CN107841573A - 寨卡病毒检测探针、荧光定量rt‑pcr试剂盒及检测方法 - Google Patents

寨卡病毒检测探针、荧光定量rt‑pcr试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公布了一种寨卡病毒检测探针、荧光定量RT‑PCR试剂盒及检测方法。所述探针的靶标序列是位于寨卡病毒的3’‑UTR区域的特异性核酸序列，所述试剂盒包含寨卡病毒3’‑UTR区域特异的引物对和Taqman荧光探针，通过实时荧光定量RT‑PCR，能准确地将寨卡病毒感染样本检测出来，使用方便快捷，灵敏度高，特异性强，重复性好。

Description

寨卡病毒检测探针、荧光定量RT-PCR试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及病原微生物的检测，具体涉及一种用实时荧光定量RT-PCR扩增技术，快速检测寨卡病毒的引物探针对、试剂盒及其使用方法。
背景技术
寨卡病毒病(ZikaVirusDisease)是由寨卡病毒(ZikaVirus)引起，并通过蚊媒传播的一种自限性急性疾病，临床特征主要为发热、皮疹、关节痛、肌肉疼痛或结膜炎，其病情通常较温和，症状可持续数日至一周，极少引起死亡。寨卡病毒对绝大多数感染者而言症状温和，但对孕妇危害巨大，会大大增加新生儿畸形风险，可能导致新生儿小头畸形甚至死亡等。
自2015年5月以来，寨卡疫情在拉丁美洲和加勒比海国家大肆流行，并迅速蔓延超过40多个国家，疫情最严重的巴西，感染者多达150万人，新生儿小头症疑似病例激增至3894例。截止2016年9月11日，新加坡境内感染的寨卡确诊病例总数已达329起。中国疾病预防控制中心专家表示，随着周边国家近期发生的寨卡病毒疫情，我国存在输入寨卡病毒疫情的风险。自2016年2月9日我国确诊第一例寨卡病毒患者起，到2016年9月已有20余例寨卡病毒确诊患者。2016年2月1日，世界卫生组织召开紧急会议应对疫情，决定把寨卡病毒列为国际紧急卫生事故。
此前报道，寨卡病毒主要通过埃及伊蚊叮咬传播，由于传播该病毒的伊蚊在全世界都可以找到，病毒的爆发很可能会传播到更多国家。而且在2016年2月2日，得克萨斯州发现第一例通过性接触被感染寨卡病毒的患者，寨卡病毒能够通过性接触传染，意味着它将对每个国家都构成威胁。美国《细胞报告》杂志2016年9月6日发布的一项实验鼠研究显示，寨卡病毒能在其眼睛里存活，并有可能通过眼泪传播。
寨卡病毒属于黄病毒科(flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)，病毒颗粒呈球状，直径约为40-90nm，是全长为11kb的单股正链RNA，包含10794个核苷酸编码的3419个氨基酸。该病毒主要有非洲型和亚洲型两个亚型，与同为黄病毒属的登革热病毒、黄热病病毒、日本脑炎病毒(乙脑病毒)或西尼罗病毒非常相近。
目前针对寨卡病毒的实验室诊断方法有病原学方法、血清学方法和核酸检测技术。传统的病原学方法主要通过细胞进行病毒的分离，耗时、耗力，而且寨卡病毒的病毒血症持续时间短，较难采集到合适的样品。血清学方法，包括ELISA、免疫荧光、中和试验等，也被广泛应用于寨卡病毒的实验室检测，但是病毒特异性IgM和中和抗体出现较晚，约发病后1周才可检出，同时黄病毒间交叉反应常见，难以鉴别。核酸检测技术，荧光定量RT-PCR检测以灵敏度高、特异性强、重复性好、定量准确、速度快、无污染等的诸多优点成为寨卡病毒感染实验室确诊的重要工具。
中国专利申请CN201610340665.6阐述了一种寨卡病毒的荧光定量PCR方法、引物及试剂盒，但是该方法中首先进行反转录反应，再进行荧光定量PCR检测，这样容易造成污染。中国专利申请CN201610099248.7、中国专利申请CN201610147785.4分别介绍了寨卡病毒的荧光定量RT-PCR检测试剂盒，引物探针区域均设计在蛋白编码区域。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于寨卡病毒检测的实时荧光定量RT-PCR检测引物探针对及其试剂盒，以及一种使用该试剂盒快速检测寨卡病毒的方法。
经对目前NCBI中收录的寨卡病毒全长序列进行分析，表明其3’-UTR区域保守性很强，相对于蛋白编码区域更适合作为靶标区域进行检测。本发明针对寨卡病毒3’-UTR区域，利用实时荧光定量RT-PCR技术，设计特异性引物和探针，制成寨卡病毒实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒。
本发明所采取的技术方案是：
本发明首先提供了一种用于检测寨卡病毒的核酸探针，其靶标序列位于寨卡病毒的3’-UTR区域中，具体针对下述特异性靶标序列(SEQ ID No.1)中的任意一段序列：
5’-TGCAGCCTGTAACCCCCCCAGGAGAAGCTGGGAAACCAAGCTCATAGTCAGGCCGAGAACGCCATGGCACGGAAGAAGCCATGCTGCCTGTGAGCCCCTCAGAGGACACTGAGTCAAAAAACCCCACGCGCTTGGAAGCGCAGGATGGGAAAAGAAGGTGGCGACCTTCCCCACCCTT-3’
优选的，所述核酸探针序列长度为12～28碱基。最优选的，所述核酸探针序列如下：
5’-CCATGCTGCCTGTGAGCCCCTC-3’(SEQ ID No.2)
本发明还提供了一种用于检测寨卡病毒的引物对，该引物对能够用于扩增包含上述核酸探针序列的寨卡病毒3’-UTR区域特异性靶标序列。
所述引物对的一个优选例子的序列如下：
引物1：5’-ATAGTCAGGCCGAKAACGCCAT-3’(其中K代表G或T)(SEQ ID No.3)；
引物2：5’-CCATCCTGCGCYTCCAAGC-3’(其中Y代表T或C)(SEQ ID No.4)。
进一步的，本发明提供了一种用于快速检测寨卡病毒的实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括实时荧光定量RT-PCR反应液，所述RT-PCR反应液中含有Taqman荧光探针和引物对，其中：所述Taqman荧光探针的靶标序列位于寨卡病毒的3’-UTR区域中，具体针对序列表中SEQ ID No.1所示特异性靶标序列中的任意一段序列；所述引物对用于扩增包含该荧光探针序列的寨卡病毒3’-UTR区域特异性靶标序列。
在本发明的一个实施例中，所述荧光探针和引物对的序列如下所示：
荧光探针：5’-FAM-CCATGCTGCCTGTGAGCCCCTC-BHQ-1-3’(SEQ ID No.2)；
引物1：5’-ATAGTCAGGCCGAKAACGCCAT-3’(其中K代表G或T)(SEQ ID No.3)；
引物2：5’-CCATCCTGCGCYTCCAAGC-3’(其中Y代表T或C)(SEQ ID No.4)。
在本发明用于快速检测寨卡病毒的实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒中，所述RT-PCR反应液优选为一步法实时荧光定量PCR的RT-PCR反应液，例如含有2×One Step RT-PCRBufferⅢ、TaKaRa Ex Taq HS(5U/μL)、PrimeScript RT Enzyme MixⅡ、引物对和Taqman荧光探针。
在本发明的实施例中，所述2×One Step RT-PCR BufferⅢ、TaKaRa Ex Taq HS(5U/μL)、PrimeScript RT Enzyme MixⅡ由来自Takara公司的货号为RR064A的OneStepPrimeScriptTMRT-PCRKit试剂盒提供。
作为优选的，RT-PCR反应液中所述引物的浓度为1～10μM，更优选为5μM。
作为优选的，RT-PCR反应液中所述荧光探针的浓度为1～5μM，更优选为2μM。
进一步的，所述试剂盒还包括阳性对照品和/或阴性对照品。
作为优选的，本发明的阳性对照品为含有寨卡病毒3’-UTR区域特异性靶标RNA片段的假病毒溶液。
作为优选的，所述寨卡病毒3’-UTR区域特异性靶标序列为序列表中SEQ ID No.1所示。
作为优选的，本发明的阴性对照品为DEPC水。
本发明试剂盒应保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
利用本发明的试剂盒快速检测寨卡病毒的方法，每次检测均应设立阳性对照和阴性对照，包括如下步骤：
(1)核酸提取：提取待检样品中的病毒RNA；
(2)实时荧光定量RT-PCR：利用上述检测寨卡病毒的实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒进行逆转录和PCR扩增，分别以提取的待检样品RNA、阳性对照品和阴性对照品为模板，与试剂盒的RT-PCR反应液混合，进行实时荧光定量RT-PCR，检测荧光信号；
(3)结果判断：①在阳性对照品的扩增曲线Ct值(threshold cycle)在25～28之间，阴性对照品的扩增曲线Ct值≥39的情况下，进行后续判断，否则应进行问题查找；②待检样品的扩增曲线Ct值≤37为阳性；③待检样品的扩增曲线Ct值≥39为阴性；④待检样品的扩增曲线37＜Ct值＜39，为灰色区域，需对样品重新进行核酸提取和RT-PCR检测。
上述步骤(2)中，优选的，每个PCR反应体系的总体积为20μL，其中包括15μLRT-PCR反应液和5μL模板；PCR反应条件通常设置为：42℃5分钟逆转录，95℃3分钟预变性，95℃5秒→60℃35秒，FAM通道用于收集检测荧光信号，共40个循环。
本发明的有益效果是：
本发明针对寨卡病毒最保守的3’-UTR区域，特异性设计了引物对和Taqman探针序列，分别与目的基因的3个区域结合，具有很高的特异性，能准确地将不同类型的寨卡病毒检测出来。同时，本发明的试剂盒使用快捷，能在较短的时间内(1h)检测出寨卡病毒，灵敏度高，能检测到低至5个拷贝的寨卡病毒，特异性好，与临床上类似病毒均没有非特异性反应，而且使用方便，只需将提取的模板样本加入反应管中，人工操作时间少于5min。本发明的试剂盒适合临床使用和推广，对我国的寨卡病毒防控工作具有重要的意义。
附图说明
图1为实施例4特异性实验的荧光检测结果，各检测曲线对应的模板是：1—登革热病毒RNA，2—甲型流感病毒RNA，3—乙型流感病毒RNA，4—乙型脑炎病毒RNA，5—丙型肝炎病毒RNA，6—人巨细胞病毒RNA，7—麻疹病毒RNA，8—阳性对照品。
图2为实施例5灵敏度实验的荧光检测结果，各检测曲线对应的模板是：1～7为含有寨卡病毒3’-UTR区域特异性靶标RNA片段的假病毒溶液，浓度依次为1.0×100、1.0×101、1.0×102、1.0×103、1.0×104、1.0×105、1.0×106拷贝/μL。
图3为实施例5灵敏度实验的10倍梯度稀释标准曲线图。
图4为实施例6重复性试验的阳性对照品的荧光检测结果。
图5为实施例6重复性试验的阴性对照品的荧光检测结果。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明实施例中的技术方案，并使本发明实施例的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明实施例中的技术方案作进一步详细的说明，但并不局限于此。
实施例1：用于快速检测寨卡病毒的引物探针对的设计
下载NCBI中寨卡病毒基因序列，利用Vector NTI软件进行序列比对，选择最保守的3’-UTR区域，设计引物对和探针，序列如下：
引物1：5’-ATAGTCAGGCCGAKAACGCCAT-3’(其中K代表G或T)(SEQ ID No.3)；
引物2：5’-CCATCCTGCGCYTCCAAGC-3’(其中Y代表T或C)(SEQ ID No.4)；
荧光探针：5’-FAM-CCATGCTGCCTGTGAGCCCCTC-BHQ-1-3’(SEQ ID No.2)。
实施例2：用于快速检测寨卡病毒的实时荧光定量RT-PCR试剂盒的建立
用于快速检测寨卡病毒的实时荧光定量RT-PCR试剂盒，包括RT-PCR反应液、阳性对照品、阴性对照品、说明书和盒体。
其中RT-PCR反应液含有2×One Step RT-PCR BufferⅢ、TaKaRa Ex Taq HS(5U/μL)、PrimeScript RT Enzyme MixⅡ、引物1、引物2和荧光探针。
所述2×One Step RT-PCR BufferⅢ、TaKaRa Ex Taq HS(5U/μL)、PrimeScriptRT Enzyme MixⅡ由来自Takara公司的货号为RR064A的OneStepPrimeScriptTMRT-PCRKit试剂盒提供。
所述引物1、引物2各自浓度为5μM；
所述荧光探针浓度为2μM。
所述阳性对照品为含有寨卡病毒3’-UTR区域特异性靶标RNA片段的假病毒溶液。所述寨卡病毒3’-UTR区域特异性靶标序列为：
TGCAGCCTGTAACCCCCCCAGGAGAAGCTGGGAAACCAAGCTCATAGTCAGGCCGAGAACGCCATGGCACGGAAGAAGCCATGCTGCCTGTGAGCCCCTCAGAGGACACTGAGTCAAAAAACCCCACGCGCTTGGAAGCGCAGGATGGGAAAAGAAGGTGGCGACCTTCCCCACCCTT(SEQ ID No.1)。浓度为1000拷贝/μL，对应的Ct值在25左右。
所述阴性对照品为DEPC水。
实施例3：寨卡病毒的快速检测方法
利用实施例2的试剂盒快速检测寨卡病毒，具体步骤如下：
(1)提取待检样品RNA：利用市面上病毒RNA提取试剂盒提取样本中的病毒RNA；
(2)实时荧光定量RT-PCR：利用上述检测寨卡病毒的实时荧光定量RT-PCR试剂盒进行PCR扩增，每个模板(提取的待检样品、阳性对照和阴性对照)分别加入RT-PCR反应液，每个PCR反应体系的总体积为20μL，其中包括15μLRT-PCR反应液和5μL模板。RT-PCR反应条件：42℃5分钟逆转录，95℃3分钟预变性，95℃5秒→60℃35秒，FAM通道用于收集检测荧光信号，共40个循环。设置完成后，保存文件，运行程序。
(3)结果判断：阳性对照品Ct值(threshold cycle)在25～28之间，阴性对照Ct≥39，进行后续判断，否则应进行问题查找；②待检样品的扩增曲线Ct值≤37为阳性；③待检样品的扩增曲线Ct值≥39为阴性；④待检样品的扩增曲线37＜Ct值＜39，为灰色区域，需对样品重新进行核酸提取和RT-PCR检测。
实施例4：特异性实验
利用实施例3的方法分别对登革热病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒RNA、乙型脑炎病毒RNA、丙型肝炎病毒RNA、人巨细胞病毒RNA、麻疹病毒RNA、阳性对照品进行RT-PCR检测，结果见图1，结果表明，仅含寨卡病毒3’-UTR区域特异性靶标RNA片段的假病毒溶液，即阳性对照品为阳性，其余管均为阴性。结果表明，本发明的检测试剂盒特异性高，能准确地、特异地将寨卡病毒检测出来。
实施例5：灵敏度实验
取阳性对照品(即构建好的含有寨卡病毒3’-UTR区域特异性靶标RNA片段的假病毒溶液)，测定其浓度并计算拷贝数，按照10倍的浓度梯度稀释，选取1.0×100～1.0×106拷贝/μL的浓度作为样品，用本发明的试剂盒和检测方法。
检测结果如图2和图3所示，结果表明，本试剂盒对寨卡病毒的最低检出限浓度为1.0×100拷贝/μL，即最低检出限为5拷贝；10倍梯度稀释的标准曲线，斜率为3.502，相关系数R2为0.999。
实施例6：重复性试验
取试剂盒中的阳性对照品和阴性对照品，用本发明的试剂盒和检测方法，连续重复10次试验，检测结果见图4和图5所示，结果显示阳性对照品Ct值变异系数均小于5％，阴性对照品均无扩增。
以上实施例表明，本发明的试剂盒具有准确性好、灵敏度高、重复性强、使用方便的特点，适合临床使用。
以上实施例仅为介绍本发明的优选案例，对于本领域技术人员来说，在不背离本发明精神的范围内所进行的任何显而易见的变化和改进，都应被视为本发明的一部分。

Claims (11)

1.一种用于检测寨卡病毒的核酸探针，其靶标序列位于寨卡病毒的3’-UTR区域中，具体针对序列表中SEQ ID No.1所示特异性靶标序列中的任意一段序列。
2.如权利要求1所述的核酸探针，其特征在于，所述核酸探针序列如下：
5’-CCATGCTGCCTGTGAGCCCCTC-3’。
3.一种用于检测寨卡病毒的引物对，该引物对能够用于扩增包含权利要求1或2所述核酸探针序列的寨卡病毒3’-UTR区域特异性靶标序列。
4.如权利要求3所述的引物对，其特征在于，所述引物对的序列如下：
引物1：5’-ATAGTCAGGCCGAKAACGCCAT-3’，其中K代表G或T；
引物2：5’-CCATCCTGCGCYTCCAAGC-3’，其中Y代表T或C。
5.一种用于快速检测寨卡病毒的实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，包括实时荧光定量RT-PCR反应液，所述RT-PCR反应液中含有Taqman荧光探针和引物对，其中：所述Taqman荧光探针的靶标序列位于寨卡病毒的3’-UTR区域中，具体针对序列表中SEQ ID No.1所示特异性靶标序列中的任意一段序列；所述引物对用于扩增包含该荧光探针序列的寨卡病毒3’-UTR区域特异性靶标序列。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述Taqman荧光探针和引物对的序列分别如下所示：
Taqman荧光探针：5’-FAM-CCATGCTGCCTGTGAGCCCCTC-BHQ-1-3’；
引物1：5’-ATAGTCAGGCCGAKAACGCCAT-3’，其中K代表G或T；
引物2：5’-CCATCCTGCGCYTCCAAGC-3’，其中Y代表T或C。
7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR反应液为一步法实时荧光定量PCR的RT-PCR反应液，含有2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ、TaKaRa Ex Taq HS和PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ。
8.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述RT-PCR反应液中引物的浓度为1～10μM，Taqman荧光探针的浓度为1～5μM。
9.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照品和/或阴性对照品，所述阳性对照品为含有寨卡病毒3’-UTR区域特异性靶标RNA片段的假病毒溶液，所述阴性对照品为DEPC水。
10.利用权利要求5～9任意一项所述试剂盒快速检测寨卡病毒的方法，每次检测均应设立阳性对照和阴性对照，具体包括如下步骤：
1)提取待检样品RNA；
2)分别以提取的待检样品RNA、阳性对照品和阴性对照品为模板，利用所述试剂盒进行实时荧光定量RT-PCR，检测荧光信号；
3)结果判断：①在阳性对照品的扩增曲线Ct值在25～28之间和阴性对照品的扩增曲线Ct值≥39的情况下，进行后续判断，否则进行问题查找；②待检样品的扩增曲线Ct值≤37为阳性；③待检样品的扩增曲线Ct值≥39为阴性；④待检样品的扩增曲线37＜Ct值＜39，为灰色区域，需对样品重新进行核酸提取和RT-PCR检测。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤2)的反应条件设置为：42℃5分钟逆转录，95℃3分钟预变性，95℃5秒→60℃35秒，FAM通道用于收集检测荧光信号，共40个循环。
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