JPH07107999A - 遺伝子解析方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 遺伝子診断技術における遺伝子解析の方法及
びその装置に関する。 【構成】 生体試料より生体又はウイルスの核酸を抽出
し、これに特定塩基配列を有し、特異的な相互作用を有
した物質を標識したオリゴヌクレオチドプライマーと、
４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、及びＤＮＡ合
成酵素を作用させて、該特定塩基配列を選択的に増幅さ
せる反応を行い、次いで増幅された該特定塩基配列に相
補的で、且つ該増幅反応で用いた該オリゴヌクレオチド
プライマーと異なる塩基配列を有し、蛍光標識されたオ
リゴヌクレオチドプローブと、ハイブリダイゼイション
反応させ、次いで該オリゴヌクレオチドプライマーの該
標識物と相互作用を有する物質を結合させた微粒子を用
いて、該オリゴヌクレオチドプローブの精製を行い、次
いで該蛍光標識物の濃度を検出することにより、該生体
試料中に該特定塩基配列の存在を検出する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、遺伝子診断技術におけ
る遺伝子解析の方法及びその装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】生体試料中の遺伝子を解析することによ
り、感染症の診断や遺伝子診断が可能となってきた。遺
伝子診断を行う上で重要な技術に、特開昭６１−２７４
６９７等に示すＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａ
ｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ）法がある。この技術は特定の
塩基配列を持つ領域を、この領域のセンス鎖およびアン
チセンス鎖の、それぞれ上流の塩基配列を持った核酸断
片をもちいて、ＤＮＡ合成酵素による鋳型伸長反応を繰
り返すことで、１０万倍〜１００万倍に増幅し、試料中
にただ１つの標的部位でも選択的に増幅することが出来
る。そのため元の試料も、毛髪１本や１滴の血液程度の
微量な試料から、ゲノムの特定領域を簡便に増幅でき
る。このような特徴を持つＰＣＲ法は感染症や遺伝病の
診断等の臨床検査や、法医学の分野での個人認識等に広
く用いられている。

【０００３】従来の感染症の遺伝子診断法は、被検者の
血液等の生体試料を採取し、ＰＣＲ増幅を用いて、ウイ
ルスの持つ遺伝子領域が増幅したかしないかを判定して
いる。増幅の有無はこの反応液をアガロースやポリアク
リルアミド等のゲルに乗せ電気泳動し、ＤＮＡをエチジ
ウムブロミド（ＥｔＢｒ）で染色することにより、既知
の遺伝子領域の大きさのＤＮＡバンドがあるか無いか
を、目視により判定している。

【０００４】また電気泳動を用いないで、ＰＣＲ増幅さ
れた遺伝子を検出する方法に、増幅産物と相補的に結合
するオリゴヌクレオチドプローブで相補鎖結合（ハイブ
リダイゼイション）をおこなう方法がある。実験医学８
巻，９号：（１９９０）１０２〜１０６記載の方法は、
一本鎖ＤＮＡが疎水性表面のプラスチックに吸着するこ
とを利用し、増幅された二本鎖ＤＮＡを変性して一本鎖
ＤＮＡに解離して、マイクロプレートに吸着させ、これ
にビオチン標識したオリゴヌクレオチドプローブとハイ
ブリダイゼイション反応を行い、これにβ−ガラクトシ
ダーゼ標識したストレプトアビジンを加え、ビオチンと
ストレプトアビジンとの結合を利用して、β−ガラクト
シダーゼの蛍光を検出する方法がある。増幅反応を行っ
た反応液に、目的の領域の増幅反応が起こってない場
合、ハイブリダイゼイション反応は起こらないので、蛍
光標識物の検出はない。

【０００５】尚これらのプロセスは、手操作で行ってい
る。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上記のような検出方法
をはじめ、生体試料からゲノムを抽出するプロセス、及
びＤＮＡ増幅の反応液の調製プロセスはこれまで手操作
で行われており、大変な労力を要している。特に多数の
試料を手操作で処理するには、過酷であり時には調製ミ
スを起こす可能性がある。またこれらのプロセスは、液
体の注入、混合、分離、加温、冷却等の操作を繰り返す
作業であるので煩雑であり、また再現性良く試料調製を
行うには熟練を要する。さらに取り扱う生体試料には検
査者に感染する恐れのあるウイルスや、環境を汚染する
細菌等も含まれる為、組み換えＤＮＡ実験指針に示す法
律等に従って、作業所全体を隔離したり、クリーンベン
チを使用する等、取り扱い場所を限定し厳重な注意を払
う必要がある。

【０００７】これらの課題を解決するには、生体試料か
らのゲノムの抽出から検出までのプロセスを一貫して行
う自動化装置の開発が重要である。プロセスの自動化に
関しては、特開平３―１２５９７２に示すＤＮＡ抽出精
製装置があるが、検出手段は設けられていない。従来の
検出手段は、前述したとおりであるが、手操作で行うこ
とは簡単でも、そのまま自動化するには課題が多い。電
気泳動法を自動化する場合、ゲルを再現性良く作成する
工程や、試料をゲルに充填する操作に熟練を要するた
め、手操作でしか行うことが出来なかった。

【０００８】一方電気泳動法独自の課題として、検出時
間が長いことが挙げられる。これは電気泳動法での検出
には、１００ｎｇ以上のＤＮＡが必要であり、このため
ＰＣＲ増幅におけるサイクル数を増加させ、ＰＣＲ産物
のコピー数を増加させる必要があった。よってＰＣＲ増
幅にかかる時間及びゲルの作成から電気泳動でＤＮＡを
分離する時間は全部で６時間以上かかる。また電気泳動
法では、目的の遺伝子と目的外の遺伝子が共にゲル中で
の移動度が同じである場合、診断における偽陽性を判断
することは困難である。特にＰＣＲ増幅法では、オリゴ
ヌクレオチドプライマーの設計や反応緩衝液組成、及び
温度サイクルの条件等、増幅条件の如何によって、目的
の遺伝子領域でないものも同時に多数増幅し、判断がで
きなくなる問題があった。

【０００９】このような問題を解決するには、増幅した
ＤＮＡの塩基配列を直接観察することが必要で、ハイブ
リダイゼイションや塩基配列決定をするなど、対策が必
要である。一方、前述したβ−ガラクトシダーゼの蛍光
を検出する方法は、電気泳動法を用いないため、上記の
問題の解決する一つの発明であり、自動化も可能である
が、目的の増幅したＤＮＡの塩基長により、ハイブリダ
イゼイションの効率が悪くなることや、吸着の条件を最
適化する操作が難しいこと、および定量性にかける問題
がある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】上記課題を達成するため
には、自動化に適したプロセスを構築することが重要で
あり、本発明者らは鋭意研究の結果、予め標識したオリ
ゴヌクレオチドプライマーとＤＮＡ合成酵素を作用さ
せ、分析対象試料中の任意の特定塩基配列を選択的に増
幅し、その増幅の有無を該特定塩基配列内に相補的であ
り、且つ蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブを
作用させ、その蛍光標識を検出する簡便な方法を見出
し、本発明を完成するに至った。すなわち本発明のプロ
セスを図１を用いて説明すると、（１）生体試料より生
体又はウイルスの核酸を含むＤＮＡを抽出する工程６２
と、（２）これに特定塩基配列を有し、特異的な相互作
用を有した物質を標識したオリゴヌクレオチドプライマ
ーと、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、及びＤ
ＮＡ合成酵素を作用させて、該特定塩基配列を選択的に
増幅させる反応を行う工程６３と、（３）該特定塩基配
列に相補的で、且つ該増幅反応で用いた該オリゴヌクレ
オチドプライマーと異なる塩基配列を有し、蛍光物質を
標識したオリゴヌクレオチドプローブとＤＮＡ増幅工程
の反応物を、ハイブリダイゼイション反応させる工程６
４と、（４）該オリゴヌクレオチドプライマーの該標識
物と相互作用を有する結合物を結合させた微粒子を用い
て、該オリゴヌクレオチドプローブの精製を行う工程６
５と、（５）該蛍光標識物の濃度を検出する工程６６
と、（６）該蛍光標識物の検出データを記憶し、基準値
と比較して該特定塩基配列の有無を判定する工程によっ
て、該生体試料中に該特定塩基配列の存在を検出するこ
とを特徴とするものである。

【００１１】またこれを実行する本発明の装置は、該生
体試料及び液体を保持する容器と、これに液体を分注、
混合、及び除去する分注機と、該容器内の液体を冷却す
る保冷室と、該容器内の液体を加温する加温機と、該蛍
光標識物を検出する検出器と、該容器を該分注機、該保
冷室、該加温機、該検出器間に搬送する搬送機と、該分
注機、該保冷室、該加温機、該検出器、該搬送機を制御
し、且つ該検出器の検出データを解析し、解析結果を判
定するコントローラと、該分注機、該保冷室、該加温
機、該検出器、該搬送機の作動空間を覆い、装置内部作
業空間と装置外部空間を遮断する筐体を備えたことを特
徴とするものである。

【００１２】

【作用】以下本発明の作用を詳述する。

【００１３】（１）ＤＮＡ抽出工程 生体試料から核酸を抽出しやすくするため、生体試料の
蛋白質を熱変性させ、更に界面活性剤を作用させて変性
させる。次いで蛋白質分解酵素を混入後、該酵素作用温
度に保持することによって、ゲノムＤＮＡを核内蛋白よ
り単離する。次いで、これらの反応液を加熱し、蛋白質
分解酵素を失活させる。本発明における生体試料として
は、組織細胞、菌体、培養細胞などが用いられ、新鮮な
試料に限らず凍結保存やホルマリン保存されたものも用
いられ、特に限定されるものでない。

【００１４】一般的な蛋白質の熱変性は、生体試料を適
当なバッファに懸濁し、９０℃以上に保持することで行
われる。界面活性剤として用いられるものには、陰イオ
ン性界面活性剤である、ドデシル硫酸アンモニウム（Ｓ
ＤＳ）や、Ｎ−ドデシルサルコシン酸ナトリウム（Ｓａ
ｒｋｏｓｙｌ）及び、非イオン性界面活性剤である、ポ
リオキシエチレンオクチルフェニルエーテル（商品名：
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、及びＮｏｎｄｉｅｔＰ−４
０）が用いられるが、これらに限定されるものではな
い。

【００１５】（２）ＤＮＡ増幅工程 本発明の解析方法を以下、図２に基づき説明する。

【００１６】ＤＮＡ配列中の、検出しようとする領域と
相補する塩基配列を持つオリゴヌクレオチドプライマー
１を準備する。また逆鎖の塩基配列を有するオリゴヌク
レオチドプライマー２を準備しその５’末端付近に標識
物３を標識しておく。これらの塩基長は、２０塩基以上
３５塩基前後迄が望ましいが、少なくとも８塩基以上あ
ればオリゴヌクレオチドプライマーとして使用出来る。

【００１７】本発明に用いられるオリゴヌクレオチドプ
ライマーは分析しようとする遺伝子ＤＮＡに合わせて、
適宜任意調製して使用するものであり、プライマーとし
て機能しうるものであれば特に限定されるものでなく、
又その調製に際しては通常行われているＤＮＡ合成機等
を用いて行えば良い。本発明の実施例では、標識物３は
ビオチンを用い、後述の精製処理時に必要な結合体７に
ストレプトアビジンをもちいて、これらの親和性結合を
利用するが、他の結合であっても同様に利用することが
出来る。

【００１８】ＤＮＡ増幅工程は、得られたゲノムＤＮＡ
と、準備したオリゴヌクレオチドプライマー１，２と、
ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰの４種類のデ
オキシヌクレオチド三リン酸と、ＤＮＡ合成酵素およ
び、ＤＮＡ合成酵素活性の得られる反応緩衝液を加え、
常法に従ってＰＣＲ増幅を行う。ＤＮＡ合成酵素には、
サーマス アクチカスより精製された、Ｔａｑ ポリメ
ラーゼ（Ｃｅｔｕｓ）が用いられるが、これに限定され
るものではなく、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ等のＤＮ
Ａ合成酵素も使用することが出来る。

【００１９】ＰＣＲ増幅方法を具体的に説明すると、対
象のゲノムＤＮＡを９０度以上の高温で１本鎖に解離さ
せ（デナチュレーション反応）、次いで相補鎖が結合す
る温度に保持する（アニール反応）。ついでＤＮＡポリ
メラーゼの活性温度に保つと、アニール反応時におい
て、オリゴヌクレオチドプライマー１、および２が、ゲ
ノムＤＮＡにアニールしていれば、ＤＮＡ合成酵素がデ
オキシヌクレオチド三リン酸を取り込み、鋳型伸長反応
を行い（エクステンション）、目的の領域を含む二本鎖
ＤＮＡが合成される。ついで再びデナチュレーション反
応を行い一本鎖に解離させ、それぞれの一本鎖ＤＮＡ
に、もう一方のオリゴヌクレオチドプライマーとアニー
ル反応が起これば、特定の長さの目的の二本鎖ＤＮＡ４
が得られ、これらの工程を２０から３０回繰り返すと、
目的の二本鎖ＤＮＡ４が１００万コピー以上得られる。

【００２０】得られたゲノムＤＮＡ中に目的のＤＮＡ領
域がない場合、目的の塩基長を持つ二本鎖ＤＮＡ４は産
生されない。尚、それぞれのオリゴヌクレオチドプライ
マー１および２は、数１０ｐｍｏｌの等量を加える場合
が一般的であるが、オリゴヌクレオチドプライマー１を
数ｐｍｏｌの制限量加え、もう一方の標識したオリゴヌ
クレオチドプライマー２を、オリゴヌクレオチドプライ
マー１の１０から１００倍量加え、二本鎖ＤＮＡより多
くの一本鎖ＤＮＡを得る方法もあり、いずれの方法も有
効である。

【００２１】（３）ハイブリダイゼイション工程 ＤＮＡ増幅工程を行った反応液に、オリゴヌクレオチド
プローブ５を作用させる（ハイブリダイゼイション）。
このオリゴヌクレオチドプローブ５の塩基配列は、目的
とするＤＮＡ配列中の、オリゴヌクレオチドプライマー
１および２の配列以外を選択し、更にこのオリゴヌクレ
オチドプローブ５の５’末端或いは５’末端から数塩基
内側の領域に蛍光色素６が標識されたものを準備する。
このオリゴヌクレオチドプローブ５の塩基長は、２０塩
基以上であれば使用可能であり、好ましくは３０から５
０塩基あればより確実であるが、塩基長が長鎖となれば
切断されやすくなり、その取り扱いや、合成に手間が掛
かるため、２０から３０塩基前後のものが適切である。

【００２２】本発明において蛍光色素６は後述の検出器
の構成を考慮する必要があるが、良く用いられるものと
して、テキサスレッドやフルオレセインイソチオシアネ
イト（ＦＩＴＣ）があり、適当な蛍光が得られる蛍光色
素であれば、何等これらに限定されるものではない。ハ
イブリダイゼイション反応は、二本鎖ＤＮＡ４を変性さ
せ、一本鎖ＤＮＡに解離し、次いで一本鎖ＤＮＡとオリ
ゴヌクレオチドプローブ５と相補鎖に結合させる方法で
ある。一般的な変性方法にはアルカリ変性と熱変性があ
るが、熱変性の方が簡便である。具体的には、ＰＣＲ増
幅反応後の反応液に、オリゴヌクレオチドプローブ５を
混合し、反応液温度を９０℃〜９５℃に保ち、次いで反
応液温度を４０〜７０℃の温度に保ち、その後４℃に急
冷する。尚、反応液の温度は上記の限りでなく、対象と
なる遺伝子の塩基配列や塩基長により異なるため、最も
効率良くハイブリダイゼイション反応が起こるよう各々
の温度を調節しなければならない。

【００２３】（４）精製工程 ハイブリダイゼイション工程を行った反応液に、標識物
３との結合物７をコートした磁気ビーズ８を混在させ、
次いで容器１０外より磁気９を作用させる。この過程に
おいてＤＮＡ増幅工程で使用した、標識物３であるビオ
チンが、結合物７であるストレプトアビジンと特異的結
合を起こし、磁気ビーズ８に結合し、次いで容器１０外
からの磁気的作用により磁気ビーズ８は強磁性体となり
容器１０内に凝集する。この後ピペッタを用いて洗浄液
を添加後、洗浄液の吸引と排出を繰り返すと、精製工程
は終了する。この精製においてＤＮＡ増幅工程で用いた
オリゴヌクレオチドプライマー２は、ＤＮＡ増幅工程で
目的の二本鎖ＤＮＡ４の増幅の有無に係らず容器１０内
に残留する。目的の二本鎖ＤＮＡ４の増幅産物がある場
合、これにハイブリダイゼイション工程で結合した、オ
リゴヌクレオチドプローブ５が容器内に残留する。結合
物７をコートした磁気ビーズに用いられるものとして
は、ダイナル社製のダイナビーズＭ−２８０ストレプト
アビジンがあり、これは粒径２．８μｍポリスチレンビ
ーズに、ストレプトアビジンが化学的に結合されている
ものであるが、これに限定されるものではない。

【００２４】（５）検出工程 精製工程を行った反応液に、ハイブリダイゼイション工
程で用いた蛍光色素６に、蛍光色素６の励起波長５４を
照射し、発光波長５５を光電子倍増素子によって検出す
る。この方法において検出器の構成としては光源４８、
照射部、発光を調整する調整部、発光を受光する受光部
を備えている。本発明において蛍光色素６にＦＩＴＣを
用い、その極大励起波長である４９４ｎｍを、アルゴン
レーザを光源４８として調整して照射し、発光波長５１
８ｎｍをホトダイオードを用いているが、蛍光色素に他
の物質を用いても、これらの蛍光色素の励気波長を与え
る適当な光源があれば、同様に用いることが出来る。例
えば、テキサスレッドを用いるならば、その励気波長５
９４ｎｍをヘリウム−ネオンレーザが使用出来、ローダ
ミンを用いるならば、その励気波長５７８ｎｍをヘリウ
ム−ネオンレーザ或いはヤグレーザが使用出来る。

【００２５】（６）判定工程 検出器での該蛍光標識物の検出データはＣＰＵに転送さ
れ、記憶される。次いで、検出データは目的別に設定さ
れた基準値と比較され、特定塩基配列が増幅したかしな
いかを判定し、表示パネルに表示する。また検出データ
は増幅したＤＮＡの量に相関があるので、定量的な測定
にも使用することが出来る。なお基準値は、目的別の特
定塩基配列の濃度に応じた蛍光強度をもとに設定されて
いる。

【００２６】次いで、本発明を実行する遺伝子診断装置
の作用を説明する。

【００２７】この発明にかかる遺伝子診断装置において
は、一体成型して作られた容器は多数の独立した孔が設
けられており、多数の試料を一度に処理することがで
き、また分注機が設けられているから、試薬を定量的に
概容器に分注することや、混合及び吸引除去が出来るた
め、ＤＮＡ抽出工程におけるＳＤＳや蛋白質分解酵素の
注入、及びＤＮＡ増幅工程におけるオリゴヌクレオチド
プライマー１及び２、４種のデオキシヌクレオチド三リ
ン酸、ＤＮＡ合成酵素、反応緩衝液の添加、及びハイブ
リダイゼイション工程におけるオリゴヌクレオチドプロ
ーブ５、及び精製工程における磁気ビーズ８等の添加、
混合、オリゴヌクレオチドプローブ５の吸引除去を行う
ことが出来る。また保冷室が設けられているから、生体
試料及び試薬の保存が出来る。また加温機が設けられて
いるから、容易に容器内の液体を加温することが出来る
ので、ＤＮＡ抽出工程における生体試料の加熱、蛋白質
分解酵素の作用温度の保持、及びＤＮＡ増幅工程におけ
る、対象のゲノムＤＮＡを９０度以上の高温で１本鎖に
解離させる温度、相補鎖が結合する温度、ＤＮＡ合成酵
素を活性させ、デオキシヌクレオチド三リン酸を取り込
み鋳型伸長反応が行われる温度、及びハイブリダイゼイ
ション工程における、二本鎖ＤＮＡを変性させ、一本鎖
ＤＮＡに解離する温度、次いで一本鎖ＤＮＡとオリゴヌ
クレオチドプローブと相補鎖に結合させる温度に容易に
保持することが出来る。また検出器が設けられているか
ら、検出工程におけるハイブリダイゼイション工程で用
いたオリゴヌクレオチドプローブの標識物である蛍光色
素に、蛍光色素の励起波長を照射し、発光波長を光電子
倍増素子によって容易に検出することが出来る。また、
搬送機によって容器を上記分注機、上記保冷室、上記加
温機、上記検出器間に搬送することが出来る。また上記
分注機、上記保冷室、上記加温機、上記検出器、上記搬
送機の作動空間を覆い、装置内部作業空間と装置外部空
間を遮断する筐体が設けられているから、生体試料を閉
じ込めた状態で処理することができるので、作業者や環
境を汚染することなく遺伝子解析を行うことが出来る。

【００２８】このように生体試料を解析するために必要
な、試薬の分注、混合、遠心分離操作、加温の操作がコ
ントローラによりプログラマブルに実行できるため、試
料の調製を自動で行うことが出来る。そして検出器によ
って、調製された試料の調製結果を得ることが出来る。

【００２９】

【実施例】遺伝子解析装置の構成を図３に示す。１２は
容器を示し、一つの容器に横８列縦１２列合計９６の孔
１３が設けられており、それぞれの孔１３に調べたい試
料１４を保持し、この孔１３のそれぞれの中で試料調製
が行われる。１５は分注装置を示し、詳細は後に記載す
るが、この分注機１５は、使い捨てのチップ内に液体を
保持し、試薬容器から試料容器へ、定量的に液体を注入
したり、試料から不要な液体を吸引し除去したり、試料
内にチップ先端を保持し、吸引及び吐出を繰り返すこと
で、液体と試料の混合を行うことが出来る。１６は加温
機を示す。この加温機１６は、設置された容器１２内の
液体を、任意の温度で任意の時間保持することが出来、
連続的に酵素反応及び生化学反応を制御することが出来
る。１７は保冷室であり、容器１２内の試料及び試薬を
保存することが出来る。１９は検出器であり、容器１２
内の試料の調製結果を調べる機構であり、詳細は後に記
載するが、光源、試料への照射部、試料台、検出部から
なる。２０は搬送機を示し、その先端は容器１２を水平
に保持し移動することが出来、容器１２を分注機１５、
加温機１６、保冷室１７、検出器１９のそれぞれへ搬送
することが出来る。２１はコントローラであり、分注機
１５、加温機１６、保冷室１７、検出器１９、及び搬送
機２０の各機構をプログラマブルに動作させる。またコ
ントローラ２１は試料調製中の動作を監視し、更に試料
調製の結果を取り込み、遺伝子解析の判定を行う。また
本装置の分注機１５、加温機１６、保冷室１７、検出器
１９、及び搬送機２０を覆うよう、筐体６８が設けられ
ており、試料調製中は試料を装置内に閉じ込める作用が
ある。

【００３０】このように試料調製における基本動作であ
る、液体の分注、分離、混合、および液体の保温、保存
を行うことができるので、様々な酵素反応や液体の分離
が可能であり、以下示すような試料調製を本装置は実行
することが出来る。尚、遺伝子解析の対象は本実施例の
限りでなく、既知の遺伝子領域であれば、如何なるＤＮ
Ａ領域にも対処することが出来る。

【００３１】１．遺伝子抽出方法 本装置に用いる試料は、血液、組織細胞、精液等の生体
試料が挙げられる。これらは採取しやすいので遺伝子解
析では良く用いられる試料である。血液をそのままの状
態で遺伝子診断に用いる場合、白血球細胞や血清中より
ＤＮＡを抽出する。血液１μｌ中に白血球は約５０００
個含まれ、５０μｌの血液があれば約１μｇのゲノムＤ
ＮＡが得ることができ、ゲノムの診断における点突然変
異の検出や、遺伝子多型を調べて個人の識別が可能であ
る。またウイルスの感染の診断の場合、症状が認められ
るほどの感染後期であれば、１ｍｌ以下の血液量で感染
菌の同定を診断することが出来る。

【００３２】以下、ゲノムＤＮＡの抽出方法を記載す
る。

【００３３】血液からゲノムを抽出する場合を、図３お
よび図４を用いて説明する。容器１２の孔１３それぞれ
に、血液５０μｌ分注し、次いでＴＮＥバッファ（１０
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ
ＥＤＴＡ）を１００μｌ分注する。次いで１０％ＳＤＳ
を１０μｌ分注し、この際分注機１５によって血液とＴ
ＮＥバッファ及びＳＤＳを混合する。次いで加温機１６
に容器１２を設置し、９５度で５分加熱する。この操作
により血液成分の蛋白質はほぼ変性され、ゲノムは核外
へ放出される。この後容器１２を分注機１５へ移動し、
蛋白質分解酵素であるプロテイナーゼＫ（１０ｍｇ／ｍ
ｌ，ＳＩＧＭＡ社製）を５μｌ分注し混合する。次いで
加温機１６に容器１２を設置し、５５度で３０分加熱す
る。この操作により、ゲノムＤＮＡが巻きついたヒスト
ンを分解し、増幅反応が行われ易くする。この反応液を
９０℃で５分加熱し、この後１０μｌを増幅反応へ持ち
越す。診断対象がｍｔＤＮＡの場合を説明する。ｍｔＤ
ＮＡは生化学辞典（東京化学同人発行）によると、ミト
コンドリアは１細胞当たり１００から２０００個含ま
れ、ヒトの場合１０００から２０００個含まれる。ミト
コンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）はヒストンと結合され
ておらず、プラスミド状態である。このため本発明での
抽出方法では、ゲノムＤＮＡの抽出とは異なり、９５度
で５分加熱する熱変性だけで、増幅には十分な量のＤＮ
Ａが得られる。

【００３４】診断対象がメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮ
Ａ）の場合を説明する。生体試料中にはリボヌクレアー
ゼ（ＲＮａｓｅ）が含まれており、ｍＲＮＡを分解する
ので、採取した生体試料はすぐさまフェノールやクロロ
ホルム等の有機溶媒を混合し、遠心分離操作を行い、Ｒ
Ｎａｓｅを分解することが望ましいが、本発明では遠心
分離操作を省いている。よってこの場合の遺伝子抽出方
法はＤＮＡと同様に行う。この後ｍＲＮＡは直接ＰＣＲ
増幅を行うことが出来ないので、逆転写酵素により相補
的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を合成する必要がある。本実施例
では既知の領域に相補するプライマーを用い、既知領域
のｃＤＮＡの合成を行う。ｃＤＮＡの合成方法を詳述す
ると、生体試料を前述のゲノムＤＮＡの抽出方法と同様
に行い、ｍＲＮＡを準備する。次いでこれに以下の試薬
２０μｌを混入する。

【００３５】１×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ １ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ（Ｔ
ａｋａｒａ） ２０ｕｎｉｔｓ ＲＮａｓｅ インヒビター（Ｔａｋａ
ｒａ） １μｇ アンチセンス プライマー ２００ｕｎｉｔ 逆転者酵素（リバース トランスクリ
プターゼ ＸＬ，Ｔａｋａｒａ） これらの反応液を調
製し、３７℃で１時間反応を行えばｃＤＮＡが得られ
る。

【００３６】一方ウイルスゲノムの検出においての抽出
方法は、ウイルスゲノムにはＤＮＡウイルスとＲＮＡウ
イルスがあるが、上記の方法と同様である。この場合、
ウイルス感染初期では、ウイルスの数はごくわずかであ
るため、通常のＰＣＲ増幅では、検出できる感度まで増
幅できないない恐れがある。この場合、用いる生体試料
の量を増加させるか、ＰＣＲ増幅の温度サイクル数を増
やしたり、増幅率を向上させる必要がある。本発明では
容器の容量に制限があるため、生体試料の量をｍｌオー
ダに増加させることはできないが、一度の処理を大量に
行なえるため、同一試料からのスクリーニング回数を増
やすことによって、感度を向上させることが出来る。

【００３７】２．遺伝子増幅方法及び検出方法 １．によって得られた遺伝子をＰＣＲ増幅法を用いて各
目的の領域を増幅し、検出を行った。

【００３８】（１）ヒトゲノムの点変異検出の例 ヒトのフェニルケトン尿症の遺伝子解析による診断例
に、実験医学，８巻，９号：（１９９０）１３５頁〜１
３９頁がある。これによるとフェニルケトン尿症は、点
変異による遺伝子異常によりアミノ酸置換がおこり、臨
床的には知能低下やけいれんが認められ、現在は新生児
マススクリーニングの対象となっている。我々は、この
報告をもとに、既知の塩基配列に遺伝子異常があるか無
いかを、この遺伝子領域の増幅の有無により調べる方法
に、本発明を用いた。まず計９６人分のフェニルケトン
尿症患者の血液と、正常人の血液を入手し、１．の方法
に従って、ＤＮＡを１μｇ抽出した。フェニルケトン尿
症患者に特異な遺伝子領域であるエクソン１２は点変異
によって、正常はＡｒｇ（ＣＧＧ）であるのに対し、異
常ではＴｒｐ（ＴＧＧ）になっている。プライマの設計
は、この変異部位のＣが、オリゴヌクレオチドプライマ
ーの３’端にマッチするプライマ１と、逆鎖のプライマ
２をＤＮＡ合成機（ＡＢＩ ３９０Ａ）により合成し
た。このプライマ１と２がマッチする場合、ＰＣＲ増幅
は行われ、２４５ｂｐの塩基長の二本鎖ＤＮＡが得られ
る。これと同様に、確認のためプライマ１が異常がある
場合マッチするオリゴヌクレオチドプライマ（プライマ
１’）を合成した。それぞれのオリゴヌクレオチドプラ
イマーの配列を以下に示す。

【００３９】プライマ１ ５’−ＡＴＧＣＣＡＣＴＧ
ＡＧＡＡＣＴＣＴＣＴＣ−３’ プライマ１’ ５’−ＡＴＧＣＣＡＣＴＧＡＧＡＡＣＴ
ＣＴＣＴＴ−３’ プライマ２ ５’−ＡＧＴＣＴＴＣＧＡＴＴＡＣＴＧ
ＡＧＡＡＡ−３’ これらのオリゴヌクレオチドプライマーのうち、プライ
マ１、およびプライマ１’を、ヌクレイク アシド リ
サーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓａｒｃ
ｈ），１３巻：１５２９−１５４１の方法に従ってビオ
チンを標識したものを準備した。次いでＰＣＲ増幅を以
下の組成で行った。

【００４０】１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０
（ｍａｒｋ） ５０ｍＭ ＫＣｌ（和光純薬） １．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂（和光純薬） ０．１％ ゼラチン（ｓｉｇｍａ） １０ｐｍｏｌ プライマ１ １０ｐｍｏｌ プライマ２ ０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴ
Ｐ（Ｔａｋａｒａ） ２．５ｕｎｉｔ ＤＮＡ合成酵素 Ｔａｑ ｐｌｙｍｅ
ｒａｓｅ（Ｃｅｔｕｓ） この反応液１００μｌを、加温機にて以下のように加温
した。

【００４１】９５℃×１分 （９５℃×１．５分、５５℃×１分、７２℃×２分）×
２８サイクル この後確認のため操作を中断して、ＤＮＡ増幅工程を終
えた４試料について、２％アガロースゲル（Ｔａｋａｒ
ａ）にて電気泳動を行った。これをＥｔＢｒで染色し、
ＵＶランプを用いて紫外線を照射し発光を観察した。結
果を図５に示す。２２はサイズマーカであり、プラスミ
ドφＸ１７４を制限酵素ＨａｅIIIで消化したものであ
る。目的の増幅産物は、サイズマーカ２２の上方から８
番目のＤＮＡと、ほぼ同じ移動距離の位置に現れる。２
３はプライマ１とプライマ２を用い、２４はプライマ
１’とプライマ２を用いて、ＤＮＡ増幅工程を行ったも
のである。２３の４試料のうち、Ｎｏ．２とＮｏ．３は
増幅ＤＮＡが現れ、Ｎｏ．１とＮｏ．４からは、発光は
みられなかった。一方２４の場合、Ｎｏ．１とＮｏ．４
からは発光がみられたが、Ｎｏ．２とＮｏ．３からは発
光がみられない。Ｎｏ．１の増幅産物量をサイズマーカ
より換算すると、約２ｐｍｏｌであった。

【００４２】この反応液を４℃に保存した。次いでプラ
イマ１及びプライマ１’側の配列に相補的な配列を持っ
た、ハイブリダイゼイションプローブ（プローブ１）を
混合する。プローブ１の塩基配列を示す。

【００４３】プローブ１ ５’−ＡＴＴＡＣＴＴＡＣＴ
ＧＴＴＡＡＴＧ−３’ このプローブ１の５’末端には、蛍光色素をアナリティ
カル ケミストリ、６２号、９００（１９９０）記載の
方法に従ってＦＩＴＣを付加している。次いでＰＣＲ反
応液にプローブ１を１ｐｍｏｌ混入し、ハイブリダイゼ
イション工程を行った。ハイブリダイゼイション工程
は、ＰＣＲ反応液５０μｌに対し、準備した０．１ｐｍ
ｏｌ／μｌ ハイブリダイゼイションプローブ１０μｌ
を混合し、これらを９５℃に３分間加冷し、次いで３７
℃で１０分間加温し、次いで４℃に加温した。次いで精
製工程を行った。精製工程は、ハイブリダイゼイション
済反応液６０μｌに、精製洗浄液１００μｌ（１０μｇ
磁気ビーズ Ｍ−２８０ストレプトアビジン （ダイ
ナル））を分注機で注入、混合後、１０分間室温で保持
し、次いで分注機の容器保持台に内蔵された磁石を作用
させ、ビオチン標識されたオリゴヌクレオチドプライマ
ーを凝集した。次いで分注機を動作させ、混合後反応液
全量を吸引した。次いで、ＴＥバッファ（１０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ）５０μｌを混合
し、容器内の核酸を懸濁し、次いで、検出器に容器を搬
送し、ＦＩＴＣの発光（５１８ｎｍ）を測定した。

【００４４】検出結果を図６に示す。このうちフェニル
ケトン尿症患者から抽出した試料１及び４は、非患者で
ある試料２及び３の蛍光度よりも高い蛍光強度を示し
た。これ以前にＦＩＴＣ標識したオリゴヌクレオチドプ
ローブを１ｐｍｏｌ測定した結果、蛍光強度は約１０，
０００（相対値）を示し、これに精製工程を行うと約１
００（相対値）を示したので、解析結果の判定基準値を
１，０００（相対値）とし、検出データが基準値以上は
目的の塩基配列の増幅が行われているとし陽性を示し、
基準値以下は目的の塩基配列の増幅が行われていない
が、目的の塩基配列が少ないので、陰性を示すようプロ
グラムした。よって図６中の判定項目は、Ｎｏ．１及び
Ｎｏ．４は陽性である＋を示し、Ｎｏ．２，Ｎｏ．３は
陰性である−を示している。同様に他の試料についても
判定することが出来た。

【００４５】（２）ウイルス感染症のウイルスゲノムの
検出の例 ヒトＢ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉ
ｒｕｓ：ＨＢＶ）感染による肝炎の、遺伝子検出方法に
関する文献に蛋白質 核酸 酵素，３５巻，１７号：
（１９９０），３００３頁〜３０１０頁がある。これに
よると、ＨＢＶゲノムは約３，２００塩基対の２本鎖Ｄ
ＮＡであり、既に全塩基配列が決定されている。我々は
上記の報告に従って、本発明を用いて以下の方法により
ＨＢＶゲノムの検出を行った。ＨＢＶはＤＮＡウイルス
であるので、生体試料からの遺伝子抽出は１．の方法に
従って１００μｌの血液より抽出したＤＮＡを約０．５
μｇ用いた。ＰＣＲ増幅により増幅させる遺伝子領域
は、ＨＢｓ抗原中の遺伝子の４３２ｂｐであり、この領
域の遺伝子部位は変異が少なく、良く保存されている領
域である。この領域の両端にそれぞれ相補的なオリゴヌ
クレオチドプライマー（プライマ３とプライマ４）をＤ
ＮＡ合成機により合成した。プライマの配列を以下に示
す。

【００４６】プライマ３ ５’−ＧＧＡＣＴＴＣＴＣＴ
ＣＡＡＴＴＴＴＣＴＡＧＧＧ−３’ プライマ４ ５’−ＣＡＡＡＴＧＧＣＡＣＴＡＧＴＡＡ
ＡＣＴＧＡＧＣ−３’ 次いで前記の方法に従って、プライマ３及びプライマ４
をビオチンを標識した。 ＰＣＲ反応液の組成は５０μｌ中 １０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｍａｒｋ） ５０ｍＭ ＫＣｌ（和光純薬） １．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂（和光純薬） ０．１％ ゼラチン（ｓｉｇｍａ） ５０ｐｍｏｌ プライマ３ ５ｐｍｏｌ プライマ４ ０．２５ｍＭ ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴ
Ｐ（Ｔａｋａｒａ） ２．５ｕｎｉｔ Ｔａｑ ｐｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｃｅｔ
ｕｓ） この反応液を、加温機にて以下の条件で加温した。

【００４７】９５℃×１分、（９５℃×１．５分、５７
℃×１分、７２℃×２分）×４０サイクル この反応液を４℃に保存した。次いでプライマ３とプラ
イマ４に挾まれた領域のハイブリダイゼイションプロー
ブ（プローブ２）を混入した。プローブ２の塩基配列を
示す。

【００４８】プローブ２ −ＴＣＣＴＣＴＴＣＡＴＣＣ
ＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＣＣＴＣＡＴＣＴ−３’ このプローブ２の５’にＦＩＴＣを付加したものを準備
した。保存したＰＣＲ反応液にプローブ２を５ｐｍｏｌ
混入し、ハイブリダイゼイション工程を行った。ハイブ
リダイゼイション工程の手順を以下に示す。

【００４９】ＰＣＲ反応液５０μｌ １ｐｍｏｌ／１０μｌ プローブ２ これらを９５℃に３分間保温し、次いで３７℃で１０分
間保温し、次いで４℃に保温した。次いで精製工程を次
の手順で行った。

【００５０】ハイブリダイゼイション済反応液 ６０μ
ｌ 精製洗浄液１００μｌ（１０μｇ 磁気ビーズ Ｍ−２
８０ ストレプトアビジン（ダイナル）） 以上を分注機で注入、混合後、１０分間室温で保持し、
次いで分注機の容器保持台に内蔵された磁石を作用さ
せ、ビオチン標識されたオリゴヌクレオチドプライマー
を凝集した。次いで分注機を動作させ、混合後反応液全
量を吸引した。ついで、ＴＥバッファに溶解し、検出器
にて検出を行った。検出器に容器１を搬送し、オリゴヌ
クレオチドプローブに標識したＦＩＴＣの蛍光光５１８
ｎｍの蛍光強度を測定した。

【００５１】検出結果を図７に示す。このうち肝炎患者
から抽出した試料１及び３は、非患者である試料２及び
４の蛍光度よりも高い値を示した。（１）の検出結果の
判定方法と同様に、このプロセスの判定基準値を測定に
より求め、１，０００を基準値とし、プログラムした。
よって図７中の判定項目に、試料Ｎｏ．１、Ｎｏ．３は
陽性を示し、Ｎｏ．２，Ｎｏ．４は陰性を示し、同様に
他の試料についても判定することが出来た。

【００５２】３．装置の説明 本発明における装置の詳細を以下記載する。

【００５３】図３は本発明における全体概略図を示し、
図８は分注機、図９は加温器、図１０は保冷室、図１１
は検出器の概略と構成を示す。

【００５４】分注機１５の詳細な機構を図８を用いて説
明する。１２は容器を示し、前述の様に９６穴の孔１３
が設けられ、これらの孔１３内で生体試料を保持、加
温、試薬の注入、混合等が行われる。同様に１８は同じ
容器を用いて試薬等を保持する試薬容器であり、容器１
２は試料台３０に、試薬容器１８は試薬台３１上に保持
される。尚試料台３０内部には、磁気ビーズの励磁のた
めに、磁石を内蔵してあり任意に試料に対して磁力を作
用させることが出来る。次いで３２は、液体を直接保持
するチップ３３を格納するチップラックであり、チップ
台３４上に保持され、容器台３０、試薬容器台３１、チ
ップ台３４は同一の移動プレート３５上に構成され、こ
の移動プレート３５はモータ３６の駆動によって、図中
矢印３７の方向に移動できる。分注動作は次の様に行わ
れる。前述のチップ３３はノズル３８に、はめあい可能
に取り付けられる。ノズル３８は容器１２の孔１３の間
隔、及びチップラック３２上の、チップ３３の並んだ間
隔にあわせて８本設けられており、１度の分注動作で、
８つの試料に分注可能である。このノズル３８へチップ
３３の取付け方法は、移動プレート３５を移動し、原点
位置にあるノズル３８の下方にチップ３３を位置させ、
ノズル３８の位置を、図中矢印３９の下方向に、移動モ
ータ４０の動作によって移動し、ノズル３８をチップ３
３へ押しつけて取り付けられる。次いでチップ３３が取
り付けられた状態で、ノズル３８を原点位置に戻し、移
動プレート３５を駆動し、ノズル３８の下方に試薬の入
った孔１３を位置させ、ノズル３８を下方に移動させ、
チップ３３の先端を試薬の液中に浸漬させる。この状態
で、ノズル３８の内孔に内包されたピストン４１を、ピ
ストンモータ４２の駆動によって、図中矢印４３の上方
向に移動させると、試薬がチップ３３内に吸引保持され
る。次いで、試薬を試料に分注する動作は、試薬をチッ
プ３３内に吸引保持したまま、ノズル３８を原点位置に
戻し移動プレート３５を移動し、ノズル３８の下方に孔
１３を位置させ、次いでノズル３８を下方に移動させ、
チップ３３の先端を容器１２内の試料に浸漬させる。こ
の状態でピストン４１を、試薬を吸引したときの逆の方
向に駆動し、試薬をチップ３３より吐出させる。この時
試薬と試料を混合させたい場合は、この状態でピストン
モータ４２を試薬を吸引する場合の方向と、試薬を吐出
する場合の方向とに順番に駆動することで可能となる。
ノズル３８に取り付けられたチップ３３の取外しは、ノ
ズル３８を原点位置に戻し、移動プレート３５を移動し
て、これに設けられたチップ廃棄口４４をノズル３８の
下方に位置させ、ピストンモータ４２と連動して駆動す
るチップ外し部（図示せず）によって取り外される。

【００５５】次いで加温機の詳細な機構を図９を用いて
説明する。１２は容器を示し、４６は伝熱ブロックであ
り、容器１２の裏側形状に合うよう加工されている。伝
熱ブロック４６はその内部のヒータと冷却ブロックの切
り替えにより、温度を１２０度から０度にまで、任意の
時間保持することができる。このように容器１２を伝熱
ブロック４６上に設置し、伝熱ブロック４６の温度を任
意の温度に保てば、容器１内の試料の温度を変化させる
ことができる。

【００５６】次いで保冷室の詳細な機構を図１０を用い
て説明する。１２は容器を示し、４７は冷却ブロックで
あり、容器１２の裏側形状に合うよう加工されている。
冷却ブロック４７は恒に４℃に保たれており、生体試料
や試薬を長時間保存することができる。

【００５７】次いで検出器１９の詳細な機構を図１１を
用いて説明する。図１１（ａ）は検出器１９の透視外観
図であり、図１１（ｂ）は検出器１９の蛍光検出方法を
更に具体的に示した構成図である。

【００５８】図１１（ａ）において４８は光源であるレ
ーザ、４９はレーザ電源、５０は試料に励起光を照射す
る照射部及び蛍光光を受光する受光部で構成された検出
部、５１は容器１２を保持する搬送プレート、５２は搬
送プレートを移動するパルスモータであり、搬送プレー
ト５１とパルスモータ５２はゴムベルト５６で連結され
ており、搬送プレート５１は搬送ガイド７６上を矢印方
向に移動させ、試料を検出位置に移動させる。この移動
制御はパルスモータ５２を制御する計算機２１の指令に
従っており、またこの計算機２１は検出部５０で検出さ
れたデータを取り込み、検出結果を判定する。７５は外
装であり、上記検出部５０、容器１２、搬送プレート５
１を覆い、検出部環境を暗室状態に保持することが出来
る。

【００５９】図１１（ｂ）を用いて検出方法を説明す
る。レーザ４８より発したレーザ光（励起光）５４はミ
ラー５７を経て、照射部５８に到達する。照射部５８内
は光ファイバチューブ５９、焦点レンズ７２により構成
され、励起光５４を透過収束させる。励起光５４はハー
フミラー７３を透過し、容器１２の孔１３内試料に照射
される。試料中の蛍光色素量に応じて、蛍光色素が励起
され蛍光光５５を発する。蛍光光５５はハーフミラー７
３を反射し、干渉フィルタ６９を透過しフォトダイオー
ド７０に到達する。フォトダイオード７０により検出さ
れた蛍光光５５はその強度により電気信号として、図１
１（ａ）のコントローラ２１に送られ判定される。

【００６０】本実施例において使用する蛍光色素に、Ｆ
ＩＴＣを用い、レーザ４８にはアルゴンレーザを用い、
干渉フィルタ６９には５００ｎｍを用いているが、これ
らに限定するものでなく蛍光色素にテキサスレッド、或
はローダミン系色素などを用いても、適当な励起光を発
する光源、及び励起光と蛍光光を干渉する干渉フィルタ
との組合せにより実行可能である。また本実施例では照
射部５８は光ファイバチューブ５９を用いて、容器１２
の孔１３の間隔ごとに８方向に分岐した（図示せず）こ
とにより、一回の検出時に容器１２の１列（８試料）を
同時に検出するよう構成したが、他の方法であっても実
行できることは言うまでもない。励起光を分岐せず１系
統で行なう場合、照射機構及び受光機構が各試料上を移
動する方法や、或は照射機構及び受光機構を固定して搬
送プレートを２軸制御し検出点に対して試料を移動する
方法もあり、本実施例と同様な作用を得られる。また試
料を保持する容器は光透過性の材質を用いれば、下方か
ら検出を行なう方法によって実施可能である。

【００６１】次いで検出のプロセスを説明すると、ハイ
ブリダイゼイション工程を終えた試料は、容器１２の孔
１３内に保持され、容器１２は搬送機２０（後述）によ
り搬送プレート５１上に設置される。搬送プレート５１
は、容器１２を照射部５０の下方に搬送し、１列８試料
の蛍光強度の検出を同時に行なう。容器は１２列あるの
で、次の列の試料を測定するには、搬送プレート５１
を、容器１２の孔の間隔分移動させたのち同様に検出す
る。

【００６２】次いで搬送機２０の詳細な構成を、図１２
を用いて説明する。本搬送機はモータ７１、モータ間の
アーム６０、ハンド部６１からなる自動制御機械であ
り、自動組立てライン等で用いられるごく一般的なロボ
ットアームである。この先端に設けられたハンド部７３
はチャック部７４を介して容器１２を保持し、持ち上
げ、移動後、容器を置くことが出来る。これらはコント
ローラ２１に指令により動作し、容器１２を分注機１
５、加温機１６、保冷室１７、検出器１９のそれぞれの
間を最短距離でそれぞれへ搬送することが出来る。

【００６３】

【発明の効果】本発明は以上説明したように構成されて
いるので、以下に記載されるような効果を奏する。

【００６４】従来方法の検出手段であった電気泳動法で
は、５時間を要していた。本発明では、液中で蛍光色素
を発光させるため、ゲルが不要であるので、ゲルを作成
する手間が省け、更に検出においては、９６サンプルの
試料の検出を、数分の時間で終えるので、実時間は検出
前処理から検出まで約１時間であり、時間的な短縮が大
きく図れる。また電気泳動法で使用するＥｔＢｒは、人
体に有害な物質であるが、本発明では用いないため安全
である。また本発明では、増幅産物にハイブリダイズし
た蛍光色素の発光を検出するので、高感度な検出を行う
ことが出来る。このため検出時における、目的のＤＮＡ
領域のコピー数が少なくできるので、ＰＣＲ増幅の温度
サイクル数を、従来方法より少なくでき、時間の短縮が
図れる。また電気泳動法では、目的のＤＮＡ領域と目的
外のＤＮＡ領域が同時に増幅し、判断ができなくなるこ
とが多く、増幅条件を厳密に検討する必要があったが、
本発明では目的外のＤＮＡ領域が増幅しても、検出結果
には影響が無い。よって一般的な反応条件を実行すれ
ば、安定した検出できるので、厳密な増幅条件を検討す
る必要が無く、簡便に遺伝子解析を行なうことができ
る。

【００６５】一方本発明における遺伝子解析法を実行す
る装置を用いれば、作業者は試料調製の大変な作業から
逃れることができ、また生体試料には検査者に感染する
恐れのあるウイルスや、環境を汚染する細菌等も含まれ
るが、これらを安全に取り扱うことができる。

【００６６】以上の様に、本発明は特に臨床検査におけ
る遺伝子解析手法を提供するものであり、医師や検査を
専門に行う機関等が、遺伝病の診断や感染症の診断を簡
便に行うことができ、且つ、大量サンプルの処理を可能
とし、迅速に遺伝子診断を行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の実施例である遺伝子解析方法を示すフ
ロー図。

【図２】本発明の実施例である遺伝子解析方法を示す
図。

【図３】本発明の実施例である遺伝子解析装置の概略
図。

【図４】本発明の実施例であるＤＮＡ抽出方法を示す実
施例。

【図５】本発明の実施例であるＤＮＡ増幅工程の結果を
示す図。

【図６】本発明の実施例であるフェニルケトン尿症の解
析結果を示す図。

【図７】本発明の実施例であるＨＢＶ遺伝子領域の解析
結果を示す図。

【図８】本発明の実施例である分注機を示す構成図。

【図９】本発明の実施例である加熱器を示す構成図。

【図１０】本発明の実施例である保冷室を示す構成図。

【図１１】本発明の実施例である検出器を示す構成図で
あり、（ａ）は検出器の透視外観図、（ｂ）は検出器の
蛍光検出方法を更に具体的に示した構成図。

【図１２】本発明の実施例である搬送機を示す構成図。

【符号の説明】

１：オリゴヌクレオチドプライマー、２：標識オリゴヌ
クレオチドプライマー、３：標識物、４：二本鎖ＤＮ
Ａ、５：オリゴヌクレオチドプローブ、６：蛍光標識
物、７：結合物、８：磁気ビーズ、９：磁気、１３：容
器、４８：光源、５４：励起光、５５：蛍光光

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】生体試料より生体又はウイルスの核酸を抽
   出し、これに特定塩基配列を有し、特異的な相互作用を
   有した物質を標識したオリゴヌクレオチドプライマー
   と、４種類のデオキシヌクレオシド三リン酸、及びＤＮ
   Ａ合成酵素を作用させて、該特定塩基配列を選択的に増
   幅させる反応を行い、次いで増幅された該特定塩基配列
   に相補的で、且つ該増幅反応で用いた該オリゴヌクレオ
   チドプライマーと異なる塩基配列を有し、蛍光物質を標
   識したオリゴヌクレオチドプローブと、ハイブリダイゼ
   イション反応させ、次いで該オリゴヌクレオチドプライ
   マーの該標識と相互作用を有する物質を結合させた微粒
   子を用いて、未反応の該オリゴヌクレオチドプローブの
   除去を行い、該蛍光物質または該化学発光物質の濃度を
   検出することにより、該生体試料中に該特定塩基配列の
   存在を検出することを特徴とする遺伝子解析方法。
2. 【請求項２】生体試料及び液体を保持する容器と、これ
   に液体を分注、混合、及び除去する分注機と、該容器内
   の液体を冷却する保冷室と、該容器内の液体を加温する
   加温機と、上記蛍光標識物を検出する検出器と、該容器
   を該分注機、該保冷室、該加温機、該検出器間に搬送す
   る搬送機と、該分注機、該保冷室、該加温機、該検出
   器、該搬送機を制御し、且つ該検出器の検出データを解
   析し、解析結果を判定するコントローラと、該分注機、
   該保冷室、該加温機、該検出器、該搬送機の作動空間を
   覆い、装置内部作業空間と装置外部空間を遮断する筐体
   を備えたことを特徴とする装置
3. 【請求項３】標識物にビオチンを用い、これと相互作用
   する物質にストレプトアビジンを用いたことを特徴とす
   る請求項１記載の遺伝子解析方法。
4. 【請求項４】微粒子がポリスチレンビーズであることを
   特徴とする請求項１記載の遺伝子解析方法。
5. 【請求項５】生体試料を加熱すること特徴とする請求項
   １記載の遺伝子解析方法。
6. 【請求項６】蛍光標識物の蛍光濃度を基準値と比較する
   ことにより、生体試料中の特定塩基配列の存在を検出す
   る判定を行うことを特徴とする請求項１記載の遺伝子解
   析方法。