CN110592192A

CN110592192A - 延迟性焦磷酸化激活性聚合反应

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Publication number: CN110592192A
Application number: CN201910447145.9A
Authority: CN
Inventors: 丁少峰; 刘强
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-06-12
Filing date: 2019-05-27
Publication date: 2019-12-20
Also published as: US20200362401A1; US11268140B2

Abstract

在大拷贝数野生型基因组DNA存在的情况下，当扩增小拷贝数癌细胞特异性突变时，常见的突变靶标基因和野生型对照基因之间的拷贝数比率为1/10000以下，这是早期癌症检测中的一个难题。为解决这一难题，我们发明了延迟性焦磷酸化激活性聚合反应(延迟性PAP)，可以将野生型基因的扩增产物积累延迟到更晚的时间或周期,例如延迟15个周期或30，000倍,因此可在低模板拷贝数比率的情况下准确可靠地扩增内对照以及靶标模板。

Description

延迟性焦磷酸化激活性聚合反应

序列表

本申请同时提交序列表。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及用于扩增核酸的焦磷酸化激活性聚合反应(PAP)。

背景技术

现有技术的描述

PAP技术用于核酸扩增

焦磷酸化激活性聚合反应(Pyrophosphorolysis activated polymerization,PAP)是一种使用3'末端阻断性引物，利用DNA聚合酶的焦磷酸化反应串联耦合聚合反应的一种核酸扩增方法(Liu and Sommer,2000；Liu and Sommer,2004b)。其引物在3'末端由具有不可延伸性的核苷酸(3'末端阻断剂)例如双脱氧核苷酸所封闭,因此不能直接被DNA聚合酶所延伸。当3'末端被阻断的引物与其互补性DNA模板杂交时，在焦磷酸或其类似物的存在下DNA聚合酶可以去除3'末端阻断性引物上的3'末端阻断剂，这一反应称为焦磷酸化反应。然后DNA聚合酶能沿着已去除3'末端阻断剂的引物而延伸DNA模板。除了本文所引用的参考文献，PAP已经在美国专利6,534,269,7,033,763,7,105,298,7,238,480,7,504,221,7,914,995和7,919,253中所描述。

在PAP中使用了3'末端阻断性引物，使得焦磷酸化反应和聚合反应的串联耦合具有极高的选择性(Liu and Sommer,2004a；Liu and Sommer,2004b)，因为一个显著的可导致假阳性的非特异性扩增(第二类错误)需要错配性焦磷酸化反应加上随后发生的由DNA聚合酶而产生的错误掺入性延伸反应,因此这种串联错误事件的发生概率估计为3.3×10^-11。

双向形式的PAP(Bi-PAP)特别适用于等位基因的特异性扩增，使用两个相对应的3'末端阻断性引物，其3'末端的单个核苷酸相互重叠(Liu and Sommer，2004a；Liu andSommer，2004b)。Bi-PAP可以在10⁹个野生型DNA模板存在的情况下检测到一个拷贝等位基因的突变而没有假阳性扩增。

DNA-PAP

PAP的最初测试采用了人类多巴胺D1基因DNA模板并使用了Tfl和Taq聚合酶，证明了DNA依赖性DNA焦磷酸化反应和DNA依赖性DNA聚合反应可以串联耦合(Liu and Sommer,2000)。当使用一个经过基因工程改造含有F667Y突变的DNA聚合酶TaqFS时可大大提高PAP的效率，这已被应用于其它DNA模板时所证明(Liu and Sommer,2002)。

RNA-PAP

此后发明的RNA-PAP可直接扩增RNA模板而无需额外的制备。RNA-PAP开创了RNA模板扩增的新机制，其中RNA依赖性DNA焦磷酸化反应移除了杂交于RNA模板上阻断性引物的3'末端阻断剂如3'末端双脱氧核苷酸，然后RNA依赖性DNA聚合反应则延伸被激活的引物。基于这种串联偶联，RNA-PAP对RNA模板上的不匹配的阻断性引物具有高度的选择性，导致了RNA模板的高度特异性扩增(美国专利号9,133,491)。

使用无环核苷酸为阻断剂及II型聚合酶

我们已证明II型DNA聚合酶可有效地催化焦磷酸化反应，激活用2-羟基乙氧基甲基取代2'-脱氧呋喃核糖基糖的无环核苷酸为3'末端阻断剂的阻断性引物。除了I型DNA聚合酶外，II型DNA聚合酶Vent(exo-)和Pfu(exo-)也用于了以无环核苷酸为阻断性引物的PAP反应(Liu and Sommer，2004c)。

多位点多重PAP

因为极少甚至没有生成引物二聚体产物及引物错配产物(Liu and Sommer，2002),PAP可在一个反应中使用多对阻断性引物(≥2)来扩增多个位点(≥2)上的多个模板(≥2)(Liu et al.，2006)。在多位点多重PAP实例中使用了八对阻断性引物来扩增人类基因组的八个位点，其中包括七个沿着人类凝血因子IX基因的30Kb序列分布在不同外显子和一个位于人类ATM基因外显子。

多重PAP还可以使用多对阻断性引物来扩增一个反应中位于同一个位点的多个几乎序列相同的模板，其中序列差异可能少至只有一个碱基替换、几个碱基缺失或插入，例如KRAS基因的多个突变体序列(美国专利申请号15462342)。

大模板拷贝数在单重常规PAP中的问题及我们的解决方案

当模板拷贝数较大,例如10⁶拷贝时，常规PAP反应的Ct值大约为15，说明扩增产物积累过早，可导致扩增反应不准确、不一致。

通过在阻断性引物的3'区域引入人工突变，我们发明了延迟性PAP。单重延迟性PAP能够将扩增产物积累延迟到更晚的时间或周期，因此克服这种模板大拷贝数问题，尤其是作为外部对照时。

低模板拷贝数比率在多重常规PAP中的问题及我们的解决方案

在癌症早期阶段，在有大量野生型基因组DNA的情况下，要检测小拷贝数的癌症细胞特异性突变基因,经常会出现低拷贝数比率的问题。例如，当靶标突变基因的模板拷贝数低，如10拷贝，但内对照野生型基因的拷贝数大，如100,000拷贝，导致模板拷贝数比率为1/10,000时，多重常规PAP倾向于可靠地扩增内对照模板，而对靶标模板的扩增则呈不一致性。这是因为内对照的扩增产物积累发生在较早的周期，并大量消耗反应底物例如dNTP和聚合酶，因此在较晚的周期内抑制了靶标的扩增产物积累。

为了克服低模板拷贝数比率的问题，我们发明了延迟性PAP。在低模板拷贝数比率条件下,通过在阻断性内对照引物的3'区域引入一个人工突变使得内对照的扩增产物积累延迟到更晚的时间或周期。在多重PAP模式下，延迟性PAP尤其能够在低拷贝数比率的情况下可靠地扩增内对照和靶标模板。

发明内容

在单重焦磷酸化激活性聚合反应中，一对正向和反向阻断性引物用于扩增一个外对照模板时，正向或反向阻断性引物的3'区域引入人工突变，延迟了扩增产物的积累时间。

使用一对正向和反向阻断性引物进行扩增，模板的拷贝数为100，000或更多。

使用一对正向和反向阻断性引物进行扩增，延迟了产物积累。

使用一对正向和反向阻断性引物进行扩增，延迟了产物积累，优选延迟10个以上的周期。

对于正向或反向阻断性引物，3'区域的人工突变为单个碱基的替代。

对于正向或反向阻断性引物，3'区域的人工突变为单个碱基的替代，包括有A至T、G或C；T至A、G或C；G至A、T或C；以及C至A、T或G替代。

对于正向或反向阻断性引物，3'区域的人工突变范围从3'末端至3'末端倒数第10个碱基。

对于正向或反向阻断性引物，3'区域的人工突变范围从3'末端至3'末端倒数第10个碱基，最好从3'末端倒数第2个碱基到第10个碱基。

对于正向或反向阻断性引物，其3'区域与起始模板互补链错配，包括有G-T，G-G，G-A，C-T，A-A，T-T，A-C和C-C错配。

在多重焦磷酸化激活性聚合反应时，在一个反应内使用多对正向和反向阻断性引物扩增多个模板，包括第一对正向和反向阻断性引物扩增第一模板作为内对照，其中所述正向或反向阻断性引物至少在其3'区域引入一个人工突变，延迟了第一对阻断性引物的扩增产物积累。

所述多对正向和反向阻断性引物还包含第二对正向和反向阻断性引物，用以扩增第二模板作为靶标，其中作为靶标的所述第二模板与作为内对照的所述第一模板的拷贝数比率为1/100或更小，优选1/1000或更小。

扩增使用第一对正向和反向阻断性引物，延迟了扩增产物积累。

扩增使用第一对正向和反向阻断性引物，延迟了扩增产物积累，优选延迟10个周期或更多。

第一对正向或反向阻断性引物中，3'区域的人工突变为单个碱基的替代。

第一对正向或反向阻断性引物中，3'区域的人工突变为单个碱基的替代，包含有A至T、G或C；T至A、G或C；G至A、T或C；以及C至A、T或G的替代。

第一对正向或反向阻断性引物中，3'区域的人工突变范围从3'末端至3'末端倒数第10个碱基.

第一对正向或反向阻断性引物中，3'区域的人工突变范围从3'末端至3'末端倒数第10个碱基，优选从3'末端倒数第2个碱基至第10个碱基。

第一对正向或反向阻断性引物中，其3'区域与起始模板互补链错配，包含有G-T，G-G，G-A，C-T，A-A，T-T，A-C和C-C的错配。

一个多重焦磷酸化激活性聚合反应包括：a)在一个反应内使用多对正向和反向阻断性引物扩增多个模板，其中第一对正向和反向引物扩增的第一模板作为内对照，第一对正向或反向阻断性引物其3'区域至少引入一个人工突变；b)扩增多个模板，因此大大延迟了第一对引物扩增产物的积累时间。

附图说明

图1示出了多重延迟性PAP。在一个反应内一个多重PAP反应含有HIV基因作为靶标以及GNAS作为内对照所(图1A至图1I)。每个HIV或GNAS反应包括一个正向3'双脱氧核苷酸阻断性引物、一个反向3'双脱氧核苷酸阻断性引物和一个带有荧光基团FAM或VIC的TaqMan探针。针对于GNAS内对照基因，设计有一个常规PAP反应和八个延迟性PAP反应，因此组合起来总共有九个多重PAP反应(表3)。每一个反应含有1000个拷贝的HIV质粒DNA和330ng人类野生型基因组DNA(即100,000拷贝基因组),即模板拷贝数比率为1/100,扩增40个周期。扩增图中x轴表示为周期数和y轴表示为荧光单位。Ct值来自表5中HIV和GNAS基因。

具体实施方式

术语

在本发明的描述中，除非另有明确的规定和限定，本发明使用的所有技术和科学术语与本领域普通技术人员通常理解的术语具有相同的含义。

PCR是指聚合酶链式反应。

焦磷酸化反应是脱氧核糖核酸聚合反应的逆反应。在焦磷酸的存在下，聚合酶可从双链DNA上将3'末端核苷酸去除而生成一个三磷酸核苷和一个3'末端去除了这个核苷酸的双链DNA：[dNMP]_n+PPi→[dNMP]_n-1+dNTP(Deutscher and Kornberg,1969)。

聚合酶或核酸聚合酶是指特征在于聚合或延伸脱氧核糖核酸的聚合酶。

3'末端阻断性引物是指一个具有3'末端非延伸型核苷酸(3'末端阻断剂)的寡核苷酸，3'末端阻断剂如双脱氧核苷酸或无环核苷酸。这种3'末端非延伸型核苷酸不能被直接延伸，但是它可以通过焦磷酸化反应被移除，然后即可由聚合酶延伸被移除后激活的引物。

PAP是指焦磷酸化激活性聚合反应(Pyrophosphorolysis activatedpolymerization)。

延迟性焦磷酸化激活性聚合反应延(即延迟性PAP)是指在扩增过程中，产物在更晚时间或周期开始累积。

双向PAP(Bi-PAP)是PAP的一种形式，使用了在3’末端处呈单个核苷酸重叠的一对相反方向的阻断性引物。

指数PAP是PAP的一种形式，用一对相反方向的正向和反向的引物使得产物随循环数而指数性累积。至少一个引物是阻断性引物。

灵敏度或检测限定义为当阻断性引物包括3'末端与与目标核酸模板匹配时,可检测的模板最小拷贝数。

特异性定义为当阻断性引物与目标核酸例如3'末端与目标核酸模板不匹配时,不可检测产物的模板最大拷贝数。

选择性，即灵敏度与特异性的比率，被定义为能够在大量不匹配模板拷贝数存在的情况下检测出少量匹配模板拷贝数而不产生假阳性的能力。

热稳定性酶是指具有热稳定或耐热的酶。

TaqFS是与野生型序列相比含有G46E和F667Y氨基酸改变的Taq聚合酶的基因工程形式。

PAP聚合酶是一种基因工程形式的Taq聚合酶，与其野生型序列相比含有F667Y氨基酸变化。它具有5'-3'核酸外切酶活性和5'-3'聚合酶活性，可有效地将ddNTP引入延伸中。

一对引物是指两个相对应反的正向和反向引物。

单重PAP意指在一个反应中用一对引物扩增一个模板。

多重PAP意指在一个反应中同时使用≥2对引物扩增≥2个的模板。多个模板可以位于多个基因位点或同一个基因位点。模板之间的序列差异可能小至只有一个碱基的替代、少数几个碱基的缺失或插入，并且可能位于同一核苷酸附近。此外，模板可能在基因序列上完全或部分重叠。

一个引物的5'区域是引物序列的5'部分，例如从5'末端起始的十个连续的核苷酸

一个引物的3'区域是引物序列的3'部分，例如从3'末端起始的十个连续的核苷酸。

引物的中间区域是5'区域与3'区域之间的引物序列中间部分。

起始模板是扩增开始前的原始模板，例如来自质粒和基因组DNA的模板。

3'完全匹配引物是指3'区域没有人工突变并且与起始模板互补链之间完全匹配。

人工突变是指人工引入引物序列的突变。

人工错配是指3’人工突变引物的3’区域人工突变与起始模板互补链之间形成的错配。

3’人工突变引物是指在其3’区域引入人工突变的引物。

常规PAP是指具有引物其3’区域与起始模板互补链完全匹配的PAP。

多重常规PAP是指在多重形式下所有PAP反应都是常规PAP反应。

延迟性PAP是指具有一个或两个3’人工突变引物与起始模板互补链之间错配的PAP。

多重延迟性PAP是指在多重形式下其中包括有至少一种延迟性PAP的反应。

实时荧光检测的术语

基线是开始循环期间的荧光信号的水平。低水平的荧光信号可以被认为是反应背景或“噪音”。

阈值被定义为明显高于基线信号的荧光信号的水平，且可从背景中区分出扩增信号。

Ct(Threshold cycle，阈值周期数)是荧光信号穿过阈值的周期数。

延迟性Ct或ΔCt＝(延迟性PAP的Ct值)–(常规PAP的Ct值),当扩增相同数量的模板时。

3’人工突变引物用于延迟性PAP的原理

为了克服大模板拷贝数和低模板拷贝数比率的问题，我们发明了一种新的3’人工突变引物，每个引物在其3’区域均含有人工突变。人工突变可以位于一个或两个引物上。

1)12种人工突变

A至T、G或C，T至A、G或C，G至A、T或C，以及C至A、T或G(表1)共12种可能的人工突变类型可以引入引物。每一个人工突变都会导致引物与起始模板互补链的人工错配，因此降低PAP扩增效率，导致扩增产物积累延迟。

表2中举例说明了T至G、C至A、G至T和C至A四种类型的人工突变。

表1:引物的3’人工突变^a

编号	3’人工突变	产生的错配
			1	A至T	T-T
2	A至G	G-T
			3	A至C	C-T
4	T至A	A-A
			5	T至G	G-A
6	T至C	C-A
			7	G至A	A-C
8	G至T	T-C
			9	G至C	C-C
10	C至A	A-G
			11	C至T	T-G
12	C至G	G-G

表1注释：^a引物中导入了12种可能的人工突变(单碱基替代)，产生了引物与起始模板互补链之间8种类型的人工错配。

2)3’人工突变引物与起始模板互补链之间的8种人工错配

12种类型的3’人工突变可导致引物和起始模板互补链之间的8种类型的人工错配(表1)。

短DNA双链中的错配可显著降低了它们的热稳定性，其程度取决于错配的类型。总共八个可能错配的热稳定性顺序大致为：G-T>G-G>G-A>C-T>A-A＝T-T>A-C＝C-C(错配G-T＝T-G，G-A＝A-G，C-T＝T-C，A-C＝C-A)(Modrich，1987)(Aboul Ela，et al.，1985)(Ikuta，et al.，1987)。

在实例中，列出的四种类型的3’人工突变导致了G-A、T-C和A-G三种类型的人工错配(表2)。

3)引物3'人工突变的位置

我们对引物3'人工突变的定位从3'末端倒数第1至第10个核苷酸。除了上述错配类型的影响以外，突变在短DNA双链中的位置也影响错配的热稳定性(Modrich，1987)(Piao，et al.，2008)，因此也影响PAP起始扩增的效率。

在示例中，4个人工突变位于引物从3'末端倒数第3位核苷酸和第5位核苷酸处(表2)。

本申请发明了用于延迟性PAP的3’人工突变引物，因为每个3’人工突变都会导致引物与起始模板互补链之间的人工错配，用以降低PAP起始扩增的效率(表2)。

表2：GNAS和HIV-1基因的引物和探针^a

表2的注释：^a GNAS或HIV PAP反应包括一个正向3'双脱氧核苷酸阻断性引物、一个反向3'双脱氧核苷酸阻断性引物和一个Taqman探针。

^b对于GNAS基因，存在两种类型的引物，即3’完全匹配引物和3’人工突变引物。

^c对于这个正向-突变-1引物，一个3’人工突变G被标示为粗体和下划线。此外，ddC是指引物3'末端的双脱氧核苷酸C。

^d将GNAS TaqMan探针标记为5’末端荧光显示基团VIC和3’末端猝灭基团MGB。HIV基因Taqman探针5'末端标记荧光显示基团为FAM及在3'末端的猝灭基团为MGB。

^e对于GNAS基因的3’人工突变引物，还出示了人工突变类型和位置。3'末端的核苷酸位置被指定为1。

示例1：材料和方法引物的制备

使用了Integrated DNA Technologies公司由3’-5’方向化学合成并进行了高效液相色谱纯化的3’ddCMP阻断性引物。

3’ddAMP、ddTMP和ddGMP阻断性引物则是通过末端转移酶(Liu和Sommer，2000；Liu和Sommer，2002)在脱氧寡核苷酸的3’末端添加ddATP、ddTTP和ddGTP合成的。然后引物用7M尿素/16％聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。每种回收引物的量由260nm处的紫外吸收率确定。

Taqman探针由Integrated DNA Technologies公司以3’-5’方向合成，并用高效液相色谱法纯化。每个探针包括含一个FAM或VIC染料的5'荧光显示基团和一个小沟结合剂(MGB)的3'非荧光淬灭剂。

模板的制备

按照Qiagen公司的方法，使用QIAamp全血迷你试剂盒从血液白细胞中提取出基因组DNA。

将化学合成的300bp HIV靶基因片段插入pUC57载体，构建重组质粒DNA。将重组质粒DNA转化入大肠杆菌繁殖后，按照Qiagen公司的方法，使用QIAamp质粒迷你试剂盒提取重组质粒DNA。将洗脱后的DNA溶解在TE缓冲液(10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，pH8.0)中，并经260nm处的紫外吸收率定量。

PAP反应

除非另有说明，每个20μl的反应混合物中含有88mM Tris-HCl(25℃，pH8.0)、10mM(NH4)₂SO₄、1.2-2.5mM MgCl₂、25μM每种dNTPs(dATP、dTTP、dGTP和dCTP)、0.1μM每个引物、0.3μM TaqMan探针、90μM Na₄PP_i、2单位PAP聚合酶，野生型基因组DNA和/或HIV质粒DNA的起始DNA模板。

热循环和荧光检测

使用Bio-Rad CFX96实时PCR检测系统对扩增产物进行定量。分析模式：荧光，基线设置：基线减去曲线拟合，阈值周期(Ct)确定：单阈值，基线方法：自动计算，阈值设置：自动计算。因此，测量每个反应的Ct值，该值与放大早期指数阶段放大产物的量成正比。

循环需要在96℃下12秒，60℃下30秒，64℃下30秒，68℃下30秒，共40个循环；或另一种循环需要96℃下12秒，64℃下45秒，68℃下45秒，共40个循环。在第一个循环之前添加96℃的变性步骤2分钟。

示例2：GNAS基因的单重延迟性PAP

在单重形式下，根据所用的引物共有两种类型的GNAS PAP反应。常规PAP反应包含一个正向和一个反向3’完全匹配引物，但延迟性PAP反应则包含至少一个在3’区域具有一个人工突变的3’人工突变引物(表3)。

对GNAS基因进行了一个常规PAP和八个延迟性PAP反应的测试(表4)。每一反应内加入330ng人类野生型基因组DNA(即100000份基因组)，进行了40个周期的扩增。

检测GNAS反应的Ct值，即荧光信号跨过阈值的周期数，见表4。为了显示延迟的时间，表4中还计算了延迟Ct或ΔCt值，每个ΔCt值等于延迟性PAP反应的Ct值减去常规PAP反应的Ct值。与常规PAP反应相比，从0.9到15.8个周期范围内，延迟性PAP反应的Ct值延迟或显著延迟，这意味着扩增产物积累延迟可达30000倍以上。

因此，本申请发明了3’人工突变性引物用于单重延迟性PAP，这一个全新的设计可以将Ct值延迟到更晚的时间或周期。所述单重延迟性PAP应用于外对照，同时HIV PAP反应在一单独反应中作为靶标。

表3：GNAS基因的一个常规PAP和八个延迟性PAP反应^a

表3注释：^a反应-1是一个常规PAP，含有两个3’完全匹配引物。反应-2到反应-4是延迟性PAP反应，每一个含有一个3’完全匹配引物和一个3’人工突变引物。反应-5到反应-9也是延迟性PAP反应，每个都含有两个3’人工突变引物。

表4：GNAS基因的单重延迟性PAP反应的Ct和ΔCt^a

表4的注释：

^a共有9个GNAS反应以单重形式进行了验证，包括1个常规反应和8个延迟性反应(表3)。每一个反应内加入330ng人类野生型基因组DNA(即100000份基因组)，扩增40个周期。

^b GNAS反应的Ct值来自两个完全相同条件的检测的平均值。此外,也显示了延迟Ct或ΔCt值。

^C NA为40个周期结束时无可用数据显示。

示例3：应用于HIV靶基因和GNAS内对照基因的多重延迟性PAP反应

多重PAP反应包含作为靶标的HIV PAP反应和作为内对照的GNAS PAP反应。对于GNAS内对照基因，设计了一个常规的PAP反应和八个延迟性PAP反应。因此，组合起来共测试了九种多重PAP反应(表3)。

对于多重反应，GNAS常规或延迟性反应扩增了330ng人类野生型基因组DNA(即100000份基因组)作为内对照，而HIV反应扩增了1000份HIV基因作为靶标(如图1所示),HIV靶基因与GNAS内对照基因之间的拷贝数比率为1/100。

在多重形式下，GNAS反应的Ct和ΔCt值见表5。与常规反应相比，从0.7到15.1个周期范围内，八个延迟反应的Ct值延迟或明显延迟，这意味着扩增产物积累延迟了高达30000倍。另外,在多重形式下,HIV反应的Ct值也显示在表5中，这在9种多重反应中变化很小,因此可靠地扩增靶标。

此外，与表4中的9个单重形式的GNAS反应相比，相应的多重形式的GNAS反应在表5中显示了相似的Ct和ΔCt值。

因此，本申请发明了3’人工突变性引物用于延迟性多重PAP，所述延迟性多重PAP可以将Ct值延迟到更晚的时间或周期。在低拷贝数比率的情况下，这种多重延迟性PAP用于可靠地扩增内对照和靶标模板。

表5：HIV靶基因和GNAS内对照基因的多重延迟性PAP反应中的Ct和ΔCt^a

表5注释：

^a多重PAP包括HIV反应和GNAS反应。对GNAS内对照基因测试了一个常规反应和八个延迟性反应(表3)。每一反应内加入1000拷贝HIV质粒DNA和330ng人类野生型基因组DNA(即100000拷贝基因组)，扩增40个周期。HIV靶基因与GNAS内对照基因的拷贝数比率为1/100。

^bHIV和GNAS反应的Ct值分别为两个完全相同条件下检测的平均值，阈值分别为83个FAM和99个VIC自定义荧光单位。

^c列出了GNAS反应的ΔCt值。

^dNA为40个周期结束时无可用数据显示。

示例4：HIV靶基因和GNAS内对照基因的多重延迟性PAP反应的性能

为了克服低模板拷贝数比率问题，共测试了9种多重PAP反应(表3)。每个多重反应都包含一个HIV靶基因反应，一个GNAS内对照基因反应。对于GNAS基因，有一个常规的PAP反应和八个延迟性PAP反应。

每一个多重反应，对HIV靶基因与GNAS内对照基因之间四个不同的拷贝数比率进行比较，其比率分别为1/10、1/100、1/1000和1/10000。通过测试这四个不同的拷贝数比率时其Ct值的一致性来评估其性能(表6)。

根据表5中GNAS内对照基因的ΔCt值大小，将多重反应分为I类和II类:

1)I类：在表5的多重反应-1、-2、-4、-5中,GNAS反应-1、-2、-4、-5的ΔCt值分别为0、0.7、2.9、3.7。在表6中当测试四个不同的拷贝数比率1/10,1/100,1/1000和1/10000时,GNAS反应的表现一致(+)。然而HIV反应仅在前两个拷贝数比率为1/10和1/100时表现一致,而在后两个拷贝数比率为1/1000和1/10000时则表现不一致(-),其性能受HIV/GNAS基因之间的拷贝数比率影响(表6)。

2)II类：在表5的多重反应-3、-6、-7和-8中,GNAS反应-3、-6、-7和-8的ΔCt值分别为11.5、15.1、13.8和15.1。在表6中当测试四个不同的拷贝数比率1/10,1/100,1/1000和1/10000时,GNAS反应-3、-6、-7和-8和HIV反应均表现一致(+)。另外,当测试有四个拷贝数比率时,HIV反应表现一致(+),其性能不受HIV/GNAS基因之间的拷贝数比率影响(表6)。

当GNAS反应的ΔCt值>10时，多重延迟性PAP应用于低模板拷贝数比率的扩增具有更好的一致性表现,可能是因为延迟性PAP反应将GNAS内对照基因的扩增产物积累延迟至更晚的周期而尚未耗尽底物，例如dNTP和聚合酶，有益于随后周期中达到HIV靶基因的扩增产物积累。

因此,影响I类或II类的一个主要因素是GNAS内对照基因的ΔCt值大小,进一步是GNAS内对照基因的3’人工突变引物中突变的位置，这是决定GNAS内对照基因的扩增产物积累延迟了多少的主要因素。

表6：应用于HIV靶基因和GNAS内对照基因的多重延迟性PAP反应的性能表现^a

表6注释：^a性能表现主要通过在已知模板拷贝数比率下其Ct值的一致性来评估。+意味着完全相同条件下反应的Ct值呈一致性。-意味着Ct值变化大，偶尔甚至无Ct值。

^b检测了HIV靶基因与GNAS内对照基因的四个不同的拷贝数比率。1/10拷贝比率是指在一个反应中有10，000拷贝HIV基因及100，000拷贝GNAS基因，1/100拷贝数比率是指1000拷贝HIV基因及100，000拷贝GNAS基因，1/1000拷贝数比率是指100拷贝HIV基因及100,000拷贝GNAS基因，1/10,000拷贝数比率是指10拷贝HIV基因及100,000拷贝GNAS基因。

^c性能表现根据在多重形式中HIV和GNAS反应的顺序来显示。

^d根据表5中GNAS内对照基因的ΔCt值，将多重反应1-8分为I类和II类。

参考文献

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序列表

<110> 丁少峰 (DING, Shaofeng), 刘强 (LIU, Qiang)

<120> 延迟性焦磷酸化激活性聚合反应

<130> BYUS1934

<150> US62/683,725

<151> 2018-06-12

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 28

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> misc_feature

<222> (28)..(28)

<223> n is dideoxyC

<400> 1

gactctgagc cctctttcca aactactn 28

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> misc_feature

<222> (28)..(28)

<223> n is dideoxyC

<400> 2

gtctcaaaga ttccagaagt caggacan 28

<210> 3

<211> 28

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> misc_feature

<222> (28)..(28)

<223> n is dideoxyC

<400> 3

gactctgagc cctctttcca aacgactn 28

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> misc_feature

<222> (28)..(28)

<223> n is dideoxyC

<400> 4

gactctgagc cctctttcca aactaatn 28

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<220>

<221> misc_feature

<222> (28)..(28)

<223> n is dideoxyC

<400> 5

gtctcaaaga ttccagaagt cagtacan 28

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

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<221> misc_feature

<222> (28)..(28)

<223> n is dideoxyC

<400> 6

gtctcaaaga ttccagaagt caggaaan 28

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 智人（Homo sapiens）

<400> 7

caatggatct caccaaagcc aa 22

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 艾滋病相关的逆转录病毒（Aids-associated retrovirus）

<220>

<221> misc_feature

<222> (30)..(30)

<223> n is dideoxyT

<400> 8

agttggagga catcaagcag ccatgcaaan 30

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 艾滋病相关的逆转录病毒（Aids-associated retrovirus）

<220>

<221> misc_feature

<222> (27)..(27)

<223> n is dideoxyT

<400> 9

tgctatgtca gttccccttg gttctcn 27

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 艾滋病相关的逆转录病毒（Aids-associated retrovirus）

<400> 10

atcaatgagg aagctgcaga 20

Claims

1.用于焦磷酸化激活性聚合反应的一对正向和反向阻断性引物以在一个反应中扩增一个对照模板，其特征在于，所述正向阻断性引物或反向阻断性引物的3'区域引入一个人工突变，延迟了扩增产物的积累时间。

2.根据权利要求1所述的用于焦磷酸化激活性聚合反应的一对正向和反向阻断性引物，其特征在于其模板的拷贝数为100，000以上。

3.根据权利要求1所述的用于焦磷酸化激活性聚合反应的一对正向和反向阻断性引物，其特征在于延迟了扩增产物积累,优选延迟10个以上周期。

4.根据权利要求1所述的用于焦磷酸化激活性聚合反应的一对正向或反向阻断性引物，其特征在于所述3'区域的人工突变为单个碱基的替代。

5.用于多重焦磷酸化激活性聚合反应的多对正向和反向阻断性引物扩增多个模板，其特征在于包括第一对正向及反向阻断性引物用以扩增第一模板作为内对照，其中第一对正向或反向阻断性引物至少有一个人工突变引入其3'区域，而延迟了第一个产物的积累时间。

6.根据权利要求5所述的用于多重焦磷酸化激活性聚合反应的多对正向和反向阻断性引物，其特征在于还进一步包括第二对正向和反向阻断性引物，以扩增第二模板作为靶标，其中作为靶标的所述第二模板与作为内对照的第一模板的拷贝数比率为1/100或更小，最好1/1000或更小。

7.根据权利要求5所述的用于多重焦磷酸化激活性聚合反应的多对正向和反向阻断性引物，其特征在于所述第一对正向和反向阻断性引物的扩增产物的积累最好延迟10个以上周期。

8.根据权利要求5所述的用于多重焦磷酸化激活性聚合反应的多对正向和反向阻断性引物，其特征在于所述第一对正向和反向阻断性引物的所述3'区域的人工突变为单个碱基的替代。

9.根据权利要求5所述的用于多重焦磷酸化激活性聚合反应的多对正向和反向阻断性引物，其特征在于所述第一对正向和反向阻断性引物的所述3'区域的人工突变的范围为从3'末端至倒数第10个碱基。

10.一种多重焦磷酸化激活性聚合反应的方法，其特征在于包括：

a)提供多对正向和反向阻断性引物在一个反应中扩增多个模板，其中第一对正向和反向阻断性引物扩增第一模板作为内对照，所述正向或反向阻断性引物在其3'区域至少引入一个人工突变，以及

b)扩增模板，延迟了第一个扩增产物的累积时间。