CN111172245A - 用于检测核酸pap扩增的焦磷酸化激活性荧光 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于测定核酸PAP扩增的焦磷酸化激活性荧光的全新荧光检测方法。荧光基团‑淬灭基团双标记阻断性引物用于PAP反应，该引物的内部区域或5'末端核苷酸带有一个荧光基团，3'末端阻断性核苷酸则带有一个淬灭基团。多个荧光基团‑淬灭基团双标记阻断性引物也用于多重PAP反应，这些引物则带有不同的荧光基团用以区分一个反应中的多个模板。
Description
序列表
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技术领域
本发明涉及分子生物学领域，特别涉及焦磷酸化激活性聚合反应(Pyrophosphorolysis activated polymerization,PAP)核酸扩增。
背景技术
焦磷酸化激活性聚合反应(PAP)
焦磷酸化激活性聚合反应(Pyrophosphorolysis activated polymerization,PAP)是一种使用3'末端阻断性引物，利用DNA聚合酶催化焦磷酸化反应串联耦合聚合反应的一种核酸扩增方法(Liu and Sommer,2000；Liu and Sommer,2004b)。其引物在3'末端由具有不可延伸性的核苷酸(3'末端阻断剂)如双脱氧核苷酸所封闭,因此不能直接被DNA聚合酶所延伸。当3'末端阻断性引物与其互补性DNA模板杂交时，在焦磷酸或其类似物的存在下DNA聚合酶可以去除3'末端阻断性引物上的3'末端阻断剂，这一反应称为焦磷酸化反应。然后DNA聚合酶能沿着已去除3'末端阻断剂的引物而延伸DNA模板,这一反应称为聚合反应。除了本文所引用的参考文献，PAP已经在美国专利6,534,269,7,033,763,7,105,298,7,238,480,7,504,221,7,914,995和7,919,253中所描述。
在PAP中使用了3'末端阻断性引物，使得焦磷酸化反应和聚合反应的串联耦合具有极高的选择性(Liu and Sommer,2004a；Liu and Sommer,2004b)，因为一个显著的可导致假阳性的非特异性扩增(第二类错误)需要错配性焦磷酸化反应加上随后发生的由DNA聚合酶而产生的错误掺入性延伸反应,因此这种串联错误事件的发生概率估计为3.3×10-11。
双向形式的PAP(Bi-PAP)特别适用于等位基因的特异性扩增，它使用两个相对应的3'末端阻断性引物，其3'末端的单个核苷酸相互重叠(Liu and Sommer，2004a；Liu andSommer，2004b)。Bi-PAP可以在109个野生型DNA模板存在的情况下检测到一个拷贝等位基因的突变而没有假阳性扩增。
DNA-PAP
PAP的最初测试采用了人类多巴胺D1基因DNA模板并使用了Tfl和Taq聚合酶，证明了DNA依赖性DNA焦磷酸化反应和DNA依赖性DNA聚合反应可以串联耦合(Liu and Sommer,2000)。当使用一个经过基因工程改造含有F667Y突变的DNA聚合酶TaqFS时可大大提高PAP的效率，这已被应用于其它DNA模板时所证明(Liu and Sommer,2002)。
RNA-PAP
此后发明的RNA-PAP可直接扩增RNA模板而无需额外的制备。RNA-PAP开创了RNA模板扩增的新机制，其中RNA依赖性DNA焦磷酸化反应移除了杂交于RNA模板上阻断性引物的3'末端阻断剂如3'末端双脱氧核苷酸，然后RNA依赖性DNA聚合反应则延伸被激活的引物。基于这种串联偶联，RNA-PAP对RNA模板上的不匹配的阻断性引物具有高度的选择性，导致了RNA模板的高度特异性扩增(美国专利号9,133,491)。
使用无环核苷酸为阻断剂及II型聚合酶
我们已证明II型DNA聚合酶可有效地催化焦磷酸化反应，激活使用2-羟基乙氧基甲基取代2'-脱氧呋喃核糖基糖的无环核苷酸为3'末端阻断剂的阻断性引物。除了I型DNA聚合酶外，II型DNA聚合酶Vent(exo-)和Pfu(exo-)也用于了以无环核苷酸为阻断性引物的PAP反应(Liu and Sommer，2004c)。
多重PAP
因为极少甚至没有生成引物二聚体及引物错配产物(Liu and Sommer，2002),PAP可在一个反应中使用多对阻断性引物(≥2)来扩增多个位点(≥2)上的多个模板(≥2)(Liuet al.，2006)。在多位点多重PAP实例中使用了八对阻断性引物来扩增人类基因组的八个位点，其中包括七个沿着人类凝血因子IX基因的30Kb序列分布在不同外显子和一个位于人类ATM基因外显子。
多重PAP还可以使用多对阻断性引物来扩增一个反应中位于同一个位点的多个几乎序列相同的模板，其中序列差异可能少至只有一个碱基替换、几个碱基缺失或插入，例如KRAS基因的多个突变体序列(美国专利申请公开号20180265919)。
目前用于检测核酸扩增的荧光方法
目前可用的荧光化学品可以分为两种主要类型：1)DNA结合性染料(例如SYBRGreen I)，和2)荧光标记的序列特异性寡核苷酸引物或探针(例如TaqMan探针)。
SYBR Green I在溶液中呈游离状态时几乎无荧光显示，但当其与双链DNA非特异性结合时发出的荧光强度可增强1,000倍。
SYBR Green I荧光的优点包括设计简单(不需要探针)、成本低、以及具有熔融曲线用于判定特定扩增产物。然而其主要缺点是与任何双链DNA的非特异性结合如引物的二聚体也会发出非特异性荧光。另外，它也不能辨识在同一个反应中的多个模板的扩增。
TaqMan探针在分子结构上是一种寡核苷酸，它带有以共价键连接到引物的5'末端核苷酸的荧光基团以及以共价键连接到3'末端核苷酸的淬灭基团。淬灭基团通过
共振能量转移(FRET)的方法淬灭了荧光团发出的荧光(Holland et al.，1991)。
在PCR扩增中，当Taq聚合酶延伸引物时，其5'-3'核酸外切酶活性会水解已杂交于其模板上的探针，释放荧光基团而发出荧光。
TaqMan探针的主要优点包括高特异性，高信噪比、和同时扩增多重位点，因为多个带有不同荧光基团的探针可在同一个反应中辨识多个模板的扩增。
一种新的荧光检测方法及其优点
我们开发了一种焦磷酸化激活的荧光方法来检测核酸PAP扩增。单重PAP使用单个荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物，该引物的荧光基团连接到内部区域或5'末端核苷酸上，淬灭基团连接到3'末端阻断性核苷酸上。多个荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物用于多重PAP，这些阻断性引物上带有不同的荧光基团以辨识同一个反应中的多个模板的扩增。
发明内容
I型荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物：
在焦磷酸化激活性聚合反应中,用于扩增模板的一对正向和反向3'末端阻断性引物(I型)，其正向或反向阻断性引物的内部区域或5'末端核苷酸上带有荧光基团，以及在3'末端阻断性核苷酸上带有淬灭基团。
一旦焦磷酸化反应去除了带有淬灭基团的3'末端阻断性核苷酸，PAP扩增中的荧光基团产生可检测到的荧光信号。
一对正向和反向阻断性引物，正向或反向阻断性引物在其内部区域或5'末端核苷酸上带有FAM或HEX荧光基团和3'末端双脱氧核苷酸上带有TAMRA淬灭基团。
一旦焦磷酸化反应去除了带有TAMRA淬灭基团的3'末端双脱氧核苷酸，在PAP扩增中FAM或HEX荧光基团产生可检测到的荧光信号。
对于正向或反向阻断性引物，荧光基团的发射光谱与通用淬灭基团的吸收光谱是重叠的。
对于正向或反向阻断性引物，荧光基团从3'末端起为30个碱基或更少。
对于正向或反向阻断性引物，将一个人工突变引入其3'区域，可将扩增产物的积累延迟到以后的时间或循环周期，这一方法称为延迟性PAP。
对于正向或反向阻断性引物，人工突变是指单个碱基的取代。
对于正向或反向阻断性引物，人工突变的范围是从3'末端起第3个碱基到第5个碱基。
用于焦磷酸化激活性聚合反应中扩增多个模板的多对正向和反向阻断性引物(I型),包括：
a)第一对正向和反向引物用以扩增第一模板，其正向或反向阻断性引物的内部区域或5'末端核苷酸上带有第一荧光基团以及3'末端阻断性核苷酸上带有一种通用淬灭基团，和
b)第二对正向和反向引物用以扩增第二模板，其正向或反向阻断性引物的内部区域或5'末端核苷酸上带有第二荧光基团以及3'末端阻断性核苷酸上带有相同的通用淬灭基团。
一旦焦磷酸化反应去除了带有通用淬灭基团的3'末端阻断性核苷酸，在PAP扩增中第一荧光基团产生可检测到的荧光信号；一旦焦磷酸化反应去除了带有相同通用淬灭基团的3'末端阻断性核苷酸，在PAP扩增中第二荧光基团产生另一个可检测到的荧光信号。
使用多对正向和反向阻断性引物时，第一对和第二对正向或反向引物上带有相同的通用淬灭基团，但是带有不相同的第一和第二荧光基团。
使用多对正向和反向阻断性引物时，第一对正向或反向阻断性引物的内部区域或5'末端核苷酸上带有FAM荧光基团以及其3'末端双脱氧核苷酸上带有通用TAMRA淬灭基团，第二对正向或反向阻断性引物的内部区域或5'末端核苷酸上带有HEX荧光基团，而3'末端双脱氧核苷酸上带有相同的通用TAMRA淬灭基团。
一旦通过焦磷酸化反应去除了带有通用TAMRA淬灭基团的3'末端双脱氧核苷酸，在PAP扩增中FAM和HEX荧光基团产生可检测到的荧光信号。
对于多对正向和反向阻断性引物，第一模板是内对照，第二模板是靶标。
多对正向和反向阻断性引物时，每个荧光基团的发射光谱与通用淬灭基团的吸收光谱是重叠的。
使用多对正向和反向阻断性引物时，荧光基团从3'末端起为30个碱基或更少。
使用多对正向和反向阻断性引物时，一对正向和反向引物中的正向或反向阻断性引物的3'区域可引入人工突变，这可以将产物积累延迟到以后的时间或循环，这称为延迟性PAP。
正向或反向阻断性引物的人工突变为单碱基取代。
正向或反向阻断性引物，人工突变引入的范围是从3'末端倒数第3个碱基至第5个碱基。
一种用于多重焦磷酸化激活性聚合反应的方法，其中在反应中使用多对正向和反向阻断性引物(I型)扩增多个模板，包括：
a)第一对正向和反向引物用以扩增第一模板，正向或反向阻断性引物的内部区域或5'末端的核苷酸上带有第一荧光基团，第一阻断性正向引物的3'末端阻断性核苷酸上带有一种通用淬灭基团。
b)一旦焦磷酸化反应去除了带有通用淬灭基团的3'末端阻断性核苷酸，在PAP扩增中第一荧光基团产生可检测到的荧光信号，
c)第二对正向和反向引物则用来扩增第二模板，正向或反向阻断性引物的内部区域或5'末端的核苷酸上带有第二荧光基团，而且在其3'末端阻断性核苷酸上带有相同的通用淬灭基团，并且
d)一旦焦磷酸化反应去除了带有通用淬灭基团的3'末端阻断性核苷酸，在PAP扩增中第二荧光基团产生可检测到的荧光信号。
II型荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物：
焦磷酸化激活性聚合反应用以扩增模板的一对正向和反向阻断性引物(II型)，正向或反向阻断性引物在3'末端阻断性核苷酸上带有荧光基团并且在内部区域或5'末端核苷酸上带有淬灭基团。
一旦焦磷酸化反应去除了带有荧光基团的3'末端阻断性核苷酸，在PAP扩增中荧光基团产生可检测到的荧光信号。
用于焦磷酸化激活性聚合反应中扩增多个模板的多对正向和反向阻断性引物(II型),包括：
a)第一对正向和反向引物用来扩增第一模板，其正向或反向阻断性引物的3'末端封阻断性苷酸上带有第一荧光基团，在其内部区域或5'末端核苷酸上带有一种通用淬灭基团，
b)第二对正向和反向引物用来扩增第二模板，其正向或反向阻断性引物的3'末端阻断性核苷酸上带有第二荧光基团，在其内部区域或5'末端核苷酸上带有相同的通用淬灭基团，和
一旦焦磷酸化反应去除了带有第一荧光基团的3'末端阻断性核苷酸，在PAP扩增中该荧光基团产生可检测到的荧光信号；一旦焦磷酸化反应去除了带有第二荧光基团的3'末端阻断性核苷酸，在PAP扩增中这第二荧光基团产生可检测到的荧光信号。
用于多重焦磷酸化激活性聚合反应的方法，在反应中扩增多对正向和反向阻断性引物(II型)来扩增多个模板，包括：
a)第一对正向和反向引物用来扩增第一模板，正向或反向阻断性引物在其3'末端阻断性核苷酸上带有第一荧光基团，并且其内部区域或5'末端核苷酸上带有一种通用淬灭基团，
b)一旦焦磷酸化反应去除了带有第一荧光基团的3'末端阻断性核苷酸，在PAP扩增中该荧光基团产生可检测到的荧光信号，
c)第二对正向和反向引物用来扩增第二模板，正向或反向阻断性引物在其3'末端阻断性核苷酸上带有第二荧光基团，而且内部区域或5'末端核苷酸上带有相同的通用淬灭基团，并且
d)一旦焦磷酸化反应去除了带有第二荧光基团的3'末端阻断性核苷酸，在PAP扩增中第二荧光基团产生可检测到的荧光信号。
附图说明
图1.焦磷酸化激活性荧光的原理
图1A显示I型荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物。荧光基团(F)如FAM以共价键连接到引物的内部区域或5'末端核苷酸上，淬灭基团(Q)如TAMRA以共价键连接到3'末端阻断性核苷酸如双脱氧核苷酸上。PAP扩增中当引物杂交于其互补的模板上时，焦磷酸化反应去除与淬灭基团共价键连接的3'末端阻断性核苷酸，导致淬灭基团与荧光基团分开,荧光基团可以发出荧光(以星号表示)，聚合反应也沿着已去除3'末端阻断剂的引物而延伸DNA模板。
图1B显示II型荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物。荧光团(F)以共价键连接到引物的3'末端阻断性核苷酸上，淬灭基团(Q)以共价键连接到5'末端或内部区域的核苷酸上。
图2.焦磷酸化激活性荧光应用于单重和多重PAP
图2A显示单重PAP用于检测GNAS基因。GNAS PAP检测使用一个正向荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物(SEQ ID 1)和一个反向阻断性引物(SEQ ID 2)(表2)。在PAP扩增中产生并检测出了一个HEX荧光信号。扩增图上X轴表示循环周期而y轴表示荧光强度单位。
图2B显示单重PAP用于检测HIV基因。HIV PAP检测使用一个正向荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物(SEQ ID 3)和一个反向阻断性引物(SEQ ID 5)(表2)。在PAP扩增中产生并检测出了一个FAM荧光信号。
图2C显示多重PAP同时检测GNAS和HIV基因。多重PAP检测GNAS基因使用正向荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物和反向阻断性引物(SEQ ID 1和2)，和检测HIV基因使用正向荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物和反向阻断性引物(SEQ ID 3和5)。在PAP扩增中生成并检测出了HEX和FAM的荧光信号。
具体实施方式
PAP技术术语
在本发明的描述中，除非另有明确的规定和限定，本发明使用的所有技术和科学术语与本领域普通技术人员通常理解的术语具有相同的含义。
PCR是指聚合酶链式反应。
焦磷酸化反应或焦磷酸化是脱氧核糖核酸聚合反应的逆反应。在焦磷酸的存在下，聚合酶可从双链DNA上将3'末端核苷酸去除而生成一个三磷酸核苷和一个3'末端去除了这个核苷酸的双链DNA：[dNMP]n+PPi→[dNMP]n-1+dNTP(Deutscher and Kornberg,1969)。
聚合酶或核酸聚合酶是指特征在于聚合或延伸脱氧核糖核酸的聚合酶。
3'末端阻断性引物,简称阻断性引物,是指一个具有3'末端非延伸型核苷酸(3'末端阻断剂)的寡核苷酸，3'末端阻断剂如双脱氧核苷酸或无环核苷酸。这种3'末端非延伸型核苷酸不能被直接延伸，但是它可以通过焦磷酸化反应被移除，然后即可由聚合酶延伸被移除后激活的引物。
PAP是指焦磷酸化激活性聚合反应(Pyrophosphorolysis activatedpolymerization)。
延迟性焦磷酸化激活性聚合反应(即延迟性PAP)是指在扩增过程中，产物在更晚时间或循环周期开始累积。
双向PAP(Bi-PAP)是PAP的一种形式，使用了在3’末端处呈单个核苷酸重叠的一对相反方向的阻断性引物。
指数PAP是PAP的一种形式，使用一对相反方向的正向和反向的引物使得产物随循环数而指数性累积。至少一个引物是阻断性引物。
灵敏度或检测限定义为当阻断性引物包括3'末端与目标核酸模板匹配时,可检测的模板最小拷贝数。
特异性定义为当阻断性引物如3'末端与目标核酸模板不匹配时,不可检测产物的模板最大拷贝数。
选择性，即灵敏度与特异性的比率，定义为能够在大量的不匹配模板拷贝数存在的情况下检测出少量匹配的模板拷贝数而不产生假阳性的能力。
热稳定性酶是指具有热稳定或耐热性的酶。
TaqFS是与野生型序列相比含有G46E和F667Y氨基酸改变的Taq聚合酶的基因工程形式。它具有5'-3'聚合酶活性，可有效地将dNTP引入延伸中，而且焦磷酸化活性可以在引物的3'末端去除ddNTP，但不能去除5'-3'外切酶活性。
PAP聚合酶是一种基因工程形式的Taq聚合酶，与其野生型序列相比含有F667Y氨基酸变化。它具有3'-5'焦磷酸化活性和5'-3'聚合酶活性，可有效地将ddNTP引入延伸中。
一对引物是指两个相对的正向和反向引物。
单重PAP意指在一个反应中使用一对引物扩增一个模板。
多重PAP意指在一个反应中同时使用≥2对引物扩增≥2个的模板。多个模板可以位于多个基因位点或同一个基因位点。模板之间的序列差异可能小至只有一个碱基的替代、少数几个碱基的缺失或插入，并且可能位于同一核苷酸附近。此外，模板可能在基因序列上完全或部分重叠。
一个引物的5'区域是引物序列的5'部分，例如从5'末端起始的十个连续的核苷酸。
一个引物的3'区域是引物序列的3'部分，例如从3'末端起始的十个连续的核苷酸。
引物的中间区域是引物序列的5'区域与3'区域之间的部分。
引物的内部区域是引物序列的5'末端与3'末端之间的部分。
起始模板是扩增开始前的原始模板，例如来自质粒和基因组DNA的模板。
荧光基团和淬灭基团的术语
荧光基团或荧光分子：可产生荧光的基团或分子，例如FAM，HEX和TET。当荧光基团吸收短波长的光能后，可发射出更长波长的荧光。每个荧光基团具有特征性的吸收光谱和特征性的发射光谱。荧光基团最有效吸收能量的特定波长称为峰值吸收，而荧光团最有效发射荧光的波长称为峰值发射。
FAM是一个荧光基团，其峰值吸收在492nm波长处并且峰值发射在520nm波长处。
HEX是一个荧光基团，其峰值吸收在535nm波长处并且峰值发射在556nm波长处。
TET是一个荧光团，其峰值吸收在521nm波长处并且峰值发射在536nm波长处。
淬灭基团或淬灭分子或淬灭剂：减低荧光基团输出荧光强度的基团或分子，例如TAMRA。它具有特征性的吸收光谱和吸收峰值。为了使通过荧光共振能量转移(FRET)的机理起作用，其淬灭基团的吸收光谱要与荧光基团的发射光谱相重叠，并且其距离荧光基团足够近，例如不超过30个核苷酸。
TAMRA是一个具有575nm吸收峰值的淬灭基团。
通用淬灭基团或通用淬灭分子或通用淬灭剂：一种淬灭基团或分子，例如TAMRA，其可减低两种或更多种类型的荧光基团的荧光强度。
荧光基团标记的引物：荧光基团,例如FAM，HEX和TE,以共价键连接到引物的5'末端、内部区域或3'末端核苷酸上。
淬灭基团标记的引物：淬灭基团，例如TAMRA，以共价键连接到引物的5'末端、内部区域或3'末端核苷酸上。
荧光基团-淬灭基团双标记引物：有两种形式：1)一个荧光基团，例如FAM、HEX和TET，以共价键连接到引物的5'末端或内部区域核苷酸上，以及一个淬灭基团，例如TAMRA，以共价键连接到3'末端核苷酸上；2)一个荧光基团，例如FAM、HEX和TET，以共价键连接到引物的3'末端核苷酸上，以及一个淬灭基团，例如TAMRA，以共价键连接到5'末端或内部区域核苷酸上。
实时荧光检测的术语
基线是初始循环周期的荧光信号的水平。低水平的荧光信号可以被认为是反应背景或“噪音”。
阈值被定义为明显高于基线信号的荧光信号的水平，且可从背景中区分出扩增信号。
Ct(Threshold cycle，阈值周期数)是荧光信号穿过阈值的循环周期数。
延迟性PAP术语
3'完全匹配引物是指3'区域没有人工突变并且与起始模板完全匹配。
人工突变是指人工引入引物序列的突变。
人工错配是指引物上引入的人工突变与起始模板之间形成的错配。
3'人工突变引物是指在其3'区域引入一个人工突变。
常规PAP是指具有两个3'完全匹配引物’的PAP。除非另有说明，PAP即表示常规PAP。
单重常规PAP是指具有两个3'完全匹配引物’的PAP。除非另有说明，单重PAP即指单重常规PAP。
多重常规PAP是指在多重形式下所有的PAP检测都是常规PAP。除非另有说明，多重PAP即指多重常规PAP。
延迟性PAP是指具有一个或两个3'区域人工突变引物可延迟产物积聚到以后的时间或循环周期。
多重延迟性PAP是指在多重PAP检测中至少有一种延迟性PAP。
焦磷酸化激活性荧光检测PAP扩增核酸的原理
1)荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物
对于I型荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物，一个荧光基团，例如FAM、HEX和TET，以共价键连接到引物的5'末端或内部区域核苷酸上，以及一个淬灭基团,例如TAMRA，以共价键连接到3'末端阻断性核苷酸上，例如双脱氧核苷酸(图1A)。
FAM、HEX、TET和TAMRA分别在492nm、535nm、521nm、552nm波长处为其吸收峰值；其发射峰值分别在520nm、556nm、536nm和575nm波长处。TAMRA淬灭基团的吸收光谱与FAM、HEX和TET荧光基团的发射光谱重叠。因此多重荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物可带具有不同的荧光基团，但有着相同的通用淬灭基团。
其他类型的荧光基团，淬灭基团如Dark淬灭剂,和3'末端阻断性核苷酸如无环核苷酸等,只要满足以下条件也可适用：1)淬灭基团的吸收光谱与荧光团的发射光谱相互重叠，2)从淬灭基团到荧光基团的距离≤30个核苷酸，以使淬灭基团可以淬灭荧光基团，并且3)与淬灭基团以共价键连接的3'末端阻断性核苷酸可以通过PAP的焦磷酸化反应去除掉。
对于II型荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物，荧光基团如FAM、HEX和TET以共价键连接到引物的3'末端阻断性核苷酸上如双脱氧核苷酸，而淬灭基团如TAMRA以共价键连接到5'末端或内部区域核苷酸上(图1B)。
2)焦磷酸化激活性荧光
在荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物的结构内，通过从荧光基团向淬灭基团荧光共振能量转移(FRET)的机制来抑制荧光基团发射荧光。
PAP扩增中一旦荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物(I型)退火至其互补的模板上时，焦磷酸化反应即去除与淬灭基团如TATRA以共价键连接的3'末端阻断性核苷酸，导致释放淬灭基团,如FAM之类的荧光基团可以发出荧光，聚合反应也沿着已去除3'末端阻断剂的引物而延伸(图1A)。
另外，不同的荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物可以带有不同的荧光基团如FAM、HEX和TET，但带有一种通用淬灭基团如TAMRA以便在一个反应中区分多个模板。
释放的荧光基团的数目等于所消耗的荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物的数目，也相当于扩增产物的数目，呈1：1：1的关系。此外三要素中的每一个都与发射的荧光强度成正比。这些均适用于单个和多个荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物。
对于II型荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物，其机理仍然包括焦磷酸化反应以释放荧光基团以发出荧光(图1B)。
除上述优点外，焦磷酸化激活性荧光对扩增产物具有特异性，因为它需要焦磷酸化反应，一种涉及共价键变化的酶催化化学反应，以释放并激活荧光基团。这在PAP扩增中是非常有效的，因为PAP扩增中所释放的荧光基团数量会呈指数性增长。
此外，表1显示焦磷酸化激活性荧光(I型)与Taqman探针(Holland等，1991)之间的差异。
表1.焦磷酸化激活性荧光与Taqman探针之间的对比
示例1：材料和方法
引物的制备
所使用的3'ddCMP阻断性引物由Integrated DNA Technologies公司以3'-5'方向化学合成并HPLC纯化。
3'ddAMP、ddTMP和ddGMP阻断性引物则是通过末端转移酶在脱氧寡核苷酸的3'末端添加ddATP、ddTTP和ddGTP合成的(Liu和Sommer，2000；Liu和Sommer，2002)。
5'末端或内部区域单标记(FAM或HEX)的引物是由Integrated DNA Technologies公司沿3'-5'方向化学合成，HPLC纯化。
Rhodamine染料标记双脱氧核苷酸类似物或阻断剂,TAMRA-ddATP，TAMRA-ddUTP，TAMRA-ddGTP和TAMRA-ddCTP,购自PerkinElmer Life Sciences公司，其中淬灭基团TAMRA通过共价键连接到引物的双脱氧脱氧核苷酸的碱基。然后通过末端转移酶将它们加到单标记引物的3'末端，以合成双标记阻断性引物。
最后将全部引物经7M尿素/16％聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯化。在260nm处使用UV吸光度确定每种回收引物的数量。
模板的制备
按照Qiagen公司的方法，使用QIAamp全血迷你试剂盒从血液白细胞中提取出基因组DNA。
将化学合成的300bp HIV靶基因片段插入pUC57载体，构建重组质粒DNA。将重组质粒DNA转化入大肠杆菌繁殖后，按照Qiagen公司的方法，使用QIAamp质粒迷你试剂盒提取重组质粒DNA。
将洗脱后的DNA溶解在TE缓冲液(10mM Tris-HCl，0.1mM EDTA，pH8.0)中，并经260nm处的紫外吸收定量。
PAP反应
除非另有说明，每个20μl的反应混合物中均含有88mM Tris-HCl(25℃，pH 8.0)、10mM(NH4)2SO4、2mM MgCl2、每种dNTPs(dATP、dTTP、dGTP和dCTP)25μM、每个引物0.1μM、150μM Na4PPi、野生型基因组DNA和/或质粒DNA的起始DNA模板和1单位聚合酶。
热循环和荧光检测
使用Bio-Rad CFX96实时PCR检测系统进行扩增。循环需要96℃持续12秒，60℃持续30秒，64℃持续30秒，68℃持续30秒，共进行45个循环。在第一个循环之前添加了96℃持续2分钟的变性步骤。
分析模式：荧光基团；基线设置：基线减去曲线拟合；阈值循环(Ct)测定：单个阈值；基线方法：自动计算；阈值设置：自动计算。荧光过滤器模式选择:FAM和/或HEX荧光检测。因此针对每个反应测量Ct值，其与扩增的早期指数阶段中的扩增产物的数量是成比例的。
示例2：GNAS和HIV基因的单重及多重PAP检测
GNAS和HIV基因的单重和多重PAP检测用来证明焦磷酸化激活性荧光是如何工作的。
选择了GNAS和HIV基因作为靶标和对照。因为HIV-1病毒DNA可以整合进入到人类基因组中，因此使用血液白细胞基因组DNA来进行检测成为一种医疗需求。
一个单重PAP检测GNAS基因使用了一个正向荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物(SEQ ID 1)和一个反向阻断性引物(SEQ ID 2)(表2)。荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物(SEQ ID 1)带有以共价键连接到引物的5'末端dAMP上的HEX荧光基团和以共价键连接到3'末端ddCMP上的TAMRA淬灭基团。当从100,000个拷贝的人类野生型基因组DNA(即330ng)扩增GNAS基因时,产生了HEX荧光信号,测量到Ct 20.5循环次数,即这时HEX荧光信号达到87个荧光单位的阈值(图2A)。此外在非模板空白对照反应中阈值以上未见HEX荧光信号，显示出检测的特异性。
另一个单重PAP检测HIV基因则使用了一个正向荧光团-淬灭基团双标记阻断性引物(SEQ ID 3)和一个反向阻断性引物(SEQ ID 5)(表2)。荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物带有以共价键连接到引物的内部区域dTMP上(从5'末端起第11个核苷酸)的FAM荧光基团(SEQ ID 3)和以共价键连接到3'末端ddUMP上的TAMRA淬灭基团。当从100个拷贝的HIV质粒DNA模板中扩增HIV基因时,产生了FAM荧光信号，测量到Ct 32.2循环次数,即这时FAM荧光信号达到122个荧光单位的阈值(图2B)。还测试了另一种正向荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物(SEQ ID 4)，其带有以共价键连接到引物的5'末端dTMP上的FAM荧光基团和以共价键连接到3'末端ddUMP上的TAMRA淬灭基团,得到了相似的结果。此外在非模板空白对照反应中未观察到高于阈值的FAM荧光信号，显示出检测的特异性。
一个多重PAP检测在同一个反应中包含GNAS基因和HIV基因。GNAS检测使用了正向荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物(SEQ ID 1)和反向阻断引物(SEQ ID 2)，而HIV检测则使用了正向荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物(SEQ ID 3)和反向阻断性引物(SEQID 5)(表2)。为了模拟医学状况下GNAS与HIV模板的拷贝数比例，在一个反应中同时加入了100,000拷贝人类野生型基因组DNA(即330ng)和100拷贝HIV模板。扩增GNAS和HIV基因产生了HEX和FAM荧光信号，分别测量到Ct 21.4和32.0循环次数(图2C)。还测试了另一种正向荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物(SEQ ID 4)，得到了相似结果。此外，在非模板空白对照反应中未产生高于阈值的HEX或FAM荧光信号，显示出检测的特异性。
因此我们发明了焦磷酸化激活性荧光用以测定单重和多重PAP的扩增。
表2.GNAS和HIV基因的引物
表2注释
a每个引物的3'末端均有一个阻断性核苷酸如ddCMP，全长匹配其起始模板。
b荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物(SEQ ID 1、3和4)带有以共价键连接到引物的内部区域或5'末端核苷酸上的荧光基团，和以共价键连接到3'末端双脱氧核苷酸上的淬灭基团。还标示了荧光基团和淬灭基团的类型。
实例3：GNAS和HIV基因的单重和多重延迟性PAP检测
通过将人工突变引入阻断性引物的3’区域而发明了延迟性PAP，这在PAP扩增中可以将产物累积延迟到稍后的时间或循环(美国专利申请号62687325)。焦磷酸化激活性荧光在这一延迟性PAP检测中进一步得到了证实。
一个单重延迟性PAP检测GNAS基因使用了一个正向荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物(SEQ ID 1)(表2)和一个从3'末端起第5个核苷酸有一个G到T人工突变的反向M1阻断性引物(SEQ ID 6)(表3)。另一个单重延迟性PAP检测GNAS基因则使用了一个正向荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物(SEQ ID 1)和一个从3'末端起第3个核苷酸处引入一个C到A工突变的反向M2阻断性引物(SEQ ID 7)(表3)。当使用100,000拷贝人类野生型基因组DNA(即330ng)扩增GNAS基因时，上述两种GNAS延迟性PAP检测产生了HEX荧光信号,分别测量到Ct 21.8和27.6循环次数。与实例2中相应的GNAS常规PAP检测(SEQ ID 1和2)比较，上述两种GNAS延迟性PAP检测(SEQ ID 1和6，SEQ ID 1和7)的Ct值延迟了多达7.1个循环次数。
一个多重PAP检测在同一个反应中包括GNAS延迟性PAP检测(SEQ ID 1和6)和HIVPAP检测(SEQ ID 3和5)。另一个多重PAP检测则包括GNAS延迟性PAP检测(SEQ ID 1和6)和HIV PAP检测(SEQ ID 1和7)。在一个反应中同时加入了100,000拷贝人类野生型基因组DNA(即330ng)和100拷贝HIV模板。对于其中的GNAS基因，在上述两种GNAS延迟性PAP检测中(SEQ ID 1和6,SEQ ID 1和7)产生了HEX荧光信号,分别测量到Ct 22.0和27.9循环次数。与实例2中的GNAS常规PAP检测(SEQ ID 1和2)相比，上述两种GNAS延迟性PAP检测(SEQ ID 1和6，SEQ ID 1和7)的Ct值最多延迟了7.4个循环次数。另外对于其中的HIV基因,上述两个多重PAP反应中的HIV PAP检测(SEQ ID 3和5)产生了FAM荧光信号，分别测量到Ct 33.4和32.7循环次数。与实例2基本一致。
因此单重和多重延迟性PAP检测证明了焦磷酸化激活性荧光可以测定核酸的PAP扩增。
表3.含有3'区域人工突变的GNAS基因的引物
表3注释
a两个分别用于GNAS基因延迟性PAP的阻断性引物被引入了3'人工突变以使其与起始模板错配。这二个反向M1和M2引物(SEQ ID 6和7)均分别与荧光基团-淬灭基团双标记阻断性引物(SEQ ID 1)配对。
b反向M1引物序列，1个人工突变T由粗体和下划线表示。另外ddC表示3'末端双脱氧核苷酸ddCMP。
c3'区域人工突变，其类型和3'末端的位置被列出。3'末端核苷酸被指定为1。
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<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 智人 （Homo sapiens）
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> n is HEX-dAMP
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> n is TAMRA-ddCMP
<400> 1
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<213> 智人 （Homo sapiens）
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<212> DNA
<213> 艾滋病相关的逆转录病毒 （Aids-associated retrovirus）
<220>
<221> misc_feature
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<220>
<221> misc_feature
<222> (28)..(28)
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<213> 艾滋病相关的逆转录病毒 （Aids-associated retrovirus）
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Claims (16)
1.一种用于焦磷酸化激活性聚合反应中扩增模板的3'末端阻断性引物，其内部区域或5'末端核苷酸上带有荧光基团以及3'末端阻断性核苷酸上带有淬灭基团，一旦焦磷酸化反应去除了与淬灭基团连接的3'末端阻断性核苷酸，在PAP扩增中的荧光基团即产生可检测到的荧光信号。
2.根据权利要求1所述的用于焦磷酸化激活性聚合反应的3'末端阻断性引物，其特征在于，FAM或HEX荧光基团连接在内部区域或5'末端核苷酸上，而TAMRA淬灭基团连接在3'末端双脱氧核苷酸上。
3.根据权利要求1所述的用于焦磷酸化激活性聚合反应的3'末端阻断性引物，其特征在于，所述荧光基团的发射光谱与淬灭基团的吸收光谱重叠。
4.根据权利要求1所述的用于焦磷酸化激活性聚合反应的3'末端阻断性引物，其中荧光基团的位置为从3'末端起的30个碱基或更少。
5.一种用于焦磷酸化激活性聚合反应中扩增模板的3'末端阻断性引物，其内部区域或5'末端核苷酸上带有淬灭基团以及3'末端阻断性核苷酸上带有荧光基团，一旦焦磷酸化反应去除了与淬灭基团连接的3'末端阻断性核苷酸，在PAP扩增中的荧光基团即产生可检测到的荧光信号。
6.根据权利要求5所述的用于焦磷酸化激活性聚合反应的3'末端阻断性引物，其特征在于，TAMRA淬灭基团连接在内部区域或5'末端核苷酸上，而FAM或HEX荧光基团连接在3'末端双脱氧核苷酸上。
7.根据权利要求5所述的用于焦磷酸化激活性聚合反应的3'末端阻断性引物，其特征在于，所述荧光基团的发射光谱与淬灭基团的吸收光谱重叠。
8.根据权利要求5所述的用于焦磷酸化激活性聚合反应的3'末端阻断性引物，其特征在于，所述淬灭基团的位置为从3'末端起的30个碱基或更少。
9.多个3'末端阻断性引物用于多重焦磷酸化激活性聚合反应以扩增在一个反应中的多个模板，包括：
a)用于扩增第一模板的第一阻断性引物，其内部区域或5'末端核苷酸上带有第一荧光基团以及3'末端阻断性核苷酸上带有一种通用淬灭基团，一旦焦磷酸化反应去除了与淬灭基团连接的3'末端阻断性核苷酸，在PAP扩增中的第一荧光基团即产生可检测到的荧光信号；和
b)用于扩增第二模板的第二阻断性引物，其内部区域或5'末端核苷酸上带有第二荧光基团以及3'末端阻断性核苷酸上带有相同的通用淬灭基团，一旦焦磷酸化反应去除了与相同的通用淬灭基团连接的3'末端阻断性核苷酸，在PAP扩增中的第二荧光基团即产生可检测到的荧光信号。
10.根据权利要求9所述的用于多重焦磷酸化激活性聚合反应的多个3'末端阻断性引物，其特征在于所述第一阻断性引物的FAM荧光基团连接到内部区域或5'末端核苷酸上，而通用的TAMRA淬灭基团连接到3'末端双脱氧核苷酸上，其中第二阻断性引物的HEX荧光基团连接到内部区域或5'末端核苷酸上，相同的通用TAMRA淬灭基团则连接到3'末端双脱氧核苷酸上。
11.根据权利要求9所述的用于多重焦磷酸化激活性聚合反应的多个3'末端阻断性引物，其特征在于所述第一阻断性引物上带有与第二阻断性引物相同的通用淬灭基团，但是第一阻断性引物上带有与第二阻断性引物不同的荧光基团。
12.根据权利要求9所述的用于多重焦磷酸化激活性聚合反应的多个3'末端阻断性引物，其特征在于所述第一模板是内部对照，第二模板是靶标。
13.根据权利要求9所述的用于多重焦磷酸化激活性聚合反应的多个3'末端阻断性引物，其特征在于所述每个荧光基团的发射光谱与通用淬灭基团的吸收光谱重叠。
14.根据权利要求9所述的用于多重焦磷酸化激活性聚合反应的多个3'末端阻断性引物，其特征在于所述荧光基团的位置为从3'末端阻断性核苷酸起30个碱基或更少。
15.一种用于多重焦磷酸化激活性聚合反应的方法，其特征在于多个3'末端阻断性引物在一个反应中扩增多个模板，包括：
a)用第一阻断性引物来扩增第一模板，其内部区域或5'末端核苷酸上带有第一荧光基团以及3'末端阻断性核苷酸上带有一个通用淬灭基团，
b)一旦焦磷酸化反应去除了与淬灭基团连接的3'末端阻断性核苷酸，在PAP扩增中的荧光基团即产生可检测到的荧光信号,
c)用第二引物来扩增第二模板，其内部区域或5'末端核苷酸上带有第二荧光基团以及3'末端阻断性核苷酸上带有相同的通用淬灭基团，和
d)一旦焦磷酸化反应去除了与相同的通用淬灭基团连接的3'末端阻断性核苷酸，在PAP扩增中的荧光基团即产生可检测到的荧光信号。
16.根据权利要求15所述的用于多重焦磷酸化激活性聚合反应的方法，其特征在于所述第一阻断性引物的FAM荧光基团连接到内部区域或5'末端核苷酸上，通用TAMRA淬灭基团连接到第一3'末端双脱氧核苷酸上,而且其中第二阻断性引物的HEX荧光基团连接到内部区域或5'末端核苷酸上，相同的通用TAMRA淬灭基团连接到第二3'末端双脱氧核苷酸上。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20200519 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |