CN113249516B - 一种2019-nCoV的引物组和2019-nCoV核酸检测试剂盒 - Google Patents

一种2019-nCoV的引物组和2019-nCoV核酸检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及病毒核酸检测方法技术领域，具体为一种2019‑nCoV的引物组，以及一种2019‑nCoV的核酸检测试剂盒。2019‑nCoV的引物组包括两对外引物、一对内引物和一环引物。本发明根据2019‑nCoV与SARS等序列比对的差异序列设计的等温扩增引物组，利用等温技术扩增靶基因的特定区域，通过可视颜色的变化或者荧光从分子水平上实现2019‑nCoV的快速核酸检测，为2019‑nCov检测提供了有效且快速的检测方法，具有广阔的前景和较大的社会效益。

Description

一种2019-nCoV的引物组和2019-nCoV核酸检测试剂盒
技术领域
本发明涉及病毒核酸检测方法技术领域，尤其涉及一种2019-nCoV的引物组，以及一种2019-nCoV的核酸检测试剂盒。
背景技术
新型冠状病毒(2019-nCoV)感染的肺炎是一种急性感染性肺炎，其病原体是一种先前未在人类中发现的新型病毒，目前感染源仍旧不明确，核酸序列的发布，使快速检测成为可能。2019-nCov所引起的肺炎疾病已成为全球性的公共卫生问题，严重危害人类安全和健康。而对于2019-nCov的感染的快速检验，是筛选临床感染治疗的关键。
目前多采用的RT-PCR技术可以快速、灵敏地检测到2019-nCov，但因技术对模板的数量和质量都有较高的要求，需要热循环及凝胶电泳等设备，价格相对昂贵，很难做到现场快速测定。LAMP是一种新型核酸扩增技术，在30～60分钟内DNA扩增可达109～1010倍。
环介导等温扩增LAMP技术是一种新型等温核酸扩增方法，采用4或6条能够识别目的基因上的6个特异区域的引物，依赖于Bst DNA聚合酶的强链置换活性，在恒温条件60-65℃下快速扩增核酸，保证扩增的高特异性和高效率。扩增结果可直接对扩增副产物焦磷酸镁沉淀通过肉眼进行判断或者对其浊度进行检测，也可通过染料染色，通过肉眼进行判定或者通过染料对LAMP扩增进行实时监测和判读。LAMP方法具有操作简单、检测快速、灵敏度和特异性高且成本低廉等优点，已在核酸研究、疾病诊断、病原检测等领域得到了广泛的应用。
发明内容
本发明针对亟需快速有效检测新型冠状病毒(2019-nCoV)的问题，提供一种可视化2019-nCov环介导等温扩增检测试剂盒。根据目前发布的新型冠状病毒的序列，(Wuhanseafood market pneumonia virus isolate Wuhan-Hu-1,complete genomeGenBank:MN908947.3)全长为29903bp，通过对其基因序列blast之后筛选出特异性序列序列设计环介导等温扩增引物，应用Primer Explorer软件设计特异性引物组，利用RT-Lamp技术扩增靶基因的特定区域，从分子水平上实现快速检测，为2019-nCov检测提供了有效且快速的检测方法，具有广阔的前景和较大的社会效益。
本发明的第一目的在于提供一种可视化2019-nCov的RT-LAMP检测引物组合物，其利用可视化2019-nCov的特定区域，进行LAMP，能够快速、简便且精准地实现可视化2019-nCov的扩增。
本发明的第二目的在于提供一种2019-nCov的LAMP检测试剂盒，其利用上述LAMP检测引物组合物进行LAMP，利用荧光可以精准的实现2019-nCov的核酸检测。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
一种2019-nCoV的引物组，包括一对外引物F3-1和B3-1、一对内引物FIP-1和BIP-1、以及一对环引物LF-1、LB-1；
所述F3-1、B3-1、FIP-1、BIP-1、LF-1、LB-1的核苷酸序列SEQ ID No如下：
F3-1：5’CTAGGTTTCAAACTTTACTTGC3’；
B3-1：5’CCTTTTTCTACAGTGAAGGATT3’；
FIP-1：
5’ACCCACATAATAAGCTGCAGCA-GTTATTTGACTCCTGGTGATT3’；
BIP-1：
5’ATGAAAATGGAACCATTACAGATGC-CAACGTACACTTTGTTTCTGA3’；
LF-1：5’CCAGCTGTCCAACCTGAAGA3’；
LB-1：5’ACTGTGCACTTGACCCTCTC3’。
一种2019-nCov检测试剂盒，包括反应预混液、显色剂、检测管。
所述反应预混液包括Bst DNA聚合酶、AMV逆转录酶、10X反应缓冲液、引物组、密封液。
更进一步地，所述反应预混液包括Bst DNA聚合酶、AMV逆转录酶、10X反应缓冲液、引物组、dNTPs、硫酸镁、甜菜碱和DEPC水。
所述引物组包括以上所述的外引物F3-1和B3-1、内引物FIP-1和BIP-1、环引物LF-1、LB-1。
所述的显色剂为HNB或SYBR green 1。
优选的，所述显色剂为3mM的HNB溶液。
以上所述的2019-nCov检测试剂盒，主要包括以下物质：1)Bst DNA大片段聚合酶；2)AMV逆转录酶；3)10X反应缓冲液；4)显色剂；5)密封液；6)标准阳性模板；7)阴性对照；8)以上所述的引物组(一对外引物F3-1和B3-1、一对内引物FIP-1和BIP-1、以及一对环引物LF-1、LB-1)。
进一步地，所述引物组的浓度比例如下：外引物、内引物、环引物的摩尔比为1:4:2。
进一步地，所述标准阳性模板为2019-nCov基因组片段；所述阴性对照为灭菌超纯水。
本发明试剂盒检测管的侧视图如图1所示，显示分装的反应预混液。
以上所述以HNB为显色剂的2019-nCov检测试剂盒的使用方法，包括环介导等温扩增和显色结果判定：
(1)检样品基因组片段：从检样品提取的基因组或体外转录获得靶基因的RNA模板。
进一步地，根据目前发布的新型冠状病毒的序列(Wuhan seafood marketpneumonia virus isolate Wuhan-Hu-1,complete genome GenBank:MN908947.3)全长为29903bp，通过对其基因序列blast之后筛选出特异性序列部分(位点：21670-22515)，人工合成靶基因；体外转录获得靶基因的RNA模板。
(2)反应体系及条件：反应管中的反应体系含有：10X buffer反应液，Bst DNA大片段聚合酶，AMV逆转录酶，引物组，显色剂，检样品基因组片段，余量为超纯水；同时设置阳性对照和阴性对照，反应管内的溶液混匀后离心，50-70℃反应30-60min，并在80℃中断反应。
进一步地，所述反应体系及条件(LAMP扩增)：采用25μL反应体系：内引物1.6μM，外引物0.4μM，环引物0.8μM，dNTP 1.6mM，甜菜碱0.8M，硫酸镁2mM，BstDNA聚合酶6U，AMV逆转录酶8U，模板RNA 5μL，10X Buffer 2.5μL，HNB染料1μL，无菌双蒸水补齐至25μL，63℃反应50min。
(3)检测结果判断：
根据反应管内反应体系的颜色判断检测结果，检测结果呈蓝色则检测结果判定为阳性，即检测样品中含有2019-nCov；检测结果呈紫色则检测结果判定为阴性，即检测样品中不含2019-nCov。
本发明试剂盒应用检测结果的示意图如图2所示，在白纸背景下观察反应液颜色，蓝色(左1和左2)说明样品中含有2019n-Cov，紫色(右1和右2)说明样品中没有2019n-Cov。
以上所述以SYBR green 1为显色剂的2019-nCov检测试剂盒的使用方法，包括环介导等温扩增和显色结果判定：
(1)检样品基因组片段：从检样品提取的基因组或体外转录获得靶基因的RNA模板。
进一步地，根据目前发布的新型冠状病毒的序列(Wuhan seafood marketpneumonia virus isolate Wuhan-Hu-1,complete genome GenBank:MN908947.3)全长为29903bp，通过对其基因序列blast之后筛选出特异性序列部分(位点：21670-22515)，人工合成靶基因；体外转录获得靶基因的RNA模板。
(2)反应体系及条件：反应管中的反应体系含有：10X buffer反应液，Bst DNA大片段聚合酶，AMV逆转录酶，引物组，显色剂，检样品基因组片段，余量为超纯水；同时设置阳性对照和阴性对照，反应管内的溶液混匀后离心，50-70℃反应30-60min，并在80℃中断反应。
进一步地，所述反应体系及条件(LAMP扩增)：采用25uL反应体系：内引物1.6μM，外引物0.4μM，环引物0.8μM，dNTP 1.6mM，甜菜碱0.8M，硫酸镁2mM，BstDNA聚合酶6U，AMV逆转录酶8U，模板RNA 5μL，10X Buffer 2.5μL，HNB染料1μL，无菌双蒸水补齐至25μL，63℃反应50min。
(3)检测结果判断：
将反应管置于激发波长为520nm的荧光灯下，显示荧光则检测结果判定为阳性，即检测样中含有2019-nCov；无荧光则检测结果判定为阴性，即检测样品不含有2019-nCov。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1)特异性好，能有效检测样本中是否存在特定基因片段，进而确定样本中是否存在2019n-Cov。
2)快速高效，能在1小时内完成检测。
3)不需要使用昂贵、精密的仪器设备，只需普通的金属浴或水浴锅，检测成本低。
4)鉴定方便简单，自然光下通过肉眼目测反应液颜色变化即可进行结果判断。
5)整个过程不涉及有毒试剂，保证了操作人员及环境的安全。
附图说明
图1为本发明试剂盒检测管的侧视图，显示分装的反应预混液；
图2为本发明试剂盒应用检测结果的示意图；
图3为实施例2中反应优化电泳图；
图4为实施例3中本发明试剂盒2019-nCov检测结果。
具体实施方式
为了更充分的理解本发明的技术内容，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步介绍和说明。
实施例1
一种可视化2019-nCov环介导等温扩增检测试剂盒
该试剂盒由反应预混液、HNB显色剂、检测管组成，其中的反应预混液包括BstDNA聚合酶、AMV逆转录酶、10X反应缓冲液、dNTP、硫酸镁、特异性引物组、甜菜碱和DEPC水。
所述特异性引物组包括包括一对外引物F3-1和B3-1、一对内引物FIP-1和BIP-1、以及一对环引物LF-1、LB-1，其核苷酸序列SEQ ID No如下：
F3-1：5’CTAGGTTTCAAACTTTACTTGC3’；
B3-1：5’CCTTTTTCTACAGTGAAGGATT3’；
FIP-1：
5’ACCCACATAATAAGCTGCAGCA-GTTATTTGACTCCTGGTGATT3’；
BIP-1：
5’ATGAAAATGGAACCATTACAGATGC-CAACGTACACTTTGTTTCTGA3’；
LF-1：5’CCAGCTGTCCAACCTGAAGA3’；
LB-1：5’ACTGTGCACTTGACCCTCTC3’。
实施例2
一种可视化2019-nCov环介导等温扩增检测试剂盒的优化
本发明的试剂盒的优化程序为筛选最适的特异性引物组，内外引物的最适浓度比，最适反应温度，硫酸镁浓度，甜菜碱浓度，dNTP浓度，反应时间，均通过取反应扩增产物，用1％的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，根据电泳图片显示特征性梯状条带的强弱来确定最佳条件。最后优化显色剂的用量。以下以最适反应温度的优化为例具体说明。
1)、模板RNA的制备
人工合成靶基因。体外转录获得靶基因的RNA模板，稀释至0.1μg/μL。
2)、LAMP扩增的反应体系
采用25μL反应体系：内引物1.6μM，外引物0.4μM，环引物0.8μM，dNTP 1.6mM，甜菜碱0.8M，硫酸镁2mM，BstDNA聚合酶6U，AMV逆转录酶，模板RNA 5μL，10X Buffer 2.5μL，HNB染料1μL，DEPC水补足余量，63℃反应50min。外设置阴性对照，用5μL DEPC水代替RNA模板
3)、RT-LAMP扩增的反应条件优化
反应管分别置于60-70℃温育50分钟。最后确定63℃为最佳反应条件。
4)、结果判定
取5μL扩增产物，用1％的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图如图3所示，电泳图片显示63℃时结果最好。
验证实验1：
1)、LAMP检测方法中，LAMP检测引物组的外引物、内引物以及环引物的最优摩尔比。
实验方法：LAMP反应的三对引物浓度比例会影响LAMP扩增反应的进行，我们在外引物：环引物：内引物＝1：(1～3)：(2～6)的比例范围内设计了优化实验。
在25μL的LAMP体系中，具体成分为10×Buffer 2.5μL，dNTPs(10mM)4μL(终浓度1.6mM)，甜菜碱(5M)4μL(终浓度0.8M)，MgSO4(50mM)3μL(终浓度6mM)，Bst DNA聚合酶1μL，AMV逆转录酶1μL，HNB染料(3mM)1μL(终浓度120μM)，RNA模板5μL，DEPC水补足体系。外设置阴性对照，用5μL DEPC水代替RNA模板。
引物比例共15组，其外引物：环引物：内引物比例分别为1:1:2、1:1:3、1:1:4、1:1:5、1:1:6、1:2:2、1:2:3、1:2:4、1:2:5、1:2:6、1:3:2、1:3:3、1:3:4、1:3:5、1:3:6。外引物浓度为0.4μM，环引物和内引物的浓度随比例相应变化。
2)实验结果
当引物比例为1:2:4、1:2:5和1:3:4、1:3:5时，能够产生LAMP扩增反应，其他引物比例均没有发生反应(表1)。
表1不同引物比例的LAMP反应结果
引物比例 1:1:2 1:1:3 1:1:4 1:1:5 1:1:6
LAMP结果 - - - - -
引物比例 1:2:2 1:2:3 1:2:4 1:2:5 1:2:6
LAMP结果 - - + + -
引物比例 1:3:2 1:3:3 1:3:4 1:3:5 1:3:6
LAMP结果 - - + + -
(“-”表示反应成阴性，“+”表示反应呈阳性)
验证实验2：
1)提供的2019-nCov的LAMP检测方法中，硫酸镁的最优浓度。
实验方法:MgSO4对于扩增反应的进行有重要作用，太高或太低的浓度可能都会影响扩增反应进行。在使用HNB羟基萘酚蓝显色指示的LAMP体系中，MgSO4溶液浓度越大，反应液的颜色将会越偏紫红色，浓度过低时，反应液在反应前即呈蓝色，失去反应指示作用。同时dNTPs的浓度也会影响反应液的颜色，dNTPs的浓度越高，反应液颜色越偏蓝，本LAMP体系保持dNTPs的浓度不变，对MgSO4的浓度进行了优化。此处讨论优化的MgSO4溶液浓度不包括10×Buffer中的MgSO4。
在2 5μL的LAMP体系中，具体成分为10×Buffer 2.5μL，dNTPs(10mM)4μL(终浓度1.6mM)，甜菜碱(5M)4μL(终浓度0.8M)，Pirmer mix 1μL，Bst DNA聚合酶1μL，AMV反转录酶1μL，HNB染料(3mM)1μL(终浓度120μM)，RNA模板5μL。MgSO4(50mM)终浓度分别为2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM(如表2)，最后加入DEPC水补足体系。另外设置阴性对照，用5μL DEPC水代替RNA模板，MgSO4浓度设为6mM。
表2 LAMP反应不同的硫酸镁浓度
Figure BDA0002381754010000101
观察并记录反应前后反应液的颜色变化。分析反应结果确定硫酸镁最佳浓度。
2)实验结果
在反应前，加入了HNB染料的反应液颜色因为硫酸镁的浓度变化而有所不同，随着硫酸镁浓度从2mM增加到8mM,颜色从蓝色逐渐偏向紫红色。
Figure BDA0002381754010000102
反应后，根据颜色变化，当硫酸镁浓度为2mM和3mM时，浓度过低而没有发生LAMP扩增反应。当硫酸镁浓度达到4mM之后，出现颜色反应，但硫酸镁浓度越高，HNB染料的变色效应则会变弱，因此综合LAMP反应和显色反应的灵敏程度，我们优选5mM～6mM的硫酸镁浓度，既能保证LAMP反应高效进行又有明显的颜色差距，利于使用肉眼直接判断LAMP反应的发生。
实施例3
一种可视化2019-nCoV核酸检测试剂盒的应用
结合本发明试剂盒检测的灵敏度和相关检测标准的要求，对待检样品的处理做了优化。
1)、待检拭子样品中RNA的提取：
无菌操作，使用800μL生理盐水，将拭子收集的样本置于生理盐水中，涮洗20s，贴壁挤干净拭子上的液体，12000rpm离心5min。弃上清，加入裂解液及消化液，提取RNA。并用3倍体积的无水乙醇、0.1体积的NaAC和1μL 15mg/mL的glycogen沉淀进行浓缩。
2)、扩增
无菌操作，取1μL上述制备的煮沸后稀释液上清至分装有反应预混液、HNB显色剂的检测管中。63℃反应40min。
3)、检测结果判定
将检测管在比色卡背景下观察反应液颜色，如图4所示(阳性对照：2019-nCov RNA片段；1为含有2019-nCov拭子样本(已确诊)；2为拭子上清液；阴性对照：DEPC水)，蓝色则说明样品中含有2019-nCov，紫色则说明样品中没有含2019-nCov。
实施例4
一种2019-nCoV核酸检测试剂盒(荧光测试)的应用
1)、采用实施例3的步骤，选取样本2仅更换HNB显色剂为SYBR green 1染料，63℃反应35min。
2)、检测结果判定
将检测管在荧光灯下(激发波长：520nm)观察反应液，有明显的荧光说明样品2中含2019-nCov，与HNB染料可视化结果一致。
实施例5
LAMP检测结果与RT-PCR检测比较
Figure BDA0002381754010000121
阳性样本的Lamp阳性检出率：100％
阴性样本的Lamp阳性检出率：100％
以上所述仅以实施例来进一步说明本发明的技术内容，以便于读者更容易理解，但不代表本发明的实施方式仅限于此，任何依本发明所做的技术延伸或再创造，均受本发明的保护。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种2019-nCoV的引物组和2019-nCoV核酸检测试剂盒
<141> 2020-02-10
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequece
<400> 1
ctaggtttca aactttactt gc 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequece
<400> 2
cctttttcta cagtgaagga tt 22
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequece
<400> 3
acccacataa taagctgcag cagttatttg actcctggtg att 43
<210> 4
<211> 46
<212> DNA
<213> Artificial Sequece
<400> 4
atgaaaatgg aaccattaca gatgccaacg tacactttgt ttctga 46
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequece
<400> 5
ccagctgtcc aacctgaaga 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequece
<400> 6
actgtgcact tgaccctctc 20

Claims (5)

1.一种2019-nCoV的引物组，其特征在于，包括一对外引物F3-1和B3-1、一对内引物FIP-1和BIP-1、以及一对环引物LF-1、LB-1；
所述F3-1、B3-1、FIP-1、BIP-1、LF-1、LB-1的核苷酸序列如下：
F3-1：CTAGGTTTCAAACTTTACTTGC；
B3-1：CCTTTTTCTACAGTGAAGGATT；
FIP-1：
ACCCACATAATAAGCTGCAGCA-GTTATTTGACTCCTGGTGATT；
BIP-1：
ATGAAAATGGAACCATTACAGATGC-CAACGTACACTTTGTTTCT GA；
LF-1：CCAGCTGTCCAACCTGAAGA；
LB-1：ACTGTGCACTTGACCCTCTC。
2.一种2019-nCov检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要1所述的2019-nCoV的引物组、反应预混液、检测管、显色剂、标准阳性模板、阴性对照；所述的显色剂为HNB或SYBRgreen 1。
3.根据权利要求2所述的2019-nCov检测试剂盒，其特征在于：所述显色剂为3mM的HNB溶液。
4.根据权利要求2所述的2019-nCov检测试剂盒，其特征在于：所述反应预混液包括BstDNA聚合酶、AMV逆转录酶、10×反应缓冲液、dNTPs、硫酸镁、甜菜碱和DEPC水。
5.根据权利要求2所述的2019-nCov检测试剂盒，其特征在于，所述引物组的浓度比例如下：外引物、内引物、环引物的摩尔比为1:4:2。
CN202010085085.3A 2020-02-10 2020-02-10 一种2019-nCoV的引物组和2019-nCoV核酸检测试剂盒 Active CN113249516B (zh)

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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106434917A (zh) * 2016-09-24 2017-02-22 中华人民共和国广州机场出入境检验检疫局 一种金黄色葡萄球菌的lamp引物组及检测试剂盒与使用方法
CN108570511A (zh) * 2018-05-30 2018-09-25 华南理工大学 一种金黄色葡萄球菌的lamp检测引物组、其lamp检测试剂盒及其检测方法
CN109280711A (zh) * 2018-05-16 2019-01-29 深圳市第三人民医院(深圳市肝病研究所) 堪萨斯分枝杆菌的lamp检测引物组、检测试剂盒及其检测方法

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050202436A1 (en) * 2002-07-30 2005-09-15 Baback Gharizadeh Target-specific multiple sequencing primer pool for microbial typing and sequencing applications in DNA-sequencing technologies
CN101603096A (zh) * 2009-05-04 2009-12-16 北京海康基因芯片开发有限公司 一种检测传染病病原体的方法及试剂盒
EP2287335A1 (en) * 2009-08-05 2011-02-23 DiaSorin S.p.A. Highly sensitive rapid isothermal method for the detection of methylation patterns
CN102695806B (zh) * 2009-11-03 2014-11-05 瑞典国家兽医研究所 基因型分型
CN103497947B (zh) * 2013-09-13 2015-08-12 浙江国际旅行卫生保健中心 一种体外新型快速环介导等温扩增方法、体外检测甲型h1n1流感病毒的试剂及方法
CN103725798B (zh) * 2014-01-15 2016-02-24 中国人民解放军南京军区军事医学研究所 用于以rt-lamp法检测肾综合征出血热病毒的引物、试剂盒、检测方法
WO2015118491A1 (en) * 2014-02-06 2015-08-13 University Of The Witwatersrand, Johannesburg Method for detecting hiv
CN104131112B (zh) * 2014-08-15 2016-05-04 广州医科大学附属第三医院 一种淋球菌检测用引物组、含有该引物组的试剂盒及其应用
WO2016073255A1 (en) * 2014-11-06 2016-05-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Detection of hiv-1 nucleic acids by reverse-transcription loop-mediated isothermal amplication
CN104388592B (zh) * 2014-11-27 2017-04-05 广东温氏大华农生物科技有限公司 一种猪流行性腹泻病毒s基因rt‑lamp检测试剂盒及检测方法
US10072309B1 (en) * 2015-05-08 2018-09-11 Dougbeh-Chris Nyan Methods for real-time multiplex isothermal detection and identification of bacterial, viral, and protozoan nucleic acids
EP3098326A1 (en) * 2015-05-27 2016-11-30 Institut Pasteur Isothermal amplification assay for rapid and accurate detection of hemorrhagic fever viruses in clinical samples
CN108411033B (zh) * 2018-02-07 2022-02-11 华南农业大学 一种用于快速检测甘蔗线条花叶病毒的rt-lamp试剂盒和方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106434917A (zh) * 2016-09-24 2017-02-22 中华人民共和国广州机场出入境检验检疫局 一种金黄色葡萄球菌的lamp引物组及检测试剂盒与使用方法
CN109280711A (zh) * 2018-05-16 2019-01-29 深圳市第三人民医院(深圳市肝病研究所) 堪萨斯分枝杆菌的lamp检测引物组、检测试剂盒及其检测方法
CN108570511A (zh) * 2018-05-30 2018-09-25 华南理工大学 一种金黄色葡萄球菌的lamp检测引物组、其lamp检测试剂盒及其检测方法

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