5 mM의 농도의 TCEP/DTT를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 SARS-CoV-2와 같은 병원체로부터 유래된 핵산과 같은 소정의 주형의 검출을 위해 사용될 수 있다. 따라서, 상기 반응 혼합물은 핵산 서열 합성 반응의 생성물을 검출하기 위한 검출약을 추가로 포함할 수 있다.
(핵산 서열 합성 반응의 생성물을 검출하기 위한) 검출약은 금속착색 지시약일 수 있다. 검출약의 추가의 예는 DNA-삽입 물질 또는 pH-민감성 염료이고, 금속착색 지시약이 바람직하다. 본원에 기재된 바와 같이, 금속착색 지시약은 금속 이온, 예를 들어, 마그네슘과 착물을 구성할 수 있다. 또한 본원에 기재된 바와 같이, 바람직한 금속 이온은 전이 금속 이온 또는 전이후 금속 이온이다.
금속착색 지시약 또는 본원에서 또한 지칭되는 착물화법 지시약(complexometric indicator)은 금속 이온에 의해 결합될 수 있는 분자이고, 즉, 이는 금속 이온과 착물을 구성한다. 이러한 착물은 금속착색 지시약-금속 이온 착물, 또는 줄여서 본원에서 지칭되는 "착물"이다. 착물은 바람직하게는 비-착물/금속 이온으로 착화되지 않는 금속착색 지시약, 즉 금속 이온이 없는, 즉 금속 이온과 착물을 형성하지 않고 이에 따라 비-착물이거나 착화되지 않은 금속착색 지시약과 상이한 비색 또는 형광 특성을 갖는다. 따라서, 검출약은 바람직하게는 전이 금속 또는 전이후 금속을 포함한다. 검출약은 바람직하게는 마그네슘과 착물을 형성하거나 구성하지 않는다.
이러한 착물은 가역적이며 이는 금속착색 지시약에 결합될 때 금속 이온이 금속착색 지시약을 가진 착물로부터 방출될 수 있고/방출되는 것을 의미한다. 착물로부터의 금속 이온의 방출은 금속 이온에 대한 결합 대응물이 동시에 제공되거나 또는 예를 들어 (화학) 반응을 통해 첨가되거나 발생될 것인 경우에 일어날 수 있고, 이는 금속착색 지시약에 의해 결합된 금속 이온에 대한 충분한 농도 및/또는 친화도를 갖는다.
바람직한 금속착색 지시약은 본 발명의 맥락에서, 예를 들어 금속 이온을 가진 그것의 착물의 스펙트럼 또는 형광 특성의 변화의 검출을 위한 방법, 용도 또는 키트에 제공된다. 이러한 변화는 금속 이온이 부재하게 될 때 또는 착물로부터 방출될 때 일어난다. 본 발명의 맥락에서, 핵산 서열의 증폭 동안, 피로포스페이트가 발생되고, 이는 금속착색 지시약을 가진 착물에 있는 금속 이온에 대한 결합 대응물이다. 피로포스페이트가 금속착색 지시약에 의해 결합된 금속 이온에 대한 충분한 농도 및/또는 친화도를 갖는 경우, 금속 이온은 착물로부터 방출되고, 피로포스페이트와/피로포스페이스에 결합하고, 이에 의해 금속 이온-피로포스페이트 염을 형성한다.
상기 착물의 스펙트럼 특성의 바람직한 변화는 380 내지 740 nm의 스펙트럼 내에 있다. 따라서, 그것의 스펙트럼 특성에 있어서의 상기 착물의 스펙트럼 특성의 변화는 바람직하게는 금속 이온에 의해 결합되지 않은 금속착색 지시약과 비교할 때, 즉, 금속 이온이 더 이상 (금속착색 지시약을 갖는) 착물을 구성하지 않거나 착물로부터 방출될 때 착물의 색상의 변화이다. 이는 상기 기재된 바와 같이 일어날 수 있고, 그 이유는 예를 들어 금속 이온이 예를 들어 상기 기재된 바와 같이 핵산 서열의 증폭 과정에서 발생되는 피로포스페이트의 존재하에 착물로부터 방출되기 때문이다.
본 발명과 대조적으로, 선행 기술은 핵산 서열 금속착색 지시약, 예를 들어 금속 마그네슘, 즉, 비-전이/비-전이후 금속으로 착물을 구성하는 하이드록시나프톨 블루 (HNB)의 검출을 위해 적용되었다. 마그네슘은 증폭 방법 (PCR, LAMP 등)에 대한 중요한 이온이고, 이는 효소 활성을 위한 보조인자 및 촉매로서 역할을 하고 프라이머의 어닐링, DNA의 안정성, 및 뉴클레오티드의 혼입에 영향을 미치기 때문이다. 이러한 이유로, Mg2+ 이온에 의존적인 비색 검출 시스템을 사용하는 것은 효소 및 주형에 대한 유리 Mg2+의 수준이 반응 과정 동안 변화되기 때문에 문제가 된다. 또한, Mg2+에 의존적인 비색 검출 시스템은 검출 시스템 및 증폭 반응의 독립적인 최적화를 방해하고, 그 이유는 둘 모두가 동일한 이온의 농도와 연관되기 때문이다. 따라서, 검출약 또는 금속착색 지시약은 바람직하게는 마그네슘과 착물을 구성하지 않는다. 반응에서 불활성인 금속 이온을 사용하는 검출 시스템이 이에 따라 바람직하다. 본 발명의 맥락에서의 적합한 금속 이온, 특히 전이 금속 또는 전이후 금속 이온은 Ba2+, Sr2+, Zn2+, Cd2+, Cu2+, Co2+, Ni2+, Hg2+, Pb2+, Pt2+, Ru2+, Rh2+, Fe2+, In3+, Al3+, Bi3+, La3+, Sc3+, Th3+, 및/또는 Zr3+ 이온일 수 있고, Zn2+, Cu2+, Co2+, Ni2+, Pt2+, Ru2+, Rh2+, Fe2+ 이온이 바람직하고, Cu2+, Co2+, Ni2+, Zn2+ 및/또는 Fe2+ 이온이 바람직하고, Zn2+ 이온이 보다 바람직하다.
또한, 본 발명과 대조적으로, 선행 기술은 핵산 서열 금속착색 지시약, 예를 들어, 비-전이 금속 망간과 착물을 구성하는 칼세인의 검출을 위해 적용되었다. 이러한 착물은 금속 이온을 방출할 때 그것의 형광 특성의 변화를 위해 제공된다. 망간은 일반적으로 PCR/LAMP 반응 버퍼에 포함되지 않으며 증폭에 대해 극적인 효과를 가지는 것으로 알려져 있고, 이에 따라 회피되어야 한다. Mn2+은 PCR에서 Mg2+에 대해 치환되는 것으로 발견되었으며, 한편 이는 DNA 중합효소의 정확도를 감소시키고 결과적으로 PCR 동안 무작위 돌연변이유발을 유도하는 것으로 잘 알려져 있다. 고농도 (예를 들어, 500 μM 및 그 초과)에서, Mn2+는 PCR을 또한 억제할 수 있고 - 칼세인/Mn2+ 검출 시스템은 1 mM Mn2+를 사용한다.
본 발명의 맥락에서, 금속착색 지시약은 주형 핵산 서열, 프라이머 뉴클레오티드 서열, 뉴클레오티드 및 핵산 분자를 증폭살 수 있는 중합효소를 포함하는 반응 혼합물에 첨가되는 금속 이온에 결합하기 위해 사용된다. 물론, 금속착색 지시약 및 금속 이온은 또한 반응 혼합물에 포함된다. 따라서, 금속착색 지시약은 금속 이온에 결합하여 착물을 구성한다. 이론에 구속되지 않고, 뉴클레오티드 서열의 증폭 동안, 보다 더 많은 피로포스페이트가 방출된다. 증가된 양의 피로포스페이트는 이후 금속착색 지시약에 의해 결합되는 금속 이온에 결합할 것이다. 그 결과, 금속착색 지시약은 그것의 스펙트럼 및/또는 형광 특성을 변화시킬 것이다. 이러한 변화는 증폭 반응이 (성공적으로) 발생하거나 발생한 것의 지시약으로서 역할을 한다.
바람직하게는, 피로포스페이트 금속 이온 착물 또는 염은 금속착색 지시약보다 금속 이온에 대해 더 높은 친화도를 갖는다. 이는 금속 이온의 평형이 바람직하게는 금속착색 지시약보다 피로포스페이트로 이동되는 것을 의미한다. 또는, 바람직하게는, 피로포스페이트 금속 이온 착물 또는 염은 금속 이온의 평형을 금속착색 지시약보다 피로포스페이트와의 착화로 이동시키기에 충분한 농도로 존재한다. 숙련가는 이를 용이하게 결정할 수 있다.
또한, 금속착색 지시약과 금속 이온 사이의 착물의 스펙트럼 또는 형광 특성의 요망되는 변화가 검출될 수 있도록 본원에 기재된 반응 혼합물에 사용될 때, 숙련가는 금속착색 지시약 및/또는 금속 이온의 양을 결정할 수 있다. 금속 이온이 금속착색 지시약과 금속 이온 사이의 착물로부터 방출될 때 변화가 일어나고, 그 이유는 보다 더 많은 피로포스페이트가 본원에 기재된 바와 같은 핵산 서열의 증폭 동안 발생되고, 중합효소가 뉴클레오티드를 DNA 또는 RNA로 혼입시키는 경우에 피로포스페이트가 방출되는 것이 본 기술분야에 일반적으로 알려져 있다.
본 발명의 맥락에서, 예를 들어 본원에 기재된 방법, 용도 또는 키트의 맥락에서 사용되는 바람직한 금속 이온은 전이 금속 이온 또는 전이후 금속 이온이다. 본원에 사용되는 바와 같은 "전이 금속"은 Sc, Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Y, Zr, Nb, Mo, Tc, Ru, Rh, Pd, Ag, La, Hf, Ta, W, Re, Os, Ir, Pt, Au, Th, Rf, Db, Sg, Bh 및 Hs로 이루어진 군으로부터 선택되는 원소이다. Sr 및 Ba는 전이 금속 군의 추가의 원소인 것으로 볼 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은 "전이후 금속"은 Al, Zn, Ga, Cd, In, Sn, Hg, Tl, Pb, Bi, Po 및 At로 이루어진 군으로부터 선택되는 원소이다. 일반적으로 금속 이온 및 특히 전이 또는 전이후 금속 이온의 바람직한 예는 Ba2+, Sr2+, Zn2+, Cd2+, Cu2+, Co2+, Ni2+, Hg2+, Pb2+, Pt2+, Ru2+, Rh2+, Fe2+, In3+, Al3+, Bi3+, La3+, Sc3+, Th3+, Zr3+ 이온이고, Zn2+, Cu2+, Co2+, Ni2+, Pt2+, Ru2+, Rh2+, Fe2+ 이온이 바람직하고, Cu2+, Co2+, Ni2+, Zn2+ 및 Fe2+ 이온이 바람직하고, Zn2+ 이온이 보다 바람직하다.
금속착색 지시약의 바람직한 예는 금속 이온, 바람직하게는 전이 금속 이온 또는 전이후 금속 이온에 결합할 수 있는 것이다. 바람직한 금속착색 지시약의 예는 피로카테콜 바이올렛(pyrocatechol violet), 디티존(dithizone), 진콘, 에리오크롬 블랙 T(eriochrome black T), 뮤렉사이드(murexide), PAN, 프탈레인 퍼플(phthalein purple), 크실레놀 오렌지(xylenol orange), 2-(5-브로모-2-피리딜아조)-5-[N-프로필-N-(3-설포프로필)아미노]페놀 (5-Br-PAPS)이다. 보다 바람직한 금속착색 지시약의 예는 피로카테콜 바이올렛, 진콘, 디티존, PAN, 5-Br-PAPS이다. 보다 더 바람직한 금속착색 지시약의 예는 진콘 및 5-Br-PAPS이다. 5-Br-PAPS가 가장 바람직하다.
보다 바람직한 금속착색 지시약 진콘뿐만 아니라 진콘 유도체의 구조는 하기에 도시되어 있다. 진콘 유도체의 경우, R1, R2, 및 R3는 관련된 페닐 고리에 부착된 하나 이상의 작용기를 나타낼 수 있다:
보다 바람직한 금속착색 지시약 PAN 및 PAR 및 PAN/PAR 유도체의 구조는 하기에 도시되어 있다. PAN/PAR 유도체의 경우, R은 페놀 고리에 연결된 하나 이상의 작용기를 나타낼 수 있다:
용어 "5-Br-PAPS"는 또한 5-Br-PAPS의 유도체를 포괄하며, 이는 또한 바람직하다. 이러한 유도체는 하나 이상의 변형을 가질 수 있으나, 여전히 금속 이온과 착물을 형성할 수 있고, 동일하지만 금속 이온에 결합할 때 5-Br-PAPS와 적어도 유사한 스펙트럼 특성을 가진다. 예시적인 5-Br-PAPS (X = Br) 유도체는 2-(5-플루오로-2-피리딜아조)-5-[N-프로필-N-(3-설포프로필)아미노]페놀 (X = F), 2-(5-클로로-2-피리딜아조)-5-[N-
프로필-N-(3-설포프로필)아미노]페놀 (X = Cl), 2-(5-아이오도-2-피리딜아조)-5-[N-프로필-N-(3-설포프로필)아미노]페놀 (X = I), 2-(5-니트로-2-피리딜아조)-5-[N-프로필-N-(3-설포프로필)아미노]페놀 (X = NO2), 또는 2-(5-시아노-2-피리딜아조)-5-[N-프로필-N-(3-설포프로필)아미노]페놀 (X = CN)이다. 하기 구조는 그것의 이나트륨염 탈수화물의 형태의 PAPS 골격을 나타내고, 이에서 X는 상기 기재된 바와 같이 대체될 수 있다:
하기 구조로 예시된 바와 같이, X는 상기 기재된 바와 같이 대체될 수 있고, 또한 PAPS 유도체와 같이 피리딘 고리에서 대체 위치 (예를 들어, 위치 3-6)를 점유할 수 있다:
하기 표 1은 일부 추가의 예시적인 금속착색 지시약 및 금속 이온이 있고 그리고 없는 스펙트럼 특성의 그것의 변화를 나타낸다.
[표 1] 예시적인 금속착색 지시약 및 금속 이온이 있고 그리고 없는 스펙트럼 특성의 그것의 상응하는 변화.
하기 표 2는 마그네슘 이온의 존재하에 바람직한 금속 이온이 있고 그리고 없는 보다 바람직한 금속착색 지시약, 가시적 및 스펙트럼 특성을 나타낸다.
[표 2] 마그네슘 이온의 존재하에 바람직한 금속 이온이 있고 그리고 없는 보다 바람직한 금속착색 지시약, 가시적 및 스펙트럼 특성.
예를 들어 본 발명의 LAMP 방법의 일 구현예에서, 검출약은 금속 이온, 바람직하게는 전이 금속 또는 전이후 금속, 보다 바람직하게는 Zn2+, Cu2+, Co2+, Ni2+, Pt2+, Ru2+, Rh2+, 및/또는 Fe2+ 이온, 가장 바람직하게는 Zn2+ 이온과 조합되는 금속착색 지시약, 바람직하게는 2-(5-브로모-2-피리딜아조)-5-[N-프로필-N-(3-설포프로필)아미노]페놀 (5-Br-PAPS)이고, 상기 금속착색 지시약 및 각각의 상기 금속 이온은 착물을 구성하지만, 마그네슘과 구성하지 않고, 상기 방법은 추가로
(b) 상기 핵산 서열의 증폭으로부터 생성된 착물의 스펙트럼 또는 형광 특성의 변화를 검출하는 단계를 포함한다.
예를 들어 본 발명의 LAMP 방법의 일 구현예에서, 검출약은 금속 이온과 조합되는 5-Br-PAPS이다. 이 맥락에서의 금속 이온은 비제한적으로 Zn2+, Cu2+, Co2+, Ni2+, Pt2+, Ru2+, Rh2+, 및/또는 Fe2+ 이온, 바람직하게는 Zn2+ 이온을 포함하는, 5-Br-PAPS 및 피로포스페이트 둘 모두에 의해 킬레이트화되는 임의의 전이 또는 전이후 금속을 포함할 수 있다. 따라서, 예를 들어 본 발명의 방법에서 사용되는 반응 혼합물은 추가로 2-(5-브로모-2-피리딜아조)-5-[N-프로필-N-(3-설포프로필)아미노]페놀 (5-Br-PAPS) 및 Zn2+, Cu2+, Co2+, Ni2+, Pt2+, Ru2+, Rh2+, 및/또는 Fe2+ 이온, 바람직하게는 Zn2+ 이온을 추가로 포함할 수 있고, 상기 5-Br-PAPS 및 각각의 상기 이온은 착물을 구성한다. 이러한 맥락에서, 본 발명의 방법은 추가로
(b) 상기 핵산 서열의 증폭으로부터 생성된 착물의 스펙트럼 또는 형광 특성의 변화를 검출하는 단계를 포함한다.
5-Br-PAPS는 비제한적으로 높은 친화도를 가진 Zn2+, Cu2+, Co2+, Ni2+, Pt2+, Ru2+, Rh2+, 및/또는 Fe2+ 이온을 포함하는, 전이 또는 전이후 금속에 결합하는 능력을 가지고 이에 의해 착물을 구성하고, 색상 변화 또는 환언하면 스펙트럼 또는 형광 특성의 변화를 야기하는 화합물이다. 반응 혼합물이 Zn2+, Cu2+, Co2+, Ni2+, Pt2+, Ru2+, Rh2+, 및/또는 Fe2+ 이온, 바람직하게는 Cu2+, Co2+, Ni2+, Zn2+ 및 Fe2+ 이온, 보다 바람직하게는 Zn2+ 이온을 함유하는 경우, 반응 혼합물은 착색된다. 금속 이온이 Zn2+인 경우, 반응 혼합물은 자홍색으로 착색된다 (또한 도 1 참조). 이론에 구속되지 않고, 본 발명의 LNA-LAMP 방법의 합성 반응 또는 임의의 다른 핵산-생성 중합효소 (사슬) 반응은 신장 반응 동안 트리포스포릴화된 뉴클레오티드 (예를 들어, ATP, GTP, CTP, TTP, UTP 등)으로부터의 피로포스페이트 (PPi)의 방출을 야기한다. 특히, PPi는 또한 금속 이온 예컨대 비제한적으로 Zn2+, Cu2+, Co2+, Ni2+, Pt2+, Ru2+, Rh2+, 및/또는 Fe2+ 이온, 바람직하게는 Cu2+, Co2+, Ni2+, Zn2+ 및 Fe2+ 이온, 보다 바람직하게는 Zn2+ 이온을 포함하고, 5-Br-PAPS와 Zn2+, Cu2+, Co2+, Ni2+, Pt2+, Ru2+, Rh2+, 및/또는 Fe2+ 이온, 바람직하게는 Cu2+, Co2+, Ni2+, Zn2+ 및 Fe2+ 이온, 보다 바람직하게는 Zn2+ 이온 간의 착물을 분해할 수 있고, 이에 의해 자홍색으로부터 주황색-노란색으로의 반응 혼합물의 "색상 전이"를 야기하고 (실시예 1-4 참조), 착물의 스펙트럼 또는 형광 특성을 변화시키는 전이 및/또는 전이후 금속에 대한 킬레이터이다. 따라서, 검증되는 주형이 존재하는 경우, 신장 반응이 일어나고 PPi의 방출을 야기한다. PPi는 결국 5-Br-PAPS에 의해 초기에 착화되는 Zn2+, Cu2+, Co2+, Ni2+, Pt2+, Ru2+, Rh2+, 및/또는 Fe2+ 이온, 바람직하게는 Cu2+, Co2+, Ni2+, Zn2+ 및 Fe2+ 이온, 보다 바람직하게는 Zn2+ 이온을 착화시킨다. 스펙트럼 또는 형광 특성의 상응하는 색상 변화는 주형의 존재에 대한 지시약으로써 사용될 수 있다. 구체적으로, 증가되는 PPi 농도는 반응 혼합물의 560 nm (± 10 nm) 흡수 피크 ("자홍색")를 약하게 하고, 새로운 448 nm (± 10 nm) 피크 ("주홍색-노란색")는 특히 금속 이온이 Zn2+인 경우 동시 성장된다. 이 색상 전이는 실시간으로 모니터링될 수 있다.
본 맥락에서, 본 발명은 추가로 핵산 서열 증폭 생성물을 검출하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이고, 이는
(a) 주형 핵산 서열, 프라이머 뉴클레오티드 서열, 뉴클레오티드 및 상기 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 중합효소를 포함하는 반응 혼합물을 금속착색 지시약 및 금속 이온과 접촉시키는 단계로서, 상기 금속착색 지시약 및 상기 이온은 착물을 구성하는 것인 단계;
(b) 핵산 서열 증폭 생성물을 얻기 위한 적합한 조건하에서 상기 핵산 서열을 증폭시키는 단계;
(c) 상기 핵산 서열의 증폭으로부터 생성된 착물의 스펙트럼 또는 형광 특성의 변화를 검출하는 단계를 포함한다.
바람직하게는, 금속착색 지시약은 5-Br-PAPS이다. 바람직하게는, 금속 이온은 전이 금속 이온 또는 전이후 금속 이온, 바람직하게는 Zn2+ 이온이다. 바람직하게는, 상기 착물의 스펙트럼 특성의 변화는 380 내지 740 nm 파장의 스텍트럼 내에 있다. 보다 바람직하게는, 스텍트럼 변화는 560 nm (± 10 nm) ("자홍색") 및/또는 448 nm (± 10 nm) ("주홍색-노란색")에서 모니터링될 수 있다. 환언하면, 자홍색으로부터 주황색-노란색으로의 반응 혼합물의 스펙트럼 특성의 변화는 핵산 증폭 생성물이 핵산 서열 증폭 생성물을 검출하기 위한 시험관내 방법 또는 본원에 기재된 다른 방법, 용도 및 키트에 생성되는 경우에 가시적이다.
중요하게는, (5-Br-PAPS) 착물의 스펙트럼 또는 형광 특성의 변화는 반응 혼합물의 pH 변화에 의존적이지 않다 (실시예 4, 도 7 및 8 참조). 스펙트럼 또는 형광 특성의 변화는 유일하게 금속 이온 예컨대 Zn2+, Cu2+, Co2+, Ni2+, Pt2+, Ru2+, Rh2+, 및/또는 Fe2+ 이온, 바람직하게는 Zn2+ 이온의 이용가능성에만 의존적이다. 이용가능성은 결국 반응 혼합물에서의 PPi의 양에 의존적이지만, 바람직하게는 pH에 의존적이지 않다. 이는 예를 들어 EP2888374B1에 나타난 것과 같은 선행 기술에 기재된 방법에 대조적이다. 결과적으로, 반응 혼합물은 1 mM 이상의 Tris (트리스(하이드록시메틸)아미노메탄) 버퍼 또는 동등한 버퍼 예컨대 1 mM 초과, 1.5 mM 초과, 5 mM 초과, 10 mM 초과, 50 mM 초과, 100 mM 초과 또는 250 mM 초과의 Tris 버퍼 또는 동등한 버퍼를 포함할 수 있다. 이러한 맥락에서, 또한 pH-민감성 중합효소가 사용될 수 있다.
핵산 서열 증폭 생성물을 검출하기 위한 시험관내 방법에서의 단계 (b)의 핵산 서열 증폭 생성물은 비제한적으로, 본 발명의 중합효소 연쇄 반응 (PCR), LAMP, LNA-LAMP, 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA), 가닥 변위 증폭 (SDA), 롤링 서클 증폭 (rolling circle amplification, RCA), 재조합효소 중합효소 증폭 (RPA), 헬리카제 의존적 증폭 (HAD), 바람직하게는 PCR 또는 LNA-LAMP를 포함하는 임의의 핵산 증폭 방법에 의해 수득될 수 있다. (주형) 핵산 서열 증폭 생성물을 검출하기 위한 시험관내 방법의 단계 (b)는 본 발명의 LNA-LAMP 방법을 실시함으로써 시행될 수 있다.
(5-Br-PAPS) 착물의 스펙트럼 특성의 변화의 검출은 예를 들어, 작업자의 눈, 형광계 또는 분광광도계를 사용하여 이의 광화학적 특성에 의해 달성될 수 있다. 용어 "검출"은 용어 "모니터링"과 상호교환적으로 사용될 수 있다.
금속착색 지시약, 바람직하게는 5-Br-PAPS 대 금속 이온, 바람직하게는 Zn2+, Cu2+, Co2+, Ni2+, Pt2+, Ru2+, Rh2+, 및/또는 Fe2+ 이온, 바람직하게는 Zn2+ 이온의 최종 몰비는 2:1일 수 있다. 이는 수용액 중의 이온2+/5-Br-PAPS 착물의 화학양론에 상응한다. 이온2+/5-Br-PAPS 착물은 약 1 내지 약 250 μM, 약 10 내지 약 100 μM, 약 15 내지 약 75 μM, 약 25 내지 약 75 μM, 약 25 μM 내지 약 50 μM의 최종 농도로 첨가될 수 있다.
본 발명의 LAMP 방법은 상이한 목적을 위해 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 LAMP 방법은 핵산 서열을 합성하기 위한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명의 LAMP 방법은 핵산 서열을 검출하기 위한 것이다. 일 구현예에서, 본 발명의 LAMP 방법은 바람직하게는 병원체에 의해 야기된 질환을 진단하기 위한 것이다.
본 발명은 추가로 주형 핵산 서열에 대한 루프 매개 등온 증폭 (LAMP)에 의한 핵산 서열의 합성을 위한 키트에 관한 것이고, 이는
(i) 각각 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오티드를 포함하는, 제1 외부 프라이머 (F3) 뉴클레오티드 서열 및 제2 외부 프라이머 (B3) 뉴클레오티드 서열, 및/또는 임의로
(ii) 제1 내부 프라이머 (FIP) 뉴클레오티드 서열 및 제2 내부 프라이머 (BIP) 뉴클레오티드 서열, 및/또는 임의로
(iii) 상기 주형 핵산으로부터 상보적 핵산 가닥을 합성하는 가닥-변위-유형 반응을 촉매화하는 DNA 중합효소, 및/또는 임의로
(iv) 상기 DNA 중합효소에 대한 기질로서 역할을 하는 뉴클레오티드를 포함한다.
F3 뉴클레오티드 서열 및/또는 상기 B3 뉴클레오티드 서열은 상기 F3 뉴클레오티드 서열 또는 상기 B3 뉴클레오티드 서열의 처음 3분의 1 내에 위치하는 하나 이상의 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. F3 뉴클레오티드 서열은 상기 F3 뉴클레오티드 서열의 처음 3분의 1 내에 위치하는 하나 이상의 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. B3 뉴클레오티드 서열은 상기 B3 뉴클레오티드 서열의 처음 3분의 1 내에 위치하는 하나 이상의 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은 "처음 3분의 1"은 5'-에서 3'-배향의 뉴클레오티드 서열의 처음 3분의 1, 즉, 뉴클레오티드 서열의 5'-말단에 있는 뉴클레오티드 서열의 3분의 1의 뉴클레오티드와 관련될 수 있다.
5-Br-PAPS 및 Zn2+, Cu2+, Co2+, Ni2+, Pt2+, Ru2+, Rh2+, 및/또는 Fe2+ 이온, 바람직하게는 Zn2+ 이온은 키트의 추가의 유용한 성분이고, 그 이유는 이것이 주형 핵산 서열의 존재의 검출을 실시하는 것을 가능하게 하기 때문이다. 따라서, 본 발명의 키트는 추가로 (v) 2-(5-브로모-2-피리딜아조)-5-[N-프로필-N-(3-설포프로필)아미노]페놀 (5-Br-PAPS); 및 임의로 비제한적으로 (vi) Zn2+, Cu2+, Co2+, Pt2+, Ru2+, Rh2+, 및/또는 Fe2+ 이온, 바람직하게는 Zn2+ 이온을 포함하는 전이 또는 전이후 금속을 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 추가로 금속착색 지시약, 바람직하게는 5-Br-PAPS; 및/또는 금속 이온, 바람직하게는 Zn2+ 이온을 포함할 수 있다.
본 개시내용은 추가로 1 mM 이상의 양의 Tris 중의 완충제 또는 1 mM 초과, 1.5 mM 초과, 5 mM 초과, 10 mM 초과, 50 mM 초과, 100 mM 초과 또는 250 mM 초과의 Tris 버퍼 또는 동등한 버퍼와 같은 동등한 완충제를 함유하는 배합물에 5-Br-PAPS, (DNA) 중합효소, dNTP를 포함하는 수성 제제에 관한 것이다. 본 발명의 수성 제제는 추가로 프라이머를 포함할 수 있고, 바람직하게는 프라이머는 본원에 정의된 바와 같은 F3 뉴클레오티드 서열 및/또는 상기 B3 뉴클레오티드 서열이다. 수성 제제는 추가로 상기 DNA 중합효소에 대한 기질로서 역할을 하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 본 발명의 수성 제제는 추가로 Zn2+, Cu2+, Co2+, Ni2+, Pt2+, Ru2+, Rh2+, 및/또는 Fe2+ 이온, 바람직하게는 Zn2+ 이온을 포함할 수 있다.
본 개시내용은 추가로 본원에 정의된 바와 같은 제1 외부 프라이머 (F3) 뉴클레오티드 서열 및 제2 외부 프라이머 (B3) 뉴클레오티드 서열을 포함하는 수성 제제에 관한 것이다. 수성 제제는 추가로 본원에 정의된 바와 같은 제1 내부 프라이머 (FIP) 뉴클레오티드 서열 및 제2 내부 프라이머 (BIP) 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 수성 제제는 추가로 상기 주형 핵산으로부터 상보적 핵산 가닥을 합성하는 가닥-변위-유형 반응을 촉매화하는 DNA 중합효소를 포함할 수 있다. 수성 제제는 추가로 상기 DNA 중합효소에 대한 기질로서 역할을 하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명은 추가로 하기 항목에 관한 것이다:
1. 루프 매개 등온 증폭 (LAMP) 방법으로서,
(i) 제1 내부 프라이머 (FIP) 뉴클레오티드 서열 및 제2 내부 프라이머 (BIP) 뉴클레오티드 서열,
(ii) 제1 외부 프라이머 (F3) 뉴클레오티드 서열 및 제2 외부 프라이머 (B3) 뉴클레오티드 서열로서, 여기서 상기 F3 뉴클레오티드 서열 및/또는 상기 B3 뉴클레오티드 서열은 각각 상기 F3 뉴클레오티드 서열 또는 상기 B3 뉴클레오티드 서열의 처음 3분의 1 내에 위치하는 하나 이상의 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 제1 외부 프라이머 (F3) 뉴클레오티드 서열 및 제2 외부 프라이머 (B3) 뉴클레오티드 서열,
(iii) 상기 주형 핵산으로부터 상보적 핵산 가닥을 합성하는 가닥-변위-유형 반응을 촉매화하는 DNA 중합효소, 및
(iv) 상기 DNA 중합효소에 대한 기질로서 역할을 하는 뉴클레오티드
를 포함하는 반응 혼합물에서,
적어도 FIP 뉴클레오티드 서열 및 BIP 뉴클레오티드 서열이 상기 주형 핵산에 포함된 그것의 상보적 뉴클레오티드 서열과 안정한 염기쌍을 형성할 수 있으면서 한편 DNA 중합효소 활성이 유지될 수 있는 이러한 온도에서 주형 핵산 서열로부터 핵산 서열을 합성하는 단계를 포함하고, 이에 의해 핵산 서열을 합성하는, 루프 매개 등온 증폭 (LAMP) 방법.
2. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 FIP 뉴클레오티드 서열이 적어도 2개의 영역 F2 및 F1c를 포함하고, 여기서 상기 F1c 영역은 F2 영역의 5'-측에 연결되고,
상기 F2 영역은 상기 주형 핵산 서열에서 임의의 영역 F2c에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖고,
상기 F1c 영역은 상기 주형 핵산 서열에서 상기 F2c 영역의 5'-측에 위치하는 영역 F1c와 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 방법.
3. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 BIP 뉴클레오티드 서열은 적어도 2개의 영역 B2 및 B1c를 포함하고,
여기서 상기 B1c 영역은 B2 영역의 5'-측에 연결되고,
상기 B2 영역은 상기 주형 핵산 서열 가닥에서 임의의 영역 B2c에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖고,
상기 B1c 영역은 상기 주형 핵산 서열에서 상기 영역 B2c의 5'-측에 위치하는 영역 B1c와 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 것인 방법.
4. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 F3 뉴클레오티드 서열은 상기 주형 핵산 서열에서 영역 F3c에 대해 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖고,
영역 F3c는 상기 주형 핵산 서열에서 영역 F2c의 3'-측에 위치하고,
영역 F2c는 상기 주형 핵산 서열에서 영역 F1c의 3'-측에 위치하는 것인 방법.
5. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 B3 뉴클레오티드 서열은 상기 주형 핵산 서열에서 영역 B3c에 대해 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖고,
영역 B3c는 상기 주형 핵산 서열에서 영역 B2c의 3'-측에 위치하고,
영역 B2c는 상기 주형 핵산 서열에서 영역 B1c의 3'-측에 위치하는 것인 방법.
6. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응 혼합물은 추가로 루프 프라이머 뉴클레오티드 서열 F 및/또는 루프 프라이머 뉴클레오티드 서열 B를 포함하는 것인 방법.
7. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응 혼합물은 추가로 스템 프라이머 뉴클레오티드 서열 F 및/또는 스템 프라이머 뉴클레오티드 서열 B를 포함하는 것인 방법.
8. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응 혼합물은 추가로 스웜 프라이머 뉴클레오티드 서열 F1S 및/또는 스웜 프라이머 뉴클레오티드 서열 B1S를 포함하는 것인 방법.
9. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응 혼합물은 추가로 적어도 추가의 제1 내부 프라이머 (FIP2) 뉴클레오티드 서열 및 추가의 제2 내부 프라이머 (BIP2) 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이 둘 모두는 상기 FIP 및 BIP 뉴클레오티드 서열과 상이한 것인 방법.
10. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응 혼합물은 추가로 다중 교차 변위 증폭 LAMP로서 상기 방법을 수행하기 위한 프라이머 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
11. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응 혼합물은 추가로 역전사 등온 다중 셀프 매칭 LAMP로서 상기 방법을 수행하기 위한 프라이머 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법.
12. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 주형 핵산 서열은 단일 가닥 또는 이중 가닥인 방법.
13. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 주형 핵산 서열은 단일- 또는 이중-가닥 DNA, RNA 또는 DNA/RNA 키메라인 방법.
14. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 DNA 중합효소는 DNA-의존적 DNA 중합효소 또는 RNA-의존적 DNA 중합효소인 방법.
15. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 DNA 중합효소는 역전사 활성을 갖는 것인 방법.
16. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 F3 뉴클레오티드 서열은 15-30개, 바람직하게는 17-25개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 것인 방법.
17. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 B3 뉴클레오티드 서열은 15-30개, 바람직하게는 17-25개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 것인 방법.
18. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 F3 뉴클레오티드 서열은 1-5개, 바람직하게는 3개의 LNA 뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
19. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 B3 뉴클레오티드 서열은 1-5개, 바람직하게는 3개의 LNA 뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법.
20. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 반응 혼합물은 추가로 용융 온도를 위한 조절제, 예를 들어, 바람직하게는 0.2 M 내지 3.0 M의 농도의 베타인, 바람직하게는 0.02 % 내지 0.2 %의 농도의 Tween-20/Triton-X, 바람직하게는 20 mM 내지 80 mM의 농도의 구아니딘 티오시아네이트 또는 하이드로클로라이드, 바람직하게는 0.02 mg/ml 내지 2 mg/ml의 농도의 단일 가닥 결합 단백질 (SSB), BSA, 바람직하게는 5 mM 내지 80 mM의 농도의 TMAC, 또는 바람직하게는 0.5 mM 내지 5 mM의 농도의 TCEP/DTT를 포함하는 것인 방법.
21. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 반응 혼합물은 추가로 핵산 서열 합성 반응의 생성물을 검출하기 위한 검출약을 포함하는 것인 방법.
22. 항목 21에 있어서, 상기 검출약은 금속착색 지시약인 방법.
23. 항목 21 또는 22에 있어서, 검출약은 추가로 금속 (이온), 바람직하게는 전이 금속 (이온) 또는 전이후 금속 (이온)을 포함하는 것인 방법.
24. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 검출약은 금속 이온, 바람직하게는 전이 금속 또는 전이후 금속 이온, 보다 바람직하게는 Zn2+, Cu2+, Co2+, Ni2+, Pt2+, Ru2+, Rh2+, 및/또는 Fe2+ 이온, 가장 바람직하게는 Zn2+ 이온과 조합되는 금속착색 지시약, 바람직하게는 2-(5-브로모-2-피리딜아조)-5-[N-프로필-N-(3-설포프로필)아미노]페놀 (5-Br-PAPS)이고, 상기 금속착색 지시약 및 각각의 상기 금속 이온은 착물을 구성하지만 마그네슘과 구성하지 않고,
여기서 상기 방법은 추가로
(b) 상기 핵산 서열의 증폭으로부터 생성된 착물의 스펙트럼 또는 형광 특성의 변화를 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법.
25. 항목 24에 있어서, 반응 혼합물은 추가로 1 mM 이상의 Tris (트리스(하이드록시메틸)아미노메탄) 버퍼 또는 동등한 버퍼 예컨대 1 mM 초과, 1.5 mM 초과, 5 mM 초과, 10 mM 초과, 50 mM 초과, 100 mM 초과 또는 250 mM 초과의 Tris 버퍼 또는 동등한 버퍼를 포함하는 것인 방법.
26. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은
(a) 핵산 서열을 합성하거나,
(b) 핵산 서열을 검출하거나, 또는
(c) 병원체에 의해 야기된 질환을 진단하기 위한 것인 방법.
27. 핵산 서열 증폭 생성물을 검출하기 위한 시험관내 방법으로서,
(a) 주형 핵산 서열, 프라이머 뉴클레오티드 서열, 뉴클레오티드 및 상기 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 중합효소를 포함하는 반응 혼합물을 금속착색 지시약 및 금속 이온과 접촉시키는 단계로서, 상기 금속착색 지시약 및 상기 금속 이온, 상기 검출약 및 상기 이온은 착물을 구성하는 것인 단계;
(b) 핵산 서열 증폭 생성물을 얻기 위한 적합한 조건하에서 상기 핵산 서열을 증폭시키는 단계;
(c) 상기 핵산 서열의 증폭으로부터 생성된 착물의 스펙트럼 또는 형광 특성의 변화를 검출하는 단계
를 포함하는 핵산 서열 증폭 생성물을 검출하기 위한 시험관내 방법.
28. 항목 27에 있어서, 상기 금속 이온은 전이 금속 이온 또는 전이후 금속 이온이고 및/또는 상기 전이 또는 전이후 금속 이온 및 상기 검출약은 착물을 구성하지만, 마그네슘과 착물을 구성하지 않는 것인 방법.
29. 핵산 서열 증폭 생성물을 검출하기 위한 시험관내 방법으로서,
(a) 주형 핵산 서열, 프라이머 뉴클레오티드 서열, 뉴클레오티드 및 상기 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 중합효소를 포함하는 반응 혼합물을 금속착색 지시약 및 전이 또는 전이후 금속 이온과 접촉시키는 단계로서, 상기 금속착색 지시약 및 상기 전이 또는 전이후 금속 이온은 착물을 구성하지만 마그네슘과 착물을 구성하지 않는 단계;
(b) 핵산 서열 증폭 생성물을 얻기 위한 적합한 조건하에서 상기 핵산 서열을 증폭시키는 단계;
(c) 상기 핵산 서열의 증폭으로부터 생성된 착물의 스펙트럼 또는 형광 특성의 변화를 검출하는 단계로서, 바람직하게는 상기 핵산 서열의 증폭으로부터 생성된 착물의 스펙트럼 특성의 변화의 상기 검출 단계이고, 상기 금속착색 지시약 및 상기 전이 또는 전이후 금속 이온을 포함하는 상기 착물의 형성은 용액의 색상 변화를 초래하는 것인 단계
를 포함하는 핵산 서열 증폭 생성물을 검출하기 위한 시험관내 방법.
30. 항목 27-29 중 어느 하나에 있어서, 상기 금속착색 지시약은 2-(5-브로모-2-피리딜아조)-5-[N-프로필-N-(3-설포프로필)아미노]페놀 (5-Br-PAPS)인 방법.
31. 항목 27 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 상기 금속 이온은 Zn2+ 이온인 방법.
32. 항목 27 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 착물의 상기 스펙트럼 특성의 변화는 380 내지 740 nm 파장의 스펙트럼 내에 있는 방법.
33. 항목 27 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 반응 혼합물은 추가로 1 mM 이상의 Tris (트리스(하이드록시메틸)아미노메탄) 버퍼 또는 동등한 버퍼 예컨대 1.5 mM 초과, 5 mM 초과, 10 mM 초과, 50 mM 초과, 100 mM 초과 또는 250 mM 초과의 Tris 버퍼 또는 동등한 버퍼를 포함하는 것인 방법.
34. 항목 27 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 증폭은 항목 1-23 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 방법에 의해 수행되는 것인 방법.
35. 주형 핵산 서열에 대한 루프 매개 등온 증폭 (LAMP)에 의한 핵산 서열의 합성을 위한 키트로서,
(i) 각각 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오티드를 포함하는, 제1 외부 프라이머 (F3) 뉴클레오티드 서열 및 제2 외부 프라이머 (B3) 뉴클레오티드 서열, 및/또는 임의로
(ii) 제1 내부 프라이머 (FIP) 뉴클레오티드 서열 및 제2 내부 프라이머 (BIP) 뉴클레오티드 서열, 및/또는 임의로
(iii) 상기 주형 핵산으로부터 상보적 핵산 가닥을 합성하는 가닥-변위-유형 반응을 촉매화하는 DNA 중합효소, 및/또는 임의로
(iv) 상기 DNA 중합효소에 대한 기질로서 역할을 하는 뉴클레오티드
를 포함하는 키트.
36. 항목 35에 있어서, 상기 F3 뉴클레오티드 서열 및/또는 상기 B3 뉴클레오티드 서열은 상기 F3 뉴클레오티드 서열 또는 상기 B3 뉴클레오티드 서열의 처음 3분의 1 내에 위치하는 하나 이상의 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오티드를 포함하는 것인 키트.
37. 항목 35 또는 36에 있어서,
(v) 금속착색 지시약, 바람직하게는 5-Br-PAPS; 및 임의로
(vi) 금속 이온, 바람직하게는 Zn2+, Cu2+, Co2+, Ni2+, Pt2+, Ru2+, Rh2+, 및/또는 Fe2+ 이온, 보다 바람직하게는 Zn2+ 이온
을 추가로 포함하는 것인 키트.
38. 항목 1 내지 34 중 어느 하나의 방법을 수행하기 위한 항목 35 내지 37 중 어느 하나의 키트의 용도.
39. 1 mM 이상의 양의 Tris 중의 완충제 또는 동등한 완충제 예컨대 1 mM 초과, 1.5 mM 초과, 5 mM 초과, 10 mM 초과, 50 mM 초과, 100 mM 초과 또는 250 mM 초과의 Tris 버퍼 또는 동등한 버퍼를 함유하는 배합물에 5-Br-PAPS, (DNA) 중합효소, dNTP를 포함하는 수성 제제.
40. 항목 37에 있어서, 추가로 프라이머를 포함하는 수성 제제로서, 바람직하게는 프라이머는 항목 36에 정의된 바와 같은 F3 뉴클레오티드 서열 및/또는 상기 B3 뉴클레오티드 서열인 수성 제제.
41. 항목 39 또는 40에 있어서, 상기 DNA 중합효소에 대한 기질로서 역할을 하는 뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것인 수성 제제.
42. 항목 1 또는 36에 정의된 바와 같은 제1 외부 프라이머 (F3) 뉴클레오티드 서열 및 제2 외부 프라이머 (B3) 뉴클레오티드 서열을 포함하는 수성 제제.
43. 항목 42에 있어서, 제1 내부 프라이머 (FIP) 뉴클레오티드 서열 및 제2 내부 프라이머 (BIP) 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 것인 수성 제제.
44. 항목 42 또는 43에 있어서, 상기 주형 핵산으로부터 상보적 핵산 가닥을 합성하는 가닥-변위-유형 반응을 촉매화하는 DNA 중합효소를 추가로 포함하는 것인 수성 제제.
45. 항목 42 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 상기 DNA 중합효소에 대한 기질로서 역할을 하는 뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것인 수성 제제.
46. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 상기 핵산 서열의 증폭으로부터 생성된 착물의 스펙트럼 특성의 변화를 검출하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 금속착색 지시약 및 상기 전이 또는 전이후 금속 이온을 포함하는 상기 착물의 형성은 용액의 색상 변화를 초래하는 것인 방법.
47. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 수용액에서 실시되는 것인 방법.
48. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 약 7 내지 약 9의 pH 범위, 바람직하게는 7.5 내지 8.5의 pH 범위에서 실시되는 것인 방법.
49. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 발광, 생체-발광 또는 형광 검출을 포함하지 않는 것인 방법.
50. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 유일하게 비색 검출만을 포함하는 것인 방법.
51. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 금속착색 지시약은 수용성인 방법.
52. 선행 항목 중 어느 하나에 있어서, 상기 금속착색 지시약은 2-(5-브로모-2-피리딜아조)-5-[N-프로필-N-(3-설포프로필)아미노]페놀 (5-Br-PAPS), PAR 또는 진콘인 방법.
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본원에 사용되는 바와 같이, 단수 형태("a", "an", 및 "the")는 맥락에서 분명하게 달리 나타내지 않는 한 복수의 참조를 포함하는 것임을 유의한다. 따라서, 예를 들어, "시약"에 대한 참조는 하나 이상의 이러한 상이한 시약을 포함하고, "방법"에 대한 참조는 본원에 기재된 방법에 대해 수정하거나 치환될 수 있는 본 기술분야의 당업자에게 알려진 동등한 단계 및 방법에 대한 참조를 포함한다.
달리 나타내지 않는 한, 일련의 구성요소 앞에 있는 용어 "적어도"는 일련의 모든 구성요소를 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 본 기술분야의 당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 특정 구현예에 대한 많은 균등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본원에 사용되는 경우 용어 "및/또는"은 "및", "또는" 및 "상기 용어에 의해 연결되는 구성요소의 모든 또는 임의의 다른 조합"의 의미를 포함한다.
용어 "미만" 또는 차례로 "초과"는 구체적인 숫자를 포함하지 않는다.
예를 들어, 20 미만은 나타낸 숫자보다 낮은 것을 의미한다. 유사하게는, 보다 높은 또는 초과는 나타낸 숫자보다 더 높거나 그 초과이며, 예를 들어, 80 %보다 높음은 80 %의 나타낸 숫자보다 더 높거나 그 초과임을 의미한다.
맥락이 달리 요구되지 않는 한, 본 명세서 및 후속되는 청구범위 전반에 걸쳐, 단어 "포함하다" 및 "포함하다" 및 "포함하는"과 같은 변형어는 언급된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹의 포함을 의미하지만, 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹의 배제를 의미하는 것을 아닌 것으로 이해될 것이다. 본원에서 사용되는 경우 용어 "포함하는(comprising)"는 용어 "함유하는(containing)" 또는 "포함하는(including)"으로 대체될 수 있거나 또는 때때로 본원에 사용될 때 용어 "갖는"으로 대체될 수 있다. 본원에 사용되는 경우 "~로 이루어지는"은 명시되지 않는 임의의 구성요소, 단계, 또는 성분을 배제한다.
용어 "포함하는(including)"은 "비제한적으로 포함하는"을 의미한다. "포함하는" 및 "비제한적으로 포함하는"은 상호교환적으로 사용된다.
본 발명은 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜, 물질, 시약, 및 물질 등으로 제한되지 않으며 이에 따라 변화될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용되는 용어는 단지 특정한 구현예를 기술하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것으로 의도되지 않고, 이는 유일하게 청구범위에 의해서만 정의된다.
이상 또는 이하에 있는지 여부와 관계없이 본 명세서의 텍스트 전반에서 인용된 모든 공개물(모든 특허, 특허 출원, 과학 공개물, 설명서 등 포함)은 그 전문이 본원에 참조로 편입되어 있다. 본원에서의 어떤 것도 본 발명이 선행 발명에 의해 그러한 개시보다 선행하지 않는다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 참조로 포함된 자료와 상충되거나 본 명세서와 일치하지 않는 범위 내에서, 본 명세서는 임의의 이러한 자료를 대체할 것이다.
본원에 인용된 모든 문헌 및 특허 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 편입된다.
실시예
본 발명 및 그 장점에 대한 훨씬 더 나은 이해는 예시 목적으로만 제공되는 하기 실시예로부터 명백해질 것이다. 실시예는 임의의 방식으로 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1: 바람직한 검출 시약의 비교
본 발명자들의 바람직한 검출 시약은 요망되는 스펙트럼 특성, 즉 마그네슘의 존재하에 바람직한 금속 이온과 함께 착색된 착물을 형성하는 능력, 관찰된 색상 변화의 명료함 및 형성된 염료-금속 착물의 높은 흡광도를 가진 킬레이트 측정 염료를 식별하기 위해 초기 스크린에서 선택되었다. 잠재적인 Mg2+-민감성 검출 시약의 조합은 착물화법 염료의 최종 농도가 100 μM이었고 한편 금속 이온의 농도가 형성된 염료-금속 착물의 예측된 화학양론을 반영하는 50 μM (5-Br-PAPS, PAR 경우) 또는 100 μM (진콘 경우)이게 되는 방식으로 바람직한 착물화법 염료 (5-Br-PAPS, PAR 또는 진콘; 모두 미국 미주리주 소재의 Sigma-Aldrich로부터 공급됨) 중 하나와 바람직한 금속 이온 (Co2+, Cu2+, Fe2+, Ni2+, Rh2+, Zn2+) 중 하나를 혼합함으로써 높은 마그네슘 농도 (8 mM MgSO4)의 존재하에 완충된 조건 (20 mM Tris-HCl pH=7.9, 50 mM KCl)하에 제조되었다.
Tecan Infinite M1000 Pro 다중-방식 리더 (Tecan, 스위스 소재) 상에서의 스펙트럼 분석을 사용하여 유리 염료 및 그것의 염료-금속 착물의 λmax를 결정하였고, 한편 휴대폰 카메라로 사진을 촬영하였다. 도 1a-b에서 알 수 있는 바와 같이, 진콘/Rh2+를 제외한 모든 조합은 고농도의 마그네슘의 존재하에 염료-금속 착물 형성을 나타내었고 이는 마그네슘의 존재하에 비색 검출에 사용되는 그것의 잠재력을 입증한다. 그러나 도 1c에 나타난 바와 같이, 5-Br-PAPS 착물은 PAR 및 진콘의 착물보다 훨씬 더 높은 평균 흡광도 값을 가졌고, 이는 염료의 유리 형태와 착화된 형태 사이에 보다 명확한 색상 변화로 해석되었다. 이러한 이유로, 5-Br-PAPS는 가장 바람직한 킬레이트 측정 염료로서 선택되었고, 그 이유는 더 높은 흡광도 값이 염료와 금속 둘 모두의 더 낮은 농도를 필요로 하기 때문이며, 이 둘은 검정에서 효소 활성을 방해할 수 있다.
5-Br-PAPS/금속 착물은 피로포스페이트 (PPi)의 존재하에 킬레이트화된 금속 이온을 방출하는 그것의 능력에 대해 추가로 비교되었다. 5-Br-PAPS 및 바람직한 금속 이온 (Co2+, Cu2+, Fe2+, Ni2+, Rh2+, Zn2+, 각각 50 μM)의 100 μM 착물은 PPi의 점진적으로 더 높은 농도 (0에서 20 mM)에 노출되었고, 염료-금속 착물의 흡광도 λmax는 Tecan Infinite M1000 Pro 다중 방식 리더 (Tecan, 스위스 소재) 상에서 분광광도법으로 측정되었다. 결과 (도 2a-b)는 모든 5-Br-PAPS/금속 착물이 PPi와 반응하여 5-Br-PAPS로부터 착화된 금속을 방출하는 한편, Zn2+/5-Br-PAPS 착물은 PPi에 의해 훨씬 가장 쉽게 파괴되었음을 입증하였다 (거의 완전환 착물 파괴가 가장 낮은 시험된 농도에서 관측됨). 이는 PPi 생성 검정에서 가장 높은 감도를 초래하여야 하기 때문에, Zn2+/5-Br-PAPS 착물이 추가 시험에서 사용되는 본 발명자들의 가장 바람직한 검출 시약으로서 선택되었다.
실시예 2: Zn
2+
/5-Br-PAPS 검출 시약의 특성화
가장 바람직한 Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약을 제조하기 위해, 5-Br-PAPS의 용액을 ZnSO4의 용액 (둘 다 PCR-등급 물 중에 있음)과 5-Br-PAPS 대 ZnSO4의 최종 몰비가 수용액 중의 Zn2+/5-Br-PAPS 착물의 화학양론에 해당하는 2:1이 되는 방식으로 혼합하였다. Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약 (1.5 mM 5-Br-PAPS, 750 μM ZnSO4)의 1.5 mM 용액은 암실에서 실온에서 안정적이고, 반응 혼합물을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약은 Zn2+와 결합하기 위해 5-Br-PAPS와 경쟁하는 PPi (중합효소에 의한 dNTP 가수분해의 부산물로서 생성됨)로 인하여 DNA 증폭 동안 색상을 변화시킨다 (도 3a). 증폭이 진행됨에 따라, PPi는 축적되고 PPi의 증가된 농도는 점진적으로 Zn2+/5-Br-PAPS 착물 (자홍색)을 유리 5-Br-PAPS (주황색-노란색) 및 아연(II) 피로포스페이트로 변화시킨다. 이러한 메커니즘은 표적 검정 조건하에 기본 LAMP 반응 혼합 성분 (20 mM Tris-HCl pH=7.9, 20 mM KCl, 60 mM GuCl, 9 mM MgSO4, 0.1% Tween-20, 0.05% Triton X-100), 25 또는 50 μM Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약 및 나트륨 피로포스페이트 (0-5 mM의 농도 범위)를 함유하는 모의 샘플을 제조함으로서 쉽게 입증되었다.
Zn2+/5-Br-PAPS 착물의 색상에 대한 PPi 농도-의존적 효과는 시각적 색상 변화를 휴대폰 카메라로 기록하면서 330-600 nm 파장 범위에서 스펙트럼 분석을 수행함으로써 Tecan Infinite M1000 Pro 다중-방식 리더 (Tecan, 스위스 소재) 상에서 분광광도법으로 분석하였다.
도 3b는 증가된 PPi 농도가 반응 혼합물 (25 μM Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약 사용) 블랭크-조정된 흡수 스펙트럼을 점진적으로 변화시키는 것을 나타낸다. 구체적으로, 증가된 PPi 농도는 560 nm 흡수 피크를 약화시키고 동시에 새로운 448 nm 피크가 성장된다. 도 3c는 이것이 25 및 50 μM Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약 둘 모두를 사용하여 쉽게 식별할 수 있는 시각적 색상 변화 (자홍색으로부터 주황색-노란색까지)에 해당되는 것을 입증한다.
실시예 3: Zn
2+
/5-Br-PAPS 검출 시약을 사용하는 LAMP 증폭 검출
LAMP 증폭 반응 (모두 20 μl 최종 부피)은 20 mM Tris-HCl pH=7.9, 20 mM KCl, 60 mM GuCl (구아니딘 하이드로클로라이드), 1.4 mM dNTP, 0.1% Tween-20, 0.05% Triton X-100 및 320 U/ml Bst 2.0 WarmStart® DNA 중합효소 (M0538, New England Biolabs, 미국 메사추세츠주 소재)를 함유하는 반응 버퍼에서 수행되었다. 주형 가닥이 RNA인 RT-LAMP 반응은 또한 300 U/ml WarmStart® RTx 역전사효소 (M0380, New England Biolabs, 미국 메사추세츠주 소재) 및 0.8 M 베타인을 포함하였다. LAMP 프라이머 농도는 모든 시험된 프라이머 세트에 대해 동일하였고, 구체적으로 FIP/BIP의 경우 1600 nM, F3/B3의 경우 200 nM 그리고 LF/LB의 경우 600 nM이었다.
도 4a-b에서, LAMP 증폭은 인간 RPP30에 대한 프라이머 및 0.375 ng/μl의 인간 gDNA (G3041, Promega, 미국 위스콘신주 소재)의 주형 입력을 사용하여 수행되었다. RT-LAMP 반응은 또한 SARS-CoV-2 N 유전자에 대한 프라이머 및 25 카피/μl의 합성 SARS-CoV-2 RNA (102019, Twist Bioscience, 미국 캘리포니아주 소재)의 주형 입력을 사용하여 수행되었다. 두 경우에서, 반응은 30분 동안 65℃에서 실시되었다. 육안으로 쉽게 관찰되는 (자홍색으로부터 주황색-노란색으로의) 색상 전이는 중합효소 (예를 들어, Bst 2.0 WarmStart® DNA 중합효소 및/또는 WarmStart® RTx 역전사효소)를 가진 샘플만이 색상을 변화시키고 (도 4a), 한편 중합효소가 결여된 것은 그렇게 하지 못하기 때문에 (도 4b) 핵산 증폭에 대해 특이적이었다. 이는 LAMP 동안 생성된 피로포스페이트의 양이 놀랍게도 5-Br-PAPS로부터 Zn2+를 방출시키기에 충분하다는 것을 의미한다. 또한, 이용되는 주형 (이중-가닥 DNA/단일-가닥 RNA)의 유형은 증폭/색상 변화의 성공에 영향을 미치지 않았다. 반응 혼합물은 강하게 완충되고 (20 mM Tris-HCl, pH=7.9), 이는 pH 변화가 관찰된 색상 변화에 기여하지 않음을 의미하는 것에 유의한다.
도 5에서, 인간 RPP30을 표적화하는 LAMP 반응은 65℃에서 0.375 ng/μl의 인간 gDNA의 주형 입력 및 50 μM Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약을 사용하여 수행되었다. 도 4a-b에 도시된 실험에서와 달리, 모든 반응물은 Bst 2.0 WarmStart® DNA 중합효소를 함유하였고, 중합효소가 없는 샘플 대신 실제 무주형 대조군 (NTC) 반응이 동시에 실시되었다. 색상 변화는 90분 반응 과정 동안 예정된 간격으로 모니터링되었다. 색상은 15분 표시 시점에서 변화되기 시작되었고, 다음 10분 간격에 걸쳐 이는 적색으로부터 주황색-노란색으로 점진적으로 변화되었고, 이는 시약이 핵산 증폭이 일어남에 따라 연속적으로 색상을 변화시킨다는 것을 입증한다. 90분 기간의 종료시, 주형을 사용한 양성 반응은 여전히 주황색-노란색이었고, 한편 반대로 NTC 반응은 자홍색으로 유지되었고, 이는 킬레이트 측정 염료 5-Br-PAPS 및 그것의 Zn2+ 착물이 통상적인 LAMP 반응 조건하에 연장된 기간 동안 안정적인 것을 입증한다.
도 6a-b 및 도 7은 반응 혼합물에서 Zn2+/5-Br-PAPS 검출을 포함하여 증폭 속도 또는 감도를 방해하지 않음을 입증한다. SARS-CoV-2 RdRP 유전자를 표적화하는 RT-LAMP는 초기에 기재된 바와 같이 50 μM Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약이 있거나 없는 0.5 μM의 핵산-삽입 형광 염료, SYTO 59 (Thermo Fisher Scientific, 미국 메사추세츠주 소재)이 보충된 표준 반응 혼합물에서 수행되었다. 상이한 양의 입력 주형을 시험하였고 (SARS-CoV-2 RNA의 100, 50, 25, 12.5 및 0 카피/μl), 표적 증폭은 AriaMx Real-Time PCR 시스템 (Agilent, 미국 캘리포니아주 소재) 상에서 실시간 (Cy5 채널)으로 모니터링되었다. 반응은 65℃에서 실시되었고, 45분 동안 실시간으로 모니터링되었다. 도 6a-b는 50 μM의 Zn2+/5-Br-PAPS 시약을 사용한 반응 (도 6a)은 시험되는 모든 주형 농도에서 그것이 없는 반응과 유사한 증폭 프로파일 (도 6b, 음영 영역은 ± SEM임)을 나타내는 것을 나타낸다. 반응 시간 (TTR) 평균 ± 표준 편차 (SD)는 다소 높지만, 주형을 가진 모든 샘플은 입력 주형 양과 관계없이 색상을 주황색-노란색으로 변화시켰다. 이는 Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약을 사용하는 비색 검출이 실시간 형광 검출과 비슷한 감도를 나타내는 것을 입증한다.
하기 프라이머를 사용하였고, 하이픈 사이의 서열은 주형 핵산에 상보적이지 않은 링커이다:
인간 RPP30-F3: GTTGCTCAGGCTGGAG (서열 번호 1)
인간 RPP30-B3: ATCCTAGGAGTTTGAGACCA (서열 번호 2)
인간 RPP30-FIP: CCGCTGCTTGAGAGGCTGA-CTTTTATT-CAGCTCACTGCAACCT (서열 번호 3)
인간 RPP30-BIP: TGCACTACCACACCTGGCTATT-AAACATTT-CAACATAGTGAGACCATG (서열 번호 4)
인간 RPP30-LF: AGCGGGAGGATCACTTG (서열 번호 5)
인간 RPP30-LB: TTTTTTCCCTTGTAGAGA (서열 번호 6)
SARS-CoV-2 N-F3: AACACAAGCTTTCGGCAG (서열 번호 7)
SARS-CoV-2 N-B3: GAAATTTGGATCTTTGTCATCC (서열 번호 8)
SARS-CoV-2 N-FIP: TGCGGCCAATGTTTGTAATCAG-CCAAGGAAATTTTGGGGAC (서열 번호 9)
SARS-CoV-2 N-BIP: CGCATTGGCATGGAAGTCAC-TTT-GATGGCACCTGTGTAG (서열 번호 10)
SARS-CoV-2 N-LF: TTCCTTGTCTGATTAGTTC (서열 번호 11)
SARS-CoV-2 N-LB: TTCGGGAACGTGGTTGAC (서열 번호 12)
SARS-CoV-2 RdRP-F3: CTGTGATGCCATGCGAA (서열 번호 13)
SARS-CoV-2 RdRP-B3: CGGTCAAAGAGTTTTAACCTC (서열 번호 14)
SARS-CoV-2 RdRP-FIP: CGTGGTTTGTATGAAATCACCGAAATC-TGTT-GTATTGTTGGTGTACTGAC (서열 번호 15)
SARS-CoV-2 RdRP-BIP: GACCAGGGCTTTAACTGCAGAG-CTTT-ATCCCACTTAATGTAAGGC (서열 번호 16)
SARS-CoV-2 RdRP-LF: AGTTACCATTGAGATCTTGATTATC (서열 번호 17)
SARS-CoV-2 RdRP-LB: CACATGTTGACACTGACTTAACA (서열 번호 18)
실시예 4: Zn
2+
/5-Br-PAPS 검출 시약을 사용하는 PCR 증폭 검출
25 μM의 Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약을 함유하는 반응을 사용하여 SensoQuest Gradient Labcycler (SensoQuest, 독일 소재) 상에서의 PCR 동안 핵산 증폭을 검출하였다. PCR은 70 mM Tris-HCl pH=7.9, 17.5 mM (NH4)2SO4, 1 mM dNTP, 3 mM MgCl2, 0.02% Tween-20 및 50 U/ml HOT FIREpol DNA 중합효소 (01-02-1000, Solis Biodyne, 에스토니아 소재)를 함유하는 반응 버퍼에서 수행되었다. 0.375 ng/μl의 인간 gDNA의 입력 주형 및 인간 RPP30를 표적화하는 프라이머 (둘 모두 500 nM로의 정방향 및 역방향 프라이머)를 사용하여 증폭을 수행하였다. PCR 반응은 하기와 같이 수행되었다: 95℃에서의 10분 고온-시작 이후 용융의 45 사이클 (15초 동안 95℃)과 어닐링/신장 (30초 동안 60℃)을 후속하였다. 도 8에서 알 수 있는 바와 같이, 자홍색을 유지하는 NTC 반응과 달리, gDNA 주형을 사용한 반응은 색상을 자홍색에서 주황색-노란색으로 변화시켰고 이는 Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약이 또한 비-등온 조건하에 예컨대 PCR 동안 핵산 증폭을 검출하기 위해 사용될 수 있다는 것을 입증하였다. NTC 및 주형화 반응 둘 모두에서의 색상 보존은 또한 95℃까지의 가열의 반복된 사이클에 대해 시약의 열안정성을 입증한다.
하기 프라이머가 사용되었다:
인간 RPP30-정방향: AGATTTGGACCTGCGAGCG (서열 번호 19)
인간 RPP30-역방향: GAGCGGCTGTCTCCACAAGT (서열 번호 20)
실시예 5: 반응 완충에 대한 Zn
2+
/5-Br-PAPS 검출 시약의 내성 및 완충된 샘플의 LAMP 증폭에서의 그것의 사용
핵산 증폭 검출을 위한 비색 검출 시스템, 특히 pH-기반 검출에 의존적인 것은 완충된 샘플 또는 가변적 초기 pH를 포함하는 것 (예를 들어, 생물학적 샘플 예컨대 타액)과의 반응 실패에 취약하며, 이는 정제되지 않은 샘플과의 그것의 사용을 금지하고 있는 것은 선행 기술로부터 알려져 있다. 이러한 제한은 또한 증폭 전반에 걸친 적절한 반응 혼합물 완충을 배제하며 이는 최적이하의 증폭 동역학 및/또는 감도를 초래할 수 있다. Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약이 기능하게 하는 그것의 관련된 pH 감소로의 유리 하이드로늄 이온 축적에 의존하지 않기 때문에, 이 시약을 이용하는 반응은 또한 반응 혼합물에서 강한 완충을 견딜 수 있을 뿐만 아니라 입력 샘플의 신장도 견딜 수 있다. 이러한 특성의 조합은 그 자체를 특히 다양한 수준의 pH/버퍼링 능력을 갖는 생물학적 기질에서의 선행 핵산 단리가 없는 직접적인 병원체 검출과 같은 기술에 특히 적합하게 한다. 하기 반응은 본 발명의 비색 검정이 pH 변화와 관련하여 견고한 것을 나타내도록 설정되었고, 그 이유는 그것이 반응 혼합물 및 입력 샘플에서 둘 모두에서 바람직하게는 1.5 mM Tris 또는 이와 동등물에 비해 더 높은 버퍼를 수용하기 때문이다.
LAMP 반응은 그의 설명에서 지적된 특정 실험에서 일부 약간 수정되어 실시예 3에 기재된 것과 동일한 방식으로 수행되었다. 모의 LAMP 반응은 특정 양의 Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약이 첨가되는 일반 LAMP와 동일한 기본 조성을 가졌다. 모의 샘플을 제조하기 위해, 50 부피%의 2x 마스터 혼합물 (40 mM Tris-HCl pH=7.9, 40 mM KCl, 120 mM, GuCl, 18 mM MgSO4, 0.2% Tween-20, 0.1% Triton X-100)을 25 부피%의 물 또는 상이한 pH 10 mM 버퍼 (pH = 5, 6 - 10 mM 시트르산나트륨; pH = 7, 8, 9 - 10 mM Tris-HCl; 2.5 mM 최종 농도) 및 25 부피%의 물 (모의 음성 샘플) 또는 16 mM 나트륨 피로포스페이트 (모의 양성 샘플, 4 mM 최종 농도)와 혼합되었다.
도 9a-b 및 10은 pH 변화에 의존적인 것에 대한 Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약의 제안된 장점을 나타낸다. LAMP는 30분 동안 65℃에서 입력으로서 0.375 ng/μl의 인간 gDNA 및 0.5 μM의 SYTO 59를 사용하여 인간 RPP30을 증폭시키기 위해 사용되었다. AriaMx Real-Time PCR 시스템을 사용하여 실시간 (Cy5 채널)으로 반응을 모니터링하였다. 50 μM의 Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약을 반응 혼합물에서 상이한 농도의 Tris-HCl 버퍼를 갖는 100 μM의 페놀 레드 (pH-민감성 지시약) 및 50 μM의 5-Br-PAPS 단독 (Zn2+ 없음)과 비교하였다. 도 9a-b가 입증하는 바와 같이, 모든 조건하에서 시험된 증폭 (실시간 형관 검출에 의해 평가됨)은 주형이 존재하는 경우에 일어났다. 또한, 더 높은 농도의 Tris-HCl 버퍼가 Zn2+/5-Br-PAPS-기반 및 페놀 레드-기반 검출 둘 모두에 대해 더 빠른 증폭 시간 (더 낮은 TTR)을 야기하였고 (도 9b), 이에 따라 반응을 더 강하게 완충된 것으로 유지하는 것이 유리한 것으로 밝혀졌다. 그러나, 강한 완충 (20 mM Tris-HCl, pH=7.9)을 사용하면, pH-의존적 검출은 실시간 검출 (도 9a)에 따른 성공적인 증폭에도 불구하고 색상을 변화시키는 데 실패하였다 (도 10). 반면, Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약은 Tris-HCl 농도와 관계없이 일관된 색상 전이를 보여주었다. Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약의 관찰된 색상 변화는 5-Br-PAPS 자체가 주황색-노란색이고, 증폭으로 색상을 변화시키지 못하기 때문에 출발 반응 혼합물에서의 Zn2+의 존재에 완전하게 의존적이었음을 유의한다. 전체적으로, Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약은 핵산 증폭을 검출하기 위해 pH 변화에 의존적이지 않고, 초저강도 및 고강도 버퍼 둘 모두에서 작용한다.
도 11a에서, Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약 (25 μM)의 스펙트럼 분석 (실시예 1에 기재된 바와 같이 수행됨)은 모의 양성 샘플 (실선, 4 mM PPi 사용) 또는 모의 음성 샘플 (점선, PPi 없음)에서 보여질 수 있다. 일반적으로 사용되는 pH 수준에서 25%의 최종 LAMP 반응 혼합물 부피를 10 mM 버퍼 용액으로 대체하는 것으로 PPi의 존재 또는 부재하에 흡수 스펙트럼에 상당한 영향을 미치지 못하였다. 도 9b에서 알 수 있는 바와 같이, 이러한 색상 변화의 결여는 Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약의 더 낮은 그리고 더 높은 농도 둘 모두에서 시각적으로 잘 관측가능하였다.
도 12a-c에서, 인간 RPP30을 표적화하는 LAMP는 30분 동안 65℃에서 0.375 ng/μl의 인간 gDNA의 주형 입력, 0.5 μM의 SYTO 59 및 50 μM Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약을 사용하여 수행되었다. 입력 gDNA (25%의 최종 반응 부피)는 모의 샘플 제조에서 사용되는 바와 같이 물 또는 10 mM 버퍼에서 희석되었고, 표적 증폭은 실시간 (Cy5 채널)으로 AriaMx Real-Time PCR 시스템 상에서 모니터링되었다. gDNA 주형을 사용하는 모든 복제물은 희석제와 관계없이 성공적으로 증폭되었다 (도 12a). 개별 용해 매질 간에 반응 시간 (TTR, 도 12b)에서의 일부 약간의 차이가 존재하는 한편, 버퍼의 포함으로 증폭 및 색상 변화 (도 12c)가 일어나는 것이 방해받지 않았고, 이는 입력 샘플 완충 능력 및 pH와 관련한 Zn2+/5-Br-PAPS 검출 시약의 견고성을 확인하였다. 사실상, TTR 및 재현가능성 (즉, 복제물 간의 변동성)과 관련하여, 모든 시험된 버퍼는 물-단독 대조군의 성능과 일치하거나 이를 능가하였다.
요컨대, 본 발명자들은 놀랍게도 아연 이온과 조합되는 5-Br-PAPS가 반응 혼합물에서의 핵산 증폭을 검출하기 위해 사용될 수 있음을 나타낼 수 있었다.
실시예 6: LAMP에서의 LNA-포함 프라이머의 사용은 반응 시간 및 특이성을 개선한다
본원에 기재된 F3/B3 LAMP 프라이머에서의 그것의 LNA 변이체로의 특정 염기의 대체는 LAMP 반응 동역학 및 표적 인식을 상당하게 변경할 수 있다. 구체적으로, F3/B3 프라이머의 5' 말단 근처에의 예정된 수의 LNA 염기의 도입은 특이성을 동시에 증가시키면서 반응 시간 (TTR)을 상당하게 감소시키고, 두 특성은 잠재적인 등온 진단 테스트에서 바람직하다. 이는 양성 반응 시간을 단축하여 이에 따라 참 및 거짓 양성 결과 사이의 윈도우를 넓히는 데 유용할 수 있으며, 이는 LAMP와 같은 등온 방법에 문제가 될 수 있다. LAMP 프라이머에 LNA-변형된 염기를 혼입하는 것은 또한 프라이머 용융 온도 (Tm)를 정규화하고 A,T 또는 G,C가 풍부한 목적하는 주형 또는 높은 비율의 돌연변이를 갖는 유기체 (예를 들어, SARS-CoV-2 및 인플루엔자)를 표적화하는 경우 LAMP 프라이머 설계에서 유연성을 제공하는 데 유리하다. 본 기술분야의 당업자는 프라이머로의 LNA 혼입이 LAMP 표적 증폭 동안 프라이머 상호작용의 복합적인 특징으로 인해 주로 프라이머의 용융 온도 (Tm)를 증가시킴으로써 개선된 표적 혼성화율을 초래할 수 있고, 프라이머 기본 조성에 대한 의도하지 않은 변화는 LAMP 증폭 동안 유리한 효과를 초래할 것으로 예상되지 않고, 비-특이적 상호작용 및 증폭을 촉진하고 중합효소의 가닥 변위 활성을 방해할 수 있다는 사실을 인식할 수 있다.
달리 특정되지 않는 한, 하기 기재된 모든 실험에서, LAMP 증폭은 하기와 같이 수행되었다. 반응 혼합물은 WarmStart Colorimetric RT-LAMP 2X MasterMix (M1800, New England Biolabs, 미국 메사추세츠주 소재) 및 6개의 특이적 LAMP 프라이머로 이루어진 10x 프라이머 혼합물을 혼합함으로써 제조되었다. SARS-CoV-2 유전자 E (세트 E1, E2, E3), RdRP (세트 R1) 및 N (세트 N1)을 표적화하는 염기 LAMP 프라이머 세트는 선행 기술로부터 알려진 권장사항을 따르도록 설계되었다. LAMP 프라이머의 최종 반응 농도는 하기와 같다: FIP/BIP - 1600 nM, F3/B3 - 200 nM, LF/LB - 600 nM. 모든 검정은 20 μl 반응 부피를 이용하였다. 모든 반응은 또한 0.05% Triton X-100, 1 mM 과량의 MgCl2 (최종 농도 9 mM), 및 1 μM의 핵산-삽입 염료, SYTO 9 (Thermo Fischer Scientific, 미국 메사추세츠주 소재)로 보충되었다. 65℃에서 수행된 반응은 또한 40 mM 구아니딘 이소티오시아네이트 및 0.8 M 베타인을 포함하였다. 양성 시험 반응은 인간 게놈 DNA (COV019, Exact Diagnostics, 미국 캘리포니아주 소재; RNA 카피/rxn가 < 200이었을 경우) 또는 순수 SARS-CoV-2 RNA (102019, Twist Bioscience, 미국 캘리포니아주 소재; RNA 카피/rxn가 ≥ 200이었을 경우)와 혼합된 SARS-CoV-2 RNA를 함유하였다. 반응이 설정되었을 때, 이는 프라이머 세트-/조건-특이적 온도에서 실시되었고, Agilent AriaMx Real-Time PCR 시스템 (Agilent, 미국 캘리포니아주 소재) 상에서 증폭시켰다. 증폭 공정은 SYTO 9 형광 (FAM 채널)의 변화를 측정함으로써 30분마다 연속적으로 모니터링되었고, 반응은 90분 후에 종료되었다. 반응 시간 (TTR, 사이클 임계값 / 2)은 기본 설정을 사용하는 Agilent Aria 1.7.1 소프트웨어 (Agilent, 미국 캘리포니아주 소재)에 의해 자동적으로 결정되었다. 생성된 엠플리콘의 용융 곡선 분석은 또한 특이적 생성물을 비-특이적 생성물로부터 구분하기 위해 사용되었다. 구체적으로, 생성물은 그것의 Tm이 각 시험된 프라이머 세트에 대해 내부적으로 확입된 바와 같은 높은 주형 농도 반응에서 관찰되는 생성물의 평균 ± 0.5℃ 범위 내에 있었을 경우에 특이적인 것으로 간주되었다. 증폭이 없는 복제물은 도면 중 어느 하나에서도 도시되지 않았으며 예를 들어 평균 ± SD와 같은 기술 통계의 계산으로부터 생략되었다.
도 13에서, 4개의 상이한 LAMP 프라이머 세트 (E1, E2, R1, N1)는 RT-LAMP에서 사용되어 SARS-CoV-2 게놈으로부터의 표적 서열을 증폭시켰다. 외부 프라이머, F3/B3의 5' 말단에서의 LNA 염기 치환은 표준 LAMP 프라이머 세트와 비교되었다. 주형을 사용한 반응은 반응당 주형의 400 (E1, E2), 100 (R1) 또는 25 (N1) 카피를 포함하였다. 반응 온도는 60℃ (E1, E2) 또는 65℃ (R1, N1)이었고, 증폭은 90분 동안 진행되도록 두었다. 폐쇄형 기호는 주형을 사용한 샘플을 나타내고, 한편 개방형 기호는 NTC 반응을 나타낸다. 괄호 내의 숫자는 성공적으로 증폭된 주형을 사용한 복제의 수를 나타낸다. 도면은 모든 시험된 프라이머 세트에서 5' 말단 근처에의 LNA의 도입으로 LAMP 세트 성능의 모든 조사된 평가지표(metric)를 개선하였음을 분명하게 나타낸다. LNA를 사용한 세트는 감소된 TTR (배수-변화 대 비변형된 세트로서 도시됨) 및 변동성 (오차 막대로 표시되는 SD)뿐만 아니라 개선된 감도를 제시하는 변화되지 않은 또는 증가된 증폭 성공을 보여주었다. 결정적으로, 비-특이적 증폭에 대한 성향은 LNA 치환이 있는 세트에서 상당하게 증가하지 않았다.
외부 LAMP 프라이머로의 5' LNA 혼입의 유리한 효과는 견고하며 도 14에 입증된 바와 같이 변형된 특정 염기에 의존적이지 않다. RT-LAMP는 세트 E3와 결합하여 사용하여 90분 동안 60℃에서 SARS-CoV-2 E 유전자 (변형된 세트에 대한 반응마다 주형의 400개 카피, 염기 E3 세트에 대해 800개 카피)를 증폭시켰다. 그것의 서열 내의 LNA 염기의 수/위치에 있어서 유일하게 차이가 있는 LNA-변형된 F3/B3 프라이머 (2개의 F3 프라이머 및 2개의 B3 프라이머, [1] 또는 [2]로 표지됨)의 4개의 상이한 조합은 무 LNA 변형의 염기 세트와 비교되었다. 알 수 있는 바와 같이, 모든 단일 변이체는 두 배 많은 주형을 사용하여 비변형된 세트를 실시하였음에도 불구하고 상기 기재된 바와 같이 개선된 수행 특성을 보여주었다.
도 15에서, RT-LAMP는 세트 E1을 사용하여 수행하여 FIP, BIP, LF 및 LB가 그것의 5' 말단 근처에서 LNA로 변형되는 세트와 염기 세트를 비교하였다. FIP/BIP 프라이머의 경우, F2/B2 및 F1c/B1c 세그먼트 둘 모두는 변형되었다. 반응은 주형의 400개 카피를 포함하였고, 90분 동안 60℃에서 실시되었다. 알 수 있는 바와 같이, 이러한 프라이머 세트에서의 LNA 변형은 LAMP 증폭 성능의 무변화 또는 상당한 악화를 초래한다. TTR은 더 높고 (더 느리고), 변동성은 더 높고, 감도 (증폭된 복제의 수)는 더 낮거나 변화되지 않는다. 이는 LNA 치환 효과가 LAMP 프라이머-특이적이고, 프라이머 혼성화 거동에 대한 LNA의 일반적 효과의 결과가 아님을 보여준다. 요약하면, F3/B3 이외의 프라이머 내의 LNA는 LAMP 증폭 및/또는 표적 인식을 손상시키고, 이에 따라 F3/B3 프라이머와 달리, 다른 LAMP 프라이머의 변형은 지속적으로 바람직한 효과를 초래할 것으로 예상되지 않는다.
하기 프라이머가 사용되었고, 여기서 (+N)은 LNA의 형태의 해당하는 염기를 도시하고, 하이픈 사이의 서열은 주형 핵산에 상보적이지 않은 링커이다:
SARS-CoV-2 E1-F3: CGTTTCGGAAGAGACAGGT (서열 번호 21)
SARS-CoV-2 E1-LNA(F3): CG(+T)T(+T)CGGAAGAGACAGGT (서열 번호 22)
SARS-CoV-2 E1-B3: GACCAGAAGATCAGGAACT (서열 번호 23)
SARS-CoV-2 E1-LNA(B3): G(+A)CC(+A)G(+A)AGATCAGGAACT (서열 번호 24)
SARS-CoV-2 E1-FIP: CGCAGTAAGGATGGCTAGTGT-TTTTT-ATAGCGTACTTCTTTTTCTTGCTT (서열 번호 25)
SARS-CoV-2 E1-LNA(FIP): CGC(+A)G(+T)AAGGATGGCTAGTGT-TTTTT-(+A)(+T)AGCG(+T)ACTTCTTTTTCTTGC (서열 번호 26)
SARS-CoV-2 E1-BIP: CTTCGATTGTGTGCGTACTGCTG-T-TTCAGATTTTTAACACGAGAG (서열 번호 27)
SARS-CoV-2 E1-LNA(BIP): CT(+T)CGATTGTGTGCGTACTGCTG-T-(+T)(+T)CAG(+A)(+T)TTTTAACACGAGAG (서열 번호 28)
SARS-CoV-2 E1-LF: ACTAGCAAGAATACCACGAA (서열 번호 29)
SARS-CoV-2 E1-LNA(LF): AC(+T)(+A)GC(+A)AGATAACCACGAA (서열 번호 30)
SARS-CoV-2 E1-LB: CGTGAGTCTTGTAAAACCTTC (서열 번호 31)
SARS-CoV-2 E1-LNA(LB): CG(+T)G(+A)GTCTTGTAAAACCTTC (서열 번호 32)
SARS-CoV-2 E2-F3: TGTACTCATTCGTTTCGGAAG (서열 번호 33)
SARS-CoV-2 E2-LNA(F3): TG(+T)AC(+T)CATTCGTTTCGGAAG (서열 번호 34)
SARS-CoV-2 E2-B3: CAGGAACTCTAGAAGAATTCAGA (서열 번호 35)
SARS-CoV-2 E2-LNA(B3): C(+A)G(+G)A(+A)CTCTAGAAGAATTCAGA (서열 번호 36)
SARS-CoV-2 E2-FIP: CGCAGTAAGGATGGCTAGTGTA-TTTT-GCGTACTTCTTTTTCTTGCTT (서열 번호 37)
SARS-CoV-2 E2-LNA(FIP): CGC(+A)G(+T)AAGGATGGCTAGTGTA-TTTT-GCG(+T)(+A)CTTCTTTTTCTTGCTT (서열 번호 38)
SARS-CoV-2 E2-BIP: CTTCGATTGTGTGCGTACTGC-ATTT-CGAGAGTAAACGTAAAAAGAAGGT (서열 번호 39)
SARS-CoV-2 E2-LNA(BIP): C(+T)(+T)CGATTGTGTGCGTACTGC-ATTT-CG(+A)GAGTAAACGTAAAAAGAAGGT (서열 번호 40)
SARS-CoV-2 E2-LF: ACTAGCAAGAATACCACGAA (서열 번호 41)
SARS-CoV-2 E2-LNA(LF): (+A)C(+T)(+A)GCAAGAATACCACGA (서열 번호 42)
SARS-CoV-2 E2-LB: CGTGAGTCTTGTAAAACCTTC (서열 번호 43)
SARS-CoV-2 E2-LNA(LB): (+T)GC(+A)A(+T)ATTGTTAACGTGAG (서열 번호 44)
SARS-CoV-2 E3-F3: TACTCATTCGTTTCGGAAGAG (서열 번호 45)
SARS-CoV-2 E3-LNA(F3) [1]: (+T)AC(+T)CATTCGTTTCGGAAGAG (서열 번호 46)
SARS-CoV-2 E3-LNA(F3) [2]: T(+A)CTC(+A)TTCGTTTCGGAAGAG (서열 번호 47)
SARS-CoV-2 E3-B3: CAGGAACTCTAGAAGAATTCAGA (서열 번호 48)
SARS-CoV-2 E3-LNA(B3) [1]: C(+A)G(+G)A(+A)CTCTAGAAGAATTCAGA (서열 번호 49)
SARS-CoV-2 E3-LNA(B3) [2]: C(+A)GG(+A)ACTCTAGAAGAATTCAGA (서열 번호 50)
SARS-CoV-2 E3-FIP: GTAAGGATGGCTAGTGTAACTAGC-CAGGTACGTTAATAGTTAATAGCG (서열 번호 51)
SARS-CoV-2 E3-BIP: GCTTCGATTGTGTGCGTACT-CGAGAGTAAACGTAAAAAGAAGG (서열 번호 52)
SARS-CoV-2 E3-LF: CCACGAAAGCAAGAAAAAGAAG (서열 번호 53)
SARS-CoV-2 E3-LB: GCTGCAATATTGTTAACGTGAG (서열 번호 54)
SARS-CoV-2 R1-F3: CTGTGATGCCATGCGAA (서열 번호 55)
SARS-CoV-2 R1-LNA(F3): C(+T)G(+T)GATGCCATGCGAA (서열 번호 56)
SARS-CoV-2 R1-B3: CGGTCAAAGAGTTTTAACCTC (서열 번호 57)
SARS-CoV-2 R1-LNA(B3): C(+G)G(+T)CA(+A)AGAGTTTTAACCTC (서열 번호 58)
SARS-CoV-2 R1-FIP: CGTGGTTTGTATGAAATCACCGAAATC-TGTT-GTATTGTTGGTGTACTGAC (서열 번호 59)
SARS-CoV-2 R1-BIP: GACCAGGGCTTTAACTGCAGAG-CTTT-ATCCCACTTAATGTAAGGC (서열 번호 60)
SARS-CoV-2 R1-LF: AGTTACCATTGAGATCTTGATTATC (서열 번호 61)
SARS-CoV-2 R1-LB: CACATGTTGACACTGACTTAACA (서열 번호 62)
SARS-CoV-2 N1-F3: AACACAAGCTTTCGGCAG (서열 번호 63)
SARS-CoV-2 N1-LNA(F3): A(+A)C(+A)CAAGCTTTCGGCAG (서열 번호 64)
SARS-CoV-2 N1-B3: GAAATTTGGATCTTTGTCATCC (서열 번호 65)
SARS-CoV-2 N1-LNA(B3): G(+A)(+A)ATT(+T)GGATCTTTGTCATCC (서열 번호 66)
SARS-CoV-2 N1-FIP: TGCGGCCAATGTTTGTAATCAG-CCAAGGAAATTTTGGGGAC (서열 번호 67)
SARS-CoV-2 N1-BIP: CGCATTGGCATGGAAGTCAC-TTT-GATGGCACCTGTGTAG (서열 번호 68)
SARS-CoV-2 N1-LF: TTCCTTGTCTGATTAGTTC (서열 번호 69)
SARS-CoV-2 N1-LB: ACCTTCGGGAACGTGGTT (서열 번호 70)
SEQUENCE LISTING
<110> MultiplexDX, s.r.o.
<120> LOOP MEDIATED ISOTHERMAL NUCLEIC ACID AMPLIFICATION (LAMP) USING
LNA-MODIFIED PRIMERS AND A METAL-BASED COLORIMETRIC METHOD FOR
DETECTING AN AMPLIFICATION PRODUCT
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<151> 2020-11-10
<150> US63120652
<151> 2020-12-02
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<213> Artificial
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<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SARS-CoV-2 E3-BIP
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gcttcgattg tgtgcgtact cgagagtaaa cgtaaaaaga agg 43
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<213> Artificial
<220>
<223> SARS-CoV-2 E3-LF
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ccacgaaagc aagaaaaaga ag 22
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<213> Artificial
<220>
<223> SARS-CoV-2 E3-LB
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<213> Artificial
<220>
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<223> SARS-CoV-2 R1-FIP
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agttaccatt gagatcttga ttatc 25
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<223> SARS-CoV-2 R1-LB
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<213> Artificial
<220>
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<222> (7)..(7)
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<220>
<223> SARS-CoV-2 N1-FIP
<400> 67
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<220>
<223> SARS-CoV-2 N1-BIP
<400> 68
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<220>
<223> SARS-CoV-2 N1-LF
<400> 69
ttccttgtct gattagttc 19
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> SARS-CoV-2 N1-LB
<400> 70
accttcggga acgtggtt 18
Claims (15)
- 루프 매개 등온 증폭 (LAMP) 방법으로서,
(i) 제1 내부 프라이머 (FIP) 뉴클레오티드 서열 및 제2 내부 프라이머 (BIP) 뉴클레오티드 서열,
(ii) 제1 외부 프라이머 (F3) 뉴클레오티드 서열 및 제2 외부 프라이머 (B3) 뉴클레오티드 서열로서, 여기서 상기 F3 뉴클레오티드 서열 및/또는 상기 B3 뉴클레오티드 서열은 각각 상기 F3 뉴클레오티드 서열 또는 상기 B3 뉴클레오티드 서열의 처음 3분의 1 내에 위치하는 하나 이상의 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오티드를 포함하는, 제1 외부 프라이머 (F3) 뉴클레오티드 서열 및 제2 외부 프라이머 (B3) 뉴클레오티드 서열,
(iii) 상기 주형 핵산으로부터 상보적 핵산 가닥을 합성하는 가닥-변위-유형 반응을 촉매화하는 DNA 중합효소, 및
(iv) 상기 DNA 중합효소에 대한 기질로서 역할을 하는 뉴클레오티드
를 포함하는 반응 혼합물에서,
적어도 FIP 뉴클레오티드 서열 및 BIP 뉴클레오티드 서열이 상기 주형 핵산에 포함된 그것의 상보적 뉴클레오티드 서열과 안정한 염기쌍을 형성할 수 있으면서 한편 DNA 중합효소 활성이 유지될 수 있는 이러한 온도에서 주형 핵산 서열로부터 핵산 서열을 합성하는 단계를 포함하고, 이에 의해 핵산 서열을 합성하는, 루프 매개 등온 증폭 (LAMP) 방법. - 제1항에 있어서,
(i) 상기 FIP 뉴클레오티드 서열은 적어도 2개의 영역 F2 및 F1c를 포함하고, 여기서 상기 F1c 영역은 F2 영역의 5'-측에 연결되고,
상기 F2 영역은 상기 주형 핵산 서열에서 임의의 영역 F2c에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖고,
상기 F1c 영역은 상기 주형 핵산 서열에서 상기 F2c 영역의 5'-측에 위치한 영역 F1c와 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖고,
(ii) 상기 BIP 뉴클레오티드 서열은 적어도 2개의 영역 B2 및 B1c를 포함하고,
여기서 상기 B1c 영역은 B2 영역의 5'-측에 연결되고,
상기 B2 영역은 상기 주형 핵산 서열 가닥에서 임의의 영역 B2c에 대해 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖고,
상기 B1c 영역은 상기 주형 핵산 서열에서 상기 영역 B2c의 5'-측에 위치한 영역 B1c와 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖고;
(iii) 상기 F3 뉴클레오티드 서열은 상기 주형 핵산 서열에서 영역 F3c에 대해 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖고,
여기서 영역 F3c는 상기 주형 핵산 서열에서 영역 F2c의 3'-측에 위치하고,
영역 F2c는 상기 주형 핵산 서열에서 영역 F1c의 3'-측에 위치하고; 및/또는
(iv) 상기 B3 뉴클레오티드 서열은 주형 핵산 서열에서 영역 B3c에 대해 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열을 갖고,
여기서 영역 B3c는 상기 주형 핵산 서열에서 영역 B2c의 3'-측에 위치하고,
영역 B2c는 상기 주형 핵산 서열에서 영역 B1c의 3'-측에 위치하는 것인 방법. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
(i) 상기 반응 혼합물은 추가로 루프 프라이머 뉴클레오티드 서열 F 및/또는 루프 프라이머 뉴클레오티드 서열 B를 포함하고;
(ii) 상기 반응 혼합물은 추가로 스템 프라이머 뉴클레오티드 서열 F 및/또는 스템 프라이머 뉴클레오티드 서열 B를 포함하고;
(iii) 상기 반응 혼합물은 추가로 스웜 프라이머 뉴클레오티드 서열 F1S 및/또는 스웜 프라이머 뉴클레오티드 서열 B1S를 포함하고;
(iv) 상기 반응 혼합물은 적어도 추가의 제1 내부 프라이머 (FIP2) 뉴클레오티드 서열 및 추가의 제2 내부 프라이머 (BIP2) 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 이 둘 모두는 상기 FIP 및 BIP 뉴클레오티드 서열과 상이하고;
(v) 상기 반응 혼합물은 추가로 다중 교차 변위 증폭 LAMP로서 상기 방법을 수행하기 위한 프라이머 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 및/또는
(vi) 상기 반응 혼합물은 추가로 역전사 등온 다중 셀프 매칭 LAMP로서 상기 방법을 수행하기 위한 프라이머 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) 상기 주형 핵산 서열은 단일 가닥 또는 이중 가닥이고;
(ii) 상기 주형 핵산 서열은 단일- 또는 이중-가닥 DNA, RNA 또는 DNA/RNA 키메라이고;
(iii) 상기 DNA 중합효소는 DNA-의존적 DNA 중합효소 또는 RNA-의존적 DNA 중합효소이고;
(iv) 상기 DNA 중합효소는 역전사효소 활성을 갖는 것인 방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) 상기 F3 뉴클레오티드 서열은 15-30개, 바람직하게는 17-25개의 뉴클레오티드 길이를 갖고; 및/또는
(ii) 상기 B3 뉴클레오티드 서열은 15-30개, 바람직하게는 17-25개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 것인 방법. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
(i) 상기 F3 뉴클레오티드 서열은 1-5개, 바람직하게는 3개의 LNA 뉴클레오티드를 포함하고; 및/또는
(ii) 상기 B3 뉴클레오티드 서열은 1-5개, 바람직하게는 3개의 LNA 뉴클레오티드를 포함하는 것인 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 반응 혼합물은 추가로 용융 온도를 위한 조절제, 예를 들어, 바람직하게는 0.2 M 내지 3.0 M의 농도의 베타인, 바람직하게는 0.02 % 내지 0.2 %의 농도의 Tween-20/Triton-X, 바람직하게는 20 mM 내지 80 mM의 농도의 구아니딘 티오시아네이트 또는 하이드로클로라이드, 바람직하게는 0.02 mg/ml 내지 2 mg/ml의 농도의 단일-가닥 결합 단백질 (SSB), BSA, 바람직하게는 5 mM 내지 80 mM의 농도의 TMAC, 및/또는 바람직하게는 0.5 mM 내지 5 mM의 농도의 TCEP/DTT를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 추가로 핵산 서열 합성 반응의 생성물을 검출하기 위한 검출약을 포함하고, 바람직하게는 상기 검출약은 금속착색 지시약이고, 보다 바람직하게는 검출약은 추가로 전이 금속 또는 전이후 금속을 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 검출약은 금속 이온, 바람직하게는 전이 금속 또는 전이후 금속 이온, 보다 바람직하게는 Zn2+, Cu2+, Co2+, Ni2+, Pt2+, Ru2+, Rh2+, 및/또는 Fe2+ 이온, 가장 바람직하게는 Zn2+ 이온과 조합되는 금속착색 지시약, 바람직하게는 2-(5-브로모-2-피리딜아조)-5-[N-프로필-N-(3-설포프로필)아미노]페놀 (5-Br-PAPS), PAR 또는 진콘이고, 상기 금속착색 지시약 및 각각의 상기 금속 이온은 착물을 구성하지만 마그네슘과 구성하지 않고,
상기 방법은 추가로
(b) 상기 핵산 서열의 증폭으로부터 생성된 착물의 스펙트럼 또는 형광 특성의 변화를 검출하는 단계를 포함하는 것인 방법. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은
(a) 핵산 서열을 합성하거나,
(b) 핵산 서열을 검출하거나, 또는
(c) 바람직하게는 병원체에 의해 야기된 질환을 진단하기 위한 것인 방법. - 핵산 서열 증폭 생성물을 검출하기 위한 시험관내 방법으로서,
(a) 주형 핵산 서열, 프라이머 뉴클레오티드 서열, 뉴클레오티드 및 상기 핵산 분자를 증폭시킬 수 있는 중합효소를 포함하는 반응 혼합물을 금속착색 지시약 및 전이 또는 전이후 금속 이온과 접촉시키는 단계로서, 상기 금속착색 지시약 및 상기 전이 또는 전이후 금속 이온은 착물을 구성하지만, 마그네슘과 착물을 구성하지 않는 것인 단계;
(b) 핵산 서열 증폭 생성물을 얻기 위한 적합한 조건하에서 상기 핵산 서열을 증폭시키는 단계;
(c) 상기 핵산 서열의 증폭으로부터 생성된 착물의 스펙트럼 특성의 변화를 검출하는 단계로서, 상기 금속착색 지시약 및 상기 전이 또는 전이후 금속 이온을 포함하는 상기 착물의 형성은 용액의 색상 변화를 초래하는 것인 단계
를 포함하는 핵산 서열 증폭 생성물을 검출하기 위한 시험관내 방법. - 제11항에 있어서,
(i) 상기 금속착색 지시약은 2-(5-브로모-2-피리딜아조)-5-[N-프로필-N-(3-설포프로필)아미노]페놀 (5-Br-PAPS)이고;
(ii) 상기 금속 이온은 Zn2+ 이온이고; 및/또는
(iii) 상기 착물의 스펙트럼 특성의 상기 변화는 380 내지 740 nm 파장의 스펙트럼 내에 있는 것인 방법. - 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 증폭은 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 정의된 방법에 의해 수행되는 것인 방법.
- 주형 핵산 서열에 대해 루프 매개 등온 증폭 (LAMP)에 의한 핵산 서열의 합성을 위한 키트로서,
(i) 각각 잠금 핵산 (LNA) 뉴클레오티드를 포함하는, 제1 외부 프라이머 (F3) 뉴클레오티드 서열 및 제2 외부 프라이머 (B3) 뉴클레오티드 서열, 및/또는 임의로
(ii) 제1 내부 프라이머 (FIP) 뉴클레오티드 서열 및 제2 내부 프라이머 (BIP) 뉴클레오티드 서열, 및/또는 임의로
(iii) 상기 주형 핵산으로부터 상보적 핵산 가닥을 합성하는 가닥-변위-유형 반응을 촉매화하는 DNA 중합효소, 및/또는 임의로
(iv) 상기 DNA 중합효소에 대한 기질로서 역할을 하는 뉴클레오티드, 및/또는 임의로
(v) 금속착색 지시약, 바람직하게는 5-Br-PAPS, PAR 또는 진콘; 및/또는 임의로
(vi) 금속 이온, 바람직하게는 Zn2+ 이온
를 포함하는 키트. - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 방법을 수행하기 위한 제14항의 키트의 용도.
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