CN111088406A

CN111088406A - 基于双重环介导恒温扩增技术检测新型冠状病毒的探针、引物、试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN111088406A
Application number: CN202010097730.3A
Authority: CN
Inventors: 郭媛媛; 余枝广; 刘凤玲
Original assignee: Medcaptain Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Medcaptain Medical Technology Co Ltd
Priority date: 2020-02-17
Filing date: 2020-02-17
Publication date: 2020-05-01
Anticipated expiration: 2040-02-17
Also published as: CN111088406B

Abstract

本发明提供了一种基于双重环介导恒温扩增技术检测新型冠状病毒的引物，包括第一引物组和第二引物组，第一引物组包括SEQ ID.NO.3～4所示的第一内引物对、SEQ ID.NO.5～6所示的第一外引物对、SEQ ID.NO.7～8所示的第一环引物对；第二引物组包括SEQ ID.NO.9～10所示的第二内引物对、SEQ ID.NO.11～12所示的第二外引物对、SEQ ID.NO.13‑SEQ ID.NO.14所示的第二环引物对。所述第一引物组和第二引物组分别能快速、特异性地扩增新型冠状病毒的不同靶标基因。本发明还提供了检测新型冠状病毒的探针、试剂盒及方法。

Description

基于双重环介导恒温扩增技术检测新型冠状病毒的探针、引物、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及生物医学领域，特别涉及一种基于双重环介导恒温扩增技术检测新型冠状病毒的探针、引物、试剂盒及检测方法。

背景技术

2019年年底爆发的新型冠状病毒肺炎严重影响了人们的身体健康，目前已因该病造成的死亡人数已远超2003年爆发的非典型肺炎(SARS)。目前对该新型冠状病毒(记作“2019-nCoV”)的临床检测多是依赖于PCR扩增技术，但该技术的操作复杂，需要昂贵的仪器设备，且存在耗时长、灵敏度低、易产生结果误判等缺点，不利于快速检测和应急检测。因此，有必要提供一种能简单、快速、特异性检测新型冠状病毒的技术，以提高检测效率和准确度。

发明内容

有鉴于此，本发明基于双重环介导恒温扩增技术(Duplex Loop mediatedisothermal amplification，Duplex LAMP)提供了一种检测新型冠状病毒的探针、引物、试剂盒及检测方法，以在对样本的单次测试中同步实现对新型冠状病毒的两种靶标基因的简单、快速、特异性检测，提高检测效率和准确度。

第一方面，本发明提供了一种基于双重LAMP技术检测新型冠状病毒的探针，所述探针包括第一探针和第二探针，其中，所述第一探针包括如SEQ ID NO： 1所示的第一核苷酸片段，所述第二探针包括如SEQ ID NO：2所示的第二核苷酸片段，所述第一核苷酸片段和所述第二核苷酸片段的两端独立地标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团；其中，所述第一探针可以与新型冠状病毒的ORF1ab 基因的环介导恒温扩增产物特异性结合而报告第一荧光信号，所述第二探针可以与新型冠状病毒的N基因的环介导恒温扩增产物特异性结合而报告第二荧光信号，其中，所述第一荧光信号与所述第二荧光信号不同。

上述“所述第一核苷酸片段和所述第二核苷酸片段的两端独立地标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团”可以理解为：所述第一核苷酸片段的5’端标记有第一荧光报告基团，3’端标记有第一荧光淬灭基团，所述第二核苷酸片段的5’端标记有第二荧光报告基团，3’端标记有第二荧光淬灭基团。

本发明所述第一探针、第二探针上标记的荧光报告基团和荧光淬灭基团要相匹配，以使在目标核酸不存在或未扩增时，某一探针上标记的荧光报告基团发射的荧光信号会被其上标记的荧光淬灭基团所吸收。但要注意使上述第一荧光信号与第二荧光信号不同，以便区分出两种检测靶标。

可选地，所述荧光报告基团包括羧基荧光素(FAM)、羧基-X-罗丹明 (carboxy-X-rhodamine，ROX)、六氯-6-甲基荧光素(HEX)、花青素染料 (Cyanines dyes)、德克萨斯红染料(Texas Red)、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、 2,7-二甲基-4,5-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、四氯-6-羧基荧光素(TET)和异硫氰酸荧光素(FITC)中的一种或多种，但不限于此。

可选地，所述荧光淬灭基团包括羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、4-[(2-氯-4- 硝基-苯基)-偶氮基]-苯胺(Eclipse)、黑洞淬灭剂(black hole quencher，BHQ) 4-(4’-恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸(DABCYL)和4-(N,N-二甲基氨基)偶氮苯-4’-磺酸氯(DABSYL)中的一种或多种，但不限于此。

其中，所述羧基荧光素(FAM)包括5-羧基荧光素(5-FAM)或6-羧基荧光素(6-FAM)。所述花青素染料可以包括Cy3、Cy5、Cy5.5、Quasar 705(吲哚羰花青素)等多种不同发射波长的荧光染料，但不限于此。所述羧基-X-罗丹明 (ROX)包括5-羧基-X-罗丹明(5-ROX)或6-羧基-X-罗丹明(6-ROX)。其中，所述黑洞淬灭剂(BHQ)包括黑洞淬灭剂1(BHQ-1)、黑洞淬灭剂2(BHQ-2) 或黑洞淬灭剂(BHQ-3)。

在本发明一实施方式中，所述第一核苷酸片段的5’端标记有ROX，3’端标记有BHQ-2，所述第二核苷酸片段的5’端标记有TET，3’端标记有BHQ-1。

本发明第一方面提供的基于双重LAMP技术检测新型冠状病毒的探针中，第一探针用于靶向检测新型冠状病毒的ORF1ab基因的环介导恒温扩增产物、第二探针用于靶向检测新型冠状病毒的N基因的环介导恒温扩增产物，且随各自靶标扩增物的增加，它们报告的荧光信号的强度相应增强，从而达到实时检测待测靶标核酸的目的。

第二方面，本发明提供了一种基于双重LAMP技术检测新型冠状病毒的引物，所述引物包括用于靶向新型冠状病毒的第一引物组和第二引物组，其中，所述第一引物组包括如SEQID.NO.3-SEQID.NO.4所示的第一内引物对、如 SEQID.NO.5-SEQID.NO.6所示的第一外引物对、如 SEQID.NO.7-SEQID.NO.8所示的第一环引物对；所述第二引物组包括如SEQID.NO.9-SEQID.NO.10所示的第二内引物对、如 SEQID.NO.11-SEQID.NO.12所示的第二外引物对、如 SEQID.NO.13-SEQID.NO.14所示的第二环引物对。

即，所述第一引物组包括第一内引物对、第一外引物对和第一环引物对，其中，所述第一内引物对包括SEQ ID NO：3所示的第一正向内引物FIP-Ⅰ和 SEQ ID NO：4所示的第一反向内引物BIP-Ⅰ，所述第一外引物对包括SEQ ID NO：5所示的第一正向外引物F3-Ⅰ和SEQ ID NO：6所示的第一反向外引物 B3-Ⅰ，所述第一环引物对包括SEQ ID NO：7所示的第一正向环引物LF-Ⅰ和 SEQ IDNO：8所示的第一反向环引物LB-Ⅰ。

所述第二引物组包括第二内引物对、第二外引物对和第二环引物对，其中，所述第二内引物对包括SEQ ID NO：9所示的第二正向内引物FIP-Ⅱ和SEQ ID NO：10所示的第二反向内引物BIP-Ⅱ，所述第二外引物对包括SEQ ID NO： 11所示的第二正向外引物F3-Ⅱ和SEQ ID NO：12所示的第二反向外引物B3-Ⅱ，所述第二环引物对包括SEQ ID NO：13所示的第二正向环引物LF-Ⅱ和SEQ IDNO：14所示的第二反向环引物LB-Ⅱ。

可选地，所述第一内引物对与所述第一外引物对、所述第一环引物对的摩尔比为(1～8)：1：(1～4)。优选为8：1：4。在该比例下，采用所述第一引物组可以实现对新型冠状病毒的ORF1ab基因的较佳扩增效果。进一步可选地，所述第一正内引物FIP-Ⅰ和第一反向内引物BIP-Ⅰ的摩尔比为1：1，所述第一正向外引物F3-Ⅰ和第一反向外引物B3-Ⅰ的摩尔比为1：1，所述第一正向环引物 LF-Ⅰ和第一反向环引物LB-Ⅰ的摩尔比为1：1。

类似地，所述第二内引物对与所述第二外引物对、所述第二环引物对的摩尔比为(1～8)：1：(1～4)。优选为8：1：4。在该比例下，采用所述第二引物组可以实现对新型冠状病毒的N基因的较佳扩增效果。进一步可选地，所述第二正内引物FIP-Ⅱ和第二反向内引物BIP-Ⅱ的摩尔比为1：1，所述第二正向外引物F3-Ⅱ和第二反向外引物B3-Ⅱ的摩尔比为1：1，所述第二正向环引物LF-Ⅱ和第二反向环引物LB-Ⅱ的摩尔比为1：1。

本发明第二方面提供的所述引物适用于通过环介导恒温扩增法检测新型冠状病毒时的靶标基因的扩增，其中，所述第一引物组是针对新型冠状病毒的 ORF1ab基因的6个特定高保守区域而设计，所述第二引物组是针对新型冠状病毒的N基因的6个特定高保守区域而设计，这2个引物组与各自靶标基因的特异性较高，分别能快速、特异性扩增新型冠状病毒的不同靶标基因，扩增效果较佳，还克服了同一反应体系中多组引物同时存在带来的引物与靶标之间非特异性结合的问题。

第三方面，本发明还提供了一种基于双重LAMP技术检测新型冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括如本发明第一方面所述的探针和/或如本发明第二方面所述的引物。

具体地，当所述试剂盒包括如本发明第一方面所述的探针时，该试剂盒还包括其他用于扩增新型冠状病毒的LAMP引物。可选地，当所述试剂盒包括如本发明第二方面所述的引物时，该试剂盒还包括其他用于检测新型冠状病毒的探针。

优选地，所述试剂盒包括如本发明第一方面所述的探针和如本发明第二方面所述的引物。

可选地，所述试剂盒还包括缓冲剂、链置换DNA聚合酶、逆转录酶、脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、镁盐。

其中，所述dNTPs可以为本领域常规的dNTP，包括dATP、dGTP、dTTP和 dCTP。所述链置换DNA聚合酶可以在恒定温度下进行链置换和扩增，其可以包括但不限于Bst聚合酶(如Bst聚合酶1.0、Bst聚合酶2.0)、Gsp聚合酶，还可以为其他具有类似高链置换活性的DNA聚合酶。所述镁盐可以为硫酸镁或氯化镁。所述镁盐主要用于催化所述链置换DNA聚合酶的活性。

可选地，所述缓冲剂可以包括Tris-HCl缓冲液(pH在7.5-9.0)、pH在6.8-8.2 的HEPES缓冲液、pH＝7.0-8.0的磷酸盐(PBS)缓冲液、pH＝7.6-9.5的硼酸钠缓冲液等。在本发明一实施方式中，所述缓冲剂为pH＝8.8的Tris-HCl缓冲液。

本发明的所述试剂盒中的各成分可以在使用前分别包装在不同的包装中，独立地以液态或固态形式存在；或者统一在同一包装中。可选地，所述试剂盒中的各成分可以混合成冻干制剂，这样可便于试剂盒的长期储存和运输，也避免了因多次加样带来的污染及误差。当将冻干制剂形式的所述试剂盒用于检测新型冠状病毒时，可用含待测样本基因的溶液(如样本洗脱缓冲液)来复溶所述试剂盒中的成分，得到环介导恒温扩增的扩增反应体系，对操作人员的技术要求较低。

可选地，所述试剂盒可以与恒温扩增荧光检测仪、实时荧光检测仪、其他可提供恒定温度和荧光检测的设备(如荧光定量PCR仪)等配合使用。

本发明第三方面提供的所述试剂盒能够对样本是否含有新型冠状病毒进行不同靶标的检测，具有灵敏度高、特异性强、重复性好、速度快等诸多优点。

第四方面，本发明还提供了一种基于双重LAMP技术检测新型冠状病毒的方法，包括：

提取待测样本的基因，配置扩增反应体系，以待测样本的基因为模板，进行环介导恒温扩增；其中，所述扩增反应体系包括如本发明第一方面所述的探针和/或如本发明第二方面所述的引物；

对所得扩增产物进行实时荧光检测。

本发明中，若待测样本中存在新型冠状病毒的ORF1ab基因，则在所述第一引物组存在下该靶标基因能被不断扩增，其扩增产物能被第一探针结合而报告第一荧光，并随其扩增产物的增多，对应的第一荧光信号逐渐增强，荧光信号的变化过程被仪器实时监测。类似地，若待测样本中存在新型冠状病毒的N基因，则在所述第二引物组存在下该靶标基因能被不断扩增，其扩增产物能被第二探针结合而报告第二荧光，并随其扩增产物的增多，对应的第二荧光信号逐渐增强，荧光信号的变化过程被仪器实时监测。

可选地，若检测到所述第一荧光的强度和增长速度达到阈值，则判断所述待测样本含有新型冠状病毒；或者检测到所述第二荧光的强度和增长速度达到阈值，则判断所述待测样本也含有新型冠状病毒。这样既可以排除背景干扰，又可以确保所述扩增反应的实时荧光曲线能够即时反映出不同靶标的存在，提高检测结果的准确性，可避免对新型冠状病毒的漏检。此外，上述判定条件可在荧光监测仪器中预先设定，减少所述检测方法对操作人员的依赖。

进一步地，在后续结果处理时，可以将所述第一荧光信号或所述第二荧光信号的升高转化为反向降低，使得所述第一荧光信号和第二荧光信号的显示更加清晰可辨。

其中，所述扩增反应体系还包括缓冲剂、链置换DNA聚合酶、逆转录酶、 dNTPs和镁盐。

可选地，所述扩增反应体系中，除待测样本外，其他组成(所述引物组、核酸染料、缓冲剂、链置换DNA聚合酶、dNTP、镁盐)可以以固态或溶液态独立地或混合地存在。在本发明一实施方式中，可以将所述引物组、核酸染料、缓冲剂、链置换DNA聚合酶、dNTP、镁盐混合以制成冻干制剂，再与待测样本混合。

进一步地，所述扩增反应体系中，所述第一探针的浓度为0.01～10μM。优选为0.2μM。所述扩增反应体系中，所述第二探针的浓度为0.01～10μM。优选为0.2μM。

进一步地，所述扩增反应体系中，所述dNTPs的浓度为0.08～800mM。其中，dATP、dGTP、dTTP和dCTP的比例为1：1：1：1。即，每种脱氧核糖核苷三磷酸(简写为dNTP each)的浓度为0.01～100mM，优选为0.01～10mM。更优选为0.5mM。

进一步地，所述扩增反应体系中，所述链置换DNA聚合酶的浓度为0.01～ 10U/μL。优选为0.30U/μL。

进一步地，所述扩增反应体系中，所述逆转录酶的浓度为0.01～10U/μL。优选为0.3U/μL。

进一步地，所述扩增反应体系中，所述镁盐的浓度为0.1～100mM。优选为 0.1～10mM。更优选为0.8mM。

进一步地，所述扩增反应体系中，内引物FIP-Ⅰ、BIP-Ⅰ、FIP-Ⅱ、BIP-Ⅱ的浓度分别在0.008～800μM的范围。优选为在0.1～12μM的范围。更优选为0.8 μM。

进一步地，所述扩增反应体系中，外引物F3-Ⅰ、B3-Ⅰ、F3-Ⅱ和B3-Ⅱ的浓度分别在0.001～100μM的范围。优选为在0.01～2μM的范围。更优选为0.1μM。

进一步地，所述扩增反应体系中，环引物LF-Ⅰ、LB-Ⅰ、LF-Ⅱ和LB-Ⅱ的浓度在0.004～400μM的范围。优选为在0.01～6μM的范围。更优选为0.4μM。

在本发明一实施方式中，所述扩增反应体系的体积为25μL。

在本发明一实施方式中，所述缓冲剂为Tris-HCl缓冲液；Tris-HCl在所述扩增反应体系中的浓度为5～500mM，其pH在7.5-9.0。

其中，所述待测样本可以为粗试样，包括但不限于咽喉拭子、鼻拭子、痰液、支气管肺泡灌洗液、粪便、尿液、脑脊液、全血等。

可选地，当所述待测样本为咽喉拭子、鼻拭子且拭子管中无样本保存液(如病毒保存液)时，所述提取待测样本的基因的步骤包括：对待测样本用洗脱液进行洗脱，然后吸取部分洗脱物加入稀释缓冲液之后进行加热处理，以提取待测样本的基因。加热后的溶液可直接用作LAMP反应的模板。当咽喉拭子、鼻拭子等拭子管有样本保存液(如病毒保存液)时，吸取部分保存液加入稀释缓冲液，之后进行加热处理，加热后的溶液可直接作为LAMP反应的模板使用。

其中，所述待测样本的洗脱液可以为Tris-HCl、HEPES、PBS、水等。所述加热处理的温度在90-150℃的范围。

可选地，当所述待测样本为脑脊液、全血时，应选择合适的RNA提取试剂盒进行基因提取。可选地，当所述待测样本为痰液、支气管肺泡灌洗液、尿液等液体样本时，可将它们进行离心得到沉淀，然后向沉淀中加入稀释缓冲液再进行加热处理。可选地，当所述待测样本为不成形粪便时，可将其与洗脱缓冲液混合，然后再吸取混合物加入稀释缓冲液进行加热处理，加热后的溶液可直接作为LAMP反应的模板使用。

本发明中，所述环介导恒温扩增反应是在单一的恒定温度下进行。可选地，进行所述环介导恒温扩增时的恒温温度为60～72℃。进一步可选为63～67℃。当然，在本发明其他实施方式中，也可以采用其它用于恒温核酸扩增的恒定温度(如50～82℃)。

进一步地，所述环介导恒温扩增反应的反应时间为30～70min。其中，在检测过程中，靶标病毒的逆转录与恒温扩增在同一反应管中进行。其中，靶标病毒先进行逆转录，再进行恒温扩增。可选地，所述逆转录的时间为10～20min，恒温扩增的时间为30～50min。

本发明第四方面提供的所述检测新型冠状病毒的方法，是基于双重环介导恒温扩增技术，采用两组扩增引物和两种荧光探针，如果待测样本中存在靶标基因，就能进行扩增反应得到相应的扩增产物，呈现出对应的荧光探针的特征荧光信号。所述检测方法操作简单，降低了对操作人员的专业要求，可在样本的单次测试中针对新型冠状病毒的两种靶标基因进行同步扩增检测，提高检测效率和准确度，还可克服同一反应体系中多组引物同时存在带来的引物与靶标之间非特异性结合的问题，使得临床科室检测经济高效化。此外，该方法的检测周期短，并具有特异性强、灵敏度高、准确性高、便于批量检测等特点。

本发明具有以下有益效果：

(1)本发明的检测新型冠状病毒的探针，能高特异性地识别新型冠状病毒的不同LAMP扩增产物，并报告两种不同的荧光信号；

(2)本发明的检测新型冠状病毒的引物可以特异性识别新型冠状病毒的两种不同靶标基因，并在环介导恒温扩增反应中快速、特异性地扩增，克服了同一反应体系中多组引物同时存在带来的引物与靶标之间非特异性结合的问题；

(3)本发明提供的检测新型冠状病毒的试剂盒，能够对样本进行新型冠状病毒的不同靶标检测，具有灵敏度高、特异性强、重复性好、速度快等优点；

(4)本发明提供的检测新型冠状病毒的方法，操作简单便捷，无需复杂昂贵的仪器设备，对操作人员的专业要求低，可在样本的单次测试中针对新型冠状病毒的两种靶标基因进行同步扩增检测，填补了这一领域的空白。

附图说明

图1为本发明一实施例提供的双重LAMP技术检测4个咽喉拭子样本中有无新型冠状病毒的实时荧光曲线。

具体实施方式

以下所述是本发明的示例性实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

若无特别说明，以下描述所涉及到的化学试剂均为市售试剂。

荧光探针设计

本发明一实施例针对新型冠状病毒分别设计了一套特异性的探针，包括针对新型冠状病毒的ORF1ab基因进行检测的第一探针P(Ⅰ)和针对新型冠状病毒的N因进行检测的第二探针P(Ⅱ)，探针如下：

P(Ⅰ)：5’-ROX-SEQ ID NO：1-BHQ2-3’，具体为：

5’-ROX-TAGTTGTGATGCAATCATGACTAG-BHQ2-3’；

P(Ⅱ)：5’-TET-SEQ ID NO：2-BHQ1-3’，具体为：

P(Ⅱ)：5’-TET-AAGGTTTACCCAATAATACTGCGT-BHQ1-3’。

引物设计

本发明针对新型冠状病毒的ORF1ab基因和N基因进行同源性分析，识别出高度保守区域并据此设计得到用于新型冠状病毒的双重LAMP检测的引物。

具体地，本发明所用的引物如下表1所示。

表1.本发明中检测新型冠状病毒所用的引物

试剂盒的制备：

配置液态试剂混合物，其中，该液态试剂混合物含有上述荧光探针、上述表1所示的引物、缓冲液(如pH为8.8的Tris-HCl缓冲液)、链置换DNA聚合酶(如Bst聚合酶2.0)、逆转录酶、4种脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)。其中，典型的的液态试剂混合物中各组分的含量如下：20mM的Tris-HCl、0.8mM 的MgSO₄、0.5mM的dNTP each、0.2μM的第一探针、0.2μM的第二探针、0.30U/μL的链置换DNA聚合酶、0.30U/μL的逆转录酶；内引物FIP-Ⅰ、BIP-Ⅰ、FIP-Ⅱ、BIP-Ⅱ的含量均为0.8μM，环引物LF-Ⅰ、LB-Ⅰ、LF-Ⅱ和LB-Ⅱ的含量均为0.4μM，外引物F3-Ⅰ、B3-Ⅰ、F3-Ⅱ和B3-Ⅱ的含量均为0.1μM。

2、液态试剂混合物的冻干：将上述液态试剂混合物分装至旋盖管或特制的反应管，然后置于超低温冻干机中；先将温度降至-40℃以下，启动真空泵将气压抽至1Torr或更低，然后逐步升温至某个温度点，恒温升华抽除水分；直到在管底形成小块状干粉；缓慢放入气体，得到冻干后的干粉试剂管，取出后立即密封，并于2～8℃冷藏。冻干粉形式的试剂混合物即为该试剂盒的核心成分。

待测样本的基因提取

对于临床拭子样本，其基因提取过程如下：先用棉拭子在病人咽喉部位或鼻孔部位取样，得到咽喉拭子或鼻拭子；然后将上述拭子浸入样本洗脱缓冲液 (如Tris-HCl)中，上下搅动10次进行洗脱；将一定体积的所得洗脱物加入到稀释缓冲液(如Tris-HCl)中，然后于105℃下进行加热处理，加热后的溶液含有待测样本的基因，可将其作为后续LAMP扩增的模板备用。

LAMP检测

将上述提取得到的待测样本基因作为LAMP的模板，将其溶液直接加入检测试管中，与上述冻干粉形式的试剂混合物进行混合均匀，形成体积为25μL的扩增反应体系，并置于恒温核酸扩增分析仪(例如实时荧光检测仪)的反应槽，在经历10-20min的逆转录后，在恒定温度63～67℃下进行扩增，并在扩增过程中选择双荧光通道监控第一探针和第二探针对应的两种荧光信号的变化，记录实时荧光曲线。在扩增反应结束后，根据事先确定的各荧光强度信号的变化率和荧光强度信号阈值对两个检测项目分别进行阴阳性结果判读，并实时显示在屏幕界面上。

其中，25μL的扩增反应体系中各组分的含量如下：20mM的Tris-HCl (pH＝8.8)、0.8mM的MgSO₄、0.5mM的dNTP each、0.20μM的第一探针、 0.20μM的第二探针、0.30U/μL的链置换DNA聚合酶、0.30U/μL的逆转录酶；内引物FIP-Ⅰ、BIP-Ⅰ、FIP-Ⅱ、BIP-Ⅱ的含量均为0.8μM，环引物LF-Ⅰ、LB-Ⅰ、 LF-Ⅱ和LB-Ⅱ的含量均为0.4μM，外引物F3-Ⅰ、B3-Ⅰ、F3-Ⅱ和B3-Ⅱ的含量均为0.1μM。

图1为本发明一实施例中临床4个咽喉拭子样本中双重LAMP检测新型冠状病毒的实时荧光曲线。其中，第一探针对应的第一荧光信号的监控发射波长在607nm，所设置的第一荧光强度的阈值为10000U，第一荧光强度的增长速度阈值为10％；第二探针对应的第二荧光信号的监控发射波长在538nm，所设置的第二荧光强度的阈值为10000U，第二荧光强度的增长速度阈值为10％。为便于观察，通过软件显示处理，将第二荧光信号的升高转化为反向降低，使得两种荧光信号曲线的显示更加清晰可辨。

从图1中可以看出，样本1和样本2的检测结果均为ORF1ab阳性、N阳性，其对应的第一荧光信号曲线为实线向上升高(指示ORF1ab靶标产生扩增)、第二荧光信号为虚线向下降低(指示N靶标产生扩增)，指示样本1和样本2中有新型冠状病毒2019-nCoV存在；而样本3和样本4的检测结果均为ORF1ab 阴性、N阴性，其对应的第一荧光信号曲线为实线停留在本底水平不变(指示 ORF1ab靶标未产生扩增)、第二荧光信号虚线也保持在本底不变(指示N靶标未产生扩增)，指示样本3和样本4中无新型冠状病毒2019-nCoV存在。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 深圳麦科田生物医疗技术有限公司

<120> 基于双重环介导恒温扩增技术检测新型冠状病毒的探针、引物、试剂盒及检测方法

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tagttgtgat gcaatcatga ctag 24

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaggtttacc caataatact gcgt 24

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcatcacaac tagctacatg tgctacaaag caaccatgat ctg 43

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtctagctgt ccacgagtgc aatcttcagt tcatcaccaa tt 42

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tggggtttta caggtaacc 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cctttctaca agccgcatt 19

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcatcacaac tagctacatg tgc 23

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gtctagctgt ccacgagtgc 20

<210> 9

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agcggtgaac caagacgcag ggcgcgatca aaacaacg 38

<210> 10

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aattccctcg aggacaaggc gagctcttcg gtagtagcca a 41

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccagaatgga gaacgcagtg 20

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ccgtcaccac cacgaatt 18

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agcggtgaac caagacgcag 20

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aattccctcg aggacaaggc g 21

Claims

1.一种基于双重环介导恒温扩增技术检测新型冠状病毒的探针，其特征在于，所述探针包括第一探针和第二探针，其中，所述第一探针包括如SEQ ID NO：1所示的第一核苷酸片段，所述第二探针包括如SEQ ID NO：2所示的第二核苷酸片段，所述第一核苷酸片段和所述第二核苷酸片段的两端独立地标记有荧光报告基团和荧光淬灭基团；其中，所述第一探针用于与新型冠状病毒的ORF1ab基因的环介导恒温扩增产物特异性结合而报告第一荧光信号，所述第二探针用于与新型冠状病毒的N基因的环介导恒温扩增产物特异性结合而报告第二荧光信号，其中，所述第一荧光信号与所述第二荧光信号不同。

2.一种基于双重环介导恒温扩增技术检测新型冠状病毒的引物，其特征在于，所述引物包括第一引物组和第二引物组，其中：

所述第一引物组包括第一内引物对、第一外引物对和第一环引物对，其中，所述第一内引物对包括SEQ ID NO：3所示的内引物FIP-Ⅰ和SEQ ID NO：4所示的内引物BIP-Ⅰ，所述第一外引物对包括SEQ ID NO：5所示的外引物F3-Ⅰ和SEQ ID NO：6所示的外引物B3-Ⅰ，所述第一环引物对包括SEQ ID NO：7所示的环引物LF-Ⅰ和SEQ ID NO：8所示的环引物LB-Ⅰ；

所述第二引物组包括第二内引物对、第二外引物对和第二环引物对，其中，所述第二内引物对包括SEQ ID NO：9所示的内引物FIP-Ⅱ和SEQ ID NO：10所示的内引物BIP-Ⅱ，所述第二外引物对包括SEQ ID NO：11所示的外引物F3-Ⅱ和SEQ ID NO：12所示的外引物B3-Ⅱ，所述第二环引物对包括SEQ ID NO：13所示的环引物LF-Ⅱ和SEQ ID NO：14所示的环引物LB-Ⅱ。

3.如权利要求2所述的引物，其特征在于，所述第一内引物对、所述第一外引物对、所述第一环引物对的摩尔比为(1～8)：1：(1～4)；所述第二内引物对、所述第二外引物对、所述第二环引物对的摩尔比为(1～8)：1：(1～4)。

4.一种基于双重环介导恒温扩增技术检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的探针和/或如权利要求2-3任一项所述的引物。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括缓冲剂、逆转录酶、链置换DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸和镁盐。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒内的各成分预先混合形成冻干制剂。

7.一种基于双重环介导恒温扩增技术检测新型冠状病毒的方法，其特征在于，包括：

提取待测样本的基因，配置扩增反应体系，以待测样本的基因为模板，进行环介导恒温扩增；其中，所述扩增反应体系包括如权利要求1所述的探针和/或如权利要求2-3任一项所述的引物；

对所得扩增产物进行实时荧光检测。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述扩增反应体系还包括缓冲剂、链置换DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸和镁盐。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述扩增反应体系中，所述第一探针和第二探针的浓度均在0.01～100μM的范围；所述链置换DNA聚合酶的浓度为0.01～10U/μL；所述逆转录酶的浓度为0.01～10U/μL；

所述内引物FIP-Ⅰ、BIP-Ⅰ、FIP-Ⅱ、BIP-Ⅱ的浓度分别在0.008～800μM的范围；所述外引物F3-Ⅰ、B3-Ⅰ、F3-Ⅱ和B3-Ⅱ的浓度分别在0.001～100μM的范围；所述环引物LF-Ⅰ、LB-Ⅰ、LF-Ⅱ和LB-Ⅱ的浓度在0.004～400μM的范围。

10.如权利要求7所述的方法，其特征在于，进行所述环介导恒温扩增时的恒温温度为60～72℃，恒温扩增的时间为30～70min。