CN112342318B - 一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV2的引物对、反应冻干管及试剂盒 - Google Patents

一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV2的引物对、反应冻干管及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN112342318B
CN112342318B CN202011429713.1A CN202011429713A CN112342318B CN 112342318 B CN112342318 B CN 112342318B CN 202011429713 A CN202011429713 A CN 202011429713A CN 112342318 B CN112342318 B CN 112342318B
Authority
CN
China
Prior art keywords
freeze
seq
nucleotide sequence
reaction
orf1ab
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202011429713.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112342318A (zh
Inventor
闫亚平
张鑫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Xi'an Haitaike Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shaanxi Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shaanxi Normal University filed Critical Shaanxi Normal University
Priority to CN202011429713.1A priority Critical patent/CN112342318B/zh
Publication of CN112342318A publication Critical patent/CN112342318A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112342318B publication Critical patent/CN112342318B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于检测新型冠状病毒SARS‑CoV2的引物对、反应冻干管及试剂盒，本发明首次设计了用于检测的新的引物对，经验证能够应用于新型冠状病毒SARS‑CoV2的检测。在新设计的引物对的基础上，本发明进一步设计了反应冻干管，通过将反应所需的所有试剂进行冷冻干燥，实现了产品的常温运输，降低了运输成本和储藏成本。同时，使用的石蜡即解决了指示剂冷冻干燥后变质的问题，又解决了气溶胶污染的问题。本发明基于上述反应冻干管制备成的新型冠状病毒SARS‑CoV2现场检测试剂盒中还包括：核酸释放剂、反应缓冲液、阳性对照品和阴性对照品，核酸释放剂能够高效裂解病毒并释放核酸，对LAMP反应无抑制作用，避免了繁琐的核酸提取过程，提高了新型冠状病毒SARS‑CoV2的检测效率。

Description

一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV2的引物对、反应冻干管 及试剂盒
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV2的引物对、反应冻干管及试剂盒。
背景技术
冠状病毒是一个大型病毒家族，可引起感冒、中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。新型冠状病毒SARS-CoV2是一种以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株，因2019年年底病毒性肺炎病例而被发现，2020年2月12日被世界卫生组织命名为SARS-CoV2。SARS-CoV2具有传染性强、潜伏期长、无症状感染者也可以传染他人等特点。
目前，关于SARS-CoV2的检测相关试剂盒所采用的技术多为RT-PCR技术和免疫胶体金技术，RT-PCR存在操作复杂，对设备依赖性高、检测通量低等不足；而免疫胶体金技术则的特异性和灵敏度均相对较低。
环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是2000年由日本学者Notomi发明的一种核酸体外恒温扩增技术。其特点是针对靶基因的8个区域设计6种特异性引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60-65℃恒温扩增，15-60分钟左右即可实现109-1010倍的核酸扩增。具有灵敏度高、特异性强、反应时间短、操作简单、结果易于判读等特点。
当前，中国博奥生物公司推出的六项呼吸道病毒核酸检测试剂盒(恒温扩增芯片法)是目前少数采用恒温扩增技术检测SARS-CoV2的产品，但是该产品仍然需要配备相应的设备进行检测，且检测前需要进行病毒RNA的提取，很难做到真正意义上的现场检测。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV2的引物对、反应冻干管及试剂盒。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明公开了一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV2的引物对，所述引物对为针对orf1ab基因的引物对、针对E基因的引物对或者针对N基因的引物对；
所述针对orf1ab基因的引物对，包括：
F3-Orf1ab：核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；
B3-Orf1ab：核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示；
FIP-Orf1ab：核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示；
BIP-Orf1ab：核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示；
LF-Orf1ab：核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示；
LB-Orf1ab：核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示；
所述针对E基因的引物对，包括：
F3-E：核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示；
B3-E：核苷酸序列如SEQ.ID.NO.8所示；
FIP-E：核苷酸序列如SEQ.ID.NO.9所示；
BIP-E：核苷酸序列如SEQ.ID.NO.10所示；
LF-E：核苷酸序列如SEQ.ID.NO.11所示；
LB-E：核苷酸序列如SEQ.ID.NO.12所示；
所述针对N基因的引物对，包括：
F3-N：核苷酸序列如SEQ.ID.NO.13所示；
B3-N：核苷酸序列如SEQ.ID.NO.14所示；
FIP-N：核苷酸序列如SEQ.ID.NO.15所示；
BIP-N：核苷酸序列如SEQ.ID.NO.16所示；
LF-N：核苷酸序列如SEQ.ID.NO.17所示；
LB-N：核苷酸序列如SEQ.ID.NO.18所示。
本发明还公开了一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV2的引物对的反应冻干管，该反应冻干管中包含：
Figure BDA0002826197650000031
上述引物对中表示两个引物的浓度相同，如FIP和BIP，分别都是0.8-1.6μM。
其中：
所述FIP采用权利要求1所述的引物FIP-Orf1ab、FIP-E或FIP-N；
所述BIP采用权利要求1所述的引物BIP-Orf1ab、BIP-E或BIP-N；
所述LF采用权利要求1所述的引物LF-Orf1ab、LF-E或LF-N；
所述LB采用权利要求1所述的引物LB-Orf1ab、LB-E或LB-N；
所述F3采用权利要求1所述的引物F3-Orf1ab、F3-E或F3-N；
所述B3采用权利要求1所述的引物B3-Orf1ab、B3-E或B3-N。
优选地，所述指示剂为二甲酚橙、酚红、甲酚红、溴麝香草酚蓝或中性红。
优选地，所述冻干保护剂，包括：
0.2-0.4M海藻糖；
0.1-0.25M肌醇；
1％-5％甘露醇(质量百分比)；
1％-6％甘氨酸(质量百分比)；
0.5％-2％PVP30(质量百分比)。
优选地，该反应冻干管的制备方法如下：
在每个反应冻干管加入固体石蜡，然后加热，待石蜡彻底融化后加入1μl 0.9-2.7mM的指示剂，然后迅速转移至冰浴条件下，通过石蜡将指示剂密封在反应冻干管管底；(冷冻干燥的冻干体系为15ul，加入1ul 0.9-2.7mM的指示剂后，冻干体系中指示剂的浓度即为60-180uM)
待石蜡彻底凝固后加入Bst DNA Polymerase、AMV Reverse Transcriptase、dNTP、引物对和冻干保护剂，混合均匀后每个反应冻干管分装15μl，-80℃预冷2小时后进行冷冻干燥处理6小时，制得。
本发明公开了一种用于新型冠状病毒SARS-CoV2现场检测的试剂盒，包括：
核酸释放剂1ml×96管；
反应缓冲液2.5ml；
阳性对照品1管；
阴性对照品0.5ml；
上述的反应冻干管8管/条×12条。
优选地，所述核酸释放剂，包括：
1-10mM的Tris-HCl，0.1-5mM的EDTA，0.001-0.05％的十二烷基二甲基苄基氯化铵或十二烷基二甲基苄基溴化铵。
优选地，所述阳性对照，采用以下方法制得：
合成含有SARS-CoV2 E基因、N基因、orf1ab序列的基因片段(得到的质粒可以作为三个基因检测的阳性对照，可以通用)，并连接至pUC57载体上，然后转入DH5α感受态细胞，过夜培养，提取质粒DNA，经过冷冻干燥处理获得阳性对照品；
所述阴性对照品采用无菌超纯水。
优选地，所述反应缓冲液，包括：
1.5％(质量百分比)的支链多糖，8mM的MgSO4，20mM的Tris-HCl，20mM(NH4)2SO4，50mM的KCl，0.5％的Tween-20。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明公开了用于检测新型冠状病毒SARS-CoV2的引物对，所述引物对为针对orf1ab基因的引物对、针对E基因的引物对或者针对N基因的引物对，上述序列为本发明首次设计，经验证能够应用于新型冠状病毒SARS-CoV2的检测。在新设计的引物对的基础上。
本发明还公开了基于所述引物对的冻干管，通过将反应所需的所有试剂进行冷冻干燥，实现了产品的常温运输，降低了运输成本和储藏成本。同时，使用的石蜡即解决了指示剂冷冻干燥后变质的问题，又解决了气溶胶污染的问题。
本发明基于上述反应冻干管制备成的新型冠状病毒SARS-CoV2现场检测试剂盒中还包括：核酸释放剂、反应缓冲液、阳性对照品和阴性对照品，核酸释放剂能够高效裂解病毒并释放核酸，对LAMP反应无抑制作用，避免了繁琐的核酸提取过程，提高了新型冠状病毒SARS-CoV2的检测效率。反应缓冲体系降低了LAMP的非特异性扩增；同时，配合本发明提供的新型指示剂能够在反应结束后直接肉眼观察检测结果，显色结果区分明显。
附图说明
图1为二甲酚橙为指示剂Orf1ab基因检测结果；
图2为甲酚红为指示剂E基因检测结果；
图3为酚红为指示剂E基因检测结果；
图4为中性红为指示剂N基因检测结果；
图5为溴麝香草酚蓝为指示剂N基因检测结果。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述：
实施例1
新型冠状病毒SARS-CoV2现场检测试剂盒的制备工艺包括一下5个部分：核酸释放剂、反应缓冲液、反应冻干管、阳性对照品、阴性对照品。
其中，核酸释放剂为0.01％十二烷基二甲基苄基氯化铵，2mM Tris-HCl(pH 6.5)，1mM EDTA。
其中反应缓冲液中包含0.5％支链多糖，8mM MgSO4，20mM Pipes(pH 8.6)，20mM(NH4)2SO4，12.5mM KCl，0.25％Tween-20。
其中反应冻干管中包含100μM二甲酚橙，20mg固体石蜡，0.64U/μl Bst DNAPolymerase，0.2U/μl AMV Reverse Transcriptase，2.8mM dNTP，1.6μM FIP和BIP，0.8μMLF和LB，0.4μM F3和B3，40％(V/V)冻干保护剂。
其中冻干保护剂为0.4M海藻糖，0.15M肌醇，3％甘露醇，3％甘氨酸，1％PVP30。
所述反应冻干管的制备工艺：每个反应冻干管加入20mg固体石蜡，加热，待石蜡彻底融化后加入1μl 1.5mM的二甲酚橙，然后迅速转移至冰浴条件下，通过石蜡将二甲酚橙密封在反应冻干管管底。
反应冻干管中还包括Bst DNA Polymerase、AMV Reverse Transcriptase、dNTP、引物和冻干保护剂等的混合物，各自浓度分别为0.64U/μl Bst DNA Polymerase，0.2U/μlAMV Reverse Transcriptase，2.8mM dNTP，1.6μM FIP和BIP，0.8μM LF和LB，0.4μM F3和B3，40％(V/V)冻干保护剂，混合均匀后每个反应冻干管分装15μl，-80℃预冷2小时后进行冷冻干燥处理6小时。
所述阳性对照品的制备包括以下步骤：合成含有SARS-CoV2 E基因、N基因、orf1ab部分序列的基因片段，并连接至pUC57载体上，然后转入DH5α感受态细胞，过夜培养，提取质粒DNA，经过冷冻干燥作为阳性对照品。
所述阴性对照品的制备为无菌超纯水。
实施例2
新型冠状病毒SARS-CoV2现场检测试剂盒的制备工艺包括一下5个部分：核酸释放剂、反应冻干管、反应缓冲液、阳性对照品、阴性对照品。
其中，核酸释放剂为0.05％十二烷基二甲基苄基氯化铵，5mM Tris-HCl(pH 7.0)，1mM EDTA。
其中反应缓冲液中包含1.5％支链多糖，8mM MgSO4，20mM Tris-HCl(pH 8.6)，20mM(NH4)2SO4，50mM KCl，0.5％Tween-20。
其中反应冻干管中包含60μM甲酚红，25mg固体石蜡，0.4U/μl Bst DNAPolymerase，0.25U/μl AMV Reverse Transcriptase，2mM dNTP，1.2μM FIP和BIP，0.6μMLF和LB，0.3μM F3和B3，50％冻干保护剂。
所述冻干保护剂为0.2M海藻糖，0.25M肌醇，1％甘露醇，6％甘氨酸，2％PVP30。
所述反应冻干管的制备工艺：每个反应冻干管加入20mg固体石蜡，然后加热，待石蜡彻底融化后加入1μl 0.9mM的甲酚红，然后迅速转移至冰浴条件下，通过石蜡将甲酚红密封在反应冻干管管底。待石蜡彻底凝固后加入Bst DNA Polymerase、AMV ReverseTranscriptase、dNTP、引物和冻干保护剂的混合物，使其浓度分别达到0.4U/μl Bst DNAPolymerase，0.25U/μl AMV Reverse Transcriptase，2mM dNTP，1.2μM FIP和BIP，0.6μMLF和LB，0.3μM F3和B3，50％冻干保护剂，混合均匀后每个反应冻干管分装15μl，-80℃预冷2小时后进行冷冻干燥处理6小时。
所述阳性对照的制备包括以下步骤：合成含有SARS-CoV2 E基因、N基因、orf1ab部分序列的基因片段，并连接至pUC57载体上，然后转入DH5α感受态细胞，过夜培养，提取质粒DNA，经过冷冻干燥作为阳性对照品。
所述阴性对照的制备为无菌超纯水。
实施例3
新型冠状病毒SARS-CoV2现场检测试剂盒的制备工艺包括一下5个部分：核酸释放剂、反应冻干管、反应缓冲液、阳性对照品、阴性对照品。
其中，核酸释放剂为0.01％十二烷基二甲基苄基溴化铵，2mM Tris-HCl(pH 6.5)，0.1mM EDTA。
其中，反应缓冲液中包含3％支链多糖，6mM MgSO4，20mM MOPS(pH 8.6)，10mM(NH4)2SO4，50mM KCl，1％Tween-20。
其中，反应冻干管中包含120μM酚红，25mg固体石蜡，0.8U/μl Bst DNAPolymerase，0.5U/μl AMV Reverse Transcriptase，1.5mM dNTP，1.6μM FIP和BIP，0.8μMLF和LB，0.4μM F3和B3，30％冻干保护剂。
所述冻干保护剂为0.3M海藻糖，0.25M肌醇，5％甘露醇，1％甘氨酸，0.5％PVP30。
所述反应冻干管的制备工艺：每个反应冻干管加入20mg固体石蜡，然后加热，待石蜡彻底融化后加入2μl 0.6mM的酚红，然后迅速转移至冰浴条件下，通过石蜡将酚红密封在反应冻干管管底。待石蜡彻底凝固后加入Bst DNA Polymerase、AMV ReverseTranscriptase、dNTP、引物和冻干保护剂的混合物，使其浓度分别达到0.32U/μl Bst DNAPolymerase，0.2U/μl AMV Reverse Transcriptase，1.5mM dNTP，1.6μM FIP和BIP，0.8μMLF和LB，0.4μM F3和B3，30％冻干保护剂，混合均匀后每个反应冻干管分装10μl，-80℃预冷2小时后进行冷冻干燥处理6小时。
所述阳性对照的制备包括以下步骤：合成含有SARS-CoV2 E基因、N基因、orf1ab部分序列的基因片段，并连接至pUC57载体上，然后转入DH5α感受态细胞，过夜培养，提取质粒DNA，经过冷冻干燥作为阳性对照品。
所述阴性对照的制备为无菌超纯水。
实施例4
新型冠状病毒SARS-CoV2现场检测试剂盒的制备工艺包括一下5个部分：核酸释放剂、反应冻干管、反应缓冲液、阳性对照品、阴性对照品。
其中，核酸释放剂为0.025％十二烷基二甲基苄基溴化铵，10mM Tris-HCl(pH7.5)，5mM EDTA。
所述反应缓冲液中包含2％支链多糖，10mM MgSO4，20mM Tris-HCl(pH 8.6)，20mM(NH4)2SO4，50mM KCl，0.1％Tween-20。
所述反应冻干管中包含180μM中性红，30mg固体石蜡，0.68U/μl Bst DNAPolymerase，0.25U/μl AMV Reverse Transcriptase，3.5mM dNTP，1.6μM FIP和BIP，0.8μMLF和LB，0.4μM F3和B3，35％冻干保护剂。
所述冻干保护剂为0.4M海藻糖，0.2M肌醇，1％甘露醇，2％甘氨酸，1％PVP30。
所述反应冻干管的制备工艺：每个反应冻干管加入20mg固体石蜡，然后加热，待石蜡彻底融化后加入2μl 0.9mM的中性红，然后迅速转移至冰浴条件下，通过石蜡将中性红密封在反应冻干管管底。待石蜡彻底凝固后加入Bst DNA Polymerase、AMV ReverseTranscriptase、dNTP、引物和冻干保护剂的混合物，使其浓度分别达到0.32U/μl Bst DNAPolymerase，0.2U/μl AMV Reverse Transcriptase，3.5mM dNTP，0.16μM FIP和BIP，0.8μMLF和LB，0.4μM F3和B3，50％冻干保护剂，混合均匀后每个反应冻干管分装10μl，-80℃预冷2小时后进行冷冻干燥处理6小时。
所述阳性对照的制备包括以下步骤：合成含有SARS-CoV2 E基因、N基因、orf1ab部分序列的基因片段，并连接至pUC57载体上，然后转入DH5α感受态细胞，过夜培养，提取质粒DNA，经过冷冻干燥作为阳性对照品。
所述阴性对照的制备为无菌超纯水。
实施例5
新型冠状病毒SARS-CoV2现场检测试剂盒的制备工艺包括一下5个部分：核酸释放剂、反应冻干管、反应缓冲液、阳性对照品、阴性对照品。
其中，核酸释放剂为0.05％十二烷基二甲基苄基溴化铵，10mM Tris-HCl(pH7.5)，5mM EDTA。
所述反应缓冲液中包含4％支链多糖，8mM MgSO4，20mM Pipes(pH 8.6)，20mM(NH4)2SO4，50mM KCl，0.1％Tween-20。
所述反应冻干管中包含120μM溴麝香草酚蓝，30mg固体石蜡，0.68U/μl Bst DNAPolymerase，0.25U/μl AMV Reverse Transcriptase，3.5mM dNTP，1.6μM FIP和BIP，0.8μMLF和LB，0.4μM F3和B3，35％冻干保护剂。
所述冻干保护剂为0.3M海藻糖，0.2M肌醇，3％甘露醇，6％甘氨酸，1％PVP30。
所述反应冻干管的制备工艺：每个反应冻干管加入25mg固体石蜡，然后加热，待石蜡彻底融化后加入1μl 1.8mM的溴麝香草酚蓝，然后迅速转移至冰浴条件下，通过石蜡将溴麝香草酚蓝密封在反应冻干管管底。待石蜡彻底凝固后加入Bst DNA Polymerase、AMVReverse Transcriptase、dNTP、引物和冻干保护剂的混合物，使其浓度分别达到0.75U/μlBst DNA Polymerase，0.25U/μl AMV Reverse Transcriptase，2.8mM dNTP，0.16μM FIP和BIP，0.8μM LF和LB，0.4μM F3和B3，50％冻干保护剂，混合均匀后每个反应冻干管分装15μl，-80℃预冷2小时后进行冷冻干燥处理6小时。
所述阳性对照的制备包括以下步骤：合成含有SARS-CoV2 E基因、N基因、orf1ab部分序列的基因片段，并连接至pUC57载体上，然后转入DH5α感受态细胞，过夜培养，提取质粒DNA，经过冷冻干燥作为阳性对照品。
所述阴性对照的制备为无菌超纯水。
实施例6
以orf1ab基因LAMP引物，按照实施例1的工艺制备试剂盒，然后验证其效果，结果如图1所示，阳性结果为黄色，阴性结果紫红色。
实施例7
分别以E基因LAMP引物，按照实施例2的工艺制备试剂盒，然后验证其效果，结果如图2所示，阳性结果为黄色，阴性结果为红色。
实施例8
分别以E基因LAMP引物，按照实施例3的工艺制备试剂盒，然后验证其效果，结果如图3所示，阳性结果为浅黄色，阴性结果为红色。
实施例9
分别以N基因LAMP引物，按照实施例4的工艺制备试剂盒，然后验证其效果，结果如图4所示，阳性结果为紫红色，阴性结果为黄色。
实施例10
分别以N基因LAMP引物，按照实施例5的工艺制备试剂盒，然后验证其效果，结果如图5所示，阳性结果为黄色，阴性结果为绿色。
实施例11
以orf1ab基因相应引物，按照实施例1的工艺制备试剂盒，以临床样品验证其阳性率，其结果如表1所示。
表1.本发明试剂盒检测临床样品SARS-CoV2 Orf1ab基因结果
Figure BDA0002826197650000121
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
序列表
<110> 陕西师范大学
<120> 一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV2的引物对、反应冻干管及试剂盒
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gccacataga tcatccaaat c 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgattgtgca tcagctgact 20
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgtaaaacc cacagggtca ttggattttg tgacttaaaa ggtaa 45
<210> 4
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
agtctgtacc gtctgcggta tagcatgggt tcgcggagtt 40
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcacaagttg taggtatttg ta 22
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggttatggct gtagttgtga t 21
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gagacaggta cgttaatagt ta 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
agatcaggaa ctctagaaga at 22
<210> 9
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
acaatcgaag cgcagtaagg atgcgtactt ctttttcttg cttt 44
<210> 10
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcgtactgct gcaatattgt taacagattt ttaacacgag agtaaa 46
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gctagtgtaa ctagcaagaa ta 22
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gtgagtcttg taaaaccttc tt 22
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cagtcaagcc tcttctcgtt 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gccttgttgt tgttggcctt 20
<210> 15
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
agccattcta gcaggagaag ttcacgtagt cgcaacagtt ca 42
<210> 16
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gcggtgatgc tgctcttgct cagacatttt gctctcaagc t 41
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
ctgctgcctg gagttgaatt 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gctgctgctt gacagattga 20

Claims (4)

1.一种用于新型冠状病毒SARS-CoV2现场检测的试剂盒，其特征在于，包括：
核酸释放剂1mL×96管；
反应缓冲液2.5mL；
阳性对照品1管；
阴性对照品0.5mL；
反应冻干管8管/条×12条；
所述反应冻干管包含：
指示剂60-180 μM；
固体石蜡20-30 mg；
Bst DNA Polymerase0.25-1 U/μL；
AMV Reverse Transcriptase0.2-0.5 U/μL；
dNTP1.4-3.5 mM；
FIP和BIP0.8-1.6 μM；
LF和LB0.4-0.8 μM；
F3和B30.2-0.4 μM；
冻干保护剂30%-50%；
其中：
所述FIP采用引物FIP-Orf1ab、FIP-E或FIP-N；
其中，FIP-Orf1ab的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示，FIP-E的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.9所示，FIP-N的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.15所示；
所述BIP采用引物BIP-Orf1ab、BIP-E或BIP-N；
其中，BIP-Orf1ab的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.4所示，BIP-E的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.10所示，BIP-N的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.16所示；
所述LF采用引物LF-Orf1ab、LF-E或LF-N；
其中，LF-Orf1ab的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示，LF-E的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.11所示，LF-N的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.17所示；
所述LB采用引物LB-Orf1ab、LB-E或LB-N；
其中，LB-Orf1ab的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示，LB-E的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.12所示，LB-N的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.18所示；
所述F3采用引物F3-Orf1ab、F3-E或F3-N；
其中，F3-Orf1ab的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示，F3-E的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示，F3-N的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.13所示；
所述B3采用引物B3-Orf1ab、B3-E或B3-N；
其中，B3-Orf1ab的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示，B3-E的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.8所示， B3-N的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.14所示；
所述指示剂为二甲酚橙、酚红、甲酚红、溴麝香草酚蓝或中性红；
所述冻干保护剂，包括：
0.2-0.4M 海藻糖；
0.1-0.25M 肌醇；
1%-5% 甘露醇；
1%-6% 甘氨酸；
0.5%-2% PVP30；
该反应冻干管的制备方法如下：
在每个反应冻干管加入固体石蜡，然后加热，待石蜡彻底融化后加入1μL 0.9-2.7mM的指示剂，然后迅速转移至冰浴条件下，通过石蜡将指示剂密封在反应冻干管管底；
待石蜡彻底凝固后加入Bst DNA Polymerase、AMV Reverse Transcriptase、dNTP、引物对和冻干保护剂，混合均匀后每个反应冻干管分装15μL，-80℃预冷2小时后进行冷冻干燥处理6小时，制得。
2.如权利要求1所述的用于新型冠状病毒SARS-CoV2现场检测的试剂盒，其特征在于，所述核酸释放剂，包括：
1-10 mM的Tris-HCl，0.1-5 mM的EDTA，0.001-0.05%的十二烷基二甲基苄基氯化铵或十二烷基二甲基苄基溴化铵。
3.如权利要求1所述的用于新型冠状病毒SARS-CoV2现场检测的试剂盒，其特征在于，所述阳性对照品，采用以下方法制得：
合成含有SARS-CoV2 E基因、N基因和orf1ab序列的基因片段，并连接至pUC57载体上，然后转入DH5α感受态细胞，过夜培养，提取质粒DNA，经过冷冻干燥处理获得阳性对照品；
所述阴性对照品采用无菌超纯水。
4.如权利要求1所述的用于新型冠状病毒SARS-CoV2现场检测的试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液，包括：1.5%的支链多糖，8 mM的MgSO4，20 mM的Tris-HCl，20mM (NH4)2SO4，50 mM的KCl，0.5%的Tween-20。
CN202011429713.1A 2020-12-09 2020-12-09 一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV2的引物对、反应冻干管及试剂盒 Active CN112342318B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011429713.1A CN112342318B (zh) 2020-12-09 2020-12-09 一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV2的引物对、反应冻干管及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011429713.1A CN112342318B (zh) 2020-12-09 2020-12-09 一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV2的引物对、反应冻干管及试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112342318A CN112342318A (zh) 2021-02-09
CN112342318B true CN112342318B (zh) 2023-05-30

Family

ID=74427700

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011429713.1A Active CN112342318B (zh) 2020-12-09 2020-12-09 一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV2的引物对、反应冻干管及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112342318B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW202246498A (zh) * 2021-02-11 2022-12-01 普渡研究基金會 用於環介導恆溫擴增(lamp)病原體檢測的引子設計及用途
CN113584224A (zh) * 2021-07-21 2021-11-02 上海思路迪生物医学科技有限公司 基于lamp技术检测新型冠状病毒的引物探针组合、试剂盒及检测方法
CN113774166A (zh) * 2021-09-13 2021-12-10 青岛农业大学 猪圆环病毒2型、3型、4型现场快速高灵敏鉴别诊断试剂盒及其使用方法
CN115838832A (zh) * 2022-09-29 2023-03-24 福州奥吉芯生物科技有限公司 检测新型冠状病毒的引物组及恒温检测试剂盒

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1816737A (zh) * 2003-06-30 2006-08-09 格罗宁根大学医学中心 组织加工的方法
CN101258388A (zh) * 2005-07-27 2008-09-03 Crc斯马克普林特有限公司 时间-温度指示物
CN102703431A (zh) * 2012-06-05 2012-10-03 中国水产科学研究院黄海水产研究所 基于石蜡的核酸等温扩增反应试剂保存方法及反应试剂
CN104937108A (zh) * 2012-08-23 2015-09-23 新英格兰生物实验室公司 利用pH敏感染料的扩增反应产物的检测
CN109161582A (zh) * 2018-08-14 2019-01-08 关明 一种用于环介导等温扩增的试剂及其试剂盒和应用
CN110564879A (zh) * 2019-10-10 2019-12-13 中国检验检疫科学研究院 一种快速检测霍乱弧菌的试剂盒

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1053590C (zh) * 1998-10-19 2000-06-21 卫生部长春生物制品研究所 冻干甲型肝炎减毒活疫苗及其保护剂
WO2016165831A1 (en) * 2015-04-17 2016-10-20 Curevac Ag Lyophilization of rna
CN106063933B (zh) * 2015-12-31 2020-01-07 武汉博沃生物科技有限公司 通用疫苗冻干保护剂及其应用
CN109486907B (zh) * 2018-12-21 2022-02-11 陕西师范大学 一种可常温运输的环介导等温扩增试剂、制备方法及应用
US10689716B1 (en) * 2020-03-19 2020-06-23 University Of Miami Materials and methods for detecting coronavirus
CN111349721B (zh) * 2020-03-19 2022-10-04 北京卓诚惠生生物科技股份有限公司 用于检测呼吸道感染病原体的核酸试剂、试剂盒、系统及方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1816737A (zh) * 2003-06-30 2006-08-09 格罗宁根大学医学中心 组织加工的方法
CN101258388A (zh) * 2005-07-27 2008-09-03 Crc斯马克普林特有限公司 时间-温度指示物
CN102703431A (zh) * 2012-06-05 2012-10-03 中国水产科学研究院黄海水产研究所 基于石蜡的核酸等温扩增反应试剂保存方法及反应试剂
CN104937108A (zh) * 2012-08-23 2015-09-23 新英格兰生物实验室公司 利用pH敏感染料的扩增反应产物的检测
CN109161582A (zh) * 2018-08-14 2019-01-08 关明 一种用于环介导等温扩增的试剂及其试剂盒和应用
CN110564879A (zh) * 2019-10-10 2019-12-13 中国检验检疫科学研究院 一种快速检测霍乱弧菌的试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
CN112342318A (zh) 2021-02-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112342318B (zh) 一种用于检测新型冠状病毒SARS-CoV2的引物对、反应冻干管及试剂盒
KR100937761B1 (ko) 비-병원성 또는 병원성 ｈ5 아형 인플루엔자 ａ 바이러스검출용 키트
WO2017212904A1 (ja) 複数のプライマーセットを組み合わせたｌａｍｐ法を用いたアフリカ豚コレラウイルスの迅速検出法
WO2016037418A1 (zh) 一种核酸单链环状文库的构建方法和试剂
AU2014405969A1 (en) Method for constructing nucleic acid single-stranded cyclic library and reagents thereof
CN101611155B (zh) 虾病原体诊断用序列
CN105132590B (zh) 一种牛传染性鼻气管炎病毒的lamp可视化检测方法
CN111690776A (zh) 常温等温快速检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物、探针、试剂、方法及试剂盒
WO2011156007A2 (en) Rt-lamp assay for the detection of pan-serotype dengue virus
CN113604612B (zh) 阿龙山病毒环介导等温扩增检测引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用
Nishimura et al. Direct polymerase chain reaction from whole blood without DNA isolation
KR101149422B1 (ko) 우역 바이러스, 가성우역 바이러스, 블루텅 바이러스, 리프트 계곡열 바이러스의 동시 검출을 위한 다중 프라이머 세트 및 그를 이용한 검출 방법
CN104263838B (zh) 单增李斯特菌 lamp-lfd检测试剂盒及其检测方法
CN105671210A (zh) 基于lamp技术检测李痘病毒的引物、试剂盒及检测方法
CN114410836B (zh) 一种集样本处理、核酸提取及多重恒温扩增一体化的检测人细小病毒b19的试剂盒和方法
CN105986044B (zh) 禽流感病毒核酸通用快速检测方法
Callens et al. Highly sensitive detection of swine vesicular disease virus based on a single tube RT-PCR system and DIG-ELISA detection
CN106987657B (zh) 用于鉴别牛病毒腹泻病毒和牛轮状病毒的引物组合及其应用
Soliman et al. Immunocapture and direct binding loop mediated isothermal amplification simplify molecular diagnosis of Cyprinid herpesvirus-3
US11352617B2 (en) Method for enriching biomolecules and for removing the biomolecules from a biological sample
CN107385057B (zh) 检测霍乱弧菌的rpa-iac引物及方法
WO2016058127A1 (zh) 一种转座酶打断核酸并加接头的方法和试剂
CN116042370A (zh) 一种居家自检的新型冠状病毒的检测试剂盒及其检测方法
CN113215154A (zh) TGEV、PEDV、PDCoV三重PCR检测的引物组合、试剂盒及其应用
CN106011307A (zh) H7亚型禽流感病毒核酸快速检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20231130

Address after: 710076 Unit 40502, Building 1, North District, Yichui Shangfu, No. 31 Zhangba'er Road, High tech Zone, Xi'an City, Shaanxi Province

Patentee after: Xi'an Haitaike Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 710119 No. 620 West Chang'an Street, Chang'an District, Xi'an City, Shaanxi Province

Patentee before: Shaanxi Normal University

TR01 Transfer of patent right