JP3188303B2 - ポリヌクレオチド検出法 - Google Patents

ポリヌクレオチド検出法

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Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、疾病の原因となるウイ
ルス、リケッチャ、細菌等の外来性ポリヌクレオチド、
あるいは生物中の特定の遺伝情報を担うポリヌクレオチ
ドの有無およびその変異を検出することが容易に可能な
ポリヌクレオチド検出法、及び当該方法に使用する検出
装置に関する。
【0002】
【従来の技術】「Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol.8
0, p278-282(1983)」において、標的となるポリヌクレ
オチド (DNAまたはRNA) 試料を直接固相に捕捉し
た後、あるいは標的ポリヌクレオチドと相補的な塩基配
列を含む他のポリヌクレオチドプローブを固相に固定し
たハイブリダイゼーション反応を用いて標的ポリヌクレ
オチドを固相に捕捉した後、標識物を結合した標識ポリ
ヌクレオチドを会合させることを特徴とするポリヌクレ
オチド検出法が開示されている。
【0003】この方法は、1) 電気泳動により分子量分
離したポリヌクレオチド断片試料をニトロセルロース膜
に転写して固定した後に、当該ニトロセルロース膜を放
射性同位元素で標識したポリヌクレオチドプローブを含
む溶液に浸して会合反応を行ない、2) 反応後、未反応
の標識プローブ膜から洗い流した後に、膜に結合した残
留標識プローブの量をオートラジオグラフィーにより検
出することで標的ポリヌクレオチドの有無を判定する方
法である。
【0004】また、血液や排泄物等の試料中の細菌やウ
イルス等の外来性の標的ポリヌクレオチドを検出する方
法が、特開昭58-31998に開示されている。この方法は、
1) 精製した試料中のポリヌクレオチドを加熱等により
変性させて一本鎖とした後、これを、ニトロセルロース
膜に固定し、次に、2) 検査したい細菌やウイルスのポ
リヌクレオチドと相補的な塩基配列を持つ放射性同位元
素標識されたポリヌクレオチドプローブを反応させた
後、この膜を洗浄し、後に膜に結合した残留標識プロー
ブの量をオートラジオグラフィーにより検出することで
標的ポリヌクレオチドの有無を判定する方法である。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記の
双方の検出法において標識に用いられている放射性同位
元素は、作業者の放射線被爆を最小限に抑えなければな
らないうえにトレーサー量しか用いることができず、プ
ローブ当りの比放射活性を高くすることが困難である上
に、ニトロセルロース膜に吸着した標識プローブから放
射線のバックグラウンドが生じやすく、検出に長時間を
要し、かつ検出感度が不足する場合が多い。そのため定
量的測定が困難で、ほとんどが標的ポリヌクレオチドの
有無の判定かせいぜいオートラジオグラムのフィルムの
黒化の程度を判定する半定量的測定が行なわれるにすぎ
ず、近時の産業界の要請に対しきれていない面があっ
た。さらにオートラジオグラフィーを用いるため検出の
自動化が困難であり、加えて上記のごとく作業者の放射
線被爆への考慮の必要があり、臨床フィールドで多量の
検体について測定するには不都合な面が指摘されてい
た。
【0006】そこで、本発明は、放射性同位元素の標識
を必要とせずに、高感度で精度が高く定量的な測定が可
能で、かつ自動化により単位時間あたりの測定サンプル
数を多くすることで臨床フィールドで多量の検体を検査
することが可能なポリヌクレオチド検出法及び当該方法
を用いた検出装置の提供を課題とする。
【0007】
【課題を解決するための手段】本発明者は、上記課題に
つき鋭意検討した結果、下記 (1)〜(6)に示した発
明により、当該課題を解決し得ることを見出した。すな
わち本発明は、 (1) 被測定物であるポリヌクレオチド鎖と当該ポリヌ
クレオチド鎖と相補的なポリヌクレオチド鎖に標識物を
結合した標識プローブを会合させ、会合した標識プロー
ブの量を検出するポリヌクレオチド検出法において、被
測定物であるポリヌクレオチド鎖における異なる部位に
対して各々相補的な二種以上の標識プローブを会合さ
せ、当該標識プローブと被測定物の複合体の量を当該標
識プローブの存在として一分子毎に特定・検知すること
を特徴とするポリヌクレオチド検出法、 (2) (1) 記載のポリヌクレオチド検出法において、被
測定物であるポリヌクレオチド鎖に会合させた、二種以
上の標識プローブ同士を連結後、被測定物であるポリヌ
クレオチドから解離させて、解離した標識プローブ連結
体の量を一分子毎に特定・検知することを特徴とするポ
リヌクレオチド検出法、 (3) 被測定物であるポリヌクレオチド鎖に相補的な
ポリヌクレオチド鎖を固定化した担体の当該ポリヌクレ
オチド鎖に被測定物であるポリヌクレオチド鎖を会合さ
せる第一工程、第一工程において会合させた被測定物
であるポリヌクレオチド鎖に対して各々異なる部分に対
して相補的な二種以上の標識プローブを各々会合させる
第二工程、第二工程において会合させた二種以上の標
識プローブ同士を連結し、固定化標識プローブ複合体を
調製する第三工程、第三工程により得られた固定化標
識プローブ複合体における被測定物であるポリヌクレオ
チド鎖及び標識プローブ連結体を解離・溶出し、当該溶
出液中の標識プローブ連結体の量を一分子毎に特定・検
知する第四工程とからなる、ポリヌクレオチド検出法、 (4) 液相中で、被測定物であるポリヌクレオチド鎖
と当該ポリヌクレオチド鎖の異なる部分に対して各々相
補的な二種以上の標識プローブを会合させ、連結した標
識プローブ複合体を調製し、次いで当該標識プローブ複
合体における被測定物であるポリヌクレオチド鎖と標識
プローブ連結体を解離せしめる第一工程、第一工程で
得た反応溶液を、少なくとも上記二種以上の標識プロー
ブが連結したポリヌクレオチド鎖の全部又は一部に相補
的な部分を有するポリヌクレオチド鎖を固定化した担体
と混合し、ポリヌクレオチド鎖同士で会合反応を行なわ
せしめ、固定化標識プローブ複合体を調製する第二工
程、第二工程で調製した固定化標識プローブ複合体混
合物から、上記標識プローブ連結体以外のヌクレオチド
鎖を解離・除去する第三工程、第三工程により得た上
記標識プローブ連結体以外のヌクレオチド鎖を解離・除
去した固定化標識プローブ複合体から、当該標識プロー
ブ連結体を解離・溶出し、当該溶出液中の標識プローブ
連結体の量を一分子毎に特定・検知する第四工程とから
なる、ポリヌクレオチド検出法、 (5) 被測定物であるポリヌクレオチド鎖における異な
る部位に対して各々相補的な二種以上の標識プローブに
おける標識物が異なる蛍光色素であり、一方の蛍光色素
が発する蛍光が他方の蛍光色素を励起する蛍光色素同士
であり、かつ各々の蛍光色素同士の距離が50塩基長以内
であることを特徴とする (1) 記載のポリヌクレオチド
検出法、 (6) シースフローセル、少なくとも一種以上の励起光
を発射する光源と、シースフローセルの検出部に励起光
の焦点を合わせるための受光素子、シースフローセルの
検出部より発生された蛍光を検出するための蛍光検出機
構、及び当該蛍光検出機構からの信号を標識プローブ一
分子毎の存在として識別し計数する装置からなることを
特徴とする (1) 〜 (5) 記載のポリヌクレオチド検出
法に使用する検出装置、を提供するものである。
【0008】先ず、本発明ポリヌクレオチド検出法につ
いて説明する。 A. 被測定物として本発明方法に供されるポリヌクレオ
チド鎖の種類は特に限定されず、例えば、疾病の原因と
なるウイルス、リケッチャ、細菌等の外来性ポリヌクレ
オチドはもちろん、生物中の特定の遺伝情報を担うポリ
ヌクレオチドの有無を調べる場合には内在性のポリヌク
レオチドを被測定物とすることができる。なお、二種の
プローブを会合させる必要上10塩基長以上の長さを当該
被測定ポリヌクレオチドは必要とする。
【0009】また、かかるポリヌクレオチドはDNAで
あるとRNAを問わず、その調製方法は、具体的被測定
対象の種類に応じた公知の方法を用いることができる。
被測定ポリヌクレオチド鎖と相補的なポリヌクレオチド
鎖に標識物を結合した標識プローブにおいて、「相補
的」とは、当該標識プローブが少なくとも被測定ポリヌ
クレオチド鎖に結合可能な程度に相互に水素結合をする
組合せの塩基が存在することをいい、かかる条件が満た
される限りにおいて必ずしもすべての塩基同士が相互に
水素結合をする組合せである必要はない。また、当該標
識プローブとして用いられるポリヌクレオチドの長さ
は、被測定ポリヌクレオチドとして何を用いるか、すな
わちどの程度の長さのポリヌクレオチドを標識プローブ
として用いれば目的のポリヌクレオチドを検出可能であ
るかによって決定され、その限りにおいて特に限定され
るものではない。そして当該標識プローブとして用いら
れるポリヌクレオチドは、ホスファイトトリエステル法
(Nature, 310, 105(1984))、ホスホアミダイド法(Mc B
ride,L.J.and Caruthers,M.H Tetrahedron Letters,vo
l.24,pp.245-248(1983))等の通常公知の方法によって化
学合成することが可能であり、また生物の特定遺伝子部
分をPCR法 (Saiki, R.K., et al., Science, vol.3
7, p170(1985)) 等の通常公知の方法により増幅して得
ることもできる。
【0010】ここで用いられる標識物は、標識フローブ
の存在を後述する手段を用いて一分子毎に特定・検知す
ることができる限りにおいて特に限定されるものではな
い。そして、特に検出感度及び安全性の点から好ましく
は、蛍光分析用の蛍光色素を挙げることができる。用い
られる蛍光色素の種類は特に限定されず、例えばB−フ
ィコエリスリンやR−フィコエリスリン等のフィコビリ
プロテイン;ローダミン、フルオレッセイン、4−ニト
ロベンゾ−2−オキサ−1、3−ジアゾール、フタロシ
アニン等とこれらの誘導体;ならびにこれら蛍光体を含
むポリマーを用いることができる。ただし、フィコビリ
プロテインは熱安定性や変性剤に対する安定性に問題が
あるため、あらかじめ標的ポリヌクレオチドに会合した
プローブにビオチン−アビジンあるいは、ハプテン−抗
−ハプテン抗体等を用いて標識する必要がある。また、
蛍光体を含むポリマーは、特定の色素を公知方法により
ポリマーに感作して得ることもできるが、市販品を直接
用いることもできる。
【0011】上記の場合、各々異なる蛍光体を標識物と
して選択すること、各々異なる蛍光体の蛍光波長が十分
に異なること、及び散乱光の影響を少なくするためにあ
る程度波長の長い蛍光を発する蛍光体であることが、被
測定ポリヌクレオチドの検出を容易にし得るという点で
好ましい。すなわち、用いられる発光体の組合せはフル
オレッセイン系とローダミン系あるいはフィコビリタン
パク質とローダミン系の組合せであることが好ましく、
より具体的にはフルオレッセインとスルホローダミン10
1 等の組合せを好適なものとして挙げることができる。
なお、このフルオレッセインとスルホローダミン101 の
組合せは、後述するように前者の蛍光が後者を励起する
ことができるという点において特徴を有する。
【0012】これらの蛍光色素の標識プローブとするポ
リヌクレオチドへの結合方法は特に限定されるものでは
ない。例えば、アミノ基導入試薬を用いて核酸塩基に直
接蛍光体標識をする方法や特開昭61-44353号開示の方
法、すなわち、ポリヌクレオチドの蛍光体標識部位のリ
ン酸結合を官能基を有するホスホン酸結合に置き換え、
この官能基を蛍光体結合させることにより蛍光体標識を
実現し、ポリヌクレオチドの任意の位置に標識物を導入
する方法等を採用することができる。
【0013】本発明方法においては、二種以上の標識プ
ローブを被測定物であるポリヌクレオチド鎖における異
なる部位に対して会合させることを必須とする。かかる
会合反応の様式は、特に限定されず、例えば固相に固定
化した被測定ポリヌクレオチドに標識プローブを会合さ
せることも可能であり、固定化せずに液相中で会合させ
ることも可能である。固定化被測定ポリヌクレオチドの
会合反応、液相中での会合反応双方共、通常公知の方法
に従う。
【0014】前者の固定化被測定ポリヌクレオチドとの
会合反応において、ポリヌクレオチド鎖の反応担体への
結合方法は、公知の方法、例えば当該担体の表面に官能
基を結合させて、次いでこの官能基を活性化させ、当該
活性化官能基に結合する官能基を予め導入したポリヌク
レオチド鎖を接触させる方法により実行される。例え
ば、反応担体上の官能基とポリヌクレオチド鎖は、アミ
ド結合を介して担体表面のカルボキシル基と結合させる
ことができる。
【0015】かかる場合、被測定ポリヌクレオチドを直
接反応担体上に固定することも可能であるが、捕捉用プ
ローブを予め調製してこれを固定して用いるのが被測定
ポリヌクレオチドを選択的に補捉できる点において好ま
しい。また、会合反応は、カラム法かバッチ法によるか
の別を問うものではない。なお、上記反応担体及びこれ
を用いた反応装置として好適な態様を後記参考例にて記
載する。
【0016】前者の液相中での固相を用いないハイブリ
ダイゼーョンの条件は通常の条件に従う。 B. 次に、会合済の標識プローブと被測定物の複合体又
は標識プローブ連結体の量を当該標識プローブの存在と
して一分子毎に特定・検知することが必要である。
【0017】かかる特定・検知する方法としては、液相
中で固定されていない上記被測定ポリヌクレオチドと標
識プローブの複合体を直接特定・検知することも可能で
あり、複数の標識プローブを連結させた標識プローブ連
結体の量として特定・検知することも可能である。どち
らの方法を採るのが好ましいかは、被測定ポリヌクレオ
チドと標識プローブの双方の性質に応じて異なるが、一
般的には、二本鎖ポリヌクレオチドが試料の場合には、
試料ポリヌクレオチド分子同士がポリマー状に会合して
しまい、そのポリマー状会合体に標識プローブが複数個
結合してしまうため、定量性に悪影響を及ぼすことがあ
る。このため、この場合には連結体の量として特定・検
知するのが好ましい。無論、試料ポリペプチドが一本鎖
の場合はこの限りではない。
【0018】後者の複数の標識プローブを連結させた標
識プローブ連結体の量として検知する場合には、被測定
ポリヌクレオチド上で標識プローブを連結させる必要が
ある。かかる連結手段としては、複数の標識プローブと
して被測定ポリヌクレオチド上で隣接するポリヌクレオ
チド同士を選択した場合には、直接DNAリガーゼの作
用により連結することが可能である。すなわち、被測定
ポリヌクレオチドの上流と結合し得る一方のプローブの
3'末端が水酸基で、下流に結合し得る他方のプローブの
5'末端がリン酸基であれば、DNAリガーゼを用いて両
プローブをホスホジエステル結合で連結することができ
る。DNAリガーゼとして E.coli DNAリガーゼを用
いれば、一方のプローブの3'水酸基と他方のプローブの
5'リン酸基が隣接しているときのみホスホジエステル結
合による連結反応が起こる確率が高く、一本鎖同士や距
離的に離れた位置のポリヌクレオチド間で連結反応が起
こる確率が極めて低く好適である。また、標識プローブ
同士が被測定ポリヌクレオチド上で隣接しない場合に
は、被測定ポリヌクレオチドの上流に結合し得る一方の
プローブをプライマーとしてDNAポリメラーゼで下流
方向にポリヌクレオチド鎖を伸長させ、下流に結合させ
た他方のプライマーとのギャップを上流リガーゼ反応で
埋めることで連結することができる。なお標識プローブ
同士の被測定ポリヌクレオチド上における距離は可能な
限り短いのが好ましく、DNAポリメラーゼの活性の限
界を考慮すれば2000塩基長以内、さらに好ましくは600
〜700 塩基長以内であることが望ましい。
【0019】そして、得られた標識プローブ連結体を被
測定ポリヌクレオチドから解離・溶出させて、標識プロ
ーブ連結体を一分子毎に特定・検知する手段を用いて、
標識プローブ連結体一分子毎の標識の種類と強さを特定
・検知することにより被測定ポリヌクレオチド量を検出
することができる。すなわち、非特異的に反応した標識
プローブは上記連結反応が起こらないので一種の標識体
しか有さず、上記標識プローブ連結体と明確に標識の種
類又は強さで区別することが可能である。
【0020】また、標識ポリヌクレオチドと標識プロー
ブの会合、及び標識プローブの連結反応を溶液中で行な
う場合には、反応後に未反応標識プローブと連結された
プローブを分離することが望ましい。この場合には、解
離・溶出させた標識プローブ連結体を含有する反応液を
少なくとも上記二種以上の標識プローブが連結したポリ
ヌクレオチド鎖の全部又は一部に相補的な部分を有する
ポリヌクレオチド鎖を固定化した担体と混合し、ポリヌ
クレオチド鎖同士で会合反応を行なわせしめて固定化標
識プローブ複合体を調製して、固定化標識プローブ複合
体混合物から、上記標識プローブ連結体以外のヌクレオ
チド鎖を解離・除去後、標識プローブ連結体を解離・溶
出し、当該溶出液中の標識プローブ連結体の量を一分子
毎に特定・検知する方法を採ることも可能である。
【0021】なお、被測定ポリヌクレオチドと標識プロ
ーブの複合体を直接特定・検知し、前記の連結反応をプ
ロセスとして行なわない系においては、標識プローブ同
士の被測定ポリヌクレオチド上における距離は、複合体
一分子として特定することが可能な限りにおいて特に限
定されない。そして、標識物として複数の蛍光色素を用
い、かつ一方の蛍光色素が発する蛍光が他方の蛍光色素
を蛍光体間の隣接効果により励起する組合せである場合
においては、当該蛍光色素同士の距離は励起光の種類・
強度と励起する蛍光色素の種類に応じて決定され、かつ
少なくとも50塩基長内であることが必要である。なお、
一方の蛍光色素が発する蛍光が他方の蛍光色素を励起す
る蛍光同士の組合せとしては、上記隣接効果を奏する蛍
光色素同士の組合せである限り特に限定されず、例えば
前記したフルオレッセインとスルホローダミン101 の組
合せを挙げることができる。図1にヘテロジニアス反応
を用いた本発明標識ヌクレオチド法の概念図を、図2に
同じくホモジニアス反応を用いた概念図を示す。
【0022】標識プローブの存在として一分子毎に会合
済の複合体又は標識プローブ連結体の量を特定する方法
は特に限定されないが、シースフローセル (Nguyen,D.
C.etal.,Anal.Chem,vol.59,pp.2158-2161(1987))を用
いて行なうのが好適である。なお、かかるシースフロー
セルを用いた検出装置、すなわち、シースフローセル、
少なくとも一種以上の励起光を発射する光源と、シース
フローセルの検出部に励起光の焦点を合わせるための集
光装置、シースフローセルの検出部より発生された蛍光
を検出するための蛍光検出機構、及び当該蛍光検出機構
からの信号を標識プローブ一分子毎の存在として識別し
計数する装置からなることを特徴とする検出装置を本発
明者は用いた。当該検出装置については、後述の実施例
で具体的に説明する。
【0023】
【実施例】以下、参考例及び実施例を挙げて本発明を具
体的に説明する。 <参考例1> 反応担体 図3は、本発明方法の実施過程において用いる反応担体
の一実施態様である。平板上に、反応部31、試料添加部
32、及び反応残液排出部33が設けられ、試料添加部32と
反応残液排出部33は、溝状の反応部31を介して連結され
ている。
【0024】かかる反応担体の素材は、反応部における
標識信号を検出可能な限りにおいて特に限定されるもの
ではない。例えば標識物として蛍光色素を用いる場合に
は、光学的に平坦な素材、例えば、ガラス、シリコンウ
エハー、又は光学的に平坦な構造を有するプラスチック
を用いるのが好ましい。これら反応担体の上面34は反応
部等の反応液等を保持する目的で提状にフッ素樹脂、例
えばポリテトラフルオルエチレンでコーティングされて
いる。
【0025】通常各部は直線上に連結され、各部はそれ
ぞれ等しい深さであるが、反応液等の流出速度等を調節
するために、部分的に深くしたり、浅くしたりすること
も可能であり、さらに蛇行させることも可能である。と
ころで、本発明反応担体における反応部等及び溝の形状
は、試料添加後、当該試料を前記した反応・排出工程に
付することができる限りにおいて特に限定されない。例
えば、反応部等と試料添加部及び反応残液排出部をそれ
ぞれ独立して設け、それぞれ溝を介して連結する構造も
許容される。
【0026】反応部31には、使用に際して若しくは予
め、前記したように、反応部31の表面に官能基を結合さ
せて、次いで、この官能基を活性化させ、当該活性化官
能基に結合する他の官能基を予め導入した被測定ポリヌ
クレオチド鎖を接触させる方法に代表される公知方法に
より被測定ポリヌクレオチド鎖が固定される。なお、か
かる固定化の実行に際して、担体中の他の部分はテープ
等でマスクをするのが好ましい。
【0027】試料添加部32には、例えば次記参考例2に
おける反応装置によって、標識プローブを含む試料が添
加され、本発明反応担体を揺り動かして当該試料を溝を
介して反応部31に移行させ、反応後生じる反応残液を前
記同様溝を介して反応残液排出部33に移行させ、当該反
応残液排出部33における反応残液を例えば巻き取り式の
ろ紙等によって排出・除去を行ない得る。
【0028】<参考例2> 反応装置 (1) 図4は、本発明方法の実施に際して用いられる担
体上に捕捉した物と反応した物との分離(B/F分離)
が必要なヘテロジニアス反応を行なうための反応装置の
一定実施態様である。試料を容器100 にいれ、これを容
器保持ステージ102 にセットする。標識プローブ等も同
様の容器にいれ容器保持ステージ102 にセットする。容
器ステージには各反応容器毎に専用の使い捨てピペット
チップ103 が装着されている。容器100 中の試料等は加
熱器104 により必要に応じて加熱され、試料等を変性さ
せ1本鎖オリゴヌクレオチドにすることができる。容器
保持ステージ102 は円盤状で、ステッピングモーター10
5 で回転させることができ、任意の容器を自動ピペット
106 の位置にセットすることができる。自動ピペット10
6 はX軸 (左右軸) ステージ107 とZ軸 (縦軸) ステー
ジ108 によりX軸方向と縦軸 (Z軸) 方向に移動するこ
とができる。まず、自動ピペット106 をX軸方向に移動
させ、ピペットチップ103 をセットする。次に、容器10
0 中の試料を吸い上げ、反応担体ステージ109 にセット
した一標識プローブを固定した反応担体110 の試料添加
部 (図3記載の32) に添加し、反応部に試料溶液を導入
する。使用済みのピペットチップはチップ破棄箱150 に
捨てられる。さらに、容器保持ステージ102 に装着した
他の容器から一標識プローブと他標識プローブを分注し
反応担体110 に添加する。ここでは、2種の標識プロー
ブを別々に添加しても、あるいは、2種の標識プローブ
をあらかじめ混合しておき一回のピペット操作で同時に
添加しても良い。反応担体ステージ109 はY軸方向 (紙
面の手前方向) に移動できる構造になっており、複数の
反応担体の添加部に順次試料溶液を添加できる。さら
に、反応担体ステージ109 は内部に加熱器を持つ構造
で、反応担体を一定温度に保つことができる。当該温度
は用いる試料と標識プローブの組合せに応じて適宜設定
することができる。反応担体ステージ109 はステッピン
グモーター111 で上下に傾けることができる構造になっ
ている。かかる傾斜角度は、企図する反応時間に応じ適
宜決定されるが通常15〜30℃程度が好ましい。この機構
を用いて、一定時間おきに反応担体を傾けた試料溶液を
反応部に出し入れすることで反応液をゆるやかに攪拌す
る。反応後、反応残液を参考例1記載の反応担体の反応
残液排出部 (図3の33記載) にろ紙112 をあてがい排出
する。ろ紙112 はロール状のものを用い、ローラー113
で交換することができる。試料等の反応中はろ紙は反応
担体からはれなているが、反応残液排出時にはローラー
114 が反応担体上の反応残液排出部に移動する。
【0029】ろ紙をあてがったままの状態で、Z軸ステ
ージ115 に装着した洗浄液ノズル116 を反応担体の添加
部に移動しポンプ117 を用いて洗浄液を添加する。洗浄
液は予め42〜65℃程度の適当な温度に加温しておく。洗
浄液は反応部を通過し、ろ紙により排出される。使用済
みのろ紙はろ紙破棄箱151 に捨てられる。図4には洗浄
液を保持する容器118 の一種類しか書かれていないが、
実際には複数の洗浄液がバルブ119 を介してつなげるこ
とも可能である。
【0030】(2) 図5は、本発明方法の実施に際して
用いられる、B/F分離が不要なホモジニアス反応を行
なうための反応装置の一実施態様である。試料を容器20
1 にいれ、これを容器保持ステージ202 にセットする。
標識プローブ等も同様の容器にいれ容器保持ステージ20
2 にセットする。容器ステージは各反応容器毎に専用の
使い捨てピペットチップ203 が装着されている。容器20
1中の試料等は前記参考例2 (1) と同様に加熱器204
により必要に応じて加熱され、試料等を変性させ1本鎖
オリゴヌクレオチドにすることができる。容器保持ステ
ージ202 は円盤状で、ステッピングモーター205 で回転
させることができ、任意の容器に自動ピペット206 の位
置にセットすることができる。自動ピペット206 は、ス
テッピングモーター207 により回転と上下動が可能で、
容器保持ステージ202 と反応ステージ209 の間を自由に
行き来できる。まず、自動ピペット206 を移動させ、ピ
ペットチップ203 をセットする。次に、容器201 中の試
料を吸い上げ、反応ステージ209 にセットした反応容器
208 に添加する。使用済みのピペットチップはチップ破
棄箱250 に捨てられる。さらに、容器保持ステージ202
に装着した他の容器から第1の標識プローブと第2の標
識プローブを分注し反応容器208 に添加する。ここで
は、2種の標識プローブを別々に添加しても、あるい
は、2種の標識プローブをあらかじめ混合しておき一回
のピペット操作で同時に添加しても良い。反応ステージ
209 はステッピングモーター210 で回転できる構造にな
っており、複数の反応容器に順次試料溶液と標識プロー
ブを添加できる。さらに、前記参考例2 (1) と同様に
反応ステージ209 は内部に加熱器204 を持つ構造で、反
応担体を一定温度に保つことができる。
【0031】上記反応終了後、以下の方法で反応液を第
3のプローブを固定した連結標識プローブ捕捉用カラム
215 に導入する。まず、吸引ノズル211 を昇降装置212
を用いて反応容器208 に入れる。ポンプ220 を作動さ
せ、反応液を連結標識プローブ捕捉用カラム215 に導入
する。連結標識プローブ捕捉用カラム215 は加温装置21
6 で一定温度に保たれている。なお当該温度は42〜65℃
程度が好ましい。バルブ213 を切り替え、洗浄液214 で
未連結標識プローブを洗い流す。次に、カラム温度を95
℃に上昇させ、捕捉した連結標識プローブを溶出して、
シースフローセルに導き蛍光を経時的に測定する。シー
スフローセルを用いた蛍光測定は後記実施例1に示す装
置で行うのが好ましい。
【0032】
【実施例1】 本発明検出装置 図6は本発明検出装置の一実施態様を示したものであ
る。シースフローセル300 には、液送ポンプ354 でシー
ス液355 が常に流れている。かかるシース液の線速は特
に限定されないが通常10m/sec 程度に調整するのが好ま
しい。試料溶液はカットバルブ350 を介して注入口351
から添加される。試料溶液はパルスモーター353 で駆動
されるシリンジポンプ352 でシースフローセル300 に送
りこまれる。ここで、蛍光プローブは分子ごとに配列さ
れる。各蛍光プローブ分子はレーザー光で照射される。
レーザー発振器301 及び他レーザー発振器302 から出た
レーザー光は、レーザー発振器301 のレーザー光を反射
しレーザー発振器302 から出たレーザー光を透過するダ
イクロイックミラー303 で合成された後、レンズ304 及
び305 からなるビームエキスパンダーでビーム径を拡張
させ、集光レンズ306 で集光されて、シースフローセル
の検出部307 を通過する。通過したレーザー光はビーム
ストッパー314 に吸収される。
【0033】蛍光標識プローブからレーザービームに接
触するときに発する発光は、集光レンズ308 あるいは30
9 で集められ、一標識プローブから生じる蛍光が選択的
に通過するバンドパスフィルター310 あるいは、他標識
プローブから生じる蛍光が選択的に通過するバンドパス
フィルター311 を介して光電子増倍管312 あるいは313
で検出される。光電子増倍管がとらえた信号はマイクロ
プロセッサー357 で時系列に処理される。一蛍光色素由
来の蛍光発光時刻と他蛍光色素由来の蛍光発光時刻の一
致する場合は標的DNAに標識プローブがハイブリダイ
ゼーションしていると判断し、標的DNAの分子として
計数する。いずれか一方の蛍光団由来の蛍光しか検出さ
れない場合には標識プローブが非特異的に反応している
とみなし計数の交換から除外する。
【0034】
【実施例2】 ポリヌクレオチドの検出 (1) (1) 本実施例においては、検出の対象となる標的ポリ
ヌクレオチド試料として、バクテリオファージλのDN
Aを用いた。そして、当該バクテリオファージλのDN
Aに対して、3種類のプローブを用いて、かかる標的ポ
リヌクレオチド試料を検出した。
【0035】第1のプローブとなるポリヌクレオチド
は、配列番号1に示す塩基配列を有するポリヌクレオチ
ド鎖であって、標的となるバクテリオファージλのDN
Aの塩基配列の6601番から6875番の各塩基に対して、相
補的に結合するポリヌクレオチド鎖である。第2のプロ
ーブとなるポリヌクレオチドは、配列番号2に示す塩基
配列を有するポリヌクレオチド鎖であって第1のプロー
ブとは異なる部位に相補的に結合するポリヌクレオチド
鎖である。第3のプローブとなるポリヌクレオチドは、
配列番号3に示す塩基配列を有するポリヌクレオチド鎖
であって、標的ポリヌクレオチド上で第2のプローブの
3'末端側に隣接し、かつ第1のプローブの結合位置とは
異なる。
【0036】なお、第1のプローブは標的ポリヌクレオ
チドの捕捉用で、参考例1に示した反応担体に固定して
使用した。第2・第3のプローブは標識用で、第2のプ
ローブの5'末端にポリTスペーサーを介してスルホロー
ダミン101 様蛍光団が結合しており、第3のプローブの
3'末端にポリTスペーサーを介してフルオレッセイン様
蛍光団が結合している。
【0037】(2) そして、上記の標的ポリヌクレオ
チド試料である、バクテリオファージλのDNAとして
は、λDNA(Bacteriophageλ cI857 Sam 7由来)(宝酒
造社製) を用いた。 第1のプローブとなるポリヌクレオチド鎖は、ホスホ
アミダイド法に従い合成した。 前記のごとく第2のプローブとなるポリヌクレオチド
鎖の5'末端には、ポリTスペーサーを介してスルホロー
ダミン101 様の蛍光団が結合している。本実施例におい
ては、かかるスルホローダミン101 様と思われる蛍光団
が結合した直径0.02μm の表面にカルボキシル基を有す
る粒子ポリマーを用いた。かかる粒子ポリマーとして
は、Molecular Probes,INC.製のCarboxylate-modified
Latex red(580/605)を用いた。当該スルホローダミン10
1 様の蛍光粒子によるポリヌクレオチドプローブの標識
は、ホスホアミダイド法によるポリヌクレオチドの合成
最終段階に、N−モノメトキシトリチルアミノヘキサ−
6−オキシ−β−シアノエチル−N,N−ジイソプロピ
ルアミノホスアミダイドを反応させて5'末端にアミノ基
を導入したプローブに、水溶性カルボジイミドで当該粒
子のカルボキシル基を活性化して結合させた。そして、
結合後、弱アルカリ条件下で未反応のカルボキシル基を
再生した。
【0038】前記のごとく、第3の標識用プローブと
して用いられるポリヌクレオチドの3'末端にはポリTス
ペーサーを介してフルオレッセイン様蛍光団が結合して
いる。本実施例においては、かかるフルオレッセイン様
と思われる蛍光団を含む直径0.02μm の表面にカルボキ
シル基を有する粒子ポリマーを用いた。具体的には、当
該粒子ポリマーとして、Molecular Probes, INC.製のCa
rboxylate modified Lafex Yellow-green(490/515)を用
いた。当該フルオレッセイン様蛍光粒子による第3のプ
ローブの標識は、ポリヌクレオチドの合成後に、アナリ
ティカルバイオケミストリー記載のラリー イー. モリ
ソン等の方法 (Larry E. Morrison et al., Analytical
Biochemistry, 183, pp.231-244(1989))に従い、ター
ミナルデオキシヌクレオチジル トランスフェラーゼを
用いて8− (6−アミノヘキシル) アミノアデノシンと
結合して、ポリヌクレオチドの3'末端にアミノ基を導入
した当該プローブに、水溶性カルボジイミドで当該粒子
のカルボキシル基を活性化して、当該蛍光団を結合させ
た。そして、結合後、弱アルカリ条件下で未反応のカル
ボキシル基を再生した。
【0039】調製したこれら第2・第3の標識プローブ
は、0.5 %SDS、 100μg/mlのキャリヤーDNA (変
性サケスペルマDNA)、5mg/ml 牛血清アルブミン、50
%ホルムアミド、0.5M NaClを含む50mM Tris・HCl(pH
7)のハイブリダイゼーションバッファーに懸濁して保
存した。 (3) 標的ポリヌクレオチドの捕捉用のプローブである
配列番号1に示す塩基配列を有する第1のプローブの反
応担体への固定は以下の様に行なった。
【0040】まず、ガラス製の参考例1に示す反応担体
の表面を十分に洗浄し、3− (2−アミノエチルアミノ
プロピル) トリメトキシフラン32mmol/lを反応部 (図3
・31) に作用させて、当該反応部にアミノ基を導入し
た。このアミノシラン化した反応担体を、アナリティカ
ル バイオケミストリー (1991年) 198巻、 138頁から
142頁記載のショーレン リチャード ラスムッセン等
(Soren Richard Rasmuseen et al, Analitical Bioch
emistry 198, 138-142 (1991)の方法に従い、1−メチ
ルイミダゾールと1エチル−3 (3−ジメチルアミノプ
ロピル) −カルボジイミドを用いて第1のプローブを固
定した。この担体は、0.1 %SDS、100μg/mlキャリ
ヤーDNA (変性サケスペルマDNA) 、5mMEDTA 及び
0.15M NaClを含むpH7の50mM Tris・HCl緩衝液に懸濁し
て保存した。
【0041】(4) ハイブリダイゼーション反応は、参
考例2 (1) に示す装置を用いて、以下の手順に従い行
なった。試料となるバクテリオファージλの濃度はモル
分子吸光係数=5.18×108 M-1・cm-1として求めた。キ
ャリアーDNAとして 100μg/mlの変性サケスペルマD
NAを含む各種濃度のバクテリオファージλ溶液を容器
100 にいれ、これを容器保持ステージ102 にセットす
る。標識プローブ等も同様の容器にいれ容器保持ステー
ジ102 にセットした。容器100 中の試料等は加熱器104
により95℃に加熱され、バクテリオファージλDNAを
変性して一本鎖状態とした。次に容器100 中の試料を50
μl 吸い上げ、反応担体ステージ109 にセットした前記
(3) において第1のプローブを固定した反応担体110
の試料添加部 (図3・32) に添加し、反応部に試料溶液
を導入した。使用済みのピペットチップはチップ破棄箱
150 に捨てられる。さらに、容器保持ステージ102 に装
着した他の容器から第1の標識プローブと第2の標識プ
ローブを分注し反応担体110 に添加した。ここでは、2
種の標識プローブはあらかじめ混合され一回のピペット
操作で同時に添加した。なお、反応担体ステージ109 は
内部に加熱器を持つ構造で、ここでは55℃に設定した。
反応担体ステージ109 をステッピングモーター111 で約
30°傾斜させて、反応部 (図3・31) に試料溶液を導入
した。そして30秒毎に反応担体110 を傾け試料溶液を反
応部に出し入れすることで、当該試料溶液をゆるやかに
攪拌した。4時間後、反応残液を反応担体の反応残液排
出部 (図3・33) にろ紙112 をあてがい排出した。ろ紙
をあてがったままの状態で、Z軸ステージ115 に装着し
た洗浄液ノズル116 を反応担体の添加部に移動しポンプ
117 を用いて洗浄液を添加した。すなわち、0.1%ドデ
シル硫酸ナトリウム、5mg/ml牛血清アルブミン、0.5MNa
Cl、0.3Mクエン酸緩衝液(pH7.0)中で25℃で洗浄した
後、さらに、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム、2mM ED
TA、3M テトラメチルアンモニウム、トリス塩酸 (pH
8.0) 溶液で58℃で洗浄した。図4には洗浄液を保持す
る容器は118 の一種類しか書かれていないが、実際には
複数の洗浄液がバルブ119 を介してつながれている。そ
して、洗浄後、上記洗浄液はろ紙により排出され、使用
済みのろ紙はろ紙破棄箱151 に廃棄した。
【0042】次に、 E.coli DNAリガーゼを反応さ
せ、標的ポリヌクレオチドであるλファージDNAの上
の隣接する部位に結合した2種の標識ポリヌクレオチド
プローブを連結した。すなわち、10ユニットの E.coli
DNAリガーゼを含む5mg/ml牛血清アルブミン、 26mM
NAD、10mM硫酸アンモニウム、1mMジチオスレイト
ール、1.2mM EDTA、4mM塩化マグネシウムを含む30
mMトリス塩酸緩衝液 (pH8) 10μl を反応担体に加え、
25℃で1時間反応させた後、10mMEDTAを含む30mMト
リス塩酸緩衝液 (pH8) で洗浄した。さらに当該洗浄液
50μl を加え、反応担体を90℃に加熱しながら5分間攪
拌した。反応容器を傾け連結した標識プローブを含む溶
液を排出部に集めた。なお、リガーゼの添加、反応等の
操作は、上記標識プローブ等の反応方法と同様な装置で
行った。
【0043】さらに、溶出させた連結標識プローブを含
む溶液を図6記載の2色のレーザー光を用いるフローセ
ルタイプの蛍光計数装置で分析した。シースフローセル
300には、液送ポンプ354 でシース液 (蒸留水) 355 が
常時一定流速で流れている。かかる流速は、シースフロ
ーセルの検出部における流速が線速10m/秒となるように
設定した。
【0044】試料溶液をカットバルブ350 を介して注入
口351 から添加し、パルスモーター353 で駆動されるシ
リンジポンプ352 でシースフローセル300 に送りこま
れ、蛍光プローブは分子ごとに配列した。これらの蛍光
プローブ分子を励起するレーザー発振器としてアルゴン
レーザー発振器 (波長488nm)(301) 及びアルゴンレーザ
ーで励起した可変波長色素レーザー発振器 (波長590nm)
(302) を採用した。ダイクロイックミラー303 として
は、488nm の光を反射し、590nm の光を透過する性質の
ものを採用した。バンドパスフィルター310 又は311 と
しては、標識された蛍光色素由来の2種類の蛍光を選択
的に透過する性質のもの、具体的には、アルゴーレーザ
ー・フルオレッセイン由来の蛍光波長である510nm から
540nm の光が通過するバンドパスフィルターあるいは、
前記可変波長色素レーザー・スルホローダミン101 由来
の蛍光波長である605nm から650nm の光が透過するバン
ドパスフィルターを用いた。
【0045】図7に、蛍光発光の経時変化を示す。その
結果光電子増倍管312 がとらえたフルオレッセイン様色
素由来の蛍光と、光電子増倍管313 がとらえたスルホロ
ーダミン101様色素由来の蛍光が同時に測定される場
合、即ち連結標識プローブと、どちらか一方の蛍光体の
みが検出される場合が明瞭に識別できることが判明し
た。よって、非特異的に反応した蛍光プローブと、標識
ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイゼーションし
リガーゼにより連結された蛍光プローブが分離できるの
で、標的ポリヌクレオチドを高感度に検出できることが
判明した。
【0046】
【実施例3】 ポリヌクレオチドの検出 (2) (1) 本実施例においては、実施例2と同様に標的ポリ
ヌクレオチド試料として、バクテリオファージλのDN
Aを用いた。そして、当該バクテリオファージλのDN
Aに対して、3種類のプローブを用いて、かかる標的ポ
リヌクレオチド試料を検出した。
【0047】第一のプローブは、実施例2における第2
の標識プローブと第2の標識プローブは実施例2におけ
る第3の標識プローブと同一であり、その調製方法も実
施例2に記載の方法に準じた。第3のプローブは配列番
号4に示される塩基配列を有する第1・第2の標識プロ
ーブ連結体の捕捉用プローブであり、ホスホアミダイド
法に従い合成した。合成した捕捉用プローブを合成する
最終段階にN−モノメトキシトリチルアミノヘキサ−6
−オキシ−β−シアノエチル−N,N−ジイソプロピル
アミノホスホアミダイドを反応させて5’末端をアミノ
化した。これとは別に直径400 μm のガラスビーズを36
mMの3−(2−アミノエチルアミノプロピル) トリメトキ
シシラン水溶液を用いてアミノシラン化し、次に50mM無
水コハク酸を作用させてガラスビーズ表面にカルボキシ
ル基を導入した。アミノ基を導入した上記捕捉用プロー
ブをこれに混合し、2% 1−エチル−3(3−ジメチル
アミノプロピル)カルボジイミドを用いて縮合反応を行
わせしめて捕捉用プローブをガラスビーズ表面に固定し
て、これを捕捉用カラムとして使用した。
【0048】(2) ハイブリダイゼーション反応は、参
考例2 (2) に示す装置を用いて、以下の手順に従い行
なった。キャリアーDNAとして 100μg/mlの変性サケ
スペルマDNAを含む各種濃度のバクテリオファージλ
溶液を容器201 にいれ、これを容器保持ステージ202 に
セットした。標識プローブ等も同様の容器にいれ容器保
持ステージ202 にセットした。容器201 中の試料等は加
熱器204 により加熱され、バクテリオファージλDNA
を変性させて一本鎖状態とした。まず、自動ピペット
206 を移動させ、ピペットチップ203 をセットした。次
に、容器201 中の試料を50μl 吸い上げ、反応ステージ
209 にセットした反応容器208 に添加した。使用済みの
ピペットチップはチップ破棄箱250 に廃棄した。さら
に、容器保持ステージ202 に装着した他の容器から第1
の標識プローブと第2の標識プローブを分注し反応容器
208 に添加した。本実施例においては、2種の標識プロ
ーブをあらかじめ混合しておき一回のピペット操作で同
時に添加した。なお、反応ステージ209 は内部に加熱器
204 を持つ構造で、ここでは55℃にて設定し4時間反応
させた後、95℃で5分間加熱した。
【0049】反応終了後、反応液を第3のプローブを固
定した連結標識プローブ捕捉用カラム215 に導入した。
すなわち、吸引ノズル211 を昇降装置212 を用いて反応
容器208 に入れ、次いでポンプ220 を作動させ、反応液
を連結標識プローブ捕捉用カラム215 に導入した。な
お、連結標識プローブ捕捉用カラム215 は加温装置216
で45℃に保たれている。そして、バルブ213 を切り替
え、62℃に加熱した0.05%Tween 20、5mg/ml牛血清アル
ブミン、0.5M NaCl 、10%ホルムアミドを含む0.3Mクエ
ン酸緩衝液(pH7)で未連結標識プローブを洗い流した
後、カラム温度を95℃にして、捕捉した連結標識プロー
ブを溶出させ、シースフローセルに導き蛍光を経時的に
測定した。シースフローセルを用いた蛍光測定は実施例
1に示した装置を用いて実施例2と同様の方法で行なっ
た。
【0050】その結果、実施例2と同様に連結標識プロ
ーブをどちらか一方のプローブと明瞭に分別して検出で
きた。この結果より、本実施例においてはホモジニアス
系で反応を行わせたときに問題になる過剰量の未連結蛍
光プローブを大部分取り除けることが判明した。すなわ
ち、本法を用いればシースフローセルで個々の蛍光プロ
ーブ分子を分離検出できる程度まで未連結蛍光プローブ
を除くことが可能であるため本実施例でも実施例2に示
すのと同様に、非特異的に反応した蛍光プローブと、標
的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイゼーション
しリガーゼにより連結された蛍光プローブが分離可能で
あり、標的ポリヌクレオチドを高感度に検出できること
が判明した。
【0051】
【実施例4】 ポリヌクレオチドの検出 (3) (1) 本実施例では、実施例2・3と同様に、標的ポリ
ヌクレオチド試料として、バクテリオファージλのDN
Aを用いた。ここでは、異なる蛍光団を結合した2種の
プローブを用い、一方の蛍光団を励起したときにエネル
ギー移動により他方の蛍光団が発光する現象を用いて標
的ポリヌクレオチドを検出した。第1のプローブは捕捉
用プローブで、実施例2で用いた捕捉用の第1のプロー
ブと同一の塩基配列を有し、参考例1に示した反応担体
に固定して用いる。かかる固定化法は、実施例2 (3)
と同様の方法でアミノシラン化した反応体にN−スクシ
ンイミジル3− (2−ピリジルジチオ) プロピオン酸を
反応させた後、還元剤であるジチオスレイトールを反応
させたスルフィド基を担体に導入した。これとは別に配
列番号1で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド
のホスホアミダイド法による合成の最終段階にN−モノ
メトキシトリチルアミノヘキサ−6−オキシ−β−シア
ノエチル−N, N−ジイソプロピルアミノホスホアミダ
イドを反応させて5'末端にアミノ基を導入し、N−スク
シンイミジル3− (2−ピリジルジチオ) プロピオン酸
を反応させ、5'末端のアミノ基を修飾した。反応液にエ
タノールを加え、修飾された第1のプローブを沈澱させ
て未反応の試薬を除いた後修飾した前記ポリヌクレオチ
ドをスルフィド基を導入した担体に加えて、ジスルフィ
ド交換反応により第1のプローブが担体に固定された。
【0052】第2・第3のプローブは標識用で、配列番
号5及び配列番号6のポリヌクレオチドを有する。第3
のプローブは、バクテリオファージλのDNA上で第2
のプローブの3'末端側に隣接する。第2のプローブに
は、5'末端から55番目のCと56番目のTの間のリンの部
分にスルホローダミン101 蛍光団が結合している。第3
のプローブには、5'末端から5番目のCと6番目Tの間
のリンの部分にフルオレッセインが結合している。これ
ら蛍光団のポリヌクレオチドプローブへの標識法は特開
昭61-44353に開示の方法に従った。この方法は、ポリヌ
クレオチドの蛍光体標識部位のリン酸結合を官能基を有
するホスホン酸基に置き換え、この官能基と蛍光団を結
合させることにより蛍光標識ポリヌクレオチドプローブ
を得る手法で、任意の位置に標識物を導入できる方法で
ある。
【0053】実施例2と同様に第1のプローブを固定し
た担体に試料であるバクテリオファージλのDNAを反
応させた後、上記2種のプローブをハイブリダイズさせ
た。洗浄により未反応のプローブ等を除いた後、ジチオ
スレイトールで還元してプローブの結合した標的ポリヌ
クレオチドを遊離させた。これをシースフローセルに導
き、実施例1に示す検出装置でアルゴンレーザー(488n
m) により発光する600nmから650nm の光を検出した。そ
して、その経時的変化を図8に示した。
【0054】その結果、488nm で励起した時に通常では
検出されない600 〜650nm の蛍光が検出された。スルホ
ローダミン101 蛍光団単独の蛍光はアルゴンレーザー(4
88nm) で励起した場合弱く、また単独のフルオレッセイ
ンからの蛍光はフィルターで除去できるので、アルゴン
レーザー(488nm) で発光する600nm から650nm の光はフ
ルオレッセイン蛍光団とスルホローダミン101 の間での
エキルギー移動に由来するものであることは明らかであ
る。よって、蛍光団スルホローダミン101 蛍光団とフル
オレッセイン蛍光団の両者が隣接して結合している標的
バクテリオファージλのDNAのみが検出されているこ
とは明らかである。
【0055】本実施例では、使用するレーザーが1種類
ですむという大きな利点がある。
【0056】
【発明の効果】本発明により、放射性同位元素の標識を
必要とせずに、高感度で精度が高く、定量的な測定が可
能で、かつ自動化により単位時間あたりの測定サンプル
数を多くすることで臨床フィールドで多量の検体を検査
することが可能なポリヌクレオチド検出法、及び当該方
法を用いた検出装置が提供される。
【0057】
【配列表】
配列番号 :1 配列の長さ:275 配列の型 :核酸 鎖の数 :1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の配列 合成ポリヌクレオチド 配列 :ATCGCCATACATCCCCTTATAGGACACCGC TTTGCCCAGGTCTTTCACCGCTGTCTCCAGCTCGGA ATTAGAGCCACGACGGGATTCCAGCTTCTCCTTGAC GGCTTTGAAGGAACGGAACAGCGCCCAGCCTTTCGG ATCGAACACGATGATATTCACCACACCGCTGGCGTT CAGCGCGTAGGCTTCGATATCGTCGGTCGGGTCATA CGTGGACTTGTCACGCTTGCTCCACTCCGTGCCGCC GGACTGCGTGATGTTATTCTCCTCACTGC 配列番号 :2 配列の長さ:65 配列の型 :核酸 鎖の数 :1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の配列 他の構造体を含むポリヌクレオ
チド 配列の特徴:1 スルホローダミン101様蛍光団 配列 :TTTTTTCTTTCGGCCTGCATGAATGGCCTT GTTGATCGCGCTTTGATATACGCCGAGATCTTTAG 配列番号 :3 配列の長さ:65 配列の型 :核酸 鎖の数 :1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の配列 他の構造体を含む合成ポリヌク
レオチド 配列の特徴:65 フルオレッセイン様蛍光団 配列 :CTGTCTTGGTTTGCCCAAAGCGCATTGCAT AATCTTTCAGGGTTATGCGTTGTTCCATACTTTTT 配列番号 :4 配列の長さ:35 配列の型 :核酸 鎖の数 :1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の配列 合成ポリヌクレオチド 配列 :5’TTTTTGGCAAACCAAGACAGCTAAAGAT CTCGGCG 3’ 配列番号 :5 配列の長さ:60 配列の型 :核酸 鎖の数 :1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の配列 他の構造体を含む合成ポリヌク
レオチド 配列の特徴:55−56 スルホローダミン101様蛍
光団 配列 :TCTTTCGGCCTGCATGAATGGCCTTGTTGA TCGCGCTTTGATATACGCCGAGATCTTTAG 配列番号 :6 配列の長さ:60 配列の型 :核酸 鎖の数 :1本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の配列 他の構造体を含む合成ポリヌク
レオチド 配列の特徴:5−6 フルオレッセイン様蛍光団 配列 :CTGTCTTGGTTTGCCCAAAGCGCATTGCAT AATCTTTCAGGGTTATGCGTTGTTCCATAC
【図面の簡単な説明】
【図1】ヘテロジニアス反応を用いた本発明の標的ポリ
ヌクレオチド検出法の概念図。
【図2】ホモジニアス反応を用いた本発明の他の標的ポ
リヌクレオチド検出法の概念図。
【図3】反応担体の模式図。
【図4】ヘテロジニアス反応を行うための反応装置の模
式図。
【図5】ホモジニアス反応を行うための本発明の他の反
応装置の概念図。
【図6】シースフロ−セルを用いた多色蛍光測定装置。
【図7】測定結果例を示す図。
【図8】他測定結果例を示す図。
フロントページの続き (72)発明者 永井 啓一 東京都国分寺市東恋ケ窪1丁目280番地 株式会社 日立製作所 中央研究所内 (56)参考文献 特開 昭61−191964(JP,A) 特開 平2−268700(JP,A) 特開 平3−280900(JP,A) 特開 平2−295496(JP,A) 特開 昭62−73138(JP,A) 特開 昭64−3541(JP,A) 特開 昭62−106347(JP,A) 特開 平2−153100(JP,A) (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C12Q 1/68 G01N 21/75 - 21/78 G01N 33/58

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 (1)標的ポリヌクレオチドの配列の隣
    接する部位に各々相補的である、第1の蛍光体で標識さ
    れる第1の標識プローブと前記第1の蛍光体と異なる第
    2の蛍光体で標識される第2の標識プローブとを、前記
    隣接する部位に各々ハイブリダイゼーションさせる工程
    と、 (2)前記隣接する部位に各々ハイブリダイズした前記
    第1の標識プローブと前記第2の標識プローブとをDN
    Aリガーゼを用いて連結させて連結体を形成する工程
    と、 (3)前記連結体を前記標的ポリヌクレオチドから解離
    させる工程と、 (4)解離した前記連結体を含む溶液をシースフローセ
    ルに送りこみ、2つの波長のレーザー光を前記シースフ
    ローセルに照射して、前記第1及び第2の蛍光体に各々
    由来する蛍光を分離して蛍光の経時的変化を検出する工
    程と、 を有し、前記第1及び第2の蛍光体の双方に由来する蛍
    光が同時に検出される場合と、前記第1及び第2の蛍光
    体の何れか一方に由来する蛍光が検出される場合とを識
    別し、前記第1及び第2の蛍光体の双方に由来する蛍光
    が同時に検出される場合に、前記標的ポリヌクレオチド
    として計数することを特徴とする、ポリヌクレオチド検
    出法。
  2. 【請求項2】 (1)標的ポリヌクレオチドの配列の隣
    接しない異なる部位に各々相補的である、第1の蛍光体
    で標識される第1の標識プローブと前記第1の蛍光体と
    異なる第2の蛍光体で標識される第2の標識プローブと
    を、前記異なる部位に各々ハイブリダイゼーションさせ
    る工程と、 (2)前記第1及び第2の標識プローブの一方の鎖を伸
    長させた伸長鎖を形成した後に、前記伸長鎖と他方の標
    識プローブとをDNAリガーゼを用いて連結させて連結
    体を形成する工程と、 (3)前記連結体を前記標的ポリヌクレオチドから解離
    させる工程と、 (4)解離した前記連結体を含む溶液をシースフローセ
    ルに送りこみ、2つの波長のレーザー光を前記シースフ
    ローセルに照射して、前記第1及び第2の蛍光体に各々
    由来する蛍光を分離して蛍光の経時的変化を検出する工
    程と、 を有し、前記第1及び第2の蛍光体の双方に由来する蛍
    光が同時に検出される場合と、前記第1及び第2の蛍光
    体の何れか一方に由来する蛍光が検出される場合とを識
    別し、前記第1及び第2の蛍光体の双方に由来する蛍光
    が同時に検出される場合に、前記標的ポリヌクレオチド
    として計数することを特徴とする、ポリヌクレオチド検
    出法。
  3. 【請求項3】 (1)標的ポリヌクレオチドに相補的な
    捕捉用プローブが固定された担体上で、前記標的ポリヌ
    クレオチドと前記捕捉用プローブとをハイブリダイゼー
    ションさせて、前記標的ポリヌクレオチドを前記担体上
    に捕捉する工程と、 (2)前記標的ポリヌクレオチドの配列の異なる部位に
    各々相補的である、第1の蛍光体で標識される第1の標
    識プローブと前記第1の蛍光体と異なる第2の蛍光体で
    標識される第2の標識プローブとを、前記異なる部位に
    各々ハイブリダイゼーションさせる工程と、 (3)洗浄により未反応の前記第1及び第2の標識プロ
    ーブを除去する工程と、 (4)前記異なる部位に各々ハイブリダイズした前記第
    1の標識プローブと前記第2の標識プローブとを連結さ
    せて連結体を形成する工程と、 (5)前記連結体を前記標的ポリヌクレオチドから解離
    させる工程と、 (6)解離した前記連結体を含む溶液をシースフローセ
    ルに送りこみ、2つの波長のレーザー光を前記シースフ
    ローセルに照射して、前記第1及び第2の蛍光体に各々
    由来する蛍光を分離して蛍光の経時的変化を検出する工
    程と、 を有し、前記第1及び第2の蛍光体の双方に由来する蛍
    光が同時に検出される場合と、前記第1及び第2の蛍光
    体の何れか一方に由来する蛍光が検出される場合とを識
    別し、前記第1及び第2の蛍光体の双方に由来する蛍光
    が同時に検出される場合に、前記標的ポリヌクレオチド
    として計数することを特徴とする、ポリヌクレオチド検
    出法。
  4. 【請求項4】 (1)液相中で、標的ポリヌクレオチド
    の配列の異なる部位に各々相補的である、第1の蛍光体
    で標識される第1の標識プローブと前記第1の蛍光体と
    異なる第2の蛍光体で標識される第2の標識プローブと
    を、前記異なる部位に各々ハイブリダイゼーションさせ
    た後に、前記第1及び第2の標識プローブを連結させて
    連結体を形成し、次いで前記連結体を前記標的ポリヌク
    レオチドから解離させる工程と、 (2)前記連結体の全部又は一部に相補的な捕捉用プロ
    ーブを固定した担体の前記捕捉用プローブと解離した前
    記連結体とをハイブリダイゼーションさせる工程と、 (3)洗浄により未反応の前記第1及び第2の標識プロ
    ーブを除去する工程と、 (4)前記捕捉用プローブと前記連結体とのハイブリダ
    イゼーション体から前記連結体を解離させる工程と、 (5)解離した前記連結体を含む溶液をシースフローセ
    ルに送りこみ、2つの波長のレーザー光を前記シースフ
    ローセルに照射して、前記第1及び第2の蛍光体に各々
    由来する蛍光を分離して蛍光の経時的変化を検出する工
    程と、 を有し、前記第1及び第2の蛍光体の双方に由来する蛍
    光が同時に検出される場合と、前記第1及び第2の蛍光
    体の何れか一方に由来する蛍光が検出される場合とを識
    別し、前記第1及び第2の蛍光体の双方に由来する蛍光
    が同時に検出される場合に、前記標的ポリヌクレオチド
    として計数することを特徴とする、ポリヌクレオチド検
    出法。
  5. 【請求項5】 (1)液相中で、標的ポリヌクレオチド
    の配列の隣接する部位に各々相補的である、第1の蛍光
    体で標識される第1の標識プローブと前記第1の蛍光体
    と異なる第2の蛍光体で標識される第2の標識プローブ
    とを、前記隣接する部位に各々ハイブリダイゼーション
    させた後に、前記第1及び第2の標識プローブを連結さ
    せて連結体を形成し、次いで前記連結体を前記標的ポリ
    ヌクレオチドから解離させる工程と、 (2)前記連結体の全部又は一部に相補的な捕捉用プロ
    ーブを固定した担体の前記捕捉用プローブと解離した前
    記連結体とをハイブリダイゼーションさせる工程と、 (3)洗浄により未反応の前記第1及び第2の標識プロ
    ーブを除去する工程と、 (4)前記捕捉用プローブと前記連結体とのハイブリダ
    イゼーション体から前記連結体を解離させる工程と、 (5)解離した前記連結体を含む溶液をシースフローセ
    ルに送りこみ、2つの波長のレーザー光を前記シースフ
    ローセルに照射して、前記第1及び第2の蛍光体に各々
    由来する蛍光を分離して蛍光の経時的変化を検出する工
    程と、 を有し、前記第1及び第2の蛍光体の双方に由来する蛍
    光が同時に検出される場合と、前記第1及び第2の蛍光
    体の何れか一方に由来する蛍光が検出される場合とを識
    別し、前記第1及び第2の蛍光体の双方に由来する蛍光
    が同時に検出される場合に、前記標的ポリヌクレオチド
    として計数することを特徴とする、ポリヌクレオチド検
    出法。
  6. 【請求項6】 (1)標的ポリヌクレオチドに相補的な
    捕捉用プローブが固定された担体上で、前記標的ポリヌ
    クレオチドと前記捕捉用プローブとをハイブリダイゼー
    ションさせて、前記標的ポリヌクレオチドを前記担体上
    に捕捉する工程と、 (2)前記標的ポリヌクレオチドの配列の隣接する部位
    に各々相補的である、第1の蛍光体で標識される第1の
    標識プローブと前記第1の蛍光体と異なる第2の蛍光体
    で標識される第2の標識プローブとを、前記隣接する部
    位に各々ハイブリダイゼーションさせる工程と、 (3)洗浄により未反応の前記第1及び第2の標識プロ
    ーブを除去する工程と、 (4)前記第1及び第2の標識プローブがハイブリダイ
    ズした前記標的ポリヌクレオチドを遊離させる工程と、 (5)前記工程(4)で遊離した、前記第1及び第2の
    標識プローブがハイブリダイズした前記標的ポリヌクレ
    オチドを含む溶液をシースフローセルに送りこみ、1つ
    の波長のレーザー光を前記シースフローセルに照射し
    て、前記第1及び第2の蛍光体の一方の蛍光体を励起し
    てエネルギー移動により他方の蛍光体から発する蛍光の
    経時的変化を検出する工程と、 を有し、前記標的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリ
    ダイゼーションした前記第1及び第2の標識プローブを
    検出することを特徴とする、ポリヌクレオチド検出法。
  7. 【請求項7】 (1)標的ポリヌクレオチドの配列の隣
    接しない異なる部位に各々相補的である、第1の蛍光体
    で標識される第1の標識プローブと前記第1の蛍光体と
    異なる第2の蛍光体で標識される第2の標識プローブと
    を、前記異なる部位に各々ハイブリダイゼーションさせ
    る工程と、 (2)前記第1及び第2の標識プローブの一方の鎖を伸
    長させた伸長鎖を形成した後に、前記伸長鎖と他方の標
    識プローブとをDNAリガーゼを用いて連結させて連結
    体を形成する工程と、 (3)前記連結体を前記標的ポリヌクレオチドから解離
    させる工程と、 (4)解離した前記連結体を検出する工程と、 を有することを特徴とする、ポリヌクレオチド検出法。
  8. 【請求項8】 請求項7に記載のポリヌクレオチド検出
    法によって調製される前記解離した連結体を含む溶液が
    送りこまれるシースフローセルと、2つの波長のレーザ
    ー光を前記シースフローセルに照射する手段と、前記レ
    ーザー光により励起され、前記第1及び第2の蛍光体に
    各々由来する蛍光を分離して蛍光の経時的変化を検出す
    る手段と、前記第1及び第2の蛍光体の双方に由来する
    蛍光が同時に検出される場合と、前記第1及び第2の蛍
    光体の何れか一方に由来する蛍光が検出される場合とを
    識別し、前記第1及び第2の蛍光体の双方に由来する蛍
    光が同時に検出される場合に、前記標的ポリヌクレオチ
    ドとして計数する手段とを有することを特徴とする、蛍
    光検出装置。
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