CN117965726A - 一种靶向pml-rarg融合基因的多核苷酸及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种靶向PML‑RARG融合基因的多核苷酸及其应用，该PML‑RARG融合基因由PML基因6号外显子以及RARG基因4号外显子融合而成；该多核苷酸包含配置为与所述PML‑RARG融合基因断裂连接点附近的基因组DNA杂交的第一序列，第一序列为GGAGGCAGCGGTGGAGA。本发明提供了靶向PML‑RARG融合基因新亚型的多核苷酸，根据该多核苷酸可开发新的急性早幼粒细胞白血病检测组合物以及基因编辑工具，为该亚型的急性早幼粒细胞白血病发病机制研究以及药物研发提供更多的支持。

Description

一种靶向PML-RARG融合基因的多核苷酸及其应用

技术领域

本发明涉及血液疾病和基因检测领域，更具体地，本发明提供一种靶向PML-RARG融合基因的多核苷酸及其应用。

背景技术

急性早幼粒细胞白血病(APL)是一种特殊类型的急性髓系白血病，其特点是白血病细胞中存在特定的染色体易位。在APL中最常见的遗传标志是PML-RARA融合基因，由15号染色体上的PML基因和17号染色体上的RARA基因融合所致。然而，除了PML-RARA融合外，还存在其他罕见的融合变体，如PML-RARG融合基因，目前已经报道的PML-RARG融合基因由15号染色体上的PML基因和17号染色体上的RARG基因融合所致，PML基因的断裂连接点在3号外显子旁边的内含子区域，RARG基因的断裂连接点在1号或2号外显子旁边的内含子区域。

现有文献报道，98％以上的APL具有经典的PML-RARA融合基因，伴有PML-RARA融合基因的APL患者通过常规的维甲酸联合砷剂的靶向治疗得到了较高的缓解率和治愈率，而其它变异型的APL，包括PML-RARG对维甲酸联合砷剂可能耐药。因此，这些罕见变体的检测对于白血病的精确诊断和治疗选择至关重要。

发明内容

申请人发现，PML-RARG融合基因除已报道的融合变体外，还存在其他亚型：如图1所示，本发明发现的PML-RARG融合基因亚型的断裂连接点位于PML基因6号外显子右侧的内含子区域以及RARG基因4号外显子左侧的内含子区域；而含有该亚型PML-RARG融合基因无法采用已报道的PML-RARG融合基因的探针进行检测，导致患者跟踪治疗困难，且缺乏靶向药物和基因编辑工具。基于以上技术问题，本发明提供一种靶向PML-RARG融合基因的多核苷酸及其应用。

本发明提供的技术方案具体如下：

第一方面，本发明提供一种靶向PML-RARG融合基因的多核苷酸，所述PML-RARG融合基因由PML基因6号外显子以及RARG基因4号外显子融合而成；所述多核苷酸包含配置为与所述PML-RARG融合基因断裂连接点附近的基因组DNA杂交的第一序列，所述第一序列为GGAGGCAGCGGTGGAGA(SEQ ID NO:1)。

第二方面，本发明提供上述靶向PML-RARG融合基因的多核苷酸在制备检测PML-RARG融合基因的组合物中的用途。

第三方面，本发明提供一种用于检测上述PML-RARG融合基因的组合物，包含上述靶向PML-RARG融合基因的多核苷酸作为探针。

在本发明提供的一些实施方式中，所述组合物还包括用于扩增PML-RARG融合基因的引物对：

正向引物为：GAGCCCCGTCATAGGAAGTG(SEQ ID NO:2)；

反向引物为：GCAGCCTTCACAAGAGCTGAC(SEQ ID NO:3)。

在本发明提供的一些实施方式中，所述多核苷酸两端分别连接荧光报告基团和荧光淬灭基团。

在本发明提供的一些优选的实施方式中，荧光报告基团为5'-FAM(FITC)、dT-FAM(FITC)、3'-FAM(FITC)、5'-TET、3'-TET、5'-JOE、5'-HEX、dT-HEX、3'-HEX、5'-VIC、5'-TAMRA、dT-TAMRA、3'-TAMRA、3'-Cy3、5'-Cy3、5'-Quasar 570、3'-Quasar 570、5'-ROX、dT-ROX、3'-ROX、5'-Cy5、3'-Cy5、5'-Quasar 670、dT-Quasar 670、3'-Quasar 670、5'-SIMA、5'、3'Cy5.5中的一种；荧光淬灭基团为3'-Dabcyl、dT-Dabcyl、5'-Dabcyl、5'BHQ1、dT-BHQ1、3'-BHQ-1、5'-BHQ2、dT-BHQ2、3'-BHQ-2、3'-BHQ3、3'eclipse、3'-MGB中的一种。

在本发明提供的一些更优选的实施方式中，所述多核苷酸两端分别连接FAM和MGBNFQ。

在本发明提供的一些实施方式中，所述组合物还包括内参基因及其正反向引物。

在本发明提供的一些优选的实施方式中，所述内参基因为ABL基因；

ABL基因的正向引物为：

GTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT(SEQ ID NO:4)；

ABL基因的反向引物为：

TGATGTAGTTGCTTGGGACCCA(SEQ ID NO:5)。

第四方面，本发明提供一种试剂盒，包含上述用于检测PML-RARG融合基因的组合物。

在本发明提供的一些实施方式中，所述试剂盒还包含用于ddPCR检测的试剂。

在本发明提供的一些实施方式中，所述用于ddPCR检测的试剂包括dNTP混合物、热启动Taq酶、RNA酶抑制剂、逆转录引物、逆转录酶中的至少一种。

第五方面，本发明提供PML-RARG融合基因在制备编辑PML-RARG融合基因的基因编辑工具中的用途，所述PML-RARG融合基因由PML基因6号外显子以及RARG基因4号外显子融合而成。

在本发明提供的一些实施方式中，所述基因编辑工具为CRISPR/CAS系统。

第六方面，本发明提供PML-RARG融合基因在制备用于治疗急性早幼粒细胞白血病的药物中的用途，所述PML-RARG融合基因由PML基因6号外显子以及RARG基因4号外显子融合而成；所述PML-RARG融合基因包含

AACAGCAACCACGTGGCCAGTGGCGCCGGGGAGGCAGCGG TGGAGACACAGAGCACCAGCTCAGAGGAGATGGT(SEQ ID NO:10)。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明发现了新的PML-RARG融合基因亚型，据此设计出能靶向PML-RARG融合基因的多核苷酸，利用该多核苷酸开发出急性早幼粒细胞白血病的疾病诊断试剂，以便于对急性早幼粒细胞白血病患者进行精准治疗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1：PML-RARG基因融合的简单示意图；其中，染色体易位结构图显示15号染色体断裂连接点位于15q24.1的PML区域，12号染色体断裂连接点位于12q13.13的RARG基因区域；RNA测序分析揭示了PML外显子6和RARG外显子4之间的全新融合。

图2：骨髓cDNA的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)证实了PML-RARG融合转录物。显示了断裂连接点周围的部分核苷酸序列；使用骨髓cDNA进行PML-RARG的RT-PCR扩增217bp的条带，显示了基因组断点周围的部分核苷酸序列。ABL内参RT-PCR扩增为126bp的条带。

图3：本发明检测PML-RARG融合基因样本RNA模板的ddPCR结果示意图；阳性的微滴簇在“ch1+ch2-”区间内。

图4：本发明检测PML-RARG融合基因ddPCR试剂盒中阴性对照结果示意图，阴性对照的微滴簇在“ch1-ch2-”区间内。

图5：本发明检测PML-RARG融合基因ddPCR试剂盒中阳性对照结果示意图，阳性对照的微滴簇分别位于四个区间内。

图6：SEQ ID NO:7上断裂连接点的位置以及各区段的来源。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

定义

除非另外解释，本文中使用的所有技术和科学术语与本公开内容所属领域中普通技术人员的理解具有相同的意义。分子生物学中常见术语的定义可见于常见的《分子生物学》教材。

除非上下文另外清楚地指示，单数术语“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物。类似地，除非上下文另外清楚地指示，文字“或”意图包括“和”。术语“多个/多种”与短语“超过一个/种”同义使用，即为两个/种或更多个/种。还应理解，对于核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小，以及所有的分子量或分子质量值均为近似值，并且提供用于描述。术语“包含”意为“包括”。尽管在实施或测试本公开内容中可以使用与本文中描述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料，但在下文中描述了合适的方法和材料。

“结合”指两种物质或分子之间的联合，如一个核酸分子(例如结合区)与另一个(或其自身)(例如靶核酸分子)的杂交。如果充足量的核酸分子与其靶核酸分子形成碱基对或与其杂交以允许检测所述结合，那么该核酸分子结合或稳定结合靶核酸分子；如果两个核酸分子共有充足数目的互补核酸，从而在链彼此结合(杂交)时(例如通过形成Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen碱基对)形成稳定的双链体或三链体，那么核酸分子与另一核酸分子是“互补”的。当在需要的条件下核酸分子保持与靶核酸序列(例如基因组靶核酸序列)可检测结合时，发生稳定的结合。互补性是一个核酸分子(例如靶核酸探针)中的碱基与第二核酸分子(例如基因组靶核酸序列)中的碱基碱基配对的程度。互补性由百分数方便地描述，该百分数即在两种分子之间或在两种分子的特定区或域内形成碱基对的核苷酸的比例。在本发明中，“充分的互补性”意指在一个核酸分子或其区域与靶核酸序列(例如基因组靶核酸序列)之间存在充足数目的碱基对以实现可检测的结合。

核酸“区段”是靶核酸分子的子部分或子序列。核酸区段可以以多种方式自靶核酸分子假定地或实际地衍生。例如，靶核酸分子(如基因组靶核酸分子)的区段可通过用一种或多种限制酶消化以生成作为限制性片段的核酸区段获得。核酸区段也可以通过扩增从靶核酸分子生成、通过杂交(例如扣除杂交)、通过人工合成、或任何其它生成在序列中对应于靶核酸分子的一种或多种核酸的规程生成。核酸区段的一个具体的例子是结合区。

“探针”或“核酸探针”是能够与靶核酸分子(例如基因组靶核酸分子)杂交，且在与靶物杂交时能被直接或间接检测出来的核酸分子或核酸分子集。如此，探针允许检测且在一些实施例中量化靶核酸分子。在具体的实施例中，探针包括多个核酸分子，该核酸分子包含自靶核酸分子衍生的且如此能够与靶核酸分子的至少一部分特异性杂交的结合区。探针可以称为“经标记的核酸探针”，其指示探针直接或间接与使探针可检测的可检测模块或“标记物”偶联。

“核酸”是单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，涵盖以与天然存在的核苷酸类似的方式与核酸杂交的天然核苷酸的类似物。术语“核苷酸”包括但不限于包含与糖(如核糖、脱氧核糖或其合成类似物)连接的碱基(如嘧啶、嘌呤或其合成类似物)或与氨基酸连接的碱基(如在肽核酸(PNA)中)的单体。核苷酸是多核苷酸中的一个单体。核苷酸序列指多核苷酸中的碱基序列。

“样品”是从受试者获得的含有基因组DNA、RNA(包括mRNA)、蛋白质及其组合的生物学标本。例子包括但不限于染色体制备物、外周血、尿液、唾液、组织活组织检查、手术标本、骨髓、羊膜穿刺样品和尸检材料。在一个例子中，样品包括基因组DNA或RNA。在一些例子中，样品是细胞遗传制备物，例如其可置于显微镜载玻片上。在具体的例子中，直接使用样品，或在使用前通过例如通过固定(例如使用福尔马林)操作样品。

“靶核酸序列或分子”是核酸分子例如基因组(如含有感兴趣基因的哺乳动物基因组DNA的基因或区域)或RNA序列的限定区域或特定序列。在靶核酸序列是靶基因组序列的一个例子中，这类靶物可通过其在染色体(例如在正常细胞中)上的位置限定，例如依照细胞遗传命名通过参照在染色体上的具体位置；通过参照其在遗传图谱上的位置；通过参照假定或装配的重叠群；通过其特定序列或功能；通过其基因或蛋白质名称，或通过任何其它独特将其从基因组的其它遗传序列中鉴定出来的手段。在一些例子中，所述靶核酸序列式哺乳动物或病毒基因组序列。在其它例子中，所述靶核酸序列是RNA序列。

在一些例子中，靶核酸序列(例如基因组核酸序列)的变化与疾病或状况“有关”也就是说，靶核酸序列的检测可用于推断就疾病或状况而言的样品状态。例如，靶核酸序列可以以两种(或更多种)可区分形式存在，从而第一种形式与疾病或状况的缺失关联，而第二种(或不同)形式与该疾病或状况的存在关联。两种不同形式可以是定性可区分的(如通过多核苷酸多态性实现)，和/或两种不同形式可以是定量可区分的(如通过存在于细胞中的靶核酸序列的拷贝数实现)。

发明详述

本发明对急性早幼粒细胞白血病病人的样品进行通过转录组测序，发现了罕见的融合变体—PML-RARG融合基因，与已报道的PML-RARG融合基因进行对比发现，已报道的PML-RARG融合基因中PML基因的断裂点在3号内含子区域，RARG基因的断裂点在1号或2号内含子区域，而本发明发现的PML-RARG融合基因中，PML基因的断裂点在6号内含子区域，RARG基因的断裂点在4号内含子区域左侧。具体的，本发明发现的PML-RARG融合基因包含序列：GGAGCCCCGTCATAGGAAGTGAGGTCTTCCTGCCCAACAGCAAC CACGTGGCCAGTGGCGCCGGGGAGGCAG|CGGTGGAGACACAGA GCACCAGCTCAGAGGAGATGGTGCCCAGCTCGCCCTCGCCCCCT CCGCCTCCTCGG(SEQID NO:7)。

如图6所示，SEQ ID NO:7内|为断裂连接点；下方有下划线的区段来源于PML基因6号外显子；下方有波浪线的区段来源于RARG基因4号外显子；下方有着重号的区段来源于RARG基因4号外显子；加粗的区段来源于PML基因5号外显子。

本发明提供一种靶向PML-RARG融合基因的多核苷酸，包含配置为与断裂连接点附近的基因组DNA杂交的第一序列，所述第一序列为GGAGGCAGCGGTGGAGA(SEQ ID NO:1)；所述PML-RARG融合基因由PML基因6号外显子以及RARG基因4号外显子融合而成。

本发明还提供上述靶向PML-RARG融合基因的多核苷酸在制备检测PML-RARG融合基因的组合物中的用途。

在例示性实施方案中，本发明提供一种用于检测上述PML-RARG融合基因的组合物，包含上述靶向PML-RARG融合基因的多核苷酸作为探针。该组合物以PML-RARG融合基因的断裂连接点附近的基因组DNA为靶核酸序列，可以准确检测到PML-RARG融合基因的存在，从而进行针对性治疗或早期干预。

在例示性实施方案中，所述组合物还包括用于扩增PML-RARG融合基因的引物对：

正向引物为：GAGCCCCGTCATAGGAAGTG(SEQ ID NO:2)；

反向引物为：GCAGCCTTCACAAGAGCTGAC(SEQ ID NO:3)。

在例示性实施方案中，所述多核苷酸两端分别连接荧光报告基团和荧光淬灭基团。在一些实施方案中，荧光报告基团为5'-FAM(FITC)、dT-FAM(FITC)、3'-FAM(FITC)、5'-TET、3'-TET、5'-JOE、5'-HEX、dT-HEX、3'-HEX、5'-VIC、5'-TAMRA、dT-TAMRA、3'-TAMRA、3'-Cy3、5'-Cy3、5'-Quasar 570、3'-Quasar 570、5'-ROX、dT-ROX、3'-ROX、5'-Cy5、3'-Cy5、5'-Quasar 670、dT-Quasar 670、3'-Quasar 670、5'-SIMA、5'、3'Cy5.5中的一种；荧光淬灭基团为3'-Dabcyl、dT-Dabcyl、5'-Dabcyl、5'BHQ1、dT-BHQ1、3'-BHQ-1、5'-BHQ2、dT-BHQ2、3'-BHQ-2、3'-BHQ3、3'eclipse、3'-MGB中的一种。

在一些优选的实施方案中，所述多核苷酸两端分别连接FAM和MGBNFQ。

在一些实施方案中，所述组合物还包括内参基因及其正反向引物。在一些优选的实施方案中，所述内参基因为ABL基因；

ABL基因的正向引物为：

GTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT(SEQ ID NO:4)；

ABL基因的反向引物为：

TGATGTAGTTGCTTGGGACCCA(SEQ ID NO:5)。

本发明还提供一种试剂盒，包含上述用于检测PML-RARG融合基因的组合物。该试剂盒可用于荧光原位杂交(FISH)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、数字PCR(ddPCR)等检测技术。

传统的融合基因检测方法，如荧光原位杂交(FISH)和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)，虽然在临床实践中广泛应用，但存在灵敏度和特异性的限制。这些方法对于低丰度或者非典型融合基因的检测效果不佳，而这正是PML-RARG融合基因检测面临的挑战。数字PCR(ddPCR)技术是一种新兴的分子生物学技术，能够提供更高的灵敏度和准确性。与传统的定量PCR(qPCR)不同，ddPCR通过分割样本到数千至数万的微反应单元中，实现对单分子的定量。这种技术在检测低丰度目标、复杂基因重排以及细微的基因表达差异方面显示出显著优势。在一些实施方案中，本发明提供的试剂盒用于数字PCR检测，该试剂盒还包含用于ddPCR检测的试剂，用于ddPCR检测的试剂包括四种dNTP的混合物、热启动Taq酶、RNA酶抑制剂、逆转录引物、逆转录酶中的至少一种。

PML-RARG融合基因导致的急性早幼粒细胞白血病目前并无有效的治疗手段，本领域技术人员可用基因编辑技术构建PML-RARG融合基因以及与其相关的生物体，用于研究与PML-RARG融合基因相关的急性早幼粒细胞白血病发病机制。基于此，本发明提供上述PML-RARG融合基因在制备编辑PML-RARG融合基因的基因编辑工具中的用途。

在一些实施方案中，所述基因编辑工具为CRISPR/CAS系统，所述CRISPR/CAS系统包含第一gRNA和第一CAS蛋白、第二gRNA和第二CAS蛋白；第一gRNA靶向PML基因6号内含子区域，第一CAS蛋白切断断裂连接点；第二gRNA靶向RARG基因4号内含子区域，第二CAS蛋白切断断裂连接点。

目前缺乏PML-RARG融合基因导致的急性早幼粒细胞白血病的药物，本领域技术人员可根据本发明发现的PML-RARG融合基因进行分子扩增、蛋白转录、模型动物构建等进行药物开发。基于此，本发明提供PML-RARG融合基因在制备用于治疗急性早幼粒细胞白血病的药物中的用途。

以下通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细描述：

实施例1

1探针设计:

为了确保PML-RARG融合基因的高度特异性检测，本发明以PML-RARG融合基因断裂连接点附近的基因组DNA为靶核酸序列(如图6所示)设计出与靶核酸序列互补结合的第一序列(SEQ ID NO:1)，并在第一序列两端分别连接荧光报告基团和荧光淬灭基团，形成探针，用于在ddPCR过程中能够实时监测扩增反应。

探针的多核苷酸(即第一序列)的长度要遵循探针设计的原则：长度最好在18-27bp之间，且Tm值在68-72℃之间，优选为70℃，确保探针的Tm值要比引物的Tm值高出10℃，以保证探针在退火时探针先于引物与靶核酸序列结合。因此，探针最好是富含GC的保守片段，保证其Tm值较高。

具体的，第一序列包含17个碱基：GGAGGCAG|CGGTGGAGA(SEQ ID NO:1)，两端分别连接FAM和MGBNFQ，|为断裂连接点的位置。

本发明还设计了内参ABL基因探针，其核苷酸序列为包含20个碱基的核苷酸序列：CATTTTTGGTTTGGGCTTCA(SEQ ID NO:6)，其两端分别连接VIC和MGBNFQ。

2引物设计:

引物的碱基数目不能超过150个碱基，同时要满足引物设计原则。

2.1设计正向引物

针对PML基因断裂点的正向引物设计将以6号外显子区域的序列为目标，序列大约为GGAGCCCCGTCATAGGAAGTGAGGTCTTCCTGCCCAACAGCAAC CACGTGGCCAGTGGCGCCGGGGAGGCAG-(SEQ ID NO:8，-为断裂点)为模板序列设计正向引物，正向引物的靶核酸序列离断裂连接点不超过100碱基。

正向引物的序列为：GAGCCCCGTCATAGGAAGTG(SEQ ID NO:2)(PML exon6F)。

2.2设计反向引物

针对RARG基因断裂点的反向引物设计以4号外显子的序列为目标，序列大约为-CGGTGGAGACACAGAGCACCAGCTCAGAGGAGATGGTGCCCAG CTCGCCCTCGCCCCCTCCGCCTCCTCGG(SEQID NO:9，-为断裂点)。

反向引物的序列为：GCAGCCTTCACAAGAGCTGAC(SEQ ID NO:3)(RARG exon4R)。

2.3设计内参基因ABL的正反向引物：

ABL F：GTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGT(SEQ ID NO:4)；

ABL R：TGATGTAGTTGCTTGGGACCCA(SEQ ID NO:5)。

3试剂盒设计

试剂盒包含上述引物和探针，以及用于ddPCR检测的RT反应液，RT反应液包含dNTP混合物、热启动Taq酶、RNA酶抑制剂、逆转录引物和逆转录酶等。

实施例2

以下实施例描述了利用数字PCR技术检测PML-RARG融合基因的方法。

1样本处理

自行进行核酸提取(浓度保持在75～125ng/μL)后，从3.1设计的试剂盒中取出相应的RT反应液，室温融化并混匀后，2000rpm离心10s，均按如下配制每个测试的PCR预混液：2.5μL RT-MIX+1μL RT-酶+1.5μL RT-引物，将上述配制好的逆转录预混液分别按每管5μL的量，分装于各管内。分别取5μL模板量加入各个管内进行逆转录。提取完的核酸建议立即进行试验，否则请于-20℃以下保存。逆转录的程序为：55℃，15min；4℃，forever。

2扩增试剂准备

PCR预混液配制：从试剂盒中取出相应的反应液，室温融化并混匀后，2000rpm离心10s，均按如下配制每个测试的PCR预混液：5μLddPCR-PML-RARG反应液+10μL ddPCR MIX3，将上述配制好的PCR预混液，分别按每管15μL的量，分装于各PCR管内。

加样：分别取模板5μL，加至装有上述PCR预混液的PCR管中。每个反应体系的总体积为20μL。盖紧PCR管盖，2000rpm离心10s后震荡混匀再离心10s后，进行微滴制备。

注意：打开装有cDNA的管子前，需先将其振荡混匀并短暂离心，小心打开管盖，特别是使用排管时请谨慎操作，避免开盖力度过大导致液体溅入其他管内。

3制备微滴

将8个20μL反应体系加入到微滴发生卡中间一排的8个孔内。注意：必须先在微滴发生卡(DG8 cartridge)中间一排加样品(若样品不足8个时，空孔请加入20μLBX ddPCRBuffer Control(购于美国伯乐)。加样本时，避免产生气泡。

在微滴发生卡最底一排8个孔中各加入70μL微滴生成油，盖上胶垫(gasket)，将微滴发生卡轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴，注意仪器上指示灯状态，一般2分钟之内完成。

微滴生成于微滴发生卡最上面一排孔内，将生成的微滴(大约为35～45μL)转移到96孔板中。注意：吸取微滴(枪头不要靠壁)及释放微滴时需缓慢，防止微滴破裂。注意盖上PCR板热封膜以防油挥发，每次弃去已使用过的微滴发生卡和胶垫。

4封膜

微滴转入96孔板内后，用预热好的PX1热封仪对其进行封膜，推荐的运行程序为：180℃，5s，无需颠倒方向二次封膜；封好膜之后应该在30分钟内进行PCR反应，或者放于4℃冰箱4小时之内进行PCR。

5PCR扩增

PCR扩增程序：95℃，10min；(94℃，15s；58℃，60s)40个循环；98℃，10min；4℃，5min，反应体系设为40μL，注意升降温速度≤2℃/s。

6微滴读取

先打开电脑，再打开Droplet Reader电源，在使用前需预热至少30分钟；

将之前完成PCR的96孔板放入plate holder，平稳放入微滴读取仪中；

打开QuantaSoft软件，对96孔板中样品信息进行设置，完成后即可运行。

注意：预混液设置选择“ddPCR Supermix forprobes”；染料设置选择“FAM/VIC”。

7结果分析

7.1检测完成后，点击“2D Amplitude”查看通道1和通道2聚类图。此图允许手工或自动调节阈值用以对每个检测通道进行阳性和阴性微滴指定。

7.2点击“Auto Analyze”重设阈值

手工指定阈值：—使用阈值十字线指定整个点图的分类区域(仅在热图模式下可选)；—使用椭圆，矩形或套索阈值调节工具来分类点图区域：点击相应工具按钮，然后在“Working cluster selector”点击区域类型，使用工具选择相应区域。荧光阈值线的设置参照阴性对照和阳性对照：在2D Amplitude中，荧光阈值线的位置应该使阴性对照的微滴簇在“ch1-ch2-”区间内，阳性对照的4种微滴簇分别位于四个区间内。

8结果判定

融合基因比例计算公式：Ch1/(Ch1+Ch2)。

若且落在“ch1+ch2-”区的点≥3个，判定为阳性，且融合基因与内参基因的比例按上述公式计算。

若不符合上述阳性判定条件且总微滴数≥8000个时：总拷贝数<50需增加取样量重新抽提后进行检测，以免由于核酸加入量不够而产生漏检；总拷贝数≥50而且落在“ch1+ch2-”区的点和“ch1+ch2+”区的点之和为2个点，做3个复孔重新进行检测，若其中有2个或2个以上孔符合阳性判定则判为阳性，按融合基因比例的公式进行计算，反之，低于检测极限；总拷贝数≥50而/>，或“ch1+ch2-”区的点和“ch1+ch2+”区的点之和≤1则低于检测极限。

若不符合阳性判定条件且总微滴数<8000个，则该反应孔的微滴生成不理想，重新进行微滴生成，再按上述进行结果判断。

9质控和验证

9.1试剂盒将包括阳性和阴性对照，用于验证每次实验的准确性：

阳性对照有效性判定： 且落在“ch1+ch2-”区的点和“ch1+ch2+”区的点之和≥3个。

阴性对照有效性判定：“ch1+ch2-”区的点和“ch1+ch2+”区的点之和≤1个。

9.2进行额外的验证实验以确保引物和探针的特异性和灵敏度满足临床诊断标准，能从骨髓液、外周血液等样本提取的核酸中检测PML-RARG融合基因，不能检测出其他融合基因。

依照前述实施例，本发明提供了一种靶向PML-RARG融合基因的多核苷酸及其应用，具体的，提供了一种用于检测急性早幼粒细胞白血病中罕见PML-RARG融合基因的相关引物和探针的组合物，以及基于上述组合物的数字PCR试剂盒，在现代医学诊断、分子生物学研究以及个体化医疗中具有重要的应用价值；除了临床诊断外，该试剂盒还可用于研究PML和RARG基因融合在APL发病机制中的作用，为急性早幼粒细胞白血病的治疗提供更深入的理解。

以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种靶向PML-RARG融合基因的多核苷酸，其特征在于：所述PML-RARG融合基因由PML基因6号外显子以及RARG基因4号外显子融合而成；所述多核苷酸包含配置为与所述PML-RARG融合基因断裂连接点附近的基因组DNA杂交的第一序列，所述第一序列为GGAGGCAGCGGTGGAGA。

2.权利要求1所述的靶向PML-RARG融合基因的多核苷酸在制备检测PML-RARG融合基因的组合物中的用途。

3.一种用于检测PML-RARG融合基因的组合物，其特征在于：包含权利要求1所述的靶向PML-RARG融合基因的多核苷酸作为探针。

4.根据权利要求3所述的用于检测PML-RARG融合基因的组合物，其特征在于：所述组合物还包括用于扩增PML-RARG融合基因的引物对：

正向引物为：GAGCCCCGTCATAGGAAGTG；

反向引物为：GCAGCCTTCACAAGAGCTGAC。

5.根据权利要求3所述的用于检测PML-RARG融合基因的组合物，其特征在于：所述多核苷酸两端分别连接荧光报告基团和荧光淬灭基团。

6.根据权利要求3所述的用于检测PML-RARG融合基因的组合物，其特征在于：所述组合物还包括内参基因及其正反向引物。

7.一种试剂盒，其特征在于：包含权利要求3～6任一项所述的用于检测PML-RARG融合基因的组合物。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含用于ddPCR检测的试剂。

9.PML-RARG融合基因在制备编辑PML-RARG融合基因的基因编辑工具中的用途，其特征在于：所述PML-RARG融合基因由PML基因6号外显子以及RARG基因4号外显子融合而成。

10.PML-RARG融合基因在制备用于治疗急性早幼粒细胞白血病的药物中的用途，其特征在于：所述PML-RARG融合基因由PML基因6号外显子以及RARG基因4号外显子融合而成。