TWI679281B - 用於檢測一樣品中活的結核桿菌之方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供一種用於檢測一樣品中活的結核桿菌之方法。本發明的方法可快速檢測結核桿菌並鑑定出活的結核桿菌、大幅降低所需要的試劑與生物樣品，並且簡化實驗流程及時間。

Description

用於檢測一樣品中活的結核桿菌之方法
本發明是有關於一種用於檢測一樣品中活的結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)之方法。
肺結核(Tuberculosis，TB)是兒童與成年人的主要感染殺手之一，且為世界上最常見的傳染性疾病。目前世界上有三分之一的人口感染肺結核，其中兩千萬人為已登錄的病例；據估計肺結核在未來十年內將使三千萬人致死。另目前可能已有超過五千萬人感染多重抗藥性(multidrug-resistant，MDR)的肺結核菌。抗藥性的出現是來自公衛系統的管理失衡以及缺乏適當管理肺結核的治療所致。在多重抗藥性的肺結核菌出現之前，多重藥物治療肺結核的治癒率相當高。如今多重抗藥性的肺結核菌不但具高度傳染性，亦無法完全治癒。
肺結核是由結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)所傳染，它是由空氣懸浮微粒散播並會造成不可逆的肺部損害。若病菌自肺部釋出將可能造成全身性的疾病，影響器官包括：骨、關節、肺、脾、腸胃道及腦部等。凡接觸結核桿菌患者，50%會受感染，而15%受感染者會發病。貧窮、營養不良以及人口過剩，皆會增加結核桿菌的擴散與蔓延。因此，如何發展出檢測結核桿菌的方法及系統，為本領域的研究人員共同的迫切需求。
傳統用來檢測結核桿菌的方式為細菌培養，然而，結核桿菌的生長速度相當緩慢，需要花費6到8週以上的時間，使得快速檢測更為不易，而利用傳統的檢測方式需耗費長時間才能得到結果。此外，雖已發展出利用染色等快篩方式來檢測結核桿菌，但此方式的靈敏度低，若疑似肺結核患者篩出陰性塗片，仍須等待細菌培養及分子鑑定結果。再者，該檢測方式無法區分出活 及死的結核桿菌，不適用於用藥後的快速癒後評估。因此，若能開發出快速檢測結核桿菌的方法，且該方法可用於區分出活的結核桿菌，將對本領域的技術帶來相當大的突破。
有鑑於此，本發明之目的為提供一種用於檢測一樣品中活的結核桿菌之方法，包含下列步驟：(a)對複數磁珠的表面包覆複數結核桿菌-專一性探針(Mycobacterium tuberculosis-specific probes)，形成複數磁珠-探針複合體；(b)將磁珠-探針複合體、包含活的結核桿菌及死的結核桿菌之樣品及一核酸染劑混合，以使磁珠-探針複合體及核酸染劑與樣品中活的結核桿菌及死的結核桿菌結合；(c)以一藍光激發核酸染劑；(d)以一磁場對結合有樣品中活的結核桿菌及死的結核桿菌之磁珠-探針複合體進行磁吸，以去除雜質；(e)將磁場置換成一溫度控制模組，接而對樣品進行DNA擴增反應，得到一反應產物；以及(f)將反應產物與一螢光標記結合，接而偵測反應產物的螢光訊號，其中死的結核桿菌之DNA不會被擴增，藉此檢測出樣品中活的結核桿菌。
在本發明的一實施例中，樣品是由一肺結核的患者所分離出。
在本發明的一實施例中，螢光訊號顯示肺結核的患者被投予一用於治療肺結核的藥物之後，當樣品中活的結核桿菌相對於死的結核桿菌之比例，是低於投藥前樣品中活的結核桿菌相對於死的結核桿菌之比例，代表藥物對於滅菌有正向作用。
在本發明的一實施例中，核酸染劑是溴化丙錠(propidium monoazide,PMA)。
在本發明的一實施例中，在步驟(d)中，進行磁吸的同時，以一清洗緩衝液清洗樣品。
在本發明的一實施例中，DNA擴增反應是聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)或即時定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)。
在本發明的一實施例中，DNA擴增反應包括1至30個循環。
在本發明的一實施例中，方法的操作時間介於0.5小時至3.5小時。
在本發明的一實施例中，方法是於一微流體晶片(microfluidic chip)上進行。
在本發明的一實施例中，被檢測出樣品中活的結核桿菌之菌數介於10CFU至106CFU。
在本發明的一實施例中，結核桿菌-專一性探針結合至樣品中活的結核桿菌及死的結核桿菌的外膜(envelope)。
在本發明的一實施例中，各結核桿菌-專一性探針結合至一位於外膜處的肝素結合血球凝集素(heparin-binding hemagglutinin,HBHA)。
綜上所述，本發明用於檢測樣品中活的結核桿菌之方法的功效在於：可快速檢測結核桿菌並鑑定出活的結核桿菌、大幅降低所需要的試劑與生物樣品，本發明方法的操作時間介於0.5小時至3.5小時，大幅簡化實驗流程及時間；此外，本發明的方法對於結核桿菌用藥癒後評估，能更正確判定用藥種類的時間，使時間成本大幅減少，且精準減少藥物試驗，能降低病人對藥物副作用不適；再者，本發明結合活死菌分辨技術，且在一整合型平台中完成各種試劑分離、純化、混合、移動、反應，及訊號收集，較現有方法更為快速準確。
本發明之整合型分子診斷平台將樣品前處理、TB分離、純化、量化檢驗分析等整合到分子診斷平台，即一個晶片及一個平台系統的整合，可以替代一個大型實驗室及豐富經驗的操作員，尤其在處理TB這種極具危險性細菌的價值顯得更高，不需為防止交叉感染及擴散設立價值高昂的設備，並可取代嚴格訓練的操作人員之昂貴成本。
以下將進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
1‧‧‧微流體晶片
2‧‧‧光電倍增管
3‧‧‧雷射源
4‧‧‧溫度控制模組
5‧‧‧電磁閥
圖1顯示本發明之一實施例檢測樣品中活的結核桿菌之方法的操作流程。
圖2及圖3顯示微流體系統的外觀照片。
圖4顯示進行即時定量聚合酶鏈反應時不同循環數的光電倍增管(PMT)訊號。
圖5是一PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖，其顯示依據本發明的方法進行即時定量聚合酶鏈反應的檢測靈敏度，其中M表示標記(marker)；P表示正對照組；N表示負對照組。
圖6顯示使用50μM PMA進行本發明的方法可區分出活的結核桿菌，其中M表示標記；P表示正對照組；N表示負對照組。
圖7顯示進行即時定量聚合酶鏈反應時不同循環數的PMT訊號。
圖8顯示進行即時定量聚合酶鏈反應時不同循環數的PMT訊號。
定義
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。
如本文中所使用的，用語「結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)」意指一種屬於分枝桿菌屬(Mycobacterium)的專性需氧微生物，其可與用語「結核分枝桿菌」交換使用。
如本文中所使用的，用語「DNA」意指呈單股或雙股形式的去氧核糖核苷酸序列，此用語可與「基因」、「去氧核糖核酸」及「核酸分子」交換使用。
實施例1. 本發明用於檢測樣品中活的結核桿菌之方法的操作流程
本實施例所使用的結核桿菌樣品為結核桿菌H37Ra(得自於國家衛生研究院感染症與疫苗研究所，台灣，為ATCC 25177)是一種無毒菌株(non-virulent strain)，並具有介於結核桿菌有毒及無毒形式之間的相同表現型。
本發明用於檢測樣品中活的結核桿菌之方法可應用於整合型分子診斷平台進行自動化操作，該方法的步驟大致包括結核桿菌的純化、雜質清洗、聚合酶鏈反應、活死菌區別、及反應結果量化判讀。本發明之方法的實驗流程顯示於圖1。
由圖1可見，首先，將磁珠、包含活的結核桿菌及死的結核桿菌之樣品及溴化丙錠(propidium monoazide,PMA)混合並置於樣品槽中，接著以發出藍光的發光二極體(light emitting diode,LED)(HV5-B 1.4A/5V,CHT PRECISION CO.,LTD,Taiwan)激發PMA進入死的結核桿菌中進行DNA嵌合，同時磁珠的表面包覆有結核桿菌-專一性探針，其為特殊修飾之硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)的多醣結構，因此可以專一性抓取結核桿菌(參見步驟(a)及(b))。之後，加入磁場使已抓取結核桿菌之磁珠固定在底部，並以清洗緩衝液清洗樣品(參見步驟(c)及(d))。接著，將磁場置換成溫度控制模組(亦即聚合酶鏈反應儀)，並加入聚合酶鏈反應試劑，進行即時定量聚合酶鏈反應(參見步驟(e)及(f))，其中在進行即時定量聚合酶鏈反應之前，從樣品中萃取出總基因組DNA以作為模版。最後，以整合型分子診斷平台之螢光偵測儀偵測螢光訊號，量化成螢光定量數據並顯示於電腦上(參見步驟(g))。藉由本發明的方法，死的結核桿菌由PMA作用下，無法進行即時定量聚合酶鏈反應，故沒有螢光訊號。此方法可以快速並準確地量化用藥後結核桿菌之數量，並有效進行用藥及癒後評估。
實施例2. 於包含微流體晶片的微流體系統進行本發明用於檢測樣品中活的結核桿菌之方法
本發明用於檢測樣品中活的結核桿菌之方法可應用於整合型分子診斷平台進行自動化操作，該整合型分子診斷平台為一包含微流體晶片(microfluidic chip)1的微流體系統(microfluidic system)。
圖2及圖3顯示微流體系統的外觀照片。微流體系統的大小為56cm×38cm×45cm，由圖2及圖3可見，微流體系統與一台筆記型電腦通訊連結以控制及顯示檢測結果，且微流體系統配備有微流體晶片1、光電倍增管(photomultiplier tube,PMT)2、雷射源(laser source)3、溫度控制模組4及電磁閥 (electromagnetic valve,EMV)5。因此，執行本發明用於檢測樣品中活的結核桿菌之方法時，是於整合型分子診斷平台自動化地操作。
此外，申請人以1.77×105CFU/聚合酶鏈反應的結核桿菌樣品來進行本發明方法中的即時定量聚合酶鏈反應，所得到的Ct值為17.74。申請人並觀察不同循環數的PMT訊號，結果顯示於圖4。
圖4顯示進行即時定量聚合酶鏈反應時不同循環數的PMT訊號。由圖4可見，在第18個循環數時PMT訊號有顯著改變。這個實驗結果顯示，本發明用於檢測樣品中活的結核桿菌之方法確實可於微流體系統執行。
實施例3. 依據本發明之方法的檢測靈敏度
在本實施例中，申請人依據結核桿菌散置重複單位(mycobacterial interspersed repetitive units,MIRU)設計出專一性標靶結核桿菌基因組的引子組：前向引子的引子名稱為ETR-AF，其具有一如序列編號：1(SEQ ID NO：1)的核苷酸序列；反向引子的引子名稱為ETR-AR，其具有一如序列編號：2(SEQ ID NO：2)的核苷酸序列，並將其用來執行本發明用於檢測樣品中活的結核桿菌之方法中的DNA擴增反應(即時定量聚合酶鏈反應)。本實施例的結果顯示於表1及圖5。
表1顯示依據本發明的方法進行即時定量聚合酶鏈反應的檢測靈敏度。圖5是一PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳圖，其顯示依據本發明的方法進行即時定量聚合酶鏈反應的檢測靈敏度。由表1及圖5可見，將具有不同濃度結核桿菌(從1.44CFU至1.44×106CFU)的樣品拿來進行本發明方法中的即時定量聚合酶鏈反應，偵測極限(limit of detection,LOD)可至10~14CFU/聚合酶鏈反應。本實施例的結果顯示，本發明用於檢測樣品中活的結核桿菌之方法具有高靈敏度。
實施例4. 本發明之方法可有效區分出活的結桿菌
傳統以聚合酶鏈反應檢測結核桿菌並無法區分出活的與死的結核桿菌。申請人依據實施例1的流程來進行結核桿菌的檢測，並在執行方法的過程中發現使用50μM PMA並以發出藍光的發光二極體進行活化15分鐘，可有效區分出活的結核桿菌。此結果顯示於表2及圖6。
表2及圖6顯示使用50μM PMA進行本發明的方法可區分出活的結核桿菌。由表2可見，當使用50μM PMA來處理死的結核桿菌H37Ra時，檢測出的Ct值是接近於負對照組。由圖6可見，當使用50μM PMA來處理死的結核桿菌H37Ra時，瓊脂糖凝膠電泳圖無法顯示PCR產物的訊號。
此外，申請人以1.27×105CFU活的結核桿菌樣品及1.27×105CFU死的結核桿菌樣品來進行本發明方法中的即時定量聚合酶鏈反應，並觀察不同循環數的PMT訊號，結果顯示於圖7。
圖7顯示進行即時定量聚合酶鏈反應時不同循環數的PMT訊號。由圖7可見，相同數量的活菌及死菌樣品經由PMA處理後，活菌樣品在第16循環及產生訊號，而死菌樣品在第29循環才產生訊號。
申請人接著以1.27×105CFU活的結核桿菌樣品、1.27×103CFU活的結核桿菌樣品，及包含105CFU死的結核桿菌及103CFU活的結核桿菌之混合物來進行本發明方法中的即時定量聚合酶鏈反應，並觀察不同循環數的PMT訊號，結果顯示於圖8。
圖8顯示進行即時定量聚合酶鏈反應時不同循環數的PMT訊號。由圖8可見，包含活菌及死菌的混合物之PMT訊號與活菌樣品的PMT訊號相近。
本實施例的結果顯示，本發明的方法僅會檢測出活的結核桿菌而無法檢測出死的結核桿菌，因此可有效區分出活與死的結核桿菌。
綜上所述，本發明用於檢測樣品中活的結核桿菌之方法確實可快速檢測結核桿菌並鑑定出活的結核桿菌、具有高靈敏度、大幅降低所需要的試劑與生物樣品，可簡化實驗流程及時間，本發明操作時間介於0.5小時至3.5小時；此外，本發明的方法對於結核桿菌用藥癒後評估，能更正確判定用藥種類的時間，使時間成本大幅減少，且精準減少藥物試驗，能降低病人對藥物副作用不適；再者，本發明結合活死菌分辨技術，且在一整合型平台中完成各種試劑分離、純化、混合、移動、反應，及訊號收集，較現有方法更為快速準確。
以上所述僅為舉例性，而非為限制性者。任何未脫離本發明之精神與範疇，而對其進行之等效修改或變更，均應包含於後附之申請專利範圍中。
<110> 國立清華大學
<120> 用於檢測一樣品中活的結核桿菌之方法
<130> 107B0190-I1
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用於PCR的前向引子
<400> 1
Figure TWI679281B_D0003
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用於PCR的反向引子
<400> 2
Figure TWI679281B_D0004

Claims (12)

  1. 一種用於檢測一樣品中活的結核桿菌(Mycobacterium tuberculosis)之方法，包含下列步驟：(a)對複數磁珠的表面包覆複數結核桿菌-專一性探針，形成複數磁珠-探針複合體；(b)將該些磁珠-探針複合體、包含活的結核桿菌及死的結核桿菌之該樣品及一核酸染劑混合，以使該些磁珠-探針複合體及該核酸染劑與該樣品中活的結核桿菌及死的結核桿菌結合；(c)以一藍光激發該核酸染劑；(d)以一磁場對結合有該樣品中活的結核桿菌及死的結核桿菌之該些磁珠-探針複合體進行磁吸，以去除雜質；(e)將該磁場置換成一溫度控制模組，接而對該樣品進行DNA擴增反應，得到一反應產物；以及(f)將該反應產物與一螢光標記結合，偵測該反應產物的螢光訊號，其中死的結核桿菌之DNA不會被擴增，藉此檢測出該樣品中活的結核桿菌。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該樣品是由一肺結核的患者所分離出。
  3. 如申請專利範圍第2項所述的方法，其中該螢光訊號顯示該肺結核的患者被投予一用於治療肺結核的藥物之後，當該樣品中活的結核桿菌相對於死的結核桿菌之比例，低於投藥前該樣品中活的結核桿菌相對於死的結核桿菌之比例，代表該藥物對於滅菌有正向作用。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該核酸染劑是溴化丙錠(propidium monoazide,PMA)。
  5. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中在步驟(d)中，進行磁吸的同時，以一清洗緩衝液清洗該樣品。
  6. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該DNA擴增反應是一聚合酶鏈反應或一即時定量聚合酶鏈反應。
  7. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該DNA擴增反應包括1至30個循環。
  8. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該方法的操作時間介於0.5小時至3.5小時。
  9. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該方法是於一微流體晶片上進行。
  10. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中被檢測出該樣品中活的結核桿菌之菌數介於10CFU至106CFU。
  11. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該些結核桿菌-專一性探針結合至該樣品中活的結核桿菌及死的結核桿菌的外膜。
  12. 如申請專利範圍第11項所述的方法，其中各該些結核桿菌-專一性探針結合至一位於該外膜處的肝素結合血球凝集素。
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