CN105506188B - 用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光rt-pcr引物和荧光探针、试剂盒及检测方法 - Google Patents

用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光rt-pcr引物和荧光探针、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光RT‑PCR引物和荧光探针、试剂盒及检测方法，所述用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光RT‑PCR引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物包括如SEQ ID NO：1所示的序列，所述反向引物包括如SEQ ID NO：2所示的序列；所述荧光探针为寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括如SEQ ID NO：3所示的序列。采用本发明的技术方案，通过引入特异性荧光探针和荧光信号的动态监测使PCR产物的扩增及分析的全过程在单管内封闭完成，具有实时、准确、快速、简便的特点，无需后续处理，避免污染，为降低病死率以及控制疫情争取时间。

Description

用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针、试 剂盒及检测方法
技术领域
本发明属于体外核酸检测技术领域，本发明提供了一种用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针、试剂盒及检测方法。
背景技术
寨卡病毒（Zika virus）是一种蚊媒病毒，于1947年首次在乌干达恒河猴中发现。属黄病毒科黄病毒属，为单股正链RNA病毒，直径40-70nm，有包膜，包含10794个核苷酸，编码3419个氨基酸。寨卡病毒与同为黄病毒属的登革病毒、黄热病毒及西尼罗病毒等存在较强的血清学交叉反应。寨卡病毒可引起一种自限性急性传染病，称为寨卡病毒病，临床特征主要为发热、皮疹、关节痛或结膜炎，极少引起死亡。世界卫生组织（WHO）认为，新生儿小头畸形、格林-巴利综合征（吉兰-巴雷综合征）可能与寨卡病毒感染有关。
寨卡病毒病主要在全球热带及亚热带地区流行。1952年，在乌干达和坦桑尼亚的人体中分离到该病毒。此后,多个国家有散发病例报道。2007年,首次在西太平洋国家密克罗尼西亚的雅普岛发生寨卡病毒疫情暴发。截至2016年1月，至少在非洲、亚洲、美洲的45个国家有寨卡病毒传播的证据，以巴西疫情最为严重。根据基因型别分为非洲型和亚洲型，2016年1月美洲流行的为亚洲型。
我国南方部分地区存在可传播寨卡病毒的媒介伊蚊，近年来与之传播方式相似的登革热输入性疫情持续增多，并在南方部分省份引起了较大规模的暴发疫情。随着与相关国家或地区人员往来的日益密切，我国存在寨卡病毒输入风险。特别是我国南方地区夏秋季节伊蚊密度较高，一旦有病例输入，不排除在局部地区发生本地传播扩散的可能。因此，急需建立一种快速、高效、准确的检测方法和检测试剂盒。
发明内容
针对以上技术问题，本发明提供了一种用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针、试剂盒及检测方法，可以快速、高效、定性的检测样本中的亚洲型寨卡病毒。
对此，本发明的技术方案为：
一种用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针，所述用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光RT-PCR引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物包括如SEQ ID NO：1所示的序列，所述反向引物包括如SEQ ID NO：2所示的序列，所述荧光探针为寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针包括如SEQ ID NO：3所示的序列。
正向引物：5'-AAAGGGAGCCTGGTGACATG-3'
反向引物：5'-CTGGGAGCCATGAACTGACA-3'
寡核苷酸探针：5'-AAGAGCATCCAGCCAGAGAATCTGG-3'。
作为本发明的进一步改进，所述正向引物还包括SEQ ID NO：1所示的序列的衍生序列；所述反向引物还包括SEQ ID NO：2所示的序列的衍生序列；所述寡核苷酸探针还包括如SEQ ID NO：3所示的序列的衍生序列；其中，所述衍生序列包括引物序列的互补链序列，或向5'端和3'端方向延伸一至十个以内的碱基或删减一至十个以内的碱基得到的序列。
作为本发明的进一步改进，所述寡核苷酸探针的3’端标记有第一荧光淬灭基团，5’端标记有第一荧光报告基团。
作为本发明的进一步改进，所述第一荧光报告基团为FAM、JOE、ROX、TET、TAMRA、HEX、VIC、CY3、CY5或Texas Red中的至少一种；所述第一荧光淬灭基团为BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcyl、Lowa BlackTM RQ或Lowa BlackTM FQ中的至少一种。
本发明还公开了一种用于检测亚洲型寨卡病毒的试剂盒，所述用于检测亚洲型寨卡病毒的试剂盒包括RT-PCR反应液，所述RT-PCR反应液包含如上所述的用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针。
作为本发明的进一步改进，所述RT-PCR反应液包括内标引物和内标探针，所述内标引物包括内标正向引物和内标反向引物，所述内标正向引物包含如SEQ ID NO：4所示的序列，所述内标反向引物包含如SEQ ID NO：5所示的序列，所述内标探针包含如SEQ ID NO：6所示的序列。
内标正向引物：5'-GCCTCCTGGTCTGTGATCCTC-3'；（SEQ ID NO：4）
内标反向引物：5'-GAAGTGGGCACATCCATAGAGC-3'；（SEQ ID NO：5）
内标探针：5'-TTCTTGACACCCTGCATCCATTACCTCC-3'（SEQ ID NO：6）。
作为本发明的进一步改进，所述RT-PCR反应液包括dATP、dUTP、dGTP、dCTP四种核苷酸、所述用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针、内标引物和内标探针、含有镁离子的缓冲液组成。
作为本发明的进一步改进，所述内标探针的5’端标记有第二荧光报告基团，3’端标记有第二荧光淬灭基团。
作为本发明的进一步改进，所述第二荧光报告基团为HEX；所述第二荧光淬灭基团为BHQ1。
作为本发明的进一步改进，所述用于检测亚洲型寨卡病毒的试剂盒还包括酶混合液、内标溶液、阳性质控品、阴性质控品。
作为本发明的进一步改进，所述酶混合液为包含有热启动的Taq DNA 聚合酶、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂（RNasin）的缓冲液。
作为本发明的进一步改进，所述阳性质控品为含有插入亚洲型寨卡病毒特异型保守序列的pUC57载体质粒，所述pUC57载体质粒转化到大肠杆菌DH5α中增殖后经提取纯化用分光光度计测定浓度和纯度后用无菌TE缓冲液稀释。
优选的，所述亚洲型寨卡病毒特异型保守序列为：
AAAGGGAGCCTGGTGACATGCGCTAAGTTTGCATGCTCCAAGAAAATGACCGGGAAGAGCATCCAGCCAGAGAATCTGGAGTACCGGATAATGCTGTCAGTTCATGGCTCCCAG（如SEQ ID NO：7所示）。
作为本发明的进一步改进，阳性质控品的浓度为1.0×106copies/ml。
作为本发明的进一步改进，所述阴性质控品为无菌TE缓冲液。进一步优选的，该所述无菌TE缓冲液采用DEPC水配制。
作为本发明的进一步改进，所述内标溶液为含有插入人RNP基因特异型保守序列RNA片段的假病毒颗粒的溶液。
优选的，所述人RNP基因特异型保守序列为：
GAAGTGGGCACATCCATAGAGCACCCCAGGGAGGCAGAGGAGGTAATGGATGCAGGGTGTCAAGAATCGGCAGGGCCTGAGAGGATCACAGACCAGGAGGC（如SEQ ID NO：8所示）。
作为本发明的进一步改进，所述用于检测亚洲型寨卡病毒的试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
本发明还公开了一种亚洲型寨卡病毒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1：准备检测样品RNA模板；
步骤S2：配制含有内标引物、内标探针、如上所述的用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针的RT-PCR反应体系，对步骤S1所述的检测样品RNA模板进行扩增；其中，第一阶段反应条件为：50℃ 15min，95℃ 2min，1个循环；第二阶段反应条件为：95℃10s，60℃ 30s，40个循环；第二阶段中的每个循环结束后收集荧光信号；所述荧光探针和内标探针分别对应目标荧光通道和内标荧光通道；
步骤S3：反应结束后，读取并记录检测通道扩增曲线及扩增循环数Ct，所述检测通道包括目标荧光通道和内标荧光通道，所述目标荧光通道的扩增循环数为Ct1，所述内标荧光通道的扩增循环数为Ct2，根据以下内容进行检测结果的判断：
1）当目标荧光通道和内标荧光通道均有扩增曲线，且Ct1和Ct2均小于或等于37，则检验样品为亚洲型寨卡病毒阳性；
2）当目标荧光通道无扩增曲线，且Ct1显示为Undet或No Ct，同时，内标荧光通道有扩增曲线，Ct2≤37时，则检验样品为亚洲型寨卡病毒阴性；
3）当目标荧光通道有扩增曲线，但37＜Ct1≤40，同时，内标荧光通道有扩增曲线，且Ct2≤37时，重复一次实验，结果相同，则检验样品为亚洲型寨卡病毒阳性；
4）当目标荧光通道或内标荧光通道无扩增曲线，则检验样品为亚洲型寨卡病毒阴性；
5）当目标荧光通道和内标荧光通道均无扩增曲线，且Ct1和Ct2均显示为Undet或NoCt，更换试剂重新实验。
优选的，步骤S1所述检测样品RNA模板采用深圳市易瑞生物技术有限公司生产病毒RNA磁珠提取试剂盒，按照试剂盒说明书进行提取，提取样品前先加入4μl的内标溶液，即内标溶液参与核酸提取过程。
作为本发明的进一步改进，所述亚洲型寨卡病毒的检测方法包括以下步骤：
步骤A：待检测样本RNA的提取：所述样本RNA可以采用深圳市易瑞生物技术有限公司生产病毒RNA磁珠提取试剂盒，按照试剂盒说明书进行提取，提取样品前先加入4μl的内标溶液，即内标溶液参与核酸提取过程。
步骤B：以步骤A的待检测样本RNA为模板，加入RT-PCR反应液、酶混合液等配成RT-PCR反应体系，进行扩增反应，其中反应体系如下：RT-PCR反应液19μl、酶混合液1μl、RNA模板5μl，构成反应体系25μl；
其中，所述扩增反应按照以下程序进行：
第一阶段，反应条件为：50℃ 15min，95℃ 2min，1个循环；
第二阶段，反应条件为：95℃ 10s，60℃ 30s，40个循环；第二阶段中的每个循环结束后收集荧光信号；所述荧光探针和内标探针分别对应目标荧光通道和内标荧光通道；所述第一荧光报告基团为FAM；所述第二荧光报告基团为HEX，所述检测通道包括FAM通道和HEX通道，淬灭基团通道无；
步骤C：结果分析：
1）实验结束后保存检测数据文件，读取并记录检测通道扩增曲线及扩增循环数Ct（cycle threshold，扩增循环数），所述检测通道包括FAM通道和HEX通道，所述FAM通道的扩增循环数为Ct1，所述HEX通道的扩增循环数为Ct2。
2）分析条件设置：根据分析后图像调节基线（Baseline）的Start值、Stop值以及阈值（Threshold）的Value值（用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3-15、end值可以在5-20，调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线），使仪器给出正确的结果。
3）质量控制：
阴性对照：FAM通道无扩增曲线，HEX通道有扩增曲线，且Ct1 和Ct2值均≤32；
阳性对照：FAM通道和HEX通道均有扩增曲线，且Ct1 和Ct2值均≤32；
以上两个要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需要重新进行实验。
4）结果判读：
根据以下内容进行检测结果的判断：
当FAM通道和HEX通道均有扩增曲线，且Ct1和Ct2均小于或等于37，则检验样品为亚洲型寨卡病毒阳性；
当FAM通道无扩增曲线，且Ct1显示为Undet或No Ct，同时，HEX通道有扩增曲线，Ct2≤37时，则检验样品为亚洲型寨卡病毒阴性；
当FAM通道有扩增曲线，但37＜Ct1≤40，同时，HEX通道有扩增曲线，且Ct2≤37时，重复一次实验，结果相同，则检验样品为亚洲型寨卡病毒阳性；
当FAM通道或HEX通道无扩增曲线，则检验样品为亚洲型寨卡病毒阴性；
当FAM通道和HEX通道均无扩增曲线，且Ct1和Ct2均显示为Undet或No Ct，更换试剂重新实验。
Ct（cycle threshold，扩增循环数）值的定义为：每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。阈值的设定一般是将其设定为恰好可以覆盖住阴性对照和空白对照的荧光值处，因此可以很好的去除反应管荧光值即背景。
本发明的技术方案采用实时荧光PCR技术，通过引入特异性荧光探针和荧光信号的动态监测使PCR产物的扩增及分析的全过程可以在单管内封闭完成，并且可以对PCR扩增产物进行实时动态监测及自动分析结果，具有实时、准确、快速、简便等特点，是一种先进的分子检测技术。目前市面上还没有基于实时荧光PCR技术建立的亚洲型寨卡病毒核酸检测试剂盒。
本发明的技术方案实现了快速、特异的单管检测样本中是否含有亚洲型寨卡病毒，与其它检测技术相比具有以下有益效果：
第一，本发明的技术方案为全封闭反应，实时监控荧光数据，无需后续处理，避免污染，保证检测结果的可靠性。
第二，采用本发明的技术方案，检测快速，操作简单，全程3个小时即可出诊断结果，大大缩短了检测时间。
第三，采用本发明的技术方案，实现单管双重检测，同时引入了内标质控，提高了检测人员的检测效率，监控抽提效率和排除抑制剂干扰。
第四，采用本发明的技术方案，具有荧光探针法荧光定量PCR技术特有的优势，即特异性更强、灵敏度更高，完全满足亚洲型寨卡病毒流行病学诊断和疫情监控，为降低病死率以及控制疫情争取时间。
附图说明
图1为本发明一种实施例的亚洲型寨卡病毒检测试剂盒的FAM通道线性实验数据。图中，S1-S7分别表示浓度为1.0×109copies/ml、1.0×108copies/ml、1.0×107copies/ml、1.0×106copies/ml、1.0×105copies/ml、1.0×104copies/ml、1.0×103copies/ml的阳性质控品的扩增曲线，各3个重复数据，CK为阴性质控品，横坐标cycle表示扩增循环数，纵坐标△Rn表示荧光强度。
图2为本发明一种实施例的亚洲型寨卡病毒核酸检测试剂盒的FAM通道标准曲线示意图。
图3为本发明一种实施例的亚洲型寨卡病毒检测试剂盒的检出限实验示意图。其中S6、S7分别为1.0×104copies/ml、1.0×103copies/ml，各20次重复数据。
图4为本发明一种实施例的亚洲型寨卡病毒检测试剂盒的精密度实验示意图。其中S4和S6分别为1.0×106copies/ml、1.0×104copies/ml，各10次重复数据。
图5为本发明一种实施例的亚洲型寨卡病毒检测试剂盒的特异性实验数据。图中横坐标cycle表示扩增循环数，纵坐标△Rn表示荧光强度，A代表亚洲型寨卡病毒阳性质控品FAM通道扩增曲线，B代表内标阳性质控品HEX通道扩增曲线，特异性参考品分别为登革热病毒I型、登革热病毒II型、诺如病毒GI型、诺如病毒GII型、轮状病毒A组、禽流感病毒H5、禽流感病毒H7。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。这些实施例仅是示范性，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，凡是利用本发明内容所做的等效结构或等效流程变换，直接或间接运用于其他相关技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
本发明具有用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光RT-PCR引物和荧光荧光探针的试剂盒及检测方法采用TaqMan荧光探针法荧光PCR检测技术，快速检测样品中寨卡病毒特有序列，从而判断样品中是否存在亚洲型寨卡病毒。
实施例1
一种用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针，所述用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光RT-PCR引物包括正向引物和反向引物，所述荧光探针为寡核苷酸探针，所述正向引物、反向引物和寡核苷酸探针的序列如下所示：
正向引物：5'-AAAGGGAGCCTGGTGACATG-3'；（SEQ ID NO：1）
反向引物：5'-CTGGGAGCCATGAACTGACA-3'；（SEQ ID NO：2）
寡核苷酸探针：5'-AAGAGCATCCAGCCAGAGAATCTGG-3'；（SEQ ID NO：3）
其中，所述寡核苷酸探针的3’端标记有第一荧光淬灭基团，5’端标记有第一荧光报告基团。所述第一荧光报告基团为FAM；所述第一荧光淬灭基团为BHQ1。
实施例2
一种用于检测亚洲型寨卡病毒的试剂盒，其包括RT-PCR反应液、酶混合液、内标溶液、阳性质控品、阴性质控品。其中，所述RT-PCR反应液主要由dATP、dUTP、dGTP、dCTP四种核苷酸、实施例1所述的用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针、内标引物和内标探针、含有镁离子的缓冲液组成。所述内标引物包括内标正向引物和内标反向引物，所述内标正向引物、内标反向引物和内标探针的序列如下所示：
内标正向引物：5'-GCCTCCTGGTCTGTGATCCTC-3'；（SEQ ID NO：4）
内标反向引物：5'-GAAGTGGGCACATCCATAGAGC-3'；（SEQ ID NO：5）
内标探针：5'-TTCTTGACACCCTGCATCCATTACCTCC-3'；（SEQ ID NO：6）
其中，所述内标探针的5’端标记有第二荧光报告基团，3’端标记有第二荧光淬灭基团。所述第二荧光报告基团为HEX；所述第二荧光淬灭基团为BHQ1。
所述阳性质控品为含有插入亚洲型寨卡病毒特异型保守序列的pUC57载体质粒。所述pUC57载体质粒转化到大肠杆菌DH5α中增殖后经提取纯化用分光光度计测定浓度和纯度后用无菌TE缓冲液稀释。其中阳性质控品的浓度为1.0×106copies/ml。
其中，所述亚洲型寨卡病毒特异型保守序列为：
AAAGGGAGCCTGGTGACATGCGCTAAGTTTGCATGCTCCAAGAAAATGACCGGGAAGAGCATCCAGCCAGAGAATCTGGAGTACCGGATAATGCTGTCAGTTCATGGCTCCCAG（SEQ ID NO：7）。
所述阴性质控品为无菌TE缓冲液，该缓冲液采用DEPC水配制。
所述内标溶液为含有插入人RNP基因特异型保守序列RNA片段的假病毒颗粒的溶液。
其中，所述人RNP基因特异型保守序列为：
GAAGTGGGCACATCCATAGAGCACCCCAGGGAGGCAGAGGAGGTAATGGATGCAGGGTGTCAAGAATCGGCAGGGCCTGAGAGGATCACAGACCAGGAGGC（SEQ ID NO：8）。
所述酶混合液为包含有热启动的Taq DNA 聚合酶、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂（RNasin）的缓冲液。
本试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
采用本例所述的试剂盒，对检测样品进行检测时，包括以下步骤：
步骤A：待检测样本RNA的提取：所述样本RNA可以采用深圳市易瑞生物技术有限公司生产病毒RNA磁珠提取试剂盒，按照试剂盒说明书进行提取，提取样品前先加入4μl的内标溶液，即内标溶液参与核酸提取过程。
步骤B：以步骤A的待检测样本RNA为模板，加入RT-PCR反应液、酶混合液等配成RT-PCR反应体系，进行扩增反应，其中反应体系如下：RT-PCR反应液19μl、酶混合液1μl、RNA模板5μl，构成反应体系25μl；
其中，所述扩增反应按照以下程序进行：
第一阶段，反应条件为：50℃ 15min，95℃ 2min，1个循环；
第二阶段，反应条件为：95℃ 10s，60℃ 30s，40个循环；第二阶段中的每个循环结束后收集荧光信号；所述荧光探针和内标探针分别对应目标荧光通道和内标荧光通道；所述荧光探针的5’端标记有FAM荧光报告基团；所述内标探针的5’端标记有HEX荧光报告基团，所述检测通道包括FAM通道和HEX通道，淬灭基团通道无；
步骤C：结果分析；
1）实验结束后保存检测数据文件，读取并记录检测通道扩增曲线及扩增循环数Ct（cycle threshold，扩增循环数），所述检测通道包括FAM通道和HEX通道，所述FAM通道的扩增循环数为Ct1，所述HEX通道的扩增循环数为Ct2。
2）分析条件设置：根据分析后图像调节基线（Baseline）的Start值、Stop值以及阈值（Threshold）的Value值（用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3-15、end值可以在5-20，调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线），使仪器给出正确的结果。
3）质量控制；
阴性对照：FAM通道无扩增曲线，HEX通道有扩增曲线，且Ct1和Ct2值均≤32；
阳性对照：FAM通道和HEX通道均有扩增曲线，且Ct1和Ct2值均≤32；
以上两个要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需要重新进行实验。
4）结果判读；
根据以下内容进行检测结果的判断：
当FAM通道和HEX通道均有扩增曲线，且Ct1和Ct2均小于或等于37，则检验样品为亚洲型寨卡病毒阳性；
当FAM通道无扩增曲线，且Ct1显示为Undet或No Ct，同时，HEX通道有扩增曲线，Ct2≤37时，则检验样品为亚洲型寨卡病毒阴性；
当FAM通道有扩增曲线，但37＜Ct1≤40，同时，HEX通道有扩增曲线，且Ct2≤37时，重复一次实验，结果相同，则检验样品为亚洲型寨卡病毒阳性；
当FAM通道或HEX通道无扩增曲线，则检验样品为亚洲型寨卡病毒阴性；
当FAM通道和HEX通道均无扩增曲线，且Ct1和Ct2均显示为Undet或No Ct，更换试剂重新实验。
Ct（cycle threshold，扩增循环数）值的定义为：每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。阈值的设定一般是将其设定为恰好可以覆盖住阴性对照和空白对照的荧光值处，因此可以很好的去除反应管荧光值即背景。
实施例3
下面对实施例2的试剂盒进行线性实验、最低检出限实验、精密度实验和特异性实验。
（1）试剂盒的线性实验
目标靶标荧光探针标记为FAM荧光基团；该试剂盒的FAM通道的线性参比品，由含有目的片段的质粒组成，采用TE缓冲液将阳性质粒进行10倍的梯度稀释得到下列梯度溶液，即分别采用S1：1.0×109copies/ml、S2：1.0×108copies/ml、S3：1.0×107copies/ml、S4：1.0×106copies/ml、S5：1.0×105copies/ml、S6：1.0×104copies/ml、S7：1.0×103copies/ml作为线性参比品，进行试剂盒的线性实验，实验结果如图1所示，标准曲线即模板浓度与Ct值之间线性关系图如图2所示。由图1和图2可见，该试剂盒的在1.0×109copies/ml至1.0×103copies/ml之间具有很好的线性关系，同时该试剂盒拟合的线性方程为：Y= -3.1399x+41.513，相关系数R2=0.99423，其中Y代表Ct值，x代表阳性参考品的对数值。
（2）试剂盒的最低检出限实验
该实验验证试剂盒的最低检出限，采用线性参比品中的S6：1.0×104copies/ml、S7：1.0×103copies/ml浓度的阳性质粒作为检出限参比品，每个浓度进行20个重复样品，实验结果参考图3，由图3可见，检出限参比品S6和S7全部表现为扩增曲线，为阳性数据，因此通过该实验表明该试剂盒的检出限为1.0×103copies/ml，即达到5copies/反应。
（3）试剂盒的精密度实验
该实验验证试剂盒的批内精密度，采用线性参比品中的S4：1.0×106copies/ml、S6：1.0×104copies/ml等两个高低浓度的阳性质粒作为精密度参比品，各做10个重复样本，实验结果如图4所示，结果显示两个浓度数据变异系数均小于5%。
（4）试剂盒的特异性实验
该实验选择与亚洲型寨卡病毒具有相似感染症状的常见病原体作为特异性参考品，采用的是灭活阳性样本。特异性参考品分别为登革热病毒I型、登革热病毒II型、诺如病毒GI型、诺如病毒GII型、轮状病毒A组、禽流感病毒H5、禽流感病毒H7。利用深圳市易瑞生物技术有限公司研发的通用性病毒DNA/RNA提取试剂盒提取以上灭活样本中的DNA/RNA作为模板进行实验，实验结果如图5所示，由图5可见，这7种特异性参考品均未有典型的“S”型扩增曲线，说明该试剂盒特异性良好，。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针，其特征在于：所述用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光RT-PCR引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物如SEQID NO：1所示的序列，所述反向引物如SEQ ID NO：2所示的序列；所述荧光探针为寡核苷酸探针，所述寡核苷酸探针如SEQ ID NO：3所示的序列；所述寡核苷酸探针的3’端标记有第一荧光淬灭基团，5’端标记有第一荧光报告基团；所述第一荧光报告基团为FAM、JOE、ROX、TET、TAMRA、HEX、VIC、CY3、CY5或Texas Red中的一种；所述第一荧光淬灭基团为BHQ、TAMRA、Eclipse、Dabcyl、Lowa BlackTM RQ或Lowa BlackTM FQ中的一种。
2.一种用于检测亚洲型寨卡病毒的试剂盒，其特征在于：所述用于检测亚洲型寨卡病毒的试剂盒包括RT-PCR反应液，所述RT-PCR反应液包含如权利要求1所述的用于检测亚洲型寨卡病毒的荧光RT-PCR引物和荧光探针。
3.根据权利要求2所述的用于检测亚洲型寨卡病毒的试剂盒，其特征在于：所述RT-PCR反应液包括内标引物和内标探针，所述内标引物包括内标正向引物和内标反向引物，所述内标正向引物如SEQ ID NO：4所示的序列，所述内标反向引物如SEQ ID NO：5所示的序列，所述内标探针如SEQ ID NO：6所示的序列，其中，所述内标探针的5’端标记有第二荧光报告基团，3’端标记有第二荧光淬灭基团。
4.根据权利要求3所述的用于检测亚洲型寨卡病毒的试剂盒，其特征在于：所述第二荧光报告基团为HEX；所述第二荧光淬灭基团为BHQ1，所述第二荧光报告基团与第一荧光报告基团为不同的基团。
5.根据权利要求4所述的用于检测亚洲型寨卡病毒的试剂盒，其特征在于：所述用于检测亚洲型寨卡病毒的试剂盒还包括酶混合液、内标溶液、阳性质控品、阴性质控品；
所述阳性质控品为含有如SEQ ID NO：7所示序列的pUC57载体质粒；所述阴性质控品为无菌TE缓冲液；所述内标溶液为含有如SEQ ID NO：8所示序列的假病毒颗粒的溶液。
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