JPH03128000A - 核酸の検出法及び検出試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は核酸の検出法及び検出試薬に関する。

［従来の技術］ 最近免疫学或は分子生物学の進歩に伴い、特定の核酸の
検出を行なう頻度が増加している。

従来の核酸の検出法は、被測定物質となる一本鎖核酸を
、適当な標識物質で標識した相補的な一本鎖核酸で直接
検出する方法が主として用いられている。

［発明が解決しようとする課題］ しかしながら従来の検出法は放射性物質を用い、且つ標
識法が被測定物質と特異的に結合する物質に直接標識す
る方法、或はアビジン−ビオチンの特異的結合を利用し
た方法等が知られているが、感度不足が問題になる場合
が多い。特に疾病の診断に、最近は極微量の生体物質を
測定する場合が多くなり、臨床応用の観点から高感度化
の必要性は益々増加している。

［課題を解決するための手段］ 本発明者らは上記問題点に鑑みて、極微量の核酸の検出
を安全且つ高感度化する方法及び試薬を開発すべく鋭意
検討した結果、本発明に到達した。

すなわち本発明は、［Ｉ］試料中の一本鎖核酸（Ａ）と
、［ＩＩ］　　（Ａ）と相補な塩基配列を持つ一本鎖核
酸（Ｂ）と、［ｍ］　　（Ｂ）と相補な塩基配列を持ち
、且つ多価の結合子を有する化合物を介して標識された
一本鎖核酸（Ｃ）とを反応させることにより、試料中の
（Ａ）を検出することを特徴とする核酸の検出法及び試
料中の一本鎖核酸（Ａ）に相補な塩基配列を持つ一本鎖
核酸（Ｂ）及び（Ｂ）に相補な塩基配列を持ち、且つ多
価の結合子を有する化合物を介して標識された一本鎖核
酸（Ｃ）を含有してなる請求項１〜４のいずれか記載の
検出法に使用される核酸の検出試薬である。

この明細書において使用する「核酸」なる語は一本鎖及
び二本鎖の両方を指すものとし、必要な場合はそのどち
らかを明記するものとする。またこの「核酸」なる語は
塩基数の大小は問わず、１以上の塩基数を有する核酸を
全て含むものとする。

更にここで使用した「核酸」の中には核酸の単位成分で
あるヌクレオチドが天然に存在するものの他人工的に修
飾されたものも含むものとする。

本発明における試料としては、微生物、ウィルス、魚類
、鳥類、植物、動物、特に噴孔動物（ヒトを含む）に由
来する細胞が挙げられる。

これらの細胞は通常、溶解酵素、界面活性剤等の化学的
手段又は超音波等の物理的手段によって破砕される。−
水銀核酸（Ａ）は、まずこの破砕液中から除蛋白等の精
製手段によって抽出され、制限酵素（例えば、ＥｃｏＲ
Ｉ　、Ｈ１ｎｄＩ［Ｉ、Ｐｓｔ　Ｉ　、Ｂｇｌ　Ｉ等）
での化学的手段又は超音波等の物理的手段によって処理
することで核酸を断片化され、加熱又はアルカリによる
変性で一本鎖化されて得られる。具体的に制限酵素によ
る調製法は通常０−１．０Ｍ−ＮａＣＩを含む１００ｍ
Ｍ−Ｔｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７，５）に核酸試料０．１〜
１００μｇ及び制限酵素０．１〜１００ｕｎｉｔｓを加
え、２０〜４５℃、１０−１２０分て振盪することで行
うことができる。これらの方法は、例えばトム・マニア
チス著、モレキュラー・クローニング、コールド・スプ
リング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｔｏｏｔ　Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ　、ＭＯＬＥＣＩＪＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ、、
Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｙ−ｉｎｇ　ｔｌａｒｂｏｒ　　Ｌａ
ｂｏｒａｔ。

ｒｙ）　ｐ１０４，１９８２に詳述しである。また核酸
の量が少ない場合には種々の核酸合成酵素を用い、試験
管内で予め核酸量を検出に耐える迄増幅させておくこと
もてきる。

加熱による変性としては、約６０〜１５０°Ｃ１約１〜
３０分、好ましくは約８０〜１００℃、約１０〜２０分
て、アルカリ変性としては水酸化ナトリウムを含む水溶
液等を適量添加し、常温で約１０〜２０分程度放置し、
最後に中性に戻す方法が挙げられるが、これらに限定さ
れるものではない。

一本鎖核酸（Ｂ）としては、試料中の一本鎖核酸（Ａ）
と反応をさせることか６−（Ａ　）の塩基配列に相補な
塩基配列部分を持つ核酸が挙げられる。

デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）の場合、天然の二本鎖核酸
を一本鎖に分離・精製してもよく、又化学的方法、即ち
アデニン、グアニン、シトシン及びチミンの４種のヌク
レオチドを順番に結合していく方法で合成してもよい。

好ましくは純度及び大量生産が容易であることから化学
的方法での調製である。

又リボ核酸（ＲＮＡ）の場合は一本鎖核酸をそのま・ま
使用できる。

一本鎖核酸（Ｂ）の塩基数は、通常１〜１００００であ
り、精度及び感度の点で長い方が好ましいが、一定の塩
基数、例えば約５００塩基以上では余り変化がない。好
ましくは相補鎖が認識でき、且つ精度及び感度を確保で
きる５〜１００塩基である。

試料には種々の核酸が存在することから、−水銀核酸は
相補的な核酸以外に相補的でない核酸も含まれる。また
相補的でない核酸以外は存在しない場合もある。

一本鎖核酸（Ｃ）としては、（Ａ）との反応に預からな
かった（Ｂ）と反応する必要があることから（Ｂ）と相
補な一本鎖核酸であり、−水銀核酸としては上記と同条
件である。

多価の結合子を有する化合物としては、この各々の結合
子が反応性を有し、特に結合子を介して標識できる化合
物が挙げられる。例えば、同一の結合子を分子内に２個
以上有する高分子物質、具体的にはイムノグロブリン−
Ｍ　（ＩｇＭ）　、シクロデキストリン、−水銀核酸、
クラウンエーテル及びビオチン等が挙げられる。これら
のうち、反応性の点て好ましくは、イムノグロブリン−
Ｍ（ＩｇＭ）、−水銀核酸である。

（Ｃ）を多価の結合子を有する化合物で修飾する方法と
しては上記の分子中に保有する官能基、１列えば、水酸
基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、カルボニ
ル基等と多価の結合子を有する化合物とが化学結合、例
えば、二官能性架橋剤（例えば、グルタルアルデヒド等
）、二官能性活性化剤（例えば、水溶性カルボジイミド
、カルボジイミダゾール、Ｎ−ヒドロキシサクシニミド
、ビス（スルフオサクシニミヂル）サブストレート、ジ
スルフィドサクシニミヂルタータレート、Ｐ−フェニレ
ンビスマレイミド、ジメチルスへロイミデートニ塩酸塩
、メチル４−メルカプトブチルイミデート塩酸塩、メチ
ル４−アジドベンゾイミデート塩酸塩等）又は光架橋剤
により共有結合させる方法が挙げられる。多価の結合子
を有する化合物が一本鎖核酸の場合、（Ｃ）の化学合成
の際に直接末端に付加重合させることができる。

共有結合に際して、支持体表面と一本鎖核酸の結合部位
（末端塩基）迄の距離はある程度保つ方がハイブリダイ
ゼーション時の反応性が良好となり、結果的には感度ア
ップにつながることから好ましい。即ち、架橋剤又は活
性化剤を用いて支持体と一本鎖核酸を結合する場合、支
持体の表面及び−水銀核酸の結合部位の少なくとも゛い
ずれか一方に予め導入された官能基部分が、ある程度の
分子長（例えば、ｌｎｍ等）以上をもつように化合物（
例えば、炭素数３以上のポリメチレン基、炭素数４以上
のポリエーテル基等）が挿入されていることが好ましい
。

多価の結合子を標識する標識物質としては、例えば放射
性同位元素、蛍光物質、発光物質、酵素及びこれらを間
接的に結合しろる化合物からなる群より選ばれた物質が
挙げられる。具体的には放射性同位元素として［３２ｐ
］、［３５Ｓコ、［３Ｈコ、［１４（］及び［１２５１
］等、蛍光物質としてフルオレセインイソチオシアネー
Ｊ−（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシ
アネート（ＲＩＴＣ）、アクリジンオレンジ、フルオレ
セイン、エチジウムブロマイド及びユーロピウム誘導体
等、発光物質としてルミノール、Ｎ−メチルアクリジウ
ム誘導体及びルシフェリン等、酵素としてペルオキシダ
ーゼ、アルカリフォスファターゼ、β−ガラクトシダー
ゼ及びグルコースオキシダーゼ及び夫々の重合体等、そ
して間接的に結合し得る化合物として、更にオリゴヌク
レオチドを上記標識物質のいずれかで標識したもの、ビ
オチン（アビジンが結合し得る）及び抗体く抗原及び２
次抗体が結合し得る）等がそれぞれ挙げられるがこれら
に限られるものではない。好ましくは安全性及び安定性
の点で放射性同位元素を除く標識物質である。ここでい
う「オリゴヌクレオチド」としては化学合成にて調製さ
れる塩基数１〜５０のヌクレオチドで、且つ（Ｂ）の修
飾部分の塩基配列に相補な塩基配列を有するものが挙げ
られる。

多価の結合子を標識する方法としては、予め結合子に標
識しておいてもよく、或はまた（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ
）の３者を反応後、標識物質を付加する方法が挙げられ
る。例えば日本生化学会編「続生化学実験講座５−免疫
生化学研究法」１０２〜１１２、東京化学同人に記載の
方法で容易に行われる。

好ましくは、再現性及びキット化の点で前者である。

（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）との反応は通常のハイブリダ
イズさせる方法が挙げられる゛。例えば、ハイブリダイ
ズさせる場合、上記（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）とを混合
し、通常２５〜８０’Ｃ’程度で約１０分〜１０時間、
加温振盪する方法が挙げられる。具体的には、特願平１
−２２３７７３、特願平１−２２３７７４、特願［１＃
６３−２６２４７９号、特願昭６３−２８６０７１号、
特願平１−０２６３７９号各公報に詳述されている。又
、これらの方法は市販されている試薬キット（例えば、
ラピッド　ハイブリダイゼーション　システム「マルチ
プライム」　アマ−ジャム・ジャパン製）を用いて行な
えば更に容易である。

又、（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）とを反応させる順序とし
ては、（Ａ）と（Ｂ）を予め反応させておいた後、（Ｃ
）と反応させてもよく、上記３者を同時に投入して反応
させてもよい。好ましくは標識物質等に影響を与える夾
雑物質が除け、判定が明確になる点で前者である。

（Ｂ）は溶液中においても使用されるが、予め支持体に
固定させて使用することが再現性及び簡便さの点て好ま
しい。支持体としてはニトロセルロース、ポリエチレン
、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ナ
イロン、シリコーン、ポリウレタン、ポリフッ化ビニリ
デン等の合成樹脂、磁性体又はガラス、シリカゲル、ベ
ンＩ・ナイト等の無機材質が挙げられるがこれらに限ら
れるものではない。。好ましくは保持能力の点でニトロ
セルロース、ポリフッ化ビニリデン、ポリスチレン、ナ
イロン又はガラスである。

固定化方法としては物理吸着による方法及び化学結合に
よる方法が挙げられる。物理吸着による方法としては、
例えば核酸の場合、具体的には吸着させようとする一本
鎖核酸を含む溶液（例えば、１１０１ｔ／ｎ＋Ｉの核酸
を含むリン酸緩衝液等）を所定の支持体と接触させるこ
とが挙げられる。必要に応じて、反応後吸着を、より強
固なものにするために支持体を加熱（例えば、８０’Ｃ
Ｘ１２０分等）しても構わない。又一方、化学結合によ
る方法としては、具体的にはアミノ基、カルボキシル基
及びチオール基のような官能基が予め導入された支持体
及び−水銀核酸とを二官能性架橋剤（例えば、グルタル
アルデヒド等）、二官能性活性化剤（例えば、水溶性カ
ルボジイミド、カルボジイミダゾール、Ｎ−ヒドロキシ
サクシニミド、ビス（スルフオサクシニミヂル）サブス
トレート、ジスルフィドサクシニミヂルタータレート、
Ｐ−フェニレンビスマレイミド、ジメチルスベロイミデ
−１・二塩酸塩、メチル４−メルカプトブチルイミデー
トメチル４−アジドベンシイミゾ−１・塩酸塩等）又は
光架橋剤により共有結合させる方法が挙げられる。これ
らのうち好ましくは、−水銀核酸の結合強度及び安定性
が高まること及びハイブリダイゼーション時の反応性が
良くなることから化学結合による方法である。

又、共有結合に際して、支持体表面と（Ｂ）の結合部位
塩の距離は、前記と同様にある程度保つ方がハイブリダ
イゼーション時の反応性が良好となり、結果的には感度
アップにつながることから好ましい。

また、ここでいう試料中の一本鎖核酸の種類は一つの対
象物を検出するために一種類でもよく、また複数の対象
物を同時に検出するために二種類以上（例えば２〜３０
種）であってもよい。例えば°細菌、ウィルス、リケッ
チア、原虫、スピロヘータ等の外来性の病原性物質に起
因する疾病及び／又は核酸の塩基配列の変異、即ち塩基
の置換、挿入、欠落、転位等に起因する遺伝性疾病、に
夫々特異的な一本鎖核酸の中で任意の対象物を複数種選
択することができる。さらに同一種の疾病であっても数
種類の異なる塩基配列が存在する場合、即ち細菌やウィ
ルスの変異株または上記の遺伝的疾病等もその対象物と
することができる。具体的には、病原性物質として赤痢
菌、ジフテリア菌、ボツリヌス菌、サルモネラ菌等の細
菌類、アデノウィルス科ヒトアデノウィルス種、オルト
ミクソウィルス科インフルエンザウィルス種、パボーバ
ウイルス科ヒトパピローマウィルス種等のウィルス類が
、又遺伝性疾病として家族性高コレステロール血症、■
型高脂血症、サラセミア、血友病、糖尿病、癌等が夫々
挙げられるがこれらに限られるものではない。

本発明の検出試薬は必須構成成分息外に、この検出試薬
の使用を便ならしめるために、種々の補助剤を包含させ
ることができる。例えば、固体を溶解させる溶解剤、反
応途中で不用な構成成分を除去するための洗浄剤、標準
物質が酵素である場合には、その酵素活性を測定するた
めの基質及び酵素反応を停止するための反応停止剤等を
任意の組合せで包含させることができる。

［実施例コ 以下実施例及び比較例により本発明を更に説明するが本
発明はこれに限定されるものではない。

実施例１　特定の核酸の検出 １）−水銀核酸（Ａ）の調製 市販のｐＢＲ３２２（、宝酒造製）と制限酵素ＢｇｌＩ
（ＴＯＹＯＢＯ製、ｐＢＲ３２２を３断片に切断する）
とからメーカー推双の反応条件で完全消化し、フェノー
ル抽出、エタノール沈殿等の通常の操作を経て精製し、
更に精製したものを１００℃、１０分で熱変性し、ＴＥ
溶液（１０ｎ＋ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ７，５，０，
１ｍＭ−ＥＤＴＡ）中で濃度を１０％ｇ／＋＋＋Ｉに調
整したものを一本鎖核酸（Ａ）（試薬Ａという）として
以下の検討に用いた。

２）固定化した一本鎖核酸（Ｂ）の調製−水銀核酸とし
ては市販のｐＢＲ３２２Ｐｒ１ｒ＋＋ｅｒＨ（宝酒造製
、塩基数１６でｐＢＲ３２２と相補な塩基配列部分をも
つ）を固相に固定化して用いた。０．１Ｍの炭酸緩衝液
（ｐＨ９，８）に溶解した１、０μｇ／ｍｌ−Ｐｒｉｍ
ｅｒＨ５μｍをニトロセルロース膜上に吸着させ、２時
間室温で振盪した。次に０．０１％Ｔｗｅｅｎ含有０．
０２Ｍ燐酸緩衝液（ｐＨ７，５）　　（０，０１％Ｔｗ
ｅｅｎ−ＰＢＳ）の５００　μｌで２回洗浄し、ＰＢＳ
に溶解した１％［３ＳＡを加え、３７°Ｃ１６０分加温
振盪した後、８０℃、２時間で加熱したものを固定化し
た一本鎖核酸（Ｂ）（試薬Ｂという）として以下の検討
に用いた。

３）多価の結合子を有する化合物で修飾された一本鎖核
酸（Ｃ）の調製 市販のｐＢＲ３２２Ｐｒ１＋＋ｅｒＨに相補的な塩基配
列を有するオリゴヌクレオチドの５′末端の水酸基を、
カルボジイミダゾール及びヘキサメチレンジアミンでア
ミノアルキル化させた構造のオリゴヌクレオチドを自動
合成機で調製した。このオリゴヌクレオチドのアミノ基
とグルタルアルデヒドを米国特許第６５２７６１号明細
書に記載の方法で反応させ、シッフ塩基を作製した。続
いて同様の方法で酵素パーオキシダーゼに対する抗体（
イムノグロブリン−Ｍ（ＩｇＭ）、調製法は日本生化学
全編「続生化学実験講座５−免疫生化学研究法」１〜８
４、東京化学同人）を加えて更にシップ塩基を合成した
。これをカラムクロマトで精製し、濃度をＩｍｇ／ｍｌ
とすることで（Ｃ）（試薬Ｃという）を調製した。

４）酵素標識試薬の調製 西洋ワサビパーオキシダーゼ（ＴＯＹＯＢＯ製、以下Ｐ
ＯＤと略す）　１０ｍｇをＯ，ＩＭ−燐酸緩衝液（ｐＨ
＝６．８）　２００μｍ、５％グルタルアルデヒド２０
０μｍ（０゜１Ｍ−燐酸緩衝液、ｐＨ＝６．８）を室温
で２４時間反応。５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５で分離し
、濃度を５０％ｇ／ｍｌにしたものを酵素標識試薬（試
薬りという）とした。

５）測定 試薬への１．１０．１００μｌを夫々ハイブリダイゼー
ション溶液°１て総量を２．０ｍｌに合わせ、夫々に試
薬Ｂを加え、３７°Ｃ１１，０時間加温振盪し、生理食
塩水２ｍｌで洗浄した。続いて試薬Ｃの１０μｍをそれ
ぞれ混合し、上記と同様のハイブリダイゼーション溶液
°１て総量を２．０ｍｌに合わせ、３７°Ｃ１１，０時
間加温振盪で交雑させ、次いで０．０１％ｔｗｅｅｎ−
ＰＢＳ　（５００μｌ　Ｘ２回）で洗浄した。

これらに試薬りを各１０％ｍ添加し、３７°Ｃ１１，０
時間加温振盪し、上記と同様（０，０１％ｔｗｅｅｎ−
ＰＢＳ、５００１ｔ　Ｉ　Ｘ２回）に洗浄した。この後
、通常の免疫反応測定と同様、これらに基質溶液（過酸
化水素含有オルトフェニレンジアミン溶液’）　５００
μｍを加え、３７°Ｃ×３０分加温振盪した後、３ｍｌ
の１．５Ｎ硫酸で反応を停止した。この液の４９２ｎｍ
の吸光度を測定し、ニトロセルロース膜に結合した酵素
の活性を測定した。

：ｌ：１　５０％　　ホルムアミド ０．７５Ｍ　　ＮａＣｌ ０．０７５Ｍ　　＜えん酸２ナトリウム０．１％　フィ
コール４００ ０．１％　ポリビニルピロリド゛ン ０．６％　牛血清アルブミン ０．５％　　ドデシル硫酸ナトリウム 第一図に本検出法による核酸の検出結果を示した。

比較例１ 実施例１において、４）で酵素パーオキシダーゼの抗体
を用いる代わりに直接酵素パーオキシダーゼで結合し、
５）で試薬りを用いない以外は実施例１と同様に行なっ
て検出した。

第一図に比較６す１による検出結果を示した。

この結果、本発明の検出法は高感度に検出されることが
わかる。

実施１列２　特定の核酸の検出試薬 本発明の検出試薬は以下の試薬を別々の容器に充填した
後密栓して製造した。

１）試薬Ａ　　　　　　　　　　　　　５．０ｍ１２）
試薬１３１００本 ３）試薬Ｃ１，５ｒｏ１ ４）試薬Ｄ　　　　　　　　　　　　　１．５＋ｎ１５
）ハイフ゛リタ゛イセ゛−ショ丙容液　　　　　　　　
　　５０００＋ｎ　ｌ６）０．０１％Ｔｗｅｅｎ−ＰＢ
Ｓ　　　　　　　　　　　　　　３０００ｍ１７）生理
食塩水　　　　　　　　　５０００＋ｎ　Ｉ８）基質溶
液 ９）硫酸（１，５Ｎ） ６０＋ｎ１ ５０ｍ１ ［発明の効果コ 本発明の検出法及び検出試薬によれば、従来の検出法に
比べ、安′全且つ高感度の測定が可能となる。

従来の検出法においては対象とする核酸を検出する場合
、−水銀核酸を３２ｐのような放射性同位元素を標識物
質として用いる場合には、検出感度としては大変高感度
であるが、操作上の手間及び安全性の点では問題が多い
。また、放射性物質を使用しない場合には安全ではある
が充分な感度が得られない。本発明はこれらの欠点を改
良するための方法を提供するものである。

また−水銀核酸を複数使用する場合には変異株を持つウ
ィルスや細菌を同一検査試薬で測定できることや、多種
の疾病の同時検出を可能にした点が特徴である。一般に
ウィルスや細菌は種々の外的要因により容易に変異株を
形成し、しばしばその診断・治療を困難にする。削えば
パピローマウィルス或はインフルエンザウィルスは多種
の変ｐ株を有し、後者は特に毎年その株種を替え、流イ
ラする。従って一種の核酸しか検出出来ない試薬Ｃ場合
、その診断を誤ることにも成りかねない。本発明の検査
法によるとこの誤りを無くすことができ、マススクリー
ニングに大変都合がよい。

以上の点から、本発明は特に高感度、高精度Ｃ測定が要
求される血清またはその他の体液中に榎ＭＬ存在する目
的の核酸又は食品中の生物汚染に由来する核酸を特異的
に検出でき、且つこれらＣ検出を安全に行うものである
。本発明の主用途である臨床検査及び食品製造への適用
にはこの点偶に好ましい。

【図面の簡単な説明】

第一図は実施例１及び比較例１の特定の核酸Ｃ検出結果
を示したグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、［ I ］試料中の一本鎖核酸（Ａ）と、［II］（Ａ
   ）に相補な塩基配列を持つ一本鎖核酸（Ｂ）と、［III
   ］（Ｂ）に相補な塩基配列を持ち、且つ多価の結合子を
   有する化合物を介して標識された一本鎖核酸（Ｃ）とを
   反応させることにより、試料中の（Ａ）を検出すること
   を特徴とする核酸の検出法。 ２、（Ａ）と（Ｂ）を反応させたものに（Ｃ）を反応さ
   せる請求項１記載の検出法。 ３、多価の結合子が各々の結合子で反応性を有する物質
   である請求項１または２記載の検出法。 ４、（Ｂ）が支持体に固定している請求項１〜３のいず
   れか記載の検出法。 ５、試料中の一本鎖核酸（Ａ）に相補な塩基配列を持つ
   一本鎖核酸（Ｂ）及び（Ｂ）に相補な塩基配列を持ち、
   且つ多価の結合子を有する化合物を介して標識された一
   本鎖核酸（Ｃ）を含有してなる請求項１〜４のいずれか
   記載の検出法に使用される核酸の検出試薬。