CN113584224A

CN113584224A - 基于lamp技术检测新型冠状病毒的引物探针组合、试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN113584224A
Application number: CN202110824236.7A
Authority: CN
Inventors: 王丽娟; 严俊; 高鹏飞; 巫益鸣
Original assignee: Shanghai 3D Medicines Co Ltd
Current assignee: Shanghai 3D Medicines Co Ltd
Priority date: 2021-07-21
Filing date: 2021-07-21
Publication date: 2021-11-02

Abstract

本发明公开了基于LAMP技术检测新型冠状病毒的引物探针组合、试剂盒及检测方法。所述引物探针组合包括N基因引物探针组合和/或E基因引物探针组合，进一步包括内标引物探针组合，探针及引物的序列如SEQ ID NO:1～24所示。本发明提供的试剂盒包括所述探针引物组合，以及缓冲液、链置换DNA聚合酶、逆转录酶、镁离子、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)。所述试剂盒能够对样本中是否含有新型冠状病毒进行N基因和E基因靶标的检测以及内标监控样本的核酸提取，具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优点；引入内源性内参照系统，可以检测采样、提取和扩增的整个过程，避免假阴性结果。

Description

基于LAMP技术检测新型冠状病毒的引物探针组合、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及基于LAMP技术检测新型冠状病毒的引物探针组合、试剂盒及检测方法。

背景技术

新型冠状病毒属于β属的冠状病毒，是急性呼吸道传染病，人群普遍易感。目前所见传染源主要是新型冠状病毒感染的患者，无症状感染者也可能成为传染源。基于目前的流行病学调查，潜伏期1-14天，多为3-7天。以发热、干咳、乏力为主要表现。少数患者伴有鼻塞、流涕、咽痛、肌痛和腹泻等症状。目前对该新型冠状病毒的临床检测多依赖于实时荧光PCR技术以及基于荧光染料的LAMP技术。

但实时荧光PCR技术需要昂贵的仪器设备、操作复杂、耗时长且容易产生误判等缺点，不利于快速检测和应急检测。而基于荧光染料的LAMP技术虽然不需要昂贵的仪器设备、耗时短、可以用于快速检测，但容易产生非特异性扩增，无法对扩增产物进行鉴定，且不能使用内标，不能监控提取过程，无法防止假阴性。

综上所述，基于新型冠状病毒的RNA序列分析，尝试找出一种可以快速、简便、操作性强、特异性好、对仪器要求低的诊断新型冠状病毒2019-nCoV感染的技术方法，对于解决临床上新型冠状病毒感染确诊时间周期长、仪器要求高等问题具有十分重要的意义，将为临床上早期诊断和及时治疗提供便利。

发明内容

本发明的目的是，提供基于LAMP技术检测新型冠状病毒的引物探针组合、试剂盒及检测方法，旨在解决现有技术检测方法复杂、容易产生非特异性扩增，无法对扩增产物进行鉴定的技术问题。

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

本发明提供了一种基于LAMP技术检测新型冠状病毒N基因、E基因以及内标的靶标探针，所述每个靶标的探针包含两条寡核苷酸链，其中第一寡核苷酸链包含位于3’端的淬灭剂，第二寡核苷酸链包含位于5’端的荧光基团并在其5’部分与第一寡核苷酸链互补。其中，所述N基因靶标探针包括如SEQ ID NO:1的第一条寡核苷酸链和SEQ ID NO:2的第二条寡核苷酸链；所述E基因靶标探针包括如SEQ ID NO:3的第一条寡核苷酸链和SEQ ID NO:4的第二条寡核苷酸链；所述内标探针包括如SEQ ID NO:5的第一条寡核苷酸链和SEQ IDNO:6的第二条寡核苷酸链。

上述每个靶标探针的第二寡核苷酸链的3’区域将与作为引物的模板杂交，以通过链置换聚合酶延伸。在环介导等温扩增反应期间，当所述两条寡核苷酸链互相替换时，产生荧光信号。通过监测发射的荧光，可以检测序列的特异性扩增。

上述每个靶标的第二寡核苷酸链的量与第一寡核苷酸链的量的比率不大于1：1。

上述淬灭剂包含4-(4’-恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸(DAMCYL)、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)或黑洞淬灭剂(BHQ)；荧光基团包含羧基荧光素(FAM)、花青素染料(CY3、CY5)、羧基-X-罗丹明(ROX)中的一种或多种，但不限于此。

在本发明一实施方式中，所述N基因靶标探针的第一条寡核苷酸链的3’端标记有BHQ-1，第二条寡核苷酸链的5’端标记有FAM；E基因靶标探针的第一条寡核苷酸链的3’端标记有BHQ-3，第二条寡核苷酸链的5’端标记有CY5；内标探针的第一条寡核苷酸链的3’端标记有BHQ-2，第二条寡核苷酸链的5’端标记有ROX。

本发明第一方面提供的基于LAMP技术检测新型冠状病毒的N基因、E基因以及内标的探针中，N基因探针用于靶向检测新型冠状病毒的N基因的环介导等温扩增产物、E基因探针用于靶向检测新型冠状病毒的E基因的环介导等温扩增产物、内标探针用于监测样本的提取，且随各自靶标扩增产物的增加，它们报告的荧光信号的强度相应增强，从而达到实时监测待测靶标核酸的目的。

第二方面，本发明提供了一种基于LAMP技术检测新型冠状病毒的引物，所述引物包括用于靶向新型冠状病毒的N基因、E基因以及内标的引物组。其中，所述N基因引物组包括如SEQ ID NO:7-SEQ ID NO:8所示的外引物对、如SEQ ID NO:9-SEQ ID NO:10所示的内引物对、如SEQ ID NO:11-SEQ ID NO:12所示的环引物对；所述E基因引物组包括如SEQ IDNO:13-SEQ ID NO:14所示的外引物对、如SEQ ID NO:15-SEQ ID NO:16所示的内引物对、如SEQ ID NO:17-SEQ ID NO:18所示的环引物对；所述内标引物组包括如SEQ ID NO:19-SEQID NO:20所示的外引物对、如SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:22所示的内引物对、如SEQ ID NO:23-SEQ ID NO:24所示的环引物对。

即，所述N基因引物组包括外引物对、内引物对和环引物对，其中所述外引物对包括SEQ ID NO:7所示的正向外引物N-F3和SEQ ID NO:8所示的反向外引物N-B3，所述内引物对包括SEQ ID NO:9所示的正向内引物N-FIP和SEQ ID NO:10所示的反向内引物N-BIP，所述环引物对包括SEQ ID NO:11所示的正向环引物N-LF和SEQ ID NO:12所示的反向环引物N-LB。

所述E基因引物组包括外引物对、内引物对和环引物对，其中所述外引物对包括SEQ ID NO:13所示的正向外引物E-F3和SEQ ID NO:14所示的反向外引物E-B3，所述内引物对包括SEQ ID NO:15所示的正向内引物E-FIP和SEQ ID NO:16所示的反向内引物E-BIP，所述环引物对包括SEQ ID NO:17所示的正向环引物E-LF和SEQ ID NO:18所示的反向环引物E-LB。

所述内标引物组包括外引物对、内引物对和环引物对，其中所述外引物对包括SEQID NO:19所示的正向外引物IC-F3和SEQ ID NO:20所示的反向外引物IC-B3，所述内引物对包括SEQ ID NO:21所示的正向内引物IC-FIP和SEQ ID NO:22所示的反向内引物IC-BIP，所述环引物对包括SEQ ID NO:23所示的正向环引物IC-LF和SEQ ID NO:24所示的反向环引物IC-LB。

可选地，所述外引物对与所述内引物对、所述环引物对的摩尔比为1:(1～8):(1～4)，优选为1：8：4。在该比例下，N基因、E基因以及内标引物组可以实现对新型冠状病毒较佳的扩增效果。进一步可选地，所述正向外引物F3和反向外引物B3的摩尔比为1：1，所述正向内引物FIP和反向内引物BIP的摩尔比为1：1，所述正向环引物LF和反向环引物LB的摩尔比为1：1。

本发明第二方面提供的所述引物适用于通过环介导等温扩增反应检测新型冠状病毒时的靶标基因的扩增，其中，所述N基因引物组是针对新型冠状病毒的N基因的6个高度保守区域而设计，所述E基因引物组是针对新型冠状病毒的E基因的6个高度保守区域而设计，所述内标引物组是针对人内源性β-珠蛋白的6个高度保守区域而设计，这3个引物组与各自靶标基因的特异性较高，分别能快速、特异性扩增新型冠状病毒的不同靶标基因，扩增效果较佳，还克服了同一反应体系中多组引物同时存在带来的引物与靶标之间非特异性结合的问题。

第三方面，本发明还提供了一种基于LAMP技术检测新型冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括如本发明第一方面所述的探针和如本发明第二方面所述的引物。

可选地，所述试剂盒还包括缓冲液、链置换DNA聚合酶、逆转录酶、镁离子、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)。

可选地，所述缓冲液采用磷酸盐缓冲液(pH在7.0-8.0)、Tris-HCl缓冲液(pH在7.5-9.0)、硼酸钠缓冲液(pH在7.6-9.5)其中一种。在本发明一实施方式中，所述缓冲液为pH8.8的Tris-HCl缓冲液。

其中，所述链置换DNA聚合酶具有5’-3’DNA聚合酶活性，缺失5’-3’核酸外切酶活性，可以在60～65℃的恒定温度下进行链置换反应和扩增，包括但不限于Bst DNA聚合酶、Bca DNA聚合酶以及其它具有类似高链置换活性的DNA聚合酶。所述dNTPs包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP。所述镁离子为硫酸镁，用于催化所述链置换DNA聚合酶的活性。

本发明所述的试剂盒中的各个组分可以独立地以液态或固态形式存在。可选地，所述试剂盒中的各个组分可以冻干成微球，便于试剂盒的常温运输和长期保存。当所述试剂盒中的各个组分以冻干微球存在时，可以用含待测样本基因的RNA来复溶所述试剂盒中的组分，进行等温扩增反应。

可选地，所述试剂盒可与恒温荧光检测仪、实时荧光检测仪以及其它可提供恒定温度和荧光检测的设备。

本发明第三方面提供的所述试剂盒能够对样本中是否含有新型冠状病毒进行N基因和E基因靶标的检测以及内标监控样本的核酸提取，具有速度快、特异性好的优点。

第四方面，本发明还提供了一种基于LAMP技术检测新型冠状病毒的方法，包括：

提取待测临床样本的RNA，配制扩增的反应体系，以待测样本的RNA为模板，进行等温扩增；其中所述扩增反应体系包括如本发明第一方面所述的探针和如本发明第二方面所述的引物。

本发明中，若待测样本中存在新型冠状病的的N基因，则FAM通道的荧光信号逐渐增强，荧光信号的变化过程被仪器实时检测。类似地，若待测样本中存在新型冠状病毒地E基因，则CY5通道的荧光信号逐渐增强，荧光信号的变化过程被仪器实时检测。若待测样本中不含新型冠状病毒，则内标的ROX通道的荧光信号逐渐增强，荧光信号的变化过程被仪器实时监测。

其中，所述扩增反应体系还包括缓冲液、链置换DNA聚合酶、逆转录酶、镁离子、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)。

可选地，所述扩增反应体系中，所述引物探针组、缓冲反应液、链置换DNA聚合酶、dNTPs、镁离子可以以固态或液体独立地或混合地存在。在本发明一实施方式中，可以将所述引物探针组、缓冲反应液、链置换DNA聚合酶、dNTPs、镁离子混合制成冻干微球，再与待测样本的RNA混合复溶。

进一步地，所述扩增反应体系中，所述第一条寡核苷酸链的浓度为0.01～10μΜ，优选为0.1μΜ，第二条寡核苷酸链的浓度为0.01～10μΜ，优选为0.1μΜ。

进一步地，所述扩增反应体系中，所述链置换DNA聚合酶的浓度为1U-10U，优选为8U。

进一步地，所述扩增反应体系中，所述dNTPs的浓度为0.04～10mM。其中dATP、dGTP、dCTP、dTTP的比例为1：1：1：1，优选为每种0.4mM。

进一步地，所述扩增反应体系中，所述逆转录酶的浓度为1U-30U。优选为20U。

进一步地，所述扩增反应体系中，所述镁离子的浓度为1mM～10mM。优选为8mM。

进一步地，所述扩增反应体系中，内引物N-FIP、N-BIP、E-FIP、E-BIP、IC-FIP、IC-BIP的浓度分别为在0.1～5μΜ的范围。优选为1.6μΜ。

进一步地，所述扩增反应体系中，外引物N-F3、N-B3、E-F3、E-B3、IC-F3、IC-B3的浓度分别在0.01～2μΜ的范围。优选为0.2μΜ。

进一步地，所述扩增反应体系中，环引物N-LF、N-LB、E-LF、E-LB、IC-LF、IC-LB的浓度分别在0.01～4μΜ的范围。优选为0.8μΜ。

在本发明一实施方式中，所述扩增反应体系的体积为25μL。

在本发明一实施方式中，所述缓冲液为Tris-HCl在所述扩增反应体系中的浓度为20mM，其pH为8.8。

其中，所述待测样本为咽拭子、鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液等。

本发明中，所述环介导等温扩增反应是在60～65℃的恒温条件下进行。优选地，进行所述环介导等温扩增时的温度为61℃。

进一步地，所述环介导等温扩增反应的时间为30～60min。优选地，进行所述环介导等温扩增的时间为40min。其中，靶标病毒的逆转录和等温扩增在同一反应管中进行。

本发明第四方面提供的所述检测新型冠状病毒的方法，是基于三重环介导等温扩增技术，采用三组引物和三组荧光探针，如果待测样本中含有新冠病毒，则对应的靶标通道就能进行扩增反应得到相应的扩增产物，呈现对应的荧光探针的荧光信号。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1.本发明检测新型冠状病毒的N基因、E基因探针，能够特异性地识别新型冠状病毒的不同等温扩增产物，并报告两种不同的荧光信号。

2.引入内源性内参照系统，可以检测采样、提取和扩增的整个过程，避免假阴性结果。

3.本发明提供的检测新型冠状病毒核酸的试剂盒，能够基于三重环介导等温扩增技术，采用三组引物和三组荧光探针对样本进行新型冠状病毒不同靶标的检测，具有灵敏度高、特异性强、重复性好等优点。

4.本发明提供的检测新型冠状病毒的方法，操作简便，扩增时间短、对仪器要求低，可用于应急检测和快速检测。

附图说明

图1A为本发明N基因引物筛选结果。

图1B为本发明E基因引物筛选结果。

图1C为本发明内标引物筛选结果。

图2为本发明实施例1中N基因、E基因、内标三重扩增临床样本的检测结果。

图3为本发明实施例2中N基因引物与文献引物的对比图。

图4为本发明实施例3中E基因引物与文献中引物的对比图。

图5A为本发明实施例4中本发明检测试剂盒扩增临床样本的结果。

图5B为本发明实施例4中商业化检测试剂盒扩增临床样本的结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。

本发明引物探针的设计

本发明针对新型冠状病毒的N基因设计三组引物、探针；E基因设计三组引物、探针；内标设计三组引物、探针。设计了三套引物探针序列组，筛选出其中一套高效、特异性强、灵敏度高的新型冠状病毒N基因、E基因以及内标的引物组。参见图1A-图1C，分别为本发明N基因、E基因以及内标靶标的引物筛选结果；其中，图1A为N基因引物筛选结果；图1B为E基因引物筛选结果；图1C为内标引物筛选结果。本发明筛选的探针及引物组的具体序列如表1。另外，图1A-图1C中显示的扩增效果相对较差的两套引物探针序列组的具体序列见表2。

表1本发明采用的新型冠状病毒探针、引物序列

表23个靶标的另外2套新型冠状病毒探针、引物序列

本发明涉及一种新型冠状病毒高效扩增的逆转录和等温扩增一步法的扩增试剂，组分包括20mM pH8.8的Tris-HCl、8U链置换DNA聚合酶、20U逆转录酶、8mM Mg²⁺、0.4mMdNTPs等。

实施例1：试剂盒的制备

(1)配制液体试剂混合物，其中该液体试剂混合物含有上述表1中的引物探针、pH8.8的Tris-HCl缓冲液、Bst DNA聚合酶、逆转录酶、镁离子以及dNTPs。其中，典型的液体试剂混合物中各组分的含量如下：20mM的Tris-HCl缓冲液、8mM的MgSO₄、每种dNTPs 0.4mM、0.1μM的第一条寡核苷酸探针、0.1μM的第二条寡核苷酸探针、8U的链置换DNA聚合酶、20U的逆转录酶、外引物N-F3、N-B3、E-F3、E-B3、IC-F3、IC-B3的含量均为0.2μM、内引物N-FIP、N-BIP、E-FIP、E-BIP、IC-FIP、IC-BIP的含量均为1.6μM、环引物N-LF、N-LB、E-LF、E-LB、IC-LF、IC-LB的含量均为0.8μM。

(2)待测样本的核酸提取

对于临床拭子样本：将棉拭子样本放入样本释放剂管中，振荡10s后，室温放置10min，上清液作为后续环介导等温扩增的模板。

(3)环介导等温扩增

将上述提取到的待测样本的RNA作为模板，将模板加入八连管中，形成体积为25μL的反应体系，置于恒温扩增分析仪或实时荧光检测仪中，61℃扩增40min，反应结束后，判读结果。

(4)试验结果

参见图2，为N基因、E基因、内标三重扩增临床样本的检测结果。结果显示，样本1的检测结果为N基因阳性、E基因阳性和内标阳性，代表样本1中有新型冠状病毒2019-nCoV的存在；而样本2和样本3的检测结果均为N基因阴性、E基因阴性且内标阳性，代表样本2和样本3中无新型冠状病毒2019-nCoV存在。

实施例2：本发明专利新型冠状病毒N基因的等温扩增引物与文献(SARS-CoV-2Rapid Colorimetric LAMP Assay Kit)中等温扩增引物对比。

(1)参考文献所发表的新型冠状病毒N基因等温扩增引物组，具体序列如表3：

表3文献中新型冠状病毒N基因等温扩增的引物序列

引物名称	引物序列(5’-3’)
		WX-N-F3	ACCAGGAACTAATCAGACAAG
WX-N-B3	GACTTGATCTTTGAAATTTGGATCT
		WX-N-FIP	TTCCGAAGAACGCTGAAGCGGAACTGATTACAAACATTGGCC
WX-N-BIP	CGCATTGGCATGGAAGTCACAATTTGATGGCACCTGTGTA
		WX-N-LF	GGGGGCAAATTGTGCAATTTG
WX-N-LB	CTTCGGGAACGTGGTTGACC

将表3中的新型冠状病毒N基因等温扩增引物组采用ddH₂O稀释成100μM的储存液，然后按照1:1:8:8:4:4的比例进行混合，配制成引物混合液。同时，根据文献发表的新型冠状病毒N基因的等温扩增的引物，设计并合成探针，具体探针序列见下表4。

表4根据文献中N基因等温扩增的引物序列设计的探针序列

(2)本发明实施例1中所述的新型冠状病毒N基因等温扩增引物探针组合与文献中报道的引物组合比较，按照实施例1所述提取方法提取样本1的咽拭子。

(3)按照实施例1配制反应体系，两组反应体系只有引物和探针的序列不同，其余组分均一致。

(4)试验结果

参见图3，图3为N基因引物与文献引物的对比图。结果显示，本发明所述的N基因引物探针比文献中所述的引物出峰时间早，扩增效果好。本发明所述的N基因引物优于文献中所述的引物。

实施例3：本发明专利新型冠状病毒E基因的等温扩增引物与文献(SARS-CoV-2Rapid Colorimetric LAMP Assay Kit)中等温扩增引物对比。

(1)参考文献所发表的新型冠状病毒E基因等温扩增引物组，具体序列如表5。

表5文献中新型冠状病毒E基因等温扩增的引物序列

引物名称	引物序列(5’-3’)
		WX-E-F3	TGAGTACGAACTTATGTACTCAT
WX-E-B3	TTCAGATTTTTAACACGAGAGT
		WX-E-FIP	ACCACGAAAGCAAGAAAAAGAAGTTCGTTTCGGAAGAGACAG
WX-E-BIP	TTGCTAGTTACACTAGCCATCCTTAGGTTTTACAAGACTCACGT
		WX-E-LF	CGCTATTAACTATTAACG
WX-E-LB	GCGCTTCGATTGTGTGCGT

将表5中的新型冠状病毒E基因等温扩增引物组采用ddH₂O稀释成100μM的储存液，然后按照1:1:8:8:4:4的比例进行混合，配制成引物混合液。同时，根据文献发表的新型冠状病毒E基因的等温扩增的引物，设计并合成探针，具体探针序列见下表6。

表6根据文献中E基因等温扩增的引物序列设计的探针序列

(2)本发明实施例1中所述的新型冠状病毒E基因等温扩增引物探针组合与文献中的引物组合比较，按照实施例1所述提取方法提取样本1的咽拭子。

(4)试验结果

参见图4，为E基因引物与文献中引物的对比图。结果显示，本发明所述的E基因引物探针比文献中所述的引物出峰时间早，扩增效果好。本发明所述的E基因引物优于文献中所述的引物。

实施例4：本发明试剂盒和国内获证的新型冠状病毒2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光PCR法)扩增临床样本的效果对比

按照实施例1提供的试剂盒以及临床样本提取核酸的方法提取5个阳性样本的核酸，分别采用本发明的试剂盒以及商业化的试剂盒进行扩增，对比N基因的检测结果。

试验结果

参见图5A和图5B，其中图5A为本发明检测试剂盒扩增临床样本的结果，图5B为商业化检测试剂盒扩增临床样本的结果。结果显示，使用商业化试剂盒5个样本中有4个样本的N基因有扩增，而本发明所述试剂盒5个样本的N基因靶标全部扩增。本发明试剂盒的检测灵敏度优于商业化检测试剂盒。

上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。

序列表

<110> 上海思路迪生物医学科技有限公司

<120> 基于LAMP技术检测新型冠状病毒的引物探针组合、试剂盒及检测方法

<160> 70

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> 探针(probe)

<400> 1

tacgagcgat cgtgctagga ctctgctgac tcgctgtbh 39

<210> 2

<211> 55

<212> DNA

<213> 探针(probe)

<400> 2

acagcgagtc agcagagtcc tagcacgatc gctcgtagaa gcctcagcag cagat 55

<210> 3

<211> 37

<212> DNA

<213> 探针(probe)

<400> 3

tacgagcgat cgtgctagga ctctgctgac tcgctgt 37

<210> 4

<211> 58

<212> DNA

<213> 探针(probe)

<400> 4

acagcgagtc agcagagtcc tagcacgatc gctcgtatgc tgcaatattg ttaacgtg 58

<210> 5

<211> 37

<212> DNA

<213> 探针(probe)

<400> 5

tacgagcgat cgtgctagga ctctgctgac tcgctgt 37

<210> 6

<211> 57

<212> DNA

<213> 探针(probe)

<400> 6

acagcgagtc agcagagtcc tagcacgatc gctcgtacct ttagtgatgg cctggct 57

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 7

tgtctggtaa aggccaacaa 20

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 8

gcaatttgcg gccaatgt 18

<210> 9

<211> 42

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 9

tggcagtacg tttttgccga ggcaacaagg ccaaactgtc ac 42

<210> 10

<211> 42

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 10

aacacaagct ttcggcagac gttgattagt tcctggtccc ca 42

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 11

gaagcctcag cagcagat 18

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 12

gtccagaaca aacccaagga 20

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 13

attcgtttcg gaagagaca 19

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 14

aggaactcta gaagaattca gat 23

<210> 15

<211> 48

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 15

agtgtaacta gcaagaatac cacgaggtac gttaatagtt aatagcgt 48

<210> 16

<211> 43

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 16

cgcttcgatt gtgtgcgtac agagtaaacg taaaaagaag gtt 43

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 17

cgctattaac tattaacg 18

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 18

gcgcttcgat tgtgtgcgt 19

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 19

ccttaggctg ctggtggt 18

<210> 20

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 20

actcagtgtg gcaaaggtg 19

<210> 21

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 21

agggttgccc ataacagcat catacccttg gacccagagg 40

<210> 22

<211> 41

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 22

aggctcatgg caagaaagtg ctccttgagg ttgtccaggt g 41

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 23

tggacagatc cccaaaggac t 21

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 24

cctttagtga tggcctggct 20

<210> 25

<211> 37

<212> DNA

<213> 探针(probe)

<400> 25

tacgagcgat cgtgctagga ctctgctgac tcgctgt 37

<210> 26

<211> 58

<212> DNA

<213> 探针(probe)

<400> 26

acagcgagtc agcagagtcc tagcacgatc gctcgtatca ctcaacatgg caaggaag 58

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 27

cccaaaatca gcgaaatgca 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 28

agccaatttg gtcatctgga 20

<210> 29

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 29

cgttgttttg atcgcgcccc attacgtttg gtggaccctc 40

<210> 30

<211> 39

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 30

tgcgtcttgg ttcaccgctc attggaacgc cttgtcctc 39

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 31

ctggttactg ccagttgaat ct 22

<210> 32

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 32

tcactcaaca tggcaaggaa g 21

<210> 33

<211> 37

<212> DNA

<213> 探针(probe)

<400> 33

tacgagcgat cgtgctagga ctctgctgac tcgctgt 37

<210> 34

<211> 60

<212> DNA

<213> 探针(probe)

<400> 34

acagcgagtc agcagagtcc tagcacgatc gctcgtaact gagggagcct tgaatacacc 60

<210> 35

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 35

tggctactac cgaagagct 19

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 36

tgcagcattg ttagcaggat 20

<210> 37

<211> 41

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 37

tctggcccag ttcctaggta gtgacgaatt cgtggtggtg a 41

<210> 38

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 38

agacggcatc atatgggttg cacgggtgcc aatgtgatct 40

<210> 39

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 39

tggactgaga tctttcattt taccg 25

<210> 40

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 40

actgagggag ccttgaatac acc 23

<210> 41

<211> 37

<212> DNA

<213> 探针(probe)

<400> 41

tacgagcgat cgtgctagga ctctgctgac tcgctgt 37

<210> 42

<211> 58

<212> DNA

<213> 探针(probe)

<400> 42

acagcgagtc agcagagtcc tagcacgatc gctcgtaact gcgcttcgat tgtgtgcg 58

<210> 43

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 43

agctgatgag tacgaactt 19

<210> 44

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 44

ttcagatttt taacacgaga gt 22

<210> 45

<211> 44

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 45

cacgaaagca agaaaaagaa gtacgcattc gtttcggaag agac 44

<210> 46

<211> 44

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 46

ttgctagtta cactagccat ccttaggttt tacaagactc acgt 44

<210> 47

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 47

actgcgcttc gattgtgtgc g 21

<210> 48

<211> 37

<212> DNA

<213> 探针(probe)

<400> 48

tacgagcgat cgtgctagga ctctgctgac tcgctgt 37

<210> 49

<211> 56

<212> DNA

<213> 探针(probe)

<400> 49

acagcgagtc agcagagtcc tagcacgatc gctcgtactg cgcttcgatt gtgtgc 56

<210> 50

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 50

tgagtacgaa cttatgtact cat 23

<210> 51

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 51

ttcagatttt taacacgaga gt 22

<210> 52

<211> 42

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 52

accacgaaag caagaaaaag aagttcgttt cggaagagac ag 42

<210> 53

<211> 45

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 53

ttgctagtta cactagccat ccttaaggtt ttacaagact cacgt 45

<210> 54

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 54

ctgcgcttcg attgtgtgc 19

<210> 55

<211> 37

<212> DNA

<213> 探针(probe)

<400> 55

tacgagcgat cgtgctagga ctctgctgac tcgctgt 37

<210> 56

<211> 61

<212> DNA

<213> 探针(probe)

<400> 56

acagcgagtc agcagagtcc tagcacgatc gctcgtagac agatccccaa aggactcaaa 60

g 61

<210> 57

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 57

ccttaggctg ctggtggt 18

<210> 58

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 58

actcagtgtg gcaaaggtg 19

<210> 59

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 59

agggttgccc ataacagcat catacccttg gacccagagg 40

<210> 60

<211> 41

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 60

aggctcatgg caagaaagtg ctccttgagg ttgtccaggt g 41

<210> 61

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 61

gacagatccc caaaggactc aaag 24

<210> 62

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 62

cggtgccttt agtgatggc 19

<210> 63

<211> 37

<212> DNA

<213> 探针(probe)

<400> 63

tacgagcgat cgtgctagga ctctgctgac tcgctgt 37

<210> 64

<211> 57

<212> DNA

<213> 探针(probe)

<400> 64

acagcgagtc agcagagtcc tagcacgatc gctcgtaggg ttgcccataa cagcatc 57

<210> 65

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 65

cccagaggtt ctttgagtcc 20

<210> 66

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 66

acgtgcagct tgtcacag 18

<210> 67

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 67

ttcttgccat gagccttcac ctggggatct gtccactcct 40

<210> 68

<211> 40

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 68

tgctcggtgc ctttagtgat gggcagctca ctcagtgtgg 40

<210> 69

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 69

gggttgccca taacagcatc 20

<210> 70

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物(primer)

<400> 70

cctggctcac ctggacaa 18

Claims

1.基于LAMP技术检测新型冠状病毒的引物探针组合，其特征在于包括：

N基因引物探针组合和/或E基因引物探针组合，其中，N基因引物探针组合为：

N基因探针第一条寡核苷酸链：序列如SEQ ID NO:1所示，

N基因探针第二条寡核苷酸链：序列如SEQ ID NO:2所示，

正向外引物N-F3：序列如SEQ ID NO:7所示，

反向外引物N-B3：序列如SEQ ID NO:8所示，

正向内引物N-FIP：序列如SEQ ID NO:9所示，

反向内引物N-BIP：序列如SEQ ID NO:10所示，

正向环引物N-LF：序列如SEQ ID NO:11所示，

反向环引物N-LB：序列如SEQ ID NO:12所示；

E基因引物探针组合为：

E基因探针第一条寡核苷酸链：序列如SEQ ID NO:3所示，

E基因探针第二条寡核苷酸链：序列如SEQ ID NO:4所示，

正向外引物E-F3：序列如SEQ ID NO:13所示，

反向外引物E-B3：序列如SEQ ID NO:14所示，

正向内引物E-FIP：序列如SEQ ID NO:15所示，

反向内引物E-BIP：序列如SEQ ID NO:16所示，

正向环引物E-LF：序列如SEQ ID NO:17所示，

反向环引物E-LB：序列如SEQ ID NO:18所示。

2.如权利要求1所述的基于LAMP技术检测新型冠状病毒的引物探针组合，其特征在于还包括内标引物探针组合，为：

内标探针第一条寡核苷酸链：序列如SEQ ID NO:5所示，

内标探针第二条寡核苷酸链：序列如SEQ ID NO:6所示，

正向外引物IC-F3：序列如SEQ ID NO:19所示，

反向外引物IC-B3：序列如SEQ ID NO:20所示，

正向内引物IC-FIP：序列如SEQ ID NO:21所示，

反向内引物IC-BIP：序列如SEQ ID NO:22所示，

正向环引物IC-LF：序列如SEQ ID NO:23所示，

反向环引物IC-LB：序列如SEQ ID NO:24所示。

3.如权利要求1或2所述的基于LAMP技术检测新型冠状病毒的引物探针组合，其特征在于：所述N基因引物探针组合、E基因引物探针组合、内标引物探针组合中的外引物对、内引物对、环引物对的摩尔比为1:(1～8):(1～4)。

4.如权利要求3所述的基于LAMP技术检测新型冠状病毒的引物探针组合，其特征在于：所述正向外引物F3和反向外引物B3的摩尔比为1：1，所述正向内引物FIP和反向内引物BIP的摩尔比为1：1，所述正向环引物LF和反向环引物LB的摩尔比为1：1。

5.如权利要求1或2所述的基于LAMP技术检测新型冠状病毒的引物探针组合，其特征在于：所述N基因引物探针组合、E基因引物探针组合、内标引物探针组合中的探针第二寡核苷酸链的量与探针第一寡核苷酸链的量的比率不大于1：1。

6.如权利要求1或2所述的基于LAMP技术检测新型冠状病毒的引物探针组合，其特征在于：所述N基因探针第一条寡核苷酸链的3’端标记有BHQ-1，N基因探针第二条寡核苷酸链的5’端标记有FAM；E基因探针第一条寡核苷酸链的3’端标记有BHQ-3，E基因探针第二条寡核苷酸链的5’端标记有CY5；内标探针第一条寡核苷酸链的3’端标记有BHQ-2，内标探针第二条寡核苷酸链的5’端标记有ROX。

7.基于LAMP技术检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1或2所述的基于LAMP技术检测新型冠状病毒的引物探针组合。

8.如权利要求7所述的基于LAMP技术检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括缓冲液、链置换DNA聚合酶、逆转录酶、镁离子、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)。

9.如权利要求8所述的基于LAMP技术检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于：所述缓冲液选自pH在7.0-8.0的磷酸盐缓冲液、pH在7.5-9.0的Tris-HCl缓冲液或pH在7.6-9.5的硼酸钠缓冲液中的一种；优选为pH8.8的Tris-HCl缓冲液。

10.基于LAMP技术检测新型冠状病毒的检测方法，该方法为：提取待测临床样本的RNA，配制扩增的反应体系，以待测样本的RNA为模板，进行等温扩增反应；其中所述扩增反应体系包括如权利要求1或2所述的引物探针组合。

11.如权利要求10所述的基于LAMP技术检测新型冠状病毒的检测方法，其特征在于：所述扩增反应体系中，所述探针第一条寡核苷酸链的浓度为0.01～10μΜ，优选为0.1μΜ，探针第二条寡核苷酸链的浓度为0.01～10μΜ，优选为0.1μΜ。

12.如权利要求10所述的基于LAMP技术检测新型冠状病毒的检测方法，其特征在于：所述扩增反应体系中，内引物N-FIP、N-BIP、E-FIP、E-BIP、IC-FIP、IC-BIP的浓度分别为在0.1～5μΜ的范围，优选为1.6μΜ；外引物N-F3、N-B3、E-F3、E-B3、IC-F3、IC-B3的浓度分别在0.01～2μΜ的范围，优选为0.2μΜ；环引物N-LF、N-LB、E-LF、E-LB、IC-LF、IC-LB的浓度分别在0.01～4μΜ的范围，优选为0.8μΜ。

13.如权利要求10所述的基于LAMP技术检测新型冠状病毒的检测方法，其特征在于：所述扩增反应体系还包括缓冲液、链置换DNA聚合酶、逆转录酶、镁离子、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)。

14.如权利要求13所述的基于LAMP技术检测新型冠状病毒的检测方法，其特征在于：所述扩增反应体系中，所述链置换DNA聚合酶的浓度为1U-10U，优选为8U；所述dNTPs的浓度为0.04～10mM，其中dATP、dGTP、dCTP、dTTP的比例为1：1：1：1，优选为每种0.4mM；所述逆转录酶的浓度为1U-30U，优选为20U；所述镁离子的浓度为1mM～10mM，优选为8mM。

15.如权利要求13所述的基于LAMP技术检测新型冠状病毒的检测方法，其特征在于：所述缓冲液为Tris-HCl，在所述扩增反应体系中的浓度为20mM，其pH为8.8，所述扩增反应体系的体积为25μL。

16.如权利要求13所述的基于LAMP技术检测新型冠状病毒的检测方法，其特征在于：所述扩增反应在60～65℃的恒温条件下进行，扩增反应时间为30～60min；优选地，扩增反应温度为61℃，反应时间为40min。