WO2004044243A1 - 核酸の増幅方法及びその装置 - Google Patents

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WO2004044243A1
WO2004044243A1 PCT/JP2002/011815 JP0211815W WO2004044243A1 WO 2004044243 A1 WO2004044243 A1 WO 2004044243A1 JP 0211815 W JP0211815 W JP 0211815W WO 2004044243 A1 WO2004044243 A1 WO 2004044243A1
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WO
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oligomer
nucleic acid
labeled
amplification
target nucleic
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PCT/JP2002/011815
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English (en)
French (fr)
Inventor
Takayuki Kanda
Sinichi FUKUZONO
Satoshi Takahashi
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Hitachi High-Technologies Corporation
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Priority to EP02781745A priority patent/EP1564300A4/en
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L7/00—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices
    • B01L7/52—Heating or cooling apparatus; Heat insulating devices with provision for submitting samples to a predetermined sequence of different temperatures, e.g. for treating nucleic acid samples

Definitions

  • the present invention relates to a method for amplifying a target nucleic acid, a reagent for detection, and a device therefor, which are used for diagnosis and research in the fields of biochemistry, molecular biology, medical care and the like. Background art
  • nucleic acid amplification methods As a technique for detecting trace amounts of nucleic acids, detection of nucleic acids generated using labeled oligomers, terminators, and the like is performed in various nucleic acid amplification methods.
  • PCR polymerase chain reaction
  • two types of oligomers complementary to the sequence of a single-stranded or double-stranded target nucleic acid are synthesized and added in an excess amount to a reaction solution in the presence of a thermostable DNA polymerase. If the target nucleic acids are present in the reaction, the oligomers will bind to those specific sites.
  • the polymerase then extends the 3 'end of these oligomers by successively adding nucleotides complementary to the target nucleic acid. By continuously raising and lowering the temperature, the extended oligomer can be separated from the target nucleic acid as product nucleic acid and bound to the oligomer in the same manner as the original target nucleic acid. By repeating this process, the target nucleic acid between the two types of oligomers can be exponentially amplified.
  • LCR ligase chain reaction
  • RCR reverse chain reaction
  • TAS transfer chain reaction
  • 3SR 3SR
  • NASBA NASBA
  • SPSR NASBA
  • LAT LAT
  • SDA SDA
  • the PCR method can be used as a highly sensitive method for analyzing nucleic acids in various samples, and is used for diagnosis of infectious diseases, genetic diseases, and cancer.
  • the PCR method is also suitable for DNA typing tests during transplantation and paternity testing.
  • the nucleic acid to be analyzed or tested is often subjected to an amplification reaction using a labeled oligomer. At present, it is possible to detect even trace amounts by developing chemical substances used as labels and improving detection equipment.
  • nucleic acid amplification method various kits and the like are also sold and the labeling method is simplified, and usually, a large amount of the target nucleic acid is amplified using an oligomer labeled with a luminous body.
  • this sample is usually diluted and used so as to fall within the detection range of the apparatus. Therefore, in order to optimize the concentration of the generated nucleic acid so that the measurement can be performed by the detection device, complicated operations such as dispensing and diluting the sample are required.
  • automating the amplification of a target nucleic acid a dilution step and equipment parts are required.
  • an arbitrary nucleic acid is amplified using a mixture of a labeled or modified oligomer and the labeled or unlabeled oligomer.
  • the mixture is prepared so that the amount of the label or the luminescent substance in the solution containing the generated nucleic acid falls within the measurement range of the detection device.
  • a modified oligomer is used, a luminescent material is bonded to the modifying group.
  • the amount of labeled or modified oligomer used is reduced as compared with the conventional method, so that the cost for amplification can be reduced.
  • operations such as dilution of the generated nucleic acid can be omitted, the operation time can be reduced particularly when the same target nucleic acid is amplified from many samples.
  • Label includes fluorophores, luminophores, and radioisotopes added to oligomers to detect generated nucleic acids.
  • Labeled and labeled includes the addition and addition of the fluorophore, luminophore, and radioisotope to an oligomer or nucleic acid.
  • target nucleic acid includes a nucleic acid having a base sequence to be arbitrarily amplified among nucleic acids contained in a reaction solution in an amplification reaction.
  • product nucleic acid and product DNA include nucleic acids and DNA produced in an amplification reaction, whether labeled or modified or unlabeled or modified.
  • sequence related to the target nucleic acid includes a part or the whole of a sequence identical or complementary to the base sequence of the target nucleic acid.
  • nucleic acid that becomes type III includes a nucleic acid having a target nucleic acid and existing at the start of the reaction. In the amplification reaction, the generated nucleic acid also becomes type III, but in the present invention, it is distinguished from the type III nucleic acid.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a method for producing a labeled nucleic acid.
  • FIG. 2 shows an embodiment of the nucleic acid analyzer to which the present invention is applied.
  • FIG. 3 shows a modification of the nucleic acid analyzer of FIG.
  • FIG. 4 is a schematic diagram of the nucleic acid amplification method of Example 1.
  • FIG. 5 shows the analysis results when the ratio of the labeled ALD-F primer was 150.
  • FIG. 6 shows the analysis results when the ratio of the labeled ALD-F primer is 1/1000.
  • FIG. 7 is an external view of the extraction / amplification unit 100 of the second embodiment
  • FIG. 8 is a plan view of the extraction / amplification unit 100 of the second embodiment
  • a DNA polymerase is selected by selecting two sites sandwiching a target site of single-stranded or double-stranded DNA, and attaching an oligomer serving as a DNA replication origin to each of the two sites.
  • the oligomer used at this time usually consists of 20 to 25 bases.
  • the oligomer may be labeled with a luminescent substance or the like. Use with added substance.
  • the labeled oligomer is added so that its concentration in the reaction solution is 0.2 M to 2 M, and after amplification, it is added to the measurement range of the detection device. Diluted to enter, measurement and detection are performed.
  • oligomer A a labeled oligomer
  • oligomer B an oligomer which is not labeled with the same base sequence as the oligomer.
  • PCR target nucleic acid amplification reaction
  • the oligomer A and the oligomer B may not have the same base sequence but may have any specific sequence contained in the target nucleic acid.
  • the number of bases of the oligomer A and the oligomer B may not be the same.
  • the two types of oligomers are mixed at a mixing ratio of 1: 1-1: 1000, more preferably at a ratio of 1: 10-1: 500, and the total of both is the reaction solution.
  • the amplification reaction is carried out in such a manner that the concentration becomes 0.2 / M ⁇ 2.
  • labeled nucleic acids and unlabeled nucleic acids are generated in a mixed state, but measurement and detection can be performed without adjusting the concentration such as dilution.
  • FIG. 2 shows a conceptual diagram of the nucleic acid detection and analysis device of the present invention.
  • This device includes an extraction unit, a mixing unit, an amplification unit, a detection unit, a signal processing device, and an operation and output unit.
  • the extraction unit is a mechanism for extracting a type II nucleic acid from a biological sample.
  • the mixing unit is a mechanism that mixes various amounts of oligomer A and oligomer B to prepare an oligomer mixture.
  • Amplification part is nucleic acid, oligomer —A mechanism that amplifies a predetermined nucleic acid by mixing a mixture and a nucleic acid amplification reagent, for example, by PCR or isothermal amplification.
  • the detection unit and the signal processing device are mechanisms for detecting the amplified predetermined nucleic acid.
  • the operation and output unit controls each of the above mechanisms, and can detect and analyze a predetermined nucleic acid contained in the biological sample. As shown in FIG. 3, there are also modified examples of a nucleic acid detection and analysis device using a prepared oligomer mixture without a mixing section.
  • Detection and analysis are performed according to the following procedure. First, detection and analysis operations are performed via the operation and output unit. Based on this instruction, the extraction unit extracts a nucleic acid of type II. Next, in the mixing section, the labeled or modified group-added oligomer is added to the labeled or modified group-added oligomer having the same base sequence and not labeled or modified group. Oligomers that do not add are mixed.
  • the target nucleic acid is amplified in the amplification section using the mixture of oligomers. At the detection section, the amplified target nucleic acid is detected or analyzed by a detector.
  • the detection data is processed by the signal processing device, and the result is transmitted to the output unit. It is preferable that these components constitute an integrated device in order to increase the efficiency of detection and analysis. Thus, the present invention does not particularly require a mechanism for diluting the amplified target nucleic acid between the amplification section and the detection section.
  • the reaction solution for the amplification of the target nucleic acid may be a commonly used buffer (eg, Tris-HCl buffer), a thermostable DNA polymerase (eg, Taq DNA polymerase), salts (eg, magnesium chloride), Prepared using deoxyribonucleotide triphosphate, type I DNA (eg, human genomic DNA).
  • the reaction is also performed using the temperature cycles of denaturation, annealing, and elongation, which are commonly used, but differs somewhat depending on the target nucleic acid, the sequence of the DNA oligomer, and the number of bases.
  • PCR kits that do not contain general amplification oligomers (eg, For example, when using Takara Shuzo PCR Amplification Kit), the mixture ratio of the mixture of the oligomer A and the oligomer B is 1 ::! To 1: 100, more preferably 1: 100. 11: 500, and the total amount of the oligomer is added to the reaction solution so as to have the concentration specified in the kit, and the reaction is performed at the specified temperature cycle.
  • general amplification oligomers eg, For example, when using Takara Shuzo PCR Amplification Kit
  • the mixture ratio of the mixture of the oligomer A and the oligomer B is 1 ::! To 1: 100, more preferably 1: 100. 11: 500, and the total amount of the oligomer is added to the reaction solution so as to have the concentration specified in the kit, and the reaction is performed at the specified temperature cycle.
  • the mixing ratio of oligomer A and oligomer B is 1: 1 to 1: 10000, more preferably 1: 1.
  • the mixture is mixed at a ratio of 0 to 1: 500, and the reaction is carried out so that the total amount thereof becomes a concentration suitable for the reaction.
  • the luminescence intensity or radioactivity of the generated nucleic acid becomes suitable for detection or analysis.
  • nucleic acid amplification method examples include the PCR method, RCR (repair chain reaction) method, TAS method, 3SR method, NASBA method, SPSR method, LAT method, and SDA method. There is no particular limitation as long as the method is performed using a mixture.
  • a detection device After completion of the amplification reaction, perform detection or analysis with a detection device without dilution. In this case, instead of a device that detects the generated nucleic acid while separating it (for example, a DNA sequencer), a device that detects the generated nucleic acid in the reaction solution (for example, a fluorescent plate reader) removes unreacted oligomers. Do. When an amplification reaction is performed using an oligomer to which a modifying group has been added, after the amplification reaction, luminescence that can be detected or measured by a device equipped with a photodetector such as a photomultiplier tube, photodiode, or CCD element After performing the treatment of adding the compound via the modifying group, measurement or detection is performed. Further, in the nucleic acid detection and analysis device of the present invention, after the amplification reaction is completed, a process of adding a luminous body via the modifying group in the amplification section is performed, and then the detection or analysis is performed.
  • the substance used to label the oligomer used in the amplification reaction is the target nucleic acid test.
  • a fluorescent substance, a chemiluminescent substance, a radioisotope, or the like may be used. These have a high luminescence intensity and can be detected or analyzed even in trace amounts.
  • a phosphoric acid group, an amino group, a thiol group, biotin, digoxigenin and the like are used, and any of the modifying groups can easily add a fluorescent substance or a chemiluminescent substance.
  • the method for detecting the amplified target nucleic acid is not particularly limited as long as it can be detected by the above-mentioned detector, and the measuring apparatus is a DNA analyzer, a gel imaging analyzer, a fluorometer, a sequencer, a plate reader, and the like.
  • the device is not particularly limited as long as it is a device provided with a detector such as a die.
  • a large excess of labeled or modified target nucleic acid is prepared because all generated nucleic acids are labeled or modified at the time of nucleic acid amplification.
  • complicated operations such as dispensing and diluting the sample are required.
  • a dilution step and equipment parts are required.
  • the amount of the fluorescent substance, the luminescent substance and the radioactive isotope used for labeling or modification can be reduced, and the cost can be reduced. Further, the nucleic acid processing step can be simplified.
  • Example 1 Example 1
  • a method for detecting a specific gene region (for example, an aldolase gene as a target sequence) will be described in this example.
  • the method comprises the steps of extracting a template DNA from a sample, preparing a primer set for amplifying the target nucleic acid portion in the template DNA, an amplification reaction step, and a detection step. Is done.
  • human peripheral blood whole blood
  • biopsy tissue fragments e.g., biopsy tissue fragments, urine, etc.
  • Extraction of genomic DNA therefrom is performed by a well-known method.
  • QIAGEN DNA B QIAGEN DNA B
  • 1 oodMiniKit can be used. Specifically, follow the kit's standard protocol, but add 200 L of human whole blood and 20 L of QIAGEN Prothease to a 1.5 ml microtube. Then, add BufferAL200 + L and stir well using voltex, then incubate at 56 for 10 minutes. Thereafter, the liquid is collected by centrifuging the microtube, 200 L of ethanol is added, and the mixture is again thoroughly stirred using Vo1teX. The whole mixture is injected into the spin column in the collection tube, centrifuged at 800 rpm for 1 minute, the solution is passed through the column, and genomic DNA is captured in the column.
  • urine collected in a centrifuge tube is centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes to collect only sediment, and re-dispersed by adding physiological saline to the sediment. After washing, centrifuge again at 1000 rpm for 5 minutes to collect the sediment and use it as a sample. After that, digestion with the well-known proteinase K is performed, and genomic DNA is extracted by phenol-chloroform extraction. Tissue sections can be made similarly. Alternatively, a sample obtained by cryopreserving urine sediment, tissue fragments, and leukocytes of blood at ⁇ 80 ° C. may be used.
  • the following three polynucleotides were used as primers for PCR amplification.
  • the ALD-FF primer and the ALD-FN primer are both polynucleotides having the same sequence, hybridize with a part of the aldolase gene region of the target sequence, and are both used as FORWARD primers in a PCR amplification reaction.
  • the ALD-FF primer is a labeled polynucleotide having a fluorescent substance, FAM, bound to its 5 'end, and can be detected by fluorescence detection.
  • the ALD-FN primer is an unlabeled polynucleotide. Labeling of the polynucleotide with the fluorescent substance can be performed by a well-known method.
  • the ALD-R primer hybridizes with a part of the aldolase gene region of the target sequence and is used as a REVERSE primer in a PCR amplification reaction.
  • the ALD-FF primer and the ALD-FN primer were prepared at a concentration ratio of 1: 100 to a total concentration of 25; M.
  • This step will be described with reference to FIG.
  • a PCR amplification reaction is performed using the above-mentioned primer.
  • the PCR reaction conditions were as follows: the initial denaturation conditions were at 94 ° C for 2 minutes, and the amplification temperature cycle was 94 for 30 seconds at 94, 30 seconds at 57 C, and 60 seconds at 72. Twice, then repeat 30 times at 89, 30 seconds at 57, 20 times at 72, and finally repeat the extension reaction at 72 for 7 minutes. Next, the generated nucleic acid amplified by PCR is detected. This will be described later.
  • PCR reactions were performed in a conventional manner. In this case, only the ALD-FF primer solution was used as the FORWARD primer solution. Other concentrations, liquid volumes, reaction conditions, etc. were set the same.
  • the amount of DNA generated under PCR conditions in this example was compared with the amount of DNA generated under conventional PCR conditions. The comparison is performed by well-known gel electrophoresis. Mupid (advance) was used for the gel electrophoresis apparatus. The gel used was agarose. First, 6X sample buffer was added to each of 5 L of the reaction solution of the present example and the conventional PCR reaction solution, and each was injected into a different injection port of the gel in Mupid. Then, electrophoresis was performed at a constant voltage of 100 V for 50 minutes.
  • the entire gel was stained with a 5 mg / L ethidium bromide solution.
  • the ethidium bromide has a double-stranded DNA. Then, it is captured in the meantime and emits strong fluorescence by ultraviolet irradiation.
  • the amount of DNA can be quantified by measuring the fluorescence intensity.
  • type I DNA and DNA generated by PCR are separated into bands (due to differences in molecular weight). As a result of comparing the fluorescence intensities of the generated DNA bands, the amount of the generated DNA under the PCR conditions in the present example and the amount of the generated DNA under the conventional PCR conditions were almost the same.
  • PCR using the FORWARD primer mixed solution was confirmed to be the same as the conventional PCR, and there was no difference in the PCR reaction. That is, even if the FORWARD primer mixed solution of the present example is used, the same PCR amplification reaction can be performed under the normal conditions.
  • the FORWARD primer mixed solution of the present example is used, the same PCR amplification reaction can be performed under the normal conditions.
  • the influence of the FAM phosphor was excluded, and the determination of the amount of DNA was not affected by the FAM phosphor.
  • Detection method ⁇ Various devices can be applied. In this embodiment, a case where SSCP analysis is performed by using a capillary electrophoresis device will be described.
  • ABI PRISM (TM) 3100 Genetic Analyzer is used by Applied Biosystems.
  • TM PRISM
  • GeneScan polymer that has been independently concentrated and adjusted is loaded and electrophoresed.
  • Formamide containing an appropriate amount of well-known labeled fragment (oligomer of known base length) in 3 aL of reaction solution containing PCR-produced DNA prepared using FORWARD primer mixed solution in the above amplification reaction step Mix 37 L and heat denature at 94 for 2 minutes. Then, cool on ice to obtain a sample solution for capillary electrophoresis. The reaction solution containing the generated DNA is used without dilution.
  • the electrophoresis conditions were as follows: capillary control temperature: 18, sample injection conditions: 12 KV, 5 seconds, electrophoresis separation: 12 KV, 50 minutes.
  • the signal strength to be analyzed is based on the electrophoresis data obtained as standard, and the baseline and amplitude are changed independently.
  • FIG. 6 shows an example of the electrophoresis result according to the present example.
  • the horizontal axis shows the migration time, and the vertical axis shows the detected fluorescence intensity.
  • the peak at the 33-minute position is the fragment marker peak, and the peaks appearing around the electrophoresis time of around 39 minutes and 41 minutes are the peaks of the PCR-amplified generated DNA.
  • Type II is genomic DNA, which appears as two peaks because the target nucleic acid is amplified from both the paternal and maternal genomes. Diagnosis can be performed by analyzing these two peaks.
  • the present invention is not limited to this, and the presence or absence of a gene, information on polymorphism, and the like can be obtained by measuring and analyzing peaks of various electrophoresis samples.
  • FIG. 5 shows that the concentration ratio between the ALD-FF primer and the ALD-FN primer is 1:
  • the results of electrophoresis performed with the FORWARD primer mixed solution of 50 are shown.
  • the signal peak was obtained at the same position as in FIG.
  • the peak intensity of the generated DNA peak was about twice as large as that in FIG.
  • reaction solution 3 ⁇ L solution under the conventional conditions was The electrophoresis was performed in order and the measurement was performed. As a result, the fluorescence intensity of the peak of the generated DNA of interest was too strong and overflowed the signal intensity of the detector, and accurate measurement was not possible.
  • Add 297 L of diluent to 3 L of the sample reaction solution mix and dilute.Take out 3 ii L of this solution with a pit, and measure again by the above procedure. As a result, similar analysis results were obtained.
  • the concentration ratio of the ALD-FF primer to the ALD-FN primer within the range of 1: 1 to 1: 10000 to obtain an appropriate intensity level according to the sensitivity of the detector.
  • the detection step can be performed without performing the dilution step, so that the system can be simplified and the apparatus can be simplified.
  • Labeled primers have a higher cost than unlabeled primers.
  • the amount of the labeled primer in this case, the ALD-FF primer
  • the amount of the labeled primer can be reduced according to the sensitivity of the detection device, so that the cost of the reagent can be reduced as a whole.
  • the detection step can be directly performed without diluting the reaction solution after the amplification reaction such as PCR. For this reason, the operation becomes easy, and when constructing an automation device, the system can be simplified, and the device becomes simpler and less expensive. Also, depending on the sensitivity of the detection device, the amount of labeled primer that is expensive can be reduced. For this reason, it is possible to reduce the reagent cost as a whole and to reduce the running cost.
  • the fluorescent substance FAM was used as the label, but the label is not limited to this.
  • Various labels can be used, such as various fluorescent substances, chemiluminescent substances, bioluminescent substances, phosphors, radioisotopes, and fine particles, and the same effect can be obtained.
  • a phosphate group an amino group, a thiol group, piotin, digoxigenin and the like can be used. Any modifying group can easily add a fluorescent or chemiluminescent substance.
  • the amplification method is not limited to the PCR of the present embodiment, but can be applied to various methods, and similar effects can be obtained.
  • the method is not particularly limited as long as the method is performed using a mixture of the above oligomers, such as the RCR (repair chain reaction) method, the TAS method, the 3SR method, the NASBA method, the SPSR method, the LAT method, and the SDA method.
  • the mixing ratio of the labeled primer to the unlabeled primer is 1: 1 :! to 1: 100, more preferably, The mixture is mixed at a ratio of 1:10 to 1: 500, and the mixture is used so that the total amount becomes a concentration suitable for the reaction. As a result, the luminescence intensity or radioactivity of the produced nucleic acid becomes suitable for detection or analysis.
  • the ratio between the ALD-FF primer and the ALD-FN primer in the primer mixture and the area intensity of the separation peak are almost proportional.
  • the area intensity is divided by the ratio between the ALD-FF primer and the ALD-FN primer.
  • the total amount of generated nucleic acids can be calculated.
  • detection methods such as a detection device using gel electrophoresis using a plate gel, etc.
  • An apparatus for detecting nucleic acids while separating them can be used.
  • a fluorometer, a microplate reader, or the like can be used.
  • a step of removing unreacted oligomers may be performed.
  • a nucleic acid processing apparatus (system) based on the method of the present invention using a labeled Z-unlabeled mixed primer will be described.
  • the device configuration mainly includes an extraction unit, an amplification unit, and a detection unit as shown in FIG.
  • the extraction unit is a mechanism for extracting a type II nucleic acid containing a target nucleic acid from a specimen.
  • This is an automation unit having the same function as the step of extracting type II DNA from a specimen described in Example 1.
  • it includes a mechanism unit, a control unit, and the like having a configuration described in JP-A-2000-166565.
  • the amplification unit is a mechanism for amplifying a target nucleic acid using the labeled unlabeled mixed primer of the present invention, for example, the FORWARD primer mixed solution described in Example 1.
  • FORWARD Store the reagent solution described in the amplification reaction step in Example 1 including the primer mixed solution, and use the same temperature cycler for amplification and the same reagent as the mechanism of the extraction unit.
  • Dispensing nozzle for solution suction, dispensing It consists of a tip for dispensing, a tip holder for dispensing, a reaction vessel, a tip extractor, and an xyz moving arm.
  • the unit of the above extraction unit can also be diverted.
  • the detection unit is a mechanism for detecting and analyzing the generated nucleic acid.
  • FIG. 7 is an external view of the extraction / amplification unit 100
  • FIG. 8 is a plan view of the extraction / amplification unit 100
  • FIG. 9 is an explanatory view of the operation of attaching the chip to the nozzle.
  • the nozzles 10 and 32 are independently connected to the nozzles 36 and 39 via the piping, the nozzle holder 17 and the piping and the nozzle holder 134, respectively.
  • the dispensing nozzle 36 and the liquid suction / discharge movable nozzle 39 are fixed to the nozzle holders 17 and 34, respectively.
  • arms 16 and 33 are attached in the Y direction to arms 16 and 33, respectively (arms 16 and 3 in Fig. 7).
  • the arms 16 and 33 can move independently in the X direction (the direction orthogonal to both the Y direction and the Z direction). By making the positions in the Z direction different from each other, the X They can overlap each other in the direction. As a result, the nozzle holders 17 and 34 and the arms 16 and
  • the nozzle can be moved to the required part of the device plane by the combination of the operations of 33.
  • control operation unit The operation of these syringes, arms, nozzle holders, etc. is controlled by the control operation unit
  • the dispensing tip 15 can be stored in the tip holder 14 for dispensing (Figs. 7 and 8), and the same tip holder 14 (14a, 14b in the figure) can be stored on the device. , 14c, 14d) can be installed. Also, 48 reaction containers 24 can be installed in the reaction container rack 23, and 48 purified product storage containers 26 can be installed in the purified product rack 25. A cooling mechanism is installed below the purified product rack 25 (not shown) so that the purified product rack 25 can be kept cool.
  • washing solution bottle 19, eluent bottle 20 and diluent One bottle can be installed for each of the bottle 21, the binding promoter bottle 22, and the amplification reaction reagent container 200. Then, 48 dispensing tips 31 can be set in the nucleic acid capturing tip rack 30. Note that a heating mechanism (not shown) is provided at the bottom of the eluent bottle 20 and the binding promoter bottle 22 so that the bottle can be heated. Further, the reagent container for amplification reaction 200 is stored in the cooling unit 201 and cooled. Further, a temperature cycler 202 for an amplification reaction is provided on the apparatus.
  • the operation of the arm 16 and the nozzle holder 17 is controlled to move the nozzle 36 above the target dispensing tip 15 on the tip holder 14. Thereafter, the nozzle holder 17 is moved downward to bring the predetermined position of the dispensing tip 15 into contact with the nozzle 36. Thereby, the dispensing tip 15 can be automatically attached to the tip of the nozzle 36.
  • the nucleic acid capturing chip 31 can be attached to the tip of the nozzle 39.
  • the tip is removed by using the tip remover 27 by controlling the operation of the arm 16 and the nozzle holder 17. Do the same for the nozzle holder 34 and arm 33.
  • the liquid receivers 11 and 28 can receive the liquid discharged from the nozzles 36 and 39, and the received liquid is sent as waste liquid.
  • the washing section 18 can wash the dispensing tip 15 attached to the nozzle holder 17 via the nozzle 36 by discharging running water.
  • nucleic acid capture chip 31 As the nucleic acid capture chip 31, the one described in JP-A-2000-166565 is used. The operation of capturing, collecting, and amplifying the nucleic acid of the sample having the target nucleic acid in this case will be described.
  • the dispensing tip 15 is attached to the nozzle 36 by a predetermined operation by controlling the operations of the arm 16 and the nozzle holder 17. After that, the operation of arm 16 and nozzle holder 17 and syringe 10 By controlling the pressure, a predetermined amount of the binding promoter is sucked into the dispensing tip 15 from the binding promoter bottle 22, and further, a predetermined amount of air is sucked. Then, the dispensing tip 15 is moved to the washing table 18 and the outer wall of the dispensing tip 15 is washed with running water.
  • the nozzle holder 17 After washing the outer wall of the dispensing tip 15, the nozzle holder 17 is moved to the position of the predetermined sample 13 on the sample rack 12. A predetermined amount of the sample is aspirated into the dispensing tip 15 by controlling the operation of the syringe 10. After aspirating the sample of the dispensing tip 15, the nozzle holder 17 is moved onto the reaction vessel rack 23, and the total amount of the sample in the dispensing tip 15 is transferred to the predetermined reaction vessel 24 of the rack 23. Is discharged.
  • the sample in the reaction container 24 is further aspirated and discharged by the dispensing tip 15 to mix the sample and the binding promoter.
  • the nozzle holder 17 is moved to the position of the chip removing 27, and the dispensing tip 15 is removed from the nozzle 36 by the above-mentioned predetermined operation.
  • the nucleic acid capturing chip 31 is attached to the nozzle 39 by a predetermined operation. Thereafter, the nozzle holder 34 is moved to the reaction vessel 24 containing the above-mentioned mixture (mixture of the sample and the binding promoter) on the reaction vessel rack 23. Then, by controlling the operation of the syringe 32, the mixed solution is sucked into the nucleic acid capturing chip 31.
  • the mixed solution in the reaction vessel 24 is sucked into the nucleic acid capturing chip 31, and the tip 31 is controlled by controlling the operation of the arm 33 and the nozzle holder 34. Move to waste port 29. Then, the mixed liquid in the nucleic acid capturing chip 31 is discharged to the waste liquid port 29 by controlling the syringe 32. After discharging the mixed liquid to the waste liquid port 29, the tip 31 is moved to the liquid receiver 28 by operation control of the arm 33 and the nozzle holder 34.
  • the nozzle holder 17 After the dispensing tip 15 is attached to the nozzle 36 by controlling the operation of the arm 16 and the nozzle holder 17, the arm 16 and the nozzle holder A predetermined amount of the cleaning liquid is sucked from the cleaning liquid port 19 by controlling the operations of the syringe 17 and the syringe 10. Then, the nozzle holder 17 is operated to discharge the cleaning liquid onto a predetermined reaction vessel 24 on the reaction vessel rack 23.
  • the operation of the arm 16 and the nozzle holder 17 is controlled, so that the nozzle holder 17 is moved to the tip removal position 27, and the dispensing tip 1 is dispensed from the nozzle 36 by the predetermined operation. Remove 5.
  • the movement of the arm 33 and the nozzle holder 34 is controlled to move the nucleic acid capture chip 31 to a predetermined reaction vessel 24 on the reaction vessel rack 23 containing the washing solution. .
  • the washing solution is sucked into the nucleic acid capturing chip 31 by the operation of the syringe 32.
  • suction of the cleaning liquid suction and discharge are repeated a predetermined number of times by the operation of the syringe 32, and the solid phase 38 is cleaned with the cleaning liquid.
  • the washing solution in the reaction container 24 is sucked into the nucleic acid capturing chip 31.
  • the nucleic acid capturing chip 31 is moved to the waste liquid port 29, and the washing liquid in the nucleic acid capturing chip 31 is discharged by the operation of the syringe 32. I do. After the washing liquid is discharged, the nucleic acid capturing chip 31 is moved to the liquid receiver 28 by the operation of the arm 33 and the nozzle holder 34.
  • the nucleic acid washing step is repeated a predetermined number of times.
  • the nucleic acid washing step may be repeated as it is, but a plurality of washings are sucked into the dispensing tip 15 and the required amount is discharged into the reaction container 24. Then, after discharging the cleaning liquid, the cleaning liquid is moved to the position of the liquid receiver 11, and after the washing operation of the nucleic acid capturing chip 31, the required amount of the cleaning liquid is discharged again to the reaction container 24 by the dispensing tip 15, whereby The nucleic acid washing step can be efficiently repeated.
  • the dispensing tip 15 is attached to the nozzle 36, and then the operation of the arm 16, the nozzle holder 17, and the syringe 10. Depending on the eluent pottle 20 Then, a predetermined amount of the eluent is sucked, and the nozzle holder 17 is discharged into the predetermined reaction container 24 on the reaction container rack 23.
  • the operation of the arm 16 and the nozzle holder 17 is controlled to move the nozzle holder 17 to the tip removal position 27, and the dispensing tip from the nozzle 36 by the predetermined operation. 15 Remove 5.
  • the operation of the arm 33 and the nozzle holder 34 is controlled so that the nucleic acid capture chip 31 is placed in the predetermined reaction vessel 24 on the reaction vessel rack 23 containing the eluent. Moving. Then, the eluate is sucked into the nucleic acid capturing chip 31 by the operation of the syringe 32. After suction of the eluate, suction and discharge are repeated a predetermined number of times by the operation of the syringe 32 to bring the solid phase 38 into contact with the eluent.
  • the suction and discharge are repeated a predetermined number of times, and the eluate in the reaction vessel 24 is sucked into the nucleic acid capturing chip 31.
  • the nucleic acid capturing chip 31 is moved to the predetermined purified product storage container 26 stored in the purified product rack 25.
  • the eluate in the nucleic acid capturing chip 31 is discharged into the container 26 by the operation of the syringe 32.
  • the arm 33 and the nozzle holder 34 move the nucleic acid capturing chip 31 to the liquid receiver 28. If necessary, the elution step is repeated a predetermined number of times.
  • the above-mentioned elution step may be repeated as it is, but a plurality of eluates are sucked into the dispensing tip 15 and the required amount is discharged into the reaction container 24. Then, after the eluent is discharged, the dispensing tip 15 is moved to the position of the liquid receiver 11. After the suction and discharge operation of the nucleic acid capture chip 31, the required amount of eluate is again discharged into the reaction container 24 by the dispensing tip 15, so that the above-described elution step can be efficiently repeated.
  • the operation of the arm 33 and the nozzle holder 34 is controlled to move the nozzle holder 34 to the position of the tip extracting 27, and the nucleic acid capturing chip 31 from the nozzle 39 by a predetermined operation. Remove. Then move to the right end.
  • a genomic DNA solution can be obtained from the sample.
  • an amplification reaction is performed.
  • the amplification reaction reagent vessels 2 0 0 Example 1 premixed reagent solution for amplification reaction as described (d NTP, M g C l 2, T sp bar Ffa, sterile water, T sp DNA polymerase Contains FORWARD primers (mixed solutions, premix solutions such as REVERSE primer solutions).
  • the operation for amplifying the target nucleic acid contained in the genomic DNA solution in the purified product storage container 26 will be described.
  • the dispensing tip 15 on the tip holder 14 d is attached to the nozzle 36 by a predetermined operation. Thereafter, by controlling the operation of the arm 16, the nozzle holder 17, and the syringe 10, a predetermined amount of the premixed reagent solution for the amplification reaction is removed from the amplification reaction reagent container 200. Is aspirated into the dispensing tip 15. Thereafter, the nozzle holder 17 is moved onto the temperature cycler 202, and the solution in the dispensing tip 15 is discharged into a predetermined amplification vessel 203.
  • a required amount of the genomic DNA solution is transferred from the purified product storage container 26 to a predetermined amplification container 203 and mixed.
  • amplification operation such as PCR is performed under predetermined conditions.
  • the description of the opening and closing operations of the lid of the amplification vessel 203 and the lid of the temperature cycler is omitted.
  • the target nucleic acid is amplified.
  • formamide is mixed with the solution (part) after the amplification reaction, heat denaturation is performed at 94 ° C for 2 minutes, and measurement is performed using a well-known detection device. For example, it is measured by a capillary array electrophoresis apparatus.
  • a premixed reagent solution for the amplification reaction was used during amplification, but for example, each reagent may be stored separately.
  • the labeled primer and the unlabeled primer are stored separately, the information of the detector is obtained, the mixing ratio is determined at the time of amplification, and mixed.
  • a configuration for performing amplification may be adopted. In that case, prepare the required number of container storage locations in the equipment unit and perform the dispensing operation.
  • the operation of the dilution step can be omitted, so that the apparatus configuration is simplified.
  • the amount of labeled or modified oligomer used in nucleic acid amplification can be reduced. Therefore, the cost down process of the nucleic acid amplification process and the nucleic acid analysis process can be simplified.

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Abstract

本発明は、核酸増幅において、標識または修飾されたオリゴマーの使用量を下げることで、コストを下げ、かつ検出装置の測定範囲内に収まるように希釈などの操作を必要とせずに検出が可能とするものである。　当該目的を達成するために、本発明は、標的核酸を抽出する抽出工程、発光体または修飾基で標識されたオリゴマーに前記標識されたオリゴマーと同一の塩基配列を有しかつ発光体または修飾基で標識されていないオリゴマーを混合する混合工程、前記標識されたオリゴマーと標識されていないオリゴマーの混合物を用いて標的核酸を増幅する増幅工程、修飾基で標識されたオリゴマーを用いた場合には前記修飾基で標識されたオリゴマーとその増幅物に発光体を付加する工程、及び前記増幅された標的核酸を光検出器により測定する検出工程からなる核酸測定方法を提供する。

Description

核酸の増幅方法及びその装置 技術分野
本発明は、 生化学、 分子生物学、 医療分野などにおいて診断及び研 究に用いられる標的核酸の増幅方法、 検出用試薬、 及びその装置に関 する。 背景技術
微量の核酸を検出するための技術として、 さまざまな核酸増幅法に おいて、 標識されたオリゴマーやターミネータ一などを用いて生成し た核酸での検出が行なわれている。
例えば、 P C R (ポリメラーゼ連鎖反応） 法は、 単鎖または二本鎖 の標的核酸の配列に相補的な二種類のオリゴマーを合成し、 耐熱性 D N Aポリメラーゼの存在下の反応液中に過剰量加える。 もし標的核酸 が反応液中に存在すれば、 オリゴマ一はそれらの特定の部位に結合す る。 そして、 ポリメラーゼは、 標的核酸に相補的なヌクレオチドを連 続的に付加することによりこれらのオリゴマーの 3 '末端を伸張する。 連続的に温度を上下することにより、 伸張されたオリゴマーは、 生成 核酸として標的核酸から分離し、 元の標的核酸と同様にオリゴマーと 結合できる。 このプロセスを繰り返すことにより、 2種類のオリゴマ 一間の標的核酸を指数的に増幅させることができる。
また、 L C R (リガーゼ連鎖反応） 法は、 2種類の隣接するオリゴ ヌクレオチドプローブとそれらにそれぞれ相補的なプローブを、 温度 安定性 D N Aリガーゼ存在下の反応液中に過剰量加える。 ここで各プ ローブは標的配列と結合し、 D N Aリガーゼによって 2種類の隣接し て結合したプローブは連結される。 そして、 P CR法と同様、 連続的 に温度を上下することで連結されたプローブは標的配列から分離し、 元の標的核酸と同様にプローブと結合する。
その他、 RCR (修復連鎖反応） 法、 TAS法、 3 S R法、 NAS BA法、 S P S R法、 LAT法、 S D A法などが核酸増幅法として利 用されている。
この中でも特に、 P C R法は種々の試料中核酸の高感度分析法とし て使用可能で、 感染症や遺伝病、 がんの診断などに利用される。 さら に、 P CR法は、 移植や親子鑑定の際の DNAタイピング検査にも適 した方法である。 この場合、 分析や検査対象となる核酸は、 標識され たオリゴマーを用いて増幅反応が行われることが多い。 現在では、 標 識として用いられている化学物質の開発や、 検出装置の改良により、 ごく微量でも検出が可能となっている。
上記の核酸増幅法では、 さまざまなキッ トなども販売され標識方法 としては簡便化されており、 通常、 発光体で標識されたオリゴマーを 用いて標的核酸が多量に増幅される。 そして、 検出感度が向上した現 在のシーケンサーやプレートリーダーなどで増幅した標的核酸の検出 を行うためには、 このサンプルを装置の検出範囲内に入るように希釈 して用いるのが普通である。 そのため、 検出装置で測定が可能となる ように生成核酸の濃度を最適化するため、 試料を分注、 希釈するなど の煩雑な操作が必要となる。 また、 標的核酸の増幅を自動化する場合 などでは、 希釈をするための工程や装置部品などが必要である。
さらに、 上記の測定方法では、 一回の測定につき生成核酸の数十分 の一しか用いられない。 また、 生成核酸の測定回数も、 ほとんどの場 合、 数回である。 このため、 不必要に標識されたオリゴマーが用いら れているといってもよい。 しかし、 現在の核酸増幅法では、 標的とす る鐯型核酸に対してある一定量以上のオリゴマーが必要となるため、 単に標識されたオリゴマーを減らすこともできない。 今後、 遺伝子診 断などが発達してくると、 多数の検体において同じ標的部位の増幅を 行う必要があるが、 このときに標識されたオリゴマーの使用量を減ら すことができれば 1検体あたりに必要なコストを低くすることができ る。
これらの問題点を解決するためには、 簡便で、 かつコス トの低い標 識核酸増幅法が望まれている。
発明の開示
本発明では、 標識又は修飾されたオリゴマーと該標識又は該標識さ れていないオリゴマーの混合物を用い、 任意の核酸を増幅する。 混合 物は、 生成核酸を含む溶液中の該標識又は該発光体の量が検出装置の 測定範囲内に収まるよう調製する。 尚、 修飾されたオリゴマーを用い る場合は、 修飾基に発光体を結合させる。
本発明によれば、 従来の方法と比較して標識又は修飾したオリゴマ 一の使用量が下がるため、増幅のためのコストダウンが図れる。また、 生成核酸の希釈などの操作が省けるため、 特に同じ標的核酸を多数の サンプルから増幅する場合には、 操作時間を短縮することができる。 以下、 上記及びその他の本発明の新規な特徴と効果について、 図面 を参酌して説明する。 尚、 本明細書では以下の様に用語を定義する。
「標識」 とは、 生成した核酸を検出するためにオリゴマーに付加さ れた蛍光体、 発光体、 放射性同位体を含む。
「標識した及び標識された」 とは、 前記蛍光体、 発光体、 放射性同 位体を、オリゴマ一または核酸に付加した及び付加されたことを含む。
「標的核酸」 とは、 増幅反応における反応液中に含まれる核酸のう ち、 任意に増幅させる塩基配列から成る核酸を含む。 「生成核酸」 及び 「生成 D N A」 とは、 標識又は修飾されたもの、 標識又は修飾されないものに関わらず、 増幅反応において生成した核 酸及び D N Aを含む。
「標的核酸に関連する配列」 とは、 標的核酸の塩基配列と同一又は 相補的な配列の一部又は全部を含む。
「鐯型となる核酸」 とは、 標的核酸を有し、 反応開始時に存在する 核酸を含む。 なお、 増幅反応においては、 生成核酸も錶型となるが、 本発明では、 铸型となる核酸と区別する。 図面の簡単な説明
図 1は、 標識核酸の生成方法の概略図である。 図 2は、 本発明を適 用した核酸分析装置の一実施例である。 図 3は、 図 2の核酸分析装置 の変形例である。 図 4は、 実施例 1の核酸増幅法の概略図である。 図 5は、 標識された A L D— Fプライマーの割合が 1 5 0の場合の解 析結果である。 図 6は、 標識された A L D— Fプライマーの割合が 1 / 1 0 0の場合の解析結果である。
図 7は、 実施例 2の抽出 · 増幅部 1 0 0の外観図、 図 8は、 実施例 2の抽出 · 増幅部 1 0 0の平面図、 図 9は、 実施例 2のノズルへのチ ップの取り付け動作説明図である。 発明を実施するための最良の形態
核酸増幅法、 例えば P C R法は、 単鎖または二本鎖 D N Aの標的と なる部位を挟む二箇所の部位を選択し、 その二箇所のそれぞれに D N Aの複製基点となるオリゴマーを付着させ、 D N Aポリメラ一ゼを用 いて反応を行うことで必要とする部位のみを増幅させる方法である。 このとき用いられるオリゴマーは、 通常 2 0〜 2 5塩基からなり、 増幅する部位に標識が必要な場合、 このオリゴマーに発光体などの標 識物質を付加させて用いる。
従来の標識方法では、 標識されたオリゴマーは、 反応液中での濃度 が 0. 2 M〜 2 Mになるように標識されたもののみが加えられ、 増幅された後、 検出装置の測定範囲に入るように希釈されて、 測定 ' 検出が行われる。
本発明では、 図 1 に示されるように、 標識されたオリゴマー （以下 オリゴマー A とする） 及び当該オリゴマーと同一の塩基配列で標識さ れていないオリゴマー （以下オリゴマー B とする） の混合物を用いて 標的核酸の増幅反応 （P C R、 L C R等） を行う。 このとき、 オリゴ マー Aとオリゴマー Bは、 同一の塩基配列ではなく、 標的核酸に含まれ る任意の特定配列を持つものであっても良い。 また、 オリゴマー A と オリゴマー Bの塩基数は同じでなくても良い。
この 2種類のオリゴマ一は、 混合量比 1 ： 1〜： 1 ： 1 0 0 0 0、 よ り好ましくは 1 ： 1 0〜 1 ： 5 0 0の割合で混合され、 両者の合計が 反応液中で 0. 2 /M〜 2 になるように加えて増幅反応を行う。 増幅工程後には、 標識された核酸と標識されていない核酸が混在して 生成するが、 希釈などの濃度調製をすることなく、 測定 ·検出などを 行える。
従来の標的核酸の増幅、 生成核酸の希釈、 検出及び分析と本発明の 増幅、 検出及び分析を対比すると、 両者とも同じ結果を得ることが出 来る。
図 2は、本発明の核酸検出及び分析装置の概念図を示す。本装置は、 抽出部、 混合部、 増幅部、 検出部、 信号処理装置、 及び操作及び出力 部から構成される。 抽出部は、 生体試料から錶型となる核酸を抽出す る機構である。 例えば、 特開 2 0 0 0 — 1 6 6 5 5 6号記載の装置を 利用する。混合部は、諸定量のオリゴマー Aとオリゴマー Bを混合し、 オリゴマー混合物を調製する機構である。 増幅部は、 核酸、 オリゴマ —混合物、 及び核酸増幅試薬を混ぜ、 たとえば PCR法や恒温増幅法に より、 所定核酸を増幅する機構である。 検出部と信号処理装置は、 増 幅された所定核酸を検出する機構である。そして、操作及び出力部は、 上記各機構を制御し、 生体試料中に含まれる所定核酸を検出、 及び分 析できる。 尚、 図 3記載のように、 混合部がない、 調製済オリゴマー 混合物を利用する核酸検出及び分析装置等の変形例も存在する。
検出及び分析は、 以下の手順により行われる。 まず、 操作及び出力 部を介して、 検出及び分析の操作が行われる。 この指示に基づいて、 抽出部で铸型となる核酸が抽出される。 次に、 混合部において、 標識 された、 又は修飾基を付加したオリゴマーに、 前記標識された、 又は 修飾基を付加したオリゴマーと同一の塩基配列を有しかつ標識されて いない、 または修飾基を付加しないオリゴマーが混合される。 このォ リゴマーの混合物を用い、 増幅部において標的核酸が増幅される。 検 出部において、 増幅された標的核酸は検出器により検出または分析さ れる.。 この検出デ一夕は信号処理装置により処理され、 その結果は出 力部に送信される。 これらの各部は一体化された装置を構成すること が、 検出 · 分析を効率化するために好ましい。 このように、 本発明で は、 増幅部と検出部の間に、 増幅された標的核酸を希釈する機構と特 に必要としない。
標的核酸の増幅反応液は、 ごく一般的に用いられている緩衝液 （例 えば、 トリス-塩酸緩衝液）、 耐熱性 D N Aポリメラ一ゼ （例えば T a q D N Aポリメラーゼ）、 塩類 （例えば塩化マグネシウム）、 デォキ シリボヌクレオチド三リン酸、 铸型 D N A (例えばヒトゲノム D N A ) を用いて調製する。 反応もごく一般的に用いられている変性、 ァニー リング、 伸長の温度サイクルで行うが、 標的核酸や D N Aオリゴマー の配列、 塩基数により多少異なる。
また、一般的な増幅用のオリゴマーが含まれない PCR用のキッ ト（例 えば、 宝酒造社 P C R Am p l i f i c a t i o n K i t ) を 用いる場合には、前記オリゴマー Aとオリゴマー Bの混合物の混合量比 が 1 ： ：!〜 1 ： 1 0 0 0 0、 より好ましくは、 1 ： 1 0〜 1 ： 5 0 0 となり、 そのオリゴマー総量がキッ 卜に指定された濃度となるように 反応液に加え、 指定された温度サイクルで反応を行う。
標的核酸の増幅以外の反応も同時に行う反応 （例えば、 RT— P C R)においても、オリゴマー Aとオリゴマー Bの混合量比が 1 ： 1〜 1 ： 1 0 0 0 0、 より好ましくは、 1 ： 1 0〜 1 ： 5 0 0の割合で混合さ れ、 その総量が反応に適した濃度となるように用いて反応を行う。 こ れにより、 生成核酸における発光強度又は放射活性が、 検出又は分析 に適合したものとなる。
核酸増幅法としては、 P CR法のほかに、 RC R (修復連鎖反応） 法、 TAS法、 3 S R法、 NAS BA法、 S P S R法、 LAT法、 S D A法などが挙げられるが、 上記オリゴマーの混合物を用いて行われ る方法であれば特に限定されない。
増幅反応終了後、 希釈を行わずに検出装置で検出又は分析を行う。 このとき、 生成核酸を分離しながら検出する装置 （例えば、 DNAシ 一ケンサ一）ではなく、反応液中で生成核酸を検出する装置（例えば、 蛍光プレートリーダー） では、 未反応のオリゴマーの除去を行う。 修飾基を付加したオリゴマ一を用いて増幅反応を行った場合、 増幅 反応後、 光電子増倍管、 フォ トダイオード、 C CD素子などの光検出 器を備えた装置で検出または測定できるような発光体を、 当該修飾基 を介して付加する処理を行った後、 測定または検出を行う。 また、 本 発明の核酸検出及び分析装置では、 増幅反応終了後、 増幅部において 発光体を、 当該修飾基を介して付加する処理を行った後、 検出または 分析を行う。
なお、 増幅反応で用いるオリゴマーを標識する物質は、 標的核酸検 出時に本発明の検出部を備えた装置で検出が可能であれば特に制限が なく、 蛍光物質、 化学発光物質、 放射性同位体などでよい。 これらは、 発光強度が高く、 微量でも検出または分析が可能である。 また、 修飾 基は、 リン酸基、 アミノ基、 チオール基、 ピオチン、 ジゴキシゲニン などが用いられ、 どの修飾基も容易に蛍光物質または化学発光物質を 付加することができる。
また、 増幅した標的核酸の検出方法については、 上記の検出器で検 出が可能であれば特に限定されず、 測定装置は D N Aアナライザ、 ゲ ルイメージングアナライザ、 蛍光光度計、 シーケンサ一、 プレートリ ーダ一等の検出部を備えた装置であれば特に限定されない。
従来の方法では、 核酸増幅時、 すべての生成核酸が標識され、 又は 修飾基が付加されていたため、 大過剰の標識された又は修飾された標 的核酸が調製される。 検出装置で測定が可能となるように生成核酸の 濃度を最適化するため、 試料を分注、 希釈するなどの煩雑な操作が必 要となる。 また、 標的核酸の増幅を自動化する場合などでは、 希釈を するための工程や装置部品などが必要である。 本発明では、 標識又は 修飾に用いる蛍光体、 発光体および放射性同位体の使用量を減らすこ とができ、 コストダウンが図れる。 また、 核酸処理工程を簡略化でき る。
以下、 実施例により本発明をより具体的に説明するが、 本発明はこ れらに限定されるものではない。 実施例 1
特定の遺伝子 （例えば標的配列としてアルドラ一ゼ遺伝子） 領域を 検出する方法について本実施例で説明する。 本方法は、 検体からの銬 型となる D N Aの抽出工程、 鐯型 D N Aの中の標的核酸部を増幅する ためのプライマーセッ トの調製工程、 増幅反応工程、 検出工程から構 成される。
[検体からの錶型 DN Aの抽出工程]
検体としてヒ ト抹消血 （全血）、 バイオプシーによる組織片、 尿等が 使用できる。 これらからのゲノム DNAの抽出は、 周知の方法により 行われる。 例えば、 ヒ ト抹消血の場合、 Q I AGEN社の DNA B
1 o o d M i n i K i tが使用できる。 具体的には、 キッ トの標 準プロトコールに従うが、 1.5m 1マイクロチューブに、 ヒ ト全血 2 0 0 L、 Q I AGEN P r o t e a s e 2 0 Lを加える。 次い で、 B u f f e r A L 2 0 0 // Lを加えて、 v o l t e xを用い て充分に攪拌後、 5 6で、 1 0分間のインキュベーションを行う。 そ の後、 マイクロチューブを遠心して液を集め、 エタノール 2 0 0 Lを加えて再び V o 1 t e Xを用いて充分に攪拌する。 その混合液全 量をコレクションチューブ中のスピンカラムに注入し、 8 0 0 0 r p m、 1分間遠心して、 液をカラムに通し、 ゲノム DNAをカラム内に 捕捉する。 その後、 同じスピンカラムを新しいコレクションチューブ に移し、 蓋をあけてスピンカラムに B u f f e r AW 1 5 0 0 Lを注入して 80 0 0 r pmで 1分間遠心する。 再びスピンカラムを 新しいコレクションチューブに移し、 次に B u f f e r AW 2 5 0 0 Lを注入して 1 40 0 0 r pmで 3分間遠心し、 カラムの洗浄 を行う。 スピンカラムを新しいコレクションチューブに移し、 B u f f e r AE 1 0 0 Lを注入し、 8 0 0 0 r p m、 1分間遠心し、 捕捉したゲノム DNAを溶出させ、 ゲノム DNA溶液を得る。 尚、 溶 出ゲノム DN A溶液を吸光度計を用いて測定することにより、 溶出液 中の核酸量を定量する。
尿の場合は、 まず、 遠沈管に採取した尿を 1 0 0 0 r pmで 5分遠 心して沈渣のみを集め、 さらにその沈渣に生理食塩水を加えて再分散 させて洗浄し、 再度 1 0 0 0 r p mで 5分遠心して沈渣を集めて試料 とする。 その後、 周知のプロテナーゼ K消化し、 フエノール ' クロ口 ホルム抽出などでゲノム D N Aを抽出する。組織切片も同様にできる。 また、 尿沈渣物、 組織片、 血液の白血球を- 8 0度で凍結保存した試料 を使ってもよい。
[標的核酸部を増幅するためのプライマーセッ 卜の調整工程]
P C R増幅用のプライマーとして以下の 3種のポリヌクレオチドを 使用した。
5'FAM-GGGCTTGACTTTCCAACACG3' (ALD- FFプライマー）
5'GGGCTTGACTTTCCAACACG3' (ALD- FNプライマー）
5'TCTAGCCTCAATCCTCATAC3' (ALD- Rプライマー）
ALD-FF プライマーと ALD-FNプライマーは、 共に同じ配列を有する ポリヌクレオチドであり、 標的配列のアルドラーゼ遺伝子領域の一部 とハイプリダイズし、 共に P C R増幅反応の際の FORWARDプライマ一 として使用する。 また、 ALD-FFプライマ一は、 その 5 '末端に蛍光体 である FAMを結合させた標識ポリヌクレオチドであり、 蛍光検出によ り検出できる。 ALD- FNプライマーは非標識のポリヌクレオチドである。 蛍光体のポリヌクレオチドへの標識は周知の方法により行うことがで きる。
ALD-R プライマーは、 標的配列のアルドラーゼ遺伝子領域の一部と ハイブリダィズし、 P C R増幅反応の際の REVERSEプライマ一として 使用する。
P C R増幅反応の FORWARDプライマー溶液には、 ALD- FFプライマー と ALD- FNプライマーを 1 ： 1 0 0の濃度比で、 全体で 2 5 ； Mの濃度 になるように調製した。
REVERSEプライマー溶液には、 ALD-Rプライマーを 2 5 i Mに調製し たものを使用した。
[増幅反応工程]
図 4を参照して本工程について説明する。 本工程では、 上述のブラ イマ一を用いて P C R増幅反応を行う。
铸型となるゲノム D N A 1 β g、 2 mMのd NT P 5 L、 5 0 mMのM g C l 2 1. 5 f L , l O XT s pバッファー 5 L、 滅菌水 3 5. 1 ^ L、 T s p DNAポリメラーゼ 0. 4 L、 2 5 の FORWARD プライマー混合溶液 （ALD-FF プライマー ： ALD-FN プライマ一 = 1 ： 1 0 0の混合液） 1 L、 2 5 Mの REVERSEプ ライマー溶液 1 Lを混合する。 P C R反応条件は、 最初の変性条 件を 9 4°Cで 2分間、増幅温度サイクルは、 9 4でで 3 0秒間、 5 7 C で 3 0秒間、 7 2でで 6 0秒間を 1 0回、次いで、 8 9でで 3 0秒間、 5 7でで 3 0秒間、 7 2でで 6 0秒間を 2 0回繰り返し、 最後に伸長 反応を 7 2 で 7分間行う。 次に、 P C Rで増幅させた生成核酸を検 出する。 これについては後述する。
比較のため、 従来の様式での P C R反応を行った。 この場合は、 FORWARDプライマー溶液として、 ALD-FFプライマ一溶液のみを使用し た。 その他の、 濃度、 液量、 反応条件等は同じに設定した。 本実施例 での P C R条件での生成 DN A量と、 従来 P C R条件での生成 D NA 量を比較した。 比較は、 周知のゲル電気泳動にて行う。 ゲル電気泳動 装置には Mupid (ァドバンス社製）を使用した。 使用ゲルはァガロース とした。 まず本実施例の反応液と従来 P C R反応液の各 5 Lに対し て各々 6 Xサンプルバッファー を加え、 Mupid 内のゲルの異 なる注入口に各々注入した。 次いで、 1 0 0 Vの定電圧で 5 0分間、 電気泳動を行った。 その後、 5 m g/Lのェチジゥムブロマイ ド溶液 でゲル全体を染色した。 ェチジゥムブロマイ ドは、 D NA 2本鎖があ ると、 その間に取り込まれ、 紫外線照射により強い蛍光を発するよう になる。この蛍光強度を測定する事で D N A量を定量する事ができる。 電気泳動により、 铸型 DNAと、 P CRでの生成DNAとが （分子量 の違いにより） バンド状に分離される。 生成 DNAのバンドの蛍光強 度を比較した結果、 本実施例での P C R条件での生成 DNA量と、 従 来 P C R条件での生成 DNA量はほぼ同程度であった。 本実施例での FORWARD プライマー混合溶液による P C Rは従来と変わらないことが 確認でき、 P C R反応の違いはなかった。 つまり、 本実施例の FORWARD プライマー混合溶液を使っても、 通常の条件と同じ P CR増幅反応を 行うことができる。 なお、 上記紫外線照射によるェチジゥムブ口マイ ドからの蛍光検出では、 F AM蛍光体の影響は除いており、 DNA量 の定量には F AM蛍光体の影響はない。
上記実施例の他、 P C R増幅反応際の FORWARDプライマー混合溶液 として、 ALD - FFプライマーと ALD- FNプライマ一を 1 ： 1から 1 ： 1 0 0 0 0の濃度比で、 調製したものでも評価した。 上記実施例と同じ くゲル電気泳動で生成 D N A量を確認した結果、 どの場合でも P C R 反応によって生成される生成 DN A量はほぼ同等であった。 このこと は、 本実施例でのプライマー混合溶液が、 増幅反応自体を阻害するこ とはほとんどないことを示している。 つまり、 本実施例のプライマー は、 従来の条件をそのまま使うことができる為、 従来方式の P CR増 幅反応からの移行が容易である。 また他の増幅法にも同様に適用可能 である。
[検出工程]
本工程では、上記工程で調製した生成 DN Aを検出する。検出方法 · 装置は種々適用できるが、 本実施例ではキヤビラリ一電気泳動装置に より S S C P解析を実施する場合について説明する。 キヤピラリー電気泳動装置として、 App l i ed B i osys t ems社 AB I PRI SM (TM) 3 100 Gene t ic Ana l yzerを使用する。 独自に作製した内径 75 m、 検出長 3 6 c mのキヤピラリーを使用し、 同社製の GeneScanポリ マーを独自に濃縮調整したものを充填して泳動検出する。 上記増幅反応工程で、 FORWARD プライマー混合溶液を使って調整し た P C R生成 D N Aを含む反応液 3 a Lに、 周知の標識されたフラグ メントマ一力 （既知の塩基長のオリゴマー） を適量含むホルムアミ ド 3 7 Lを混合し、 9 4でで 2分間熱変性を行う。 その後、 氷冷し、 キヤビラリ一電気泳動用の試料液とする。生成 D N Aを含む反応液は、 希釈をせずにそのまま用いる。 電気泳動条件は、 キヤピラリーの制御 温度を 1 8 、 試料注入条件を 1 2 K V、 5秒、 泳動分離を 1 2 K V で 5 0分間行う。 尚、 解析する信号強度は、 標準で得られる泳動デー 夕を基に、 ベースライン、 振幅を独自に変更して使用する。
図 6に、 本実施例による泳動結果の一例を示す。 横軸に泳動時間、 縦軸に検出蛍光強度を示している。 3 3分の位置のピークはフラグメ ントマーカのピークであり、 泳動時間 3 9分付近と 4 1分付近に現れ るピークが P C R増幅された生成 D N Aのピークである。 铸型がゲノ ム D N Aであり、 父親由来と母親由来の両者のゲノムから標的核酸が 増幅されるため、 2つのピークとなって現れる。 この 2つのピークを 解析することによって、 診断などを行うことが出来る。 また、 これに 限らず、 種々の泳動試料のピークを測定 ·解析することによって、 遺 伝子の有無、 多型情報などを得ることが出来る。
尚、 図 5に、 ALD-FFプライマーと ALD-FNプライマーの濃度比が 1 ：
5 0である FORWARDプライマー混合溶液で行った場合の電気泳動結果 を示す。 図 6と同様の位置に信号ピークが得られた。 生成 D N Aのピ ークの面積強度は図 6に比べ約 2倍の大きさであった。
なお、 比較のため、 従来条件での反応液 3 ^ L液を、 上記と同じ手 順で電気泳動して測定した。 その結果、 注目している生成 D N Aのピ ークの蛍光強度が強すぎて検出器の信号強度をオーバーフローしてし まい、 正確な測定が出来なかった。 試料反応液 3 Lに希釈液 2 9 7 Lを加えて混和して希釈し、 この液の 3 ii Lをピぺッ トにて取り出 し、 再び上記手順で測定するとほぼ同じ泳動測定結果が得られ、 同様 の解析結果が得られた。
上述の増幅反応工程で述べたとおり、 ALD-FF プライマーと ALD-FN プライマーを 1 ： 1から 1 ： 1 0 0 0 0の濃度比の FORWARDプライマ 一混合溶液で行った場合、 生成 D N A量はどれもほぼ同じ （従来法と も同じ） であった。 混合比を変えた FORWARDプライマー混合溶液を使 つた反応液について、電気泳動測定した結果、泳動ピークの大きさは、 混合比率に応じて増減した。 特に ALD-FFプライマーと ALD- FNプライ マーを 1 ： 1 0から 1 ： 5 0 0の濃度比としたとき、 濃度比とピーク 面積強度がほぼ比例していることが確認できた。 この為、 好適には ALD-FF プライマーと ALD-FNプライマーの濃度比を 1 ： 1から 1 ： 1 0 0 0 0の範囲内で調整し、 検出器の感度に応じて適正な強度レベル になるようにした FORWARDプライマー混合溶液を使用する。この場合、 希釈工程を行うことなく検出工程に移ることができ、 システムの簡略 化ができ、 装置が簡便になる。
また、 標識プライマーは非標識のプライマーに比ペコス卜が高い。 本実施例では、 検出装置の感度に応じて、 標識プライマー （この場合 は ALD- FFプライマー） の使用量が低減できるため、 全体的に試薬コス トを抑えることが可能となる。
本実施例によれば、 P C Rなどの増幅反応後の反応液を希釈するこ となく、 直接検出工程を実施できる。 この為、 操作が容易になり、 自 動化装置を構築する場合、 システムが簡略化でき、 装置がより簡便に なり、 安価になる。 また、 検出装置の感度に応じて、 コス トの高い標識プライマーの使 用量が低減できる。 この為、 全体的に試薬コス トを抑えることが可能 となり、 ランニングコストを低減することが出来る。
なお、 上記実施例では、 標識物として蛍光体 F AMを使用したが、 標識物はこれに限定されない。 種々の蛍光体、 さらに化学発光体、 生 物発光体、 りん光体、 放射性同位体、 微粒子など、 種々の標識が使用 でき、 同様の効果を得ることが出来る。
さらに、 修飾基としては、 リン酸基、 アミノ基、 チオール基、 ピオ チン、 ジゴキシゲニンなどを用いることができる。 どの修飾基も容易 に蛍光物質または化学発光物質を付加することができる。
また、 増幅法についても、 本実施例の P CRに限らず、 種々の方法 に適用でき、 同様の効果を得ることが出来る。 R CR (修復連鎖反応） 法、 TAS法、 3 S R法、 NAS BA法、 S P S R法、 LAT法、 S D A法など、 上記オリゴマーの混合物を用いて行われる方法であれば 特に限定されない。
標的核酸の増幅以外の反応も同時に行う反応 （例えば、 RT— P C R) においても、 標識プライマーと非標識のプライマーの混合量比を 1 ： ：!〜 1 ： 1 0 0 0 0、 より好ましくは、 1 ： 1 0〜 1 ： 5 0 0の 割合で混合し、 その総量が反応に適した濃度となるように用いて反応 を行う。 これにより、 生成核酸における発光強度又は放射活性が、 検 出又は分析に適合したものとなる。
プライマー混合溶液の ALD- FFプライマ一と ALD- FNプライマ一の比 と分離ピークの面積強度がほぼ比例しており、面積強度を ALD- FFブラ イマ一と ALD-FNプライマーの比で割ることで、生成核酸の総量を算出 することも出来る。
増幅反応後の生成 DN Aの中の標識物を計測する方法としては、 上 記のほか、 平板ゲルを使ったゲル電気泳動を使った検出装置等、 生成 核酸を分離しながら検出する装置が使用することが出来る。 さらに、 周知の蛍光偏光測定、 時間分解りん光検出エネルギー共鳴などを使つ たホモジニァス検出法等を使えば、 蛍光光度計、 マイクロプレートリ ーダなども使用することが出来る。 または、 未反応のオリゴマーの除 去を行う工程を行ってもよい。 実施例 2
本発明の標識 Z非標識の混合プライマーを用いる方法に基づく核酸 処理装置 （システム） について説明する。
装置構成は、 主に、 図 2に示したような抽出部、 増幅部、 及び検出 部からなる。
抽出部は、 検体から標的核酸を含む铸型となる核酸を抽出する機構 である。 実施例 1で説明した、 検体からの錶型 D N Aの抽出工程と同 様の機能を有する自動化ユニッ トである。 例えば、 特開 2 0 0 0— 1 6 6 5 5 6号記載の構成を有する機構部、 制御部等からなる。
増幅部は、 本発明の標識 非標識の混合プライマー、 例えば、 実施 例 1で説明した FORWARDプライマー混合溶液を用いて標的核酸の増幅 を行う機構である。 FORWARD プライマー混合溶液をはじめとする実施 例 1の増幅反応工程に記載の試薬溶液を保管し、 増幅用の温度サイク ラー、 抽出部の機構部と同様の試薬 · 溶液吸引用分注ノズル、 分注用 チップ、 分注用チップホルダ、 反応容器、 チップ抜き、 x y z移動用 アーム等で構成される。 上記抽出部のュニッ 卜を流用することも出来 る。
検出部とは、 生成核酸の検出および分析を行う機構である。
以下、 実施形態を添付図面に基づき説明する。 抽出部及び増幅部ュ ニッ トと、 検出ユニッ トに分割した装置構成としたが、 両方を一緒に した構成でも構成できる。 抽出部及び増幅部ュニッ トについて説明する。 図 7は抽出 · 増幅部 1 0 0の外観図、 図 8は、 抽出 · 増幅部 1 0 0の平面図、 図 9はノズ ルへのチップの取り付け動作説明図である。
基本的な動作の詳細は特開 2 0 0 0— 1 6 6 5 5 6に準じる。 シリンジ 1 0、 3 2は、 液体の吸引と吐出の制御を行う。 シリンジ
1 0、 3 2は、 それぞれ配管、 ノズルホルダー 1 7、 配管、 ノズルホ ルダ一 34を介して、 ノズル 3 6、 3 9に、 それぞれ独立に接続され ている。 また、 分注ノズル 3 6、 液体吸排用可動ノズル 3 9はノズル ホルダー 1 7、 34にそれぞれ固定されており、ノズルホルダー 1 7、
34は、 それぞれアーム 1 6， 3 3に Y方向 （図 7のアーム 1 6、 3
3の長手方向）、 Z方向 （図 7のアーム 1 6、 3 3の長手方向に直交す る方向） への移動が可能な状態で固定されている。
アーム 1 6、 3 3は、 それぞれ独立に X方向 （上記 Y方向及び Z方 向の両方向に直交する方向） への移動が可能であり、 Z方向の位置に 互いに差を持たせる事により、 X方向に互いにォ一バーラップするこ とができる。 これにより、 ノズルホルダ一 1 7、 34とアーム 1 6、
3 3の動作の組み合わせにより、 装置平面状の必要な部分へノズルを 移動することができる。
これらシリンジ、 アーム、 ノズルホルダー等の動作は制御操作部に より、 制御される
分注用のチップホルダ 1 4 (図 7、 図 8 ) には分注チップ 1 5を収 納することができ、 装置上に同じチップホルダ 14を複数個 （図では 1 4 a、 1 4 b、 1 4 c、 1 4 dの 4個） 設置することができる。 また、 反応容器ラック 2 3には反応容器 24が 48本設置でき、 精製品ラッ ク 2 5には精製品収納容器 2 6が 48本設置できる。 精製品ラック 2 5の下部には保冷機構が設置されており （図示せず）、 精製品ラック 2 5を保冷することができる。
また、 装置上には、 洗浄液ボトル 1 9、 溶離液ボトル 2 0、 希釈液 ボトル 2 1、 結合促進剤ボトル 2 2、 増幅反応用試薬容器 2 0 0をそ れぞれ 1ボトルずつ設置できる。 そして、 核酸捕捉チップラック 3 0 には、 分注チップ 3 1を 4 8本設置することができる。 尚、 溶離液ポ トル 2 0、 結合促進剤ボトル 2 2の底部には加温機構が設置されてお り （図示せず）、 ボトルを加温することができる。 また、 増幅反応用試 薬容器 2 0 0は冷却ュニッ 卜 2 0 1内に収められて冷却されている。 また、 装置上には、 増幅反応用の温度サイクラ一 2 0 2が設置され る。
チップの取り付けに際しては、 アーム 1 6とノズルホルダー 1 7の 動作を制御することにより、 チップホルダ 1 4上の目的とする分注チ ップ 1 5の上方へノズル 3 6を移動させる。 その後、 下方へノズルホ ルダー 1 7を移動し、 分注チップ 1 5の所定の位置とノズル 3 6とを 接触させる。 これにより、 ノズル 3 6の先端に分注チップ 1 5を自動 的に取り付けることができる。 これと同様の制御をノズル 3 9、 ノズ ルホルダー 3 4、 アーム 3 3に対して行うことにより、 ノズル 3 9の 先端に核酸捕捉チップ 3 1を取り付けることができる。
チップの取り外しは、 アーム 1 6とノズルホルダ一 1 7 とを動作制 御することにより、 チップ抜き 2 7を使って行う。 ノズルホルダー 3 4、 アーム 3 3似ついても同様に行う。
液受け 1 1、 2 8は、 ノズル 3 6、 3 9からの吐出液を受ける事が 可能で、 受けた液体は廃液として送られる。 洗浄部 1 8は、 流水の吐 出によりノズルホルダ一 1 7にノズル 3 6を介して取り付けられた分 注チップ 1 5を洗浄することができる。
核酸捕捉チップ 3 1は、 特開 2 0 0 0— 1 6 6 5 5 6に記載のもの を使用する。この場合の標的核酸を有する検体の核酸を捕捉し、回収、 増幅の動作を説明する。
まず、 アーム 1 6とノズルホルダー 1 7の動作を制御することによ り、 ノズル 3 6に分注チップ 1 5を所定の動作により取り付ける。 そ の後、 アーム 1 6とノズルホルダー 1 7、 及び、 シリンジ 1 0の動作 を制御することにより、 結合促進剤ボトル 2 2から所定量の結合促進 剤を分注チップ 1 5に吸引し、 更に、 所定量の空気を吸引する。 そし て、 分注チップ 1 5を洗浄台 1 8へ移動し、 分注チップ 1 5の外壁を 流水洗浄する。
分注チップ 1 5の外壁の洗浄後、 ノズルホルダー 1 7を検体ラック 1 2上の所定の検体 1 3の位置へ移動する。 シリンジ 1 0の動作を制 御することにより所定量の検体を分注チップ 1 5に吸引する。そして、 分注チップ 1 5の検体の吸引後、 ノズルホルダー 1 7を反応容器ラッ ク 2 3上に移動し、 ラック 2 3の所定の反応容器 2 4に分注チップ 1 5内の検体の全量を吐出する。
検体を反応容器 2 4へ吐出した後、 更に反応容器 2 4内の検体を分 注チップ 1 5により吸引と吐出を行うことにより、 検体と結合促進剤 を混合する。 検体と結合促進剤との混合後、 ノズルホルダー 1 7をチ ップ抜き 2 7の位置へ移動し、 上述した所定の動作によりノズル 3 6 から分注チップ 1 5を取り外す。
アーム 3 3とノズルホルダー 3 4の動作を制御することより、 ノズ ル 3 9に核酸捕捉チップ 3 1を所定の動作により取り付ける。その後、 ノズルホルダー 3 4を反応容器ラック 2 3上の上記混合液 （検体と結 合促進剤との混合液） の入った反応容器 2 4に移動する。 そして、 シ リンジ 3 2の動作を制御することにより、 核酸捕捉チップ 3 1の内部 へ上記混合液を吸引する。
所定の回数、 吸引と吐出とを繰返した後、 核酸捕捉チップ 3 1内に 反応容器 2 4内の混合液を吸引した後、 アーム 3 3、 ノズルホルダー 3 4の動作制御により、チップ 3 1を廃液口 2 9へ移動する。そして、 核酸捕捉チップ 3 1内の混合液をシリンジ 3 2の制御により廃液口 2 9へ吐出する。 混合液の廃液口 2 9への吐出後、 アーム 3 3、 ノズル ホルダ一 3 4の動作制御により液受け 2 8へチップ 3 1を移動する。 アーム 1 6 とノズルホルダー 1 7の動作を制御することにより、 ノ ズル 3 6に分注チップ 1 5を取り付けた後、 アーム 1 6とノズルホル ダ一 1 7、 及びシリンジ 1 0の動作を制御することにより洗浄液ポ卜 ル 1 9から所定量の洗浄液を吸引する。 そして、 ノズルホルダー 1 7 を動作させ、 反応容器ラック 2 3上の所定の反応容器 2 4上に洗浄液 を吐出する。
洗浄液の吐出後、 アーム 1 6とノズルホルダ一 1 7の動作を制御す ることにより、ノズルホルダー 1 7をチップ抜き 2 7の位置へ移動し、 所定の動作によりノズル 3 6から分注チップ 1 5を取り外す。
ノズルホルダー 1 7の移動後、 アーム 3 3、 ノズルホルダー 3 4の 動作を制御することにより、 洗浄液の入った反応容器ラック 2 3上の 所定の反応容器 2 4に核酸捕捉チップ 3 1 を移動する。 シリンジ 3 2 の動作により核酸捕捉チップ 3 1内へ洗浄液を吸引する。 洗浄液の吸 引後、シリンジ 3 2の動作により、所定の回数吸引と吐出を繰り返し、 固相 3 8を洗浄液により洗浄する。 所定の回数、 吸引と吐出を繰返し た後、 核酸捕捉チップ 3 1内に反応容器 2 4内の洗浄液を吸引する。 その後、 アーム 3 3、 ノズルホルダー 3 4の動作を制御することによ り、 核酸捕捉チップ 3 1を廃液口 2 9へ移動し、 核酸捕捉チップ 3 1 内の洗浄液をシリンジ 3 2の動作により吐出する。 洗浄液の吐出後、 アーム 3 3、 ノズルホルダー 3 4の動作により核酸捕捉チップ 3 1を 液受け 2 8へ移動させる。
必要に応じて、上記核酸洗浄工程は所定の回数繰返す。その際には、 上記核酸洗浄工程をそのまま繰返してもよいが、 複数回分の洗浄液を 分注チップ 1 5に吸引し、必要量を反応容器 2 4へ吐出する。そして、 洗浄液の吐出後、 液受け 1 1の位置へ移動し、 核酸捕捉チップ 3 1の 洗浄操作後、 再び必要量の洗浄液を反応容器 2 4へ分注チップ 1 5に より吐出することにより、 効率良く上記核酸洗浄工程を繰返すことが 出来る。
次に、 アーム 1 6とノズルホルダー 1 7の動作を制御することによ り、 ノズル 3 6に分注チップ 1 5を取り付けた後、 アーム 1 6とノズ ルホルダー 1 7、 及びシリンジ 1 0の動作により溶離液ポトル 2 0か ら所定量の溶離液を吸引し、 ノズルホルダー 1 7を反応容器ラック 2 3上の所定の反応容器 2 4に溶離液を吐出する。
溶離液の吐出後、 アーム 1 6とノズルホルダー 1 7の動作を制御す ることにより、ノズルホルダ一 1 7をチップ抜き 2 7の位置へ移動し、 所定の動作によりノズル 3 6から分注チップ 1 5を取り外す。
ノズルホルダ一 1 7の移動後、 アーム 3 3、 ノズルホルダー 3 4の 動作を制御することにより、 溶離液の入った反応容器ラック 2 3上の 所定の反応容器 2 4に核酸捕捉チップ 3 1を移動する。 そして、 シリ ンジ 3 2の動作により核酸捕捉チップ 3 1内へ溶離液を吸引する。 溶 離液の吸引後、 シリンジ 3 2の動作により、 所定の回数吸引と吐出を 繰り返し、 固相 3 8と溶離液とを接触させる。
所定の回数、 吸引と吐出を繰返し、 核酸捕捉チップ 3 1内に反応容 器 2 4内の溶離液を吸引する。 その後、 アーム 3 3、 ノズルホルダ一 3 4の動作を制御することにより、 精製品ラック 2 5に収納された所 定の精製品収納容器 2 6へ核酸捕捉チップ 3 1を移動する。 核酸捕捉 チップ 3 1内の溶離液をシリンジ 3 2の動作により、 収容容器 2 6に 吐出する。 溶離液の吐出後、 アーム 3 3、 ノズルホルダー 3 4の動作 により液受け 2 8へ核酸捕捉チップ 3 1を移動させる。必要に応じて、 上記溶離工程は所定の回数繰り返す。 その際には、 上記溶離工程をそ のまま繰返してもよいが、 複数回分の溶離液を分注チップ 1 5に吸引 し、 必要量を反応容器 2 4へ吐出する。 そして、 溶離液の吐出後、 液 受け 1 1の位置へ分注チップ 1 5を移動する。 核酸捕捉チップ 3 1の 吸引吐出操作後に、 再び必要量の溶離液を分注チップ 1 5により反応 容器 2 4へ吐出することにより、 効率良く上記溶離工程を繰返すこと が出来る。
上記工程終了後、 アーム 3 3、 ノズルホルダー 3 4の動作を制御す ることにより、ノズルホルダー 3 4をチップ抜き 2 7の位置へ移動し、 所定の動作によりノズル 3 9から核酸捕捉チップ 3 1 を取り外す。 そ の後右端に移動する。 上記工程で、 検体からゲノム D N A溶液を得ることが出来る。 次に増幅反応が行なう。
増幅反応用試薬容器 2 0 0には、 実施例 1記載のような増幅反応用 のプレミックスされた試薬溶液 （d N T P、 M g C l 2 、 T s pバ ッファー、 滅菌水、 T s p D N Aポリメラ一ゼ、 FORWARD プライマ —混合溶液、 REVERSE プライマー溶液等のプレミックス液） が収めら れている。
精製品収納容器 2 6内のゲノム D N A溶液を使い、 それに含まれる 標的核酸を増幅するための動作を説明する。 アーム 1 6とノズルホル ダー 1 7の動作を制御することにより、 ノズル 3 6にチップホルダ 1 4 d上の分注チップ 1 5を所定の動作により取り付ける。 その後、 ァ ーム 1 6とノズルホルダ一 1 7、 及び、 シリンジ 1 0の動作を制御す ることにより、 増幅反応用試薬容器 2 0 0から所定量の増幅反応用の プレミックスされた試薬溶液を分注チップ 1 5に吸引する。 その後、 ノズルホルダー 1 7を温度サイクラ一 2 0 2上に移動させ、 所定の増 幅用容器 2 0 3に分注チップ 1 5内の溶液を吐出する。 さらに、 同様 の操作で、 精製品収納容器 2 6内から必要量のゲノム D N A溶液を、 所定の増幅用容器 2 0 3に移し、 混合する。 その後、 所定の条件で P C Rなどの増幅動作を行う。 尚、 増幅用容器 2 0 3の蓋、 及び温度サ ィクラ一の蓋の開閉動作の説明は省略した。
上記工程で、 標的核酸の増幅が行われる。
次に、 増幅反応後の溶液 （一部） に、 ホルムアミ ドを混合し、 9 4 °C で 2分間熱変性を行った後、 周知の検出装置で測定を行う。 例えば、 キヤビラリ一アレイ電気泳動装置により測定する。 なお、 本実施例では、 増幅時には増幅反応用のプレミックスされた 試薬溶液を使用したが、 例えば、 それぞれの試薬を別々にして保管し ても良い。 さらに、 標識プライマーと非標識プライマーとを、 別々に 保管し、検出装置の情報を得て、増幅時に混合比率を決定して混合し、 増幅を行う構成にしても良い。 その場合、 必要な数の容器保管場所を 装置ユニッ ト内に準備し、 分注動作を行う。
本実施例により、 希釈工程の動作を省くことが出来るので、 装置構 成が簡単になる。 発明の効果
核酸増幅における、 標識され、 又は修飾されたオリゴマーの使用量 を低減できる。 この為、 核酸増幅処理、 及び核酸分析処理のコス トダ ゥンゃ工程簡略化を図ることができる。

Claims

請求の範囲
1
少なくとも以下のオリゴマーの混合物、 標的核酸を有する核酸、 及び 増幅試薬を用い、 該標的核酸に関連する配列を含む生成核酸を生産す る核酸増幅方法 ；
標的核酸に含まれる任意の特定配列とハイプリダイズでき、 発光体若 しくは放射性同位体で標識された、 又は修飾基を付加されたオリゴマ 一 A ；
前記特定配列とハイプリダイズでき、 オリゴマー Aと同じ物質で標識 されていない、 又はオリゴマー Aに付加された前記修飾基を付加され ていないオリゴマー B。
2 .
前記オリゴマー Aと前記オリゴマー Bの混合比率が 1 ： 1〜1 ： 1 0 0 0 0である請求項 1記載の核酸増幅方法。
3 .
前記オリゴマー Aと前記オリゴマー Bの混合比率が 1 ： 1 0〜1 ： 5 0 0である請求項 2記載の核酸増幅方法。
4 .
前記発光体が蛍光物質、 又は化学発光物質である請求項 1記載の核酸 増幅方法。
5 .
前記修飾基を付加されたオリゴマー Aが、 ピオチン化、 リン酸化、 ァ ミノ化、 ジゴキシゲニン化、 又はチオール化されたオリゴマーである 請求項 1記載の核酸増幅方法。
6 .
以下のオリゴマーを含む、 標的核酸に関連する配列を含む生成核酸を 生産できるオリゴマーのキッ 卜 ；
標的核酸に含まれる任意の特定配列とハイプリダイズでき、 発光体ま たは放射性同位体により標識され、 又は修飾基を付加されたオリゴマ 一 A ；
前記特定配列とハイプリダイズでき、 オリゴマー Aを標識する前記発 光体若しくは放射性同位体により標識されておらず、 又はオリゴマー Aに付加された前記修飾基を付加されていないオリゴマ一 B。
7 .
前記オリゴマー Aと前記オリゴマー Bの存在比率が 1 ： 1〜 1 ： 1 0 0 0 0である請求項 6記載のオリゴマーのキッ 卜。
8 .
前記オリゴマー Aと前記オリゴマー Bの存在比率が 1 ： 1 0〜 1 ： 5 0 0である請求項 7記載のオリゴマーのキッ ト。
9 .
前記発光体が、 蛍光物質又は化学発光物質である請求項 6記載のオリ ゴマーのキッ 卜。
1 0 .
前記修飾基を付加されたオリゴマー Aが、 ピオチン化、 リン酸化、 ァ ミノ化、 ジゴキシゲニン化、 又はチオール化されたオリゴマーである 請求項 6記載のオリゴマーのキッ ト。
1 1 以下の工程を含む、 核酸の分析方法 ；
少なくとも以下のオリゴマーの混合物、 標的核酸を有する核酸、 及び 増幅試薬を用いて、 該標的核酸に関連する配列を含む生成核酸を生産 する増幅工程 ；
( A ) 標的核酸に含まれる任意の特定配列とハイブリダィズでき、 発 光体若しくは放射性同位体により標識され、 又は修飾基を付加された ォリゴマー A ；
( B ) 前記特定配列と八イブリダィズでき、 オリゴマー Aを標識する 前記発光体若しくは放射性同位体により標識されておらず、 又はオリ ゴマー Aに付加された前記修飾基を付加されていないオリゴマー B ； オリゴマー Aが前記修飾基を付加されている場合、 該修飾基に発光体 を結合する結合工程 ；
前記発光体または放射性同位体を検出する検出工程。
1 2 .
請求項 1 1記載の分析方法であって、 以下の工程を含む方法 ； 検出された発光体又は放射性同位体の量に基づいて、 生成核酸の量を 算出する演算工程。
1 3 .
請求項 1 2記載の分析方法であって、 前記演算工程が、 前記オリゴマ 一 Aと前記オリゴマー Bの混合比率に基づいて、 生成核酸の量を算出 する方法。
1 4 .
請求項 1 1記載の分析方法であって、 前記増幅工程終了時若しくは前 記結合工程終了時の生成核酸を含む反応液中の発光体、 又は放射性同 位体で標識された標的核酸の濃度が、 前記検出工程で用いる検出装置 の測定可能範囲である方法。
1 5 .
以下の構成を含む、 標的核酸に関連する配列を含む生成核酸の生産装 置；
標的核酸に含まれる任意の特定配列とハイプリダイズでき、 発光体若 しくは放射性同位体により標識され、 又は修飾基を付加されたオリゴ マー Aを保持する保持容器 A ；
前記特定配列とハイプリダイズでき、 オリゴマー Aを標識する前記発 光体若しくは放射性同位体により標識されておらず、 又はオリゴマー Aに付加された前記修飾基を付加されていないオリゴマー Bを保持す る保持容器 B ；
少なくとも前記オリゴマー A、 前記オリゴマー B、 増幅試薬、 及び標 的核酸有する核酸を含む水溶液を保持できる核酸増幅容器 ； 前記核酸増幅容器に、 所定量の前記オリゴマー Aと所定量の前記オリ ゴマー Bを供給する供給機構。
1 6 .
前記供給機構の供給する前記オリゴマー Aと前記オリゴマー Bの供給 比率が 1 ： 1〜 1 ： 1 0 0 0 0である請求項 1 5記載の生産装置。
1 7 .
前記供給機構の供給する前記オリゴマー Aと前記オリゴマー Bの供給 比率が 1 ： 1 0〜 1 ： 5 0 0である請求項 1 6記載の生産装置。
1 8 .
以下の構成を含む、 標的核酸を検出する核酸分析装置 ；
以下のオリゴマー、 増幅試薬、 及び前記標的核酸を含む核酸を保持で き、 前記標的核酸に関連する配列を含む生成核酸を生産できる核酸増 幅容器 ；
( A )標的核酸に含まれる任意の特定配列とハイブリダィズでき、 発 光体若しくは放射性同位体により標識され、 又は修飾基を付加された ォリゴマー A ；
( B ) 前記特定配列とハイブリダィズでき、 オリゴマー Aを標識する 前記発光体若しくは放射性同位体により標識されておらず、 又はオリ ゴマー Aに付加された前記修飾基を付加されていないオリゴマー B ； 前記発光体若しくは放射性同位体、 又は前記修飾基と結合した発光体 を検出する検出機構。
1 9 . 以下の構成を含む、 請求項 1 8記載の核酸分析装置 ； 検出された発光体の量に基づいて算出された前記生成核酸の量に依存 する情報を表示する表示機構。
2 0 .
請求項 1 9記載の核酸分析装置であって、 前記表示機構が、 オリゴマ 一 Aとオリゴマー Bの混合率に基づいて、 前記生成核酸の量を算出す る装置。
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