CN110358808B - 用于检测ApoE基因的方法、试剂盒、引物对及探针 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测ApoE基因的方法、试剂盒、引物对及探针。所述的试剂盒包括PCR反应体系和基因芯片，所述PCR反应体系包括强耐受DNA聚合酶和引物对，所述基因芯片包括探针；所述引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；和/或，所述ApoE基因388位点探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4所示；和/或，所述ApoE基因526位点探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和/或SEQ ID NO.6所示。其操作简单、成本低廉，具有较高灵敏度、结果易读精准。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测ApoE基因的方法、试剂盒、引物对及探针。
背景技术
血液作为一种重要的生物样本，其内含有大量的DNA聚合酶抑制物质，如血红素、杂蛋白、脂肪等。为了完成血液样本核酸的PCR扩增，必须先从血液中对核酸物质进行纯化处理。一般包括以下三个过程，一是破裂细胞膜和核膜；二是纯化核酸，即去除蛋白质等影响后续PCR反应的杂质；三是洗脱核酸。通过提取处理虽然可以获得纯度比较高的核酸，但是核酸提取过程往往会导致大量的核酸损失，同时繁琐的提取纯化步骤增加了样本间交叉污染的风险，从而增加了后续PCR扩增失败的可能。此外由于提取过程耗时长，成本高，有些提取方法还需借助苯酚等有害试剂，增加了操作人员感染的风险，且难以实现高通量检测。因此，血液样本能够直接作为模板或经过简单处理就能够作为模板进行PCR扩增检测，成为血液样本扩增需要解决的难题。
人类ApoE基因位于第19号染色体长臂13区2带，全长3597bp，与其他载脂蛋白基因具有相似的结构。目前已发现的ApoE突变有数十种，目前最为常见的为复等位基因E2、E3、E4和6种不同的基因型：E2/E2、E3/E3、E4/E4、E2/E3、E2/E4和E3/E4。它们编码蛋白质之间的差别仅在于112位和158位上的单个氨基酸不同，即半胱氨酸(Cys)和精氨酸(Arg)相互取代，E2 112位和158位上均是Cys；E3 112位上是Arg，158位上是Cys；而E4则112位和158位上均是Arg。ApoE2与受体结合的能力缺失；ApoE4与受体的结合能力最强而导致脂蛋白清除加快，进而导致肝脏总胆固醇升高，LDL-C受体降低。E3和ApoE3/3分别是最常见的等位基因和基因型，不同地域或人种中ApoE基因频率和表型分布可能存在差异，但无性别差异。在中国人群中，E3频率高于80％，E2和E4频率约为10％。文献报道的中国人ApoE基因型分布为：E3/E3型73.89％，E2/E3型15.56％，E3/E4型7.22％，E2/E4型1.67％，E2/E2型1.11％，E4/E4型0.56％。多个独立研究发现，ApoE基因的388、526位点与他汀类药物的调脂有效性显著相关。
近年来，有关ApoE基因指导阿托伐他汀个体化用药的研究越来越受到临床研究者的认可，比较权威的循证依据包括：2015年中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会在药物代谢酶和药物作用靶点基因检测技术指南(试行)中推荐进行ApoE基因的检测，如果基因型为E2/E2的高血脂症患者建议选用普伐他汀治疗，以提高降脂疗效。而美国伯克利心脏实验室出版的《临床启示参考手册》中提出ApoE等位基因E4型对阿托伐他汀、普伐他汀和洛伐他汀等药物时治疗效果不佳，而E2、E3型服用阿托伐他汀、普伐他汀和洛伐他汀等药物时则降低LDL-C水平更有效的结论。通过对患者的APOE基因进行检测，主动预测心血管疾病患者对他汀类调脂的疗效和预后，指导临床医生一开始选择并确定药物品种和剂量，为个体化用药治疗提供科学依据。
目前，关于ApoE基因分型的检测多采用荧光定量PCR，高分辨溶解曲线、基因测序等技术手段。基因测序的方法适合高通量多位点的检测，但操作耗时长且灵敏度低，不适合快速临床检测；并且测序获得结果信息量较大，很多信息对患者没有用处，测序结果判读也需要一些专业知识，费用也相对高。高分辨率溶解曲线法对设备要求比较特殊，需要具有安装高分辨率软件、温度比较敏感的机器才能使用，临床推广存在一定的困难。
关于荧光定量PCR法，CN109457025A公开了一种人ApoE基因检测方法，包括提供待测样品、核酸扩增体系和荧光检测体系的混合物；通过扩增反应循环扩增靶多核苷酸；使荧光发生基团与被扩增的靶多核苷酸序列间接结合；测定荧光量；所述核酸扩增体系至少分别包含ApoE基因388位点和526位点多态性的特异性正向引物和反向引物。使用这些方法进行ApoE基因分型检测均不同程度存在购买仪器成本高，需抽提基因组DNA、操作程序复杂等问题，不利于提高检测效率并实现临床推广普及。从目前来看，这种检测需求又非常巨大，因此寻找一种高效且价格容易被患者接受的检测手段，对于ApoE基因分型检测有着重要的现实意义。
此外，本领域公知，在基因分型时，引物设计要考虑包含SNP位点的扩增产物的序列组成(GC含量)、片段大小、SNP位点在产物的位置等等，这些都是影响PCR产物与探针杂交的杂交动力学的重要因素。杂交动力学较好的PCR产物片段大小一般为200～300bp，片段较大的(比如大于500bp)PCR产物其空间位阻会不利于与探针的杂交，杂交效率下降，片段较小的(比如小于100bp)PCR产物杂交效率会较高，但会增加野生、突变探针的特异性杂交难度。GC含量较高的PCR产物由于碱基间的氢键结合能力较强，杂交效率较高，而GC含量较低的PCR产物在相同的杂交条件下效率偏低。SNP位点在PCR产物的位置也是影响杂交空间位阻的重要因素。这些因素导致可用于特定SNP位点基因分型的引物对的设计就不是特别容易。同理，探针的设计也需要克服很多困难，比如确保野生型探针和突变型探针的杂交条件尽量一致。需要大量的试验验证才能设计出较好的引物对和探针。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中进行基因分型时，需要预先对全血等待测样品进行核酸提取纯化处理从而导致了核酸大量损失、扩增效率低、成本高、操作程序复杂费时、不易推广、且增加了交叉污染以及有毒试剂使用的问题，提供一种可以无需预处理、即可直接对样品进行PCR扩增、扩增效率高、成本低、操作简单、易于推广的用于检测ApoE基因的方法、试剂盒、引物对、探针及其应用。本发明所述的方法、试剂盒、引物对及探针，可用于检测ApoE基因型，具有高度的准确性，能准确区分各类型的突变位点，可用于指导患者用药。本发明所述试剂盒中的基因芯片具有良好的信噪比，不易受全血、口腔脱落细胞等待测样品中其他干扰物的干扰，解决了含有多种干扰物的全血、口腔脱落细胞等待测样品扩增产物对芯片杂交的影响。其中的所述探针与所述引物对有良好的特异性。本发明所述方法和试剂盒的操作简单、成本低廉，不仅具有较高的灵敏度(在本发明某一较佳实施例中，检测限可低至400个白细胞，而现有技术中一般需要200微升血液来进行DNA提取)，还大大缩短了检测时间，并且结果易读精准、在判断上也十分直观，更适合临床的检测和推广。本发明所述方法能够以待测样品直接为PCR模板，可以无需抽提基因组DNA，所以不需要额外购买基因组DNA抽提试剂盒，节约成本，同时减少污染机会，适合大规模样本的检测。并且所需样本极少，最少只需1μL，且对4度冰箱保存7天内的全血等待测样本，检测结果稳定，有利于复查，或者可以利用病人其他检测的全血等待测样本，无需病人专门采样，减轻病人痛苦。本发明将待测样品直接进行PCR后杂交，就可以实现对于ApoE基因的检测。本发明所述方法中杂交的步骤可以通过全自动化杂交过程实现，从而能够更加方便快捷并且避免了人为操作过程中存在的诸多不确定因素。通过本发明所述的方法、试剂盒、引物对、探针及其应用检测患者的ApoE基因型，预测心血管疾病患者对他汀类调脂的疗效和预后，指导临床医生一开始选择并确定药物品种和剂量，为个体化用药治疗提供科学依据，减少不良反应，提供了一种简便易行的解决方案。
现有用于基因分型的方法一般是采用荧光定量PCR，即使是使用了强耐受DNA酶，待测样品也需要经过一定的预处理才能够用于PCR中，且对待检测样品的要求高、用量大。另外，本领域人员公知，在有干扰物存在的待测样品(如全血、口腔脱落细胞等)环境下，引物对、探针的设计及其配比，难度相对较高。在杂交反应中，序列组成、靶标DNA分子和探针的长度、杂交温度、盐等均会影响杂交效率和强度。用于基因分型时的扩增产物不能太长，否则会影响杂交速度，而当扩增产物较短时，引物可选择的余地非常少，同时又需要保证足够的扩增效率，并且要考虑和引物相互的配合，设计难度非常大。此外，由于探针是固定在载玻片上，而载玻片本身具有一定的排斥力，因此设计探针时，需要考虑其空间结构，减少排斥力；同时又要保证设计出的探针能够与扩增产物进行杂交；并且需要考虑探针杂交的特异性问题，对纯合突变样本要保证野生型探针杂交时不产生信号，而突变型探针能够产生信号。本发明中的野生型和突变型探针只相差一个碱基，设计难度非常大。本发明人经过大量的尝试，意外发现即使是使用普通的非荧光定量PCR，加上和基因芯片、强耐受DNA聚合酶的组合使用，配合本发明的引物对和探针，所得检测结果具有高度的准确性、灵敏度、特异性，检测方法简单、快速、成本低廉，且待检测的全血、口腔脱落细胞等样品可以是无需任何的预处理即可直接加入进行检测。
为解决上述技术问题，本发明旨在提供一种用于检测ApoE基因的试剂盒，其包括PCR反应体系和基因芯片，所述PCR反应体系包括强耐受DNA聚合酶和引物对，所述基因芯片包括探针；其中，
所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1(5’-ctgtccaaggagctgcagg-3’)和SEQID NO.2(5’-gctgcccatctcctccatc-3’)所示；
和/或，所述ApoE基因388位点探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3(5’-ATGGAGGACGTGCGCGG-3')和/或SEQ ID NO.4(5’-ATGGAGGACGTGTGCGGC-3')所示；
和/或，所述ApoE基因526位点探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5(5’-TGACCTGCAGAAGCGCCTG-3')和/或SEQ ID NO.6(5’-tgcagaagtgcctggcagt-3')所示。
本发明中，所述基因芯片可为本领域常规，一般包括固相支持物和固定在所述固相支持物上的特异性寡核苷酸探针。
较佳地，所述PCR反应体系中的引物的浓度均为0.2～1.2μM，优选0.32～0.8μM，例如0.4μM。
更佳地，所述PCR反应体系中的上游引物的浓度为0.2～0.4μM，优选0.32μM；和/或，所述PCR反应体系中的下游引物的浓度为0.6～1.2μM，优选0.96μM。
较佳地，所述基因芯片中的探针的浓度为1.5～10μM，例如2.5μM。
较佳地，所述引物对为5’端有生物检测标记物修饰的引物对，所述生物检测标记物优选为生物素、地高辛、荧光素、荧光素衍生物、荧光分子、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶，更优选生物素。通过采用不同的引物对的生物检测标记物修饰，后续杂交检测时相应的检测方法也会随之变化。这些检测方法均可为本领域人员已知的检测方法。
在本发明某一较佳实施例中，所述引物对为5’端有生物素修饰的引物对，后续杂交检测时也相应的使用抗生物素的抗体液和显色液进行检测。具体为：首先与检测探针杂交的扩增产物上的生物素(Biotin)先与链霉亲和素碱性磷酸酶复合物(Streptavidin-AP)反应，生成新的复合物：Biotin-Streptavidin-AP，后者发生如下的显色反应：
Biotin-Stripavitin-AP+BCI-P→BCI-OH+Pi(pH 7.5)
BCI-OH+NBT→蓝紫色沉淀。
其中，BCIP为5溴-4氯-3吲哚磷酸；NBT为硝基四氮唑蓝。通过使探针与上述被扩增区域杂交，从而检测ApoE基因型。
较佳地，所述探针为5’端有和基因芯片的固相支持物的修饰物相结合的基团修饰的探针，优选有氨基修饰的探针，更优选有氨基和多个碱基T修饰的探针，进一步更优选有氨基和16个碱基T修饰的探针。采用氨基修饰后，所述探针可以更好的与醛基修饰的基因芯片的固相支持物(如载玻片或硅片)相连。
较佳地，所述PCR反应体系还包括PCR反应缓冲液和/或脱氧核苷三磷酸(dNTP)。
本发明中，只要是强耐受性DNA聚合酶均可以完成本发明。所述强耐受DNA聚合酶、PCR反应缓冲液、脱氧核苷三磷酸3者可以通过商购获得，例如以商购2×PCR Mix的形式存在。例如，所述强耐受性DNA聚合酶(此处是与PCR反应缓冲液、脱氧核苷三磷酸共同混合的商购2×PCR Mix)选自下述中的一种或多种：2×Direct PCR Mix、2×TransDirectTM PCRSuper Mix、Phusion Blood Direct PCR Master Mix(2×)。
在本发明某一较佳实施例中，所述PCR反应体系的添加量如下：
较佳地，用于所述试剂盒的待测样品为含基因组DNA的生物样本，优选全血或口腔黏膜脱落细胞。
本发明所述试剂盒可为检测全血中ApoE基因的试剂盒。本发明所述试剂盒可用于直接检测全血中的ApoE基因，全血样品无需任何预处理，可以直接使用该试剂盒中所述的PCR反应体系对全血进行PCR扩增，无需抽提基因组DNA，所以不需要额外购买基因组DNA抽提试剂盒，节约成本，同时减少污染机会，适合大规模样本的检测。
当待测样品为口腔黏膜脱落细胞时，一般是将口腔黏膜脱落细胞悬浮在溶剂中以应用于PCR反应当中。
较佳地，所述试剂盒中还包括ApoE基因388位点阴性探针，其核苷酸序列优选如SEQ ID No.7(5’-ATGGAGGACGTGTACGGC-3')所示；
较佳地，所述试剂盒中还包括ApoE基因526位点阴性探针，其核苷酸序列优选如SEQ ID No.8(5’-TGACCTGCAGAATCGCCTG-3')所示。
在本发明一较佳实施例中，所述试剂盒的所述PCR反应体系中，序列分别如SEQ IDNO.3、4、5、6、7和8所示的探针的终浓度分别为5μM、5μM、1.7μM、2.5μM、2.5μM和2.5μM。
较佳地，所述试剂盒还包括杂交溶液，所述杂交溶液优选包括杂交缓冲液、预杂交液、杂交反应液、洗液，优选杂交显色试剂盒中的杂交溶液，更优选上海百傲科技股份有限公司出品的杂交显色试剂盒(货号为BST03021)。
较佳地，所述试剂盒还包括能够与所述引物对的检测标记物发生反应的溶液和显色液例如四氮唑蓝(NBT)、5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺盐(BCIP)、或四甲基联苯胺(TMB)。在PCR产物与基因芯片杂交后，再和能够与所述引物对的生物检测标记物发生反应的溶液进行混合后，所述显色液能够与其发生反应从而显色，以检测杂交信号。
本发明中，所述PCR可以为本领域常规的PCR技术，例如可以为非荧光定量PCR。
为解决上述技术问题，本发明旨在提供一种检测ApoE基因的引物对，所述的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
较佳地，所述的检测为PCR检测。
较佳地，所述检测的样品为含基因组DNA的生物样本，优选全血或口腔黏膜脱落细胞。
为解决上述技术问题，本发明旨在提供一种检测ApoE基因388位点的探针，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4所示；本发明旨在提供一种检测ApoE基因526位点的探针，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和/或SEQ ID NO.6所示。
较佳地，所述探针以基因芯片的形式存在，所述探针固定在所述基因芯片的固相支持物上。所述固相支持物可为本领域常规，例如玻片或硅片。
较佳地，所述的检测为PCR检测。
较佳地，所述检测的样品为含基因组DNA的生物样本，优选全血或口腔黏膜脱落细胞。
为解决上述技术问题，本发明旨在提供一种检测ApoE基因的组合物，所述组合物包括引物对和探针，所述引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，和/或，所述ApoE基因388位点探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3和/或SEQ ID NO.4所示，所述ApoE基因526位点探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.5和/或SEQ ID NO.6所示。
较佳地，所述探针以基因芯片的形式存在，所述探针固定在所述基因芯片的固相支持物上。
较佳地，所述的检测为PCR检测。
较佳地，所述检测的样品为含基因组DNA的生物样本，优选全血或口腔黏膜脱落细胞。
为解决上述技术问题，本发明旨在提供上述引物对、上述探针、或者上述组合物在检测ApoE基因中、在制备检测ApoE基因的试剂中或在制备检测ApoE基因的试剂盒中的应用。
为解决上述技术问题，本发明旨在提供一种非诊断目的的检测ApoE基因的方法，其包括以下步骤：将待测样品利用所述的PCR反应体系进行PCR反应，再将所得产物与所述的基因芯片进行杂交，检测杂交信号。
本发明中，通过芯片杂交法，所述寡核苷酸探针能够特异地与ApoE基因388、526位不同基因型杂交。特异性引物对可扩增含有检测目的位点的目标区域。通过靶DNA与探针的互补碱基之间形成氢键而恢复成原来的双螺旋结构原理进行的。
较佳地，在与所述的基因芯片杂交之前，所述所得产物与杂交缓冲液混合。
较佳地，在与所述的基因芯片杂交之前，先将所述基因芯片与预杂交液进行预杂交。本步骤有利于优化芯片杂交的背景。
较佳地，所述检测的样品为含基因组DNA的生物样本，优选全血或口腔黏膜脱落细胞。
本发明中，所述检测杂交信号可以是根据标记信号(经PCR扩增所得片段上的生物检测标记物的信号)在基因芯片上的位置、强度等信息获取待测信息，所述检测杂交信号的方法可以为基于与抗生物素抗体或亲和素或链霉亲和素或抗地高辛抗体或抗荧光素抗体复合在一起的碱性磷酸酶催化的四氮唑蓝(NBT)显色反应、辣根过氧化物酶催化的5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺盐(BCIP)显色反应、辣根过氧化物酶催化的四甲基联苯胺(TMB)显色反应和/或者荧光检测。具体方法可参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》。若扩增产物用荧光基团标记，也可参照用荧光检测设备(如激光共聚焦扫描仪Scan array3000等)获取待测信息。较佳地，所述检测杂交信号的方法为碱性磷酸酶催化的四氮唑蓝显色反应、辣根过氧化物酶催化的5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺显色反应、辣根过氧化物酶催化的四甲基联苯胺反应或者荧光检测。
本发明中，所述基因芯片的制备可按照生物芯片的常规制造方法进行。例如，如果固相支持物采用的是修饰玻片或硅片，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，可将寡核苷酸探针配制成溶液，然后用点样仪将其点在修饰玻片或硅片，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到基因芯片。如果寡核苷酸探针不含氨基修饰，则其制备方法也可参照：王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；Derisi，JL等于1997年在《科学》278(5338)：680-686发表的“探讨基因组内基因表达的代谢和遗传控制”(Dersi,JL,Iyer VR,Brown PO.Exploring the metablic and genetic control of geneexpression on a genomic scale.Science.1997；278(5338):680-686)及马立人等主编的生物芯片，化学工业出版社。
本发明中，扩增产物与基因芯片之间的固相杂交按照本领域的经典方法进行，或者也可参照王申五主编的《基因诊断技术-非放射性操作手册》；J.萨姆布鲁克等主编的《分子克隆实验指南》，科学出版社。
所述强耐受性DNA聚合酶中的“强耐受性”是指该聚合酶对待测样品中所含有的DNA聚合酶抑制物质具有耐受性，不受这些DNA聚合酶抑制物质的抑制。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明所述的方法、试剂盒、引物对及探针，可用于检测ApoE基因型，具有高度的准确性，能准确区分各类型的突变位点，可用于指导患者用药。本发明所述试剂盒中的基因芯片具有良好的信噪比，不易受全血、口腔脱落细胞等待测样品中其他干扰物的干扰，解决了含有多种干扰物的全血、口腔脱落细胞等待测样品扩增产物对芯片杂交的影响，所述探针与所述引物对有良好的特异性。本发明所述方法和试剂盒的操作简单、成本低廉，不仅具有较高的灵敏度(在本发明某一较佳实施例中，检测限可低至400个白细胞)，还大大缩短了检测时间，并且结果易读精准、在判断上也十分直观，更适合临床的检测和推广。本发明所述方法能够以待测样品直接为PCR模板，可以无需抽提基因组DNA，所以不需要额外购买基因组DNA抽提试剂盒，节约成本，同时减少污染机会，适合大规模样本的检测。并且所需样本极少，最少只需1μL，且对4℃冰箱保存7天内的全血等待测样本，检测结果稳定，有利于复查，或者可以利用病人其他检测的全血等待测样本，无需病人专门采样，减轻病人痛苦。本发明将待测样品直接进行PCR后杂交，就可以实现对于ApoE基因的检测。本发明所述方法中杂交的步骤可以通过全自动化杂交过程实现，从而能够更加方便快捷并且避免了人为操作过程中存在的诸多不确定因素。通过本发明所述的方法、试剂盒、引物对、探针及其应用检测患者的ApoE基因型，通过对患者的ApoE基因进行检测，主动预测心血管疾病患者对他汀类调脂的疗效和预后，指导临床医生一开始选择并确定药物品种和剂量，为个体化用药治疗提供科学依据，减少不良反应，提供了一种简便易行的解决方案。
附图说明
图1为ApoE基因芯片模式图，其中，0为阳性质控探针；1为388C探针；2为388T探针；12为388阴性质控探针；3为526C探针；2为526T探针；34为526阴性质控探针；00为空白对照。
图2为实施例4中的扫描结果图。
图3、图4为实施例4中的测序验证结果图。
图5为实施例5中的灵敏度检测结果图。
图6为实施例6中的检测结果图。
图7为实施例7中的检测结果图。
图8为实施例8中的检测结果图。
图9为对比例中的检测结果图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
所用基因序列的来源为NCBI(美国国立生物技术信息中心)：
ApoE基因388位点(rs429358)；ApoE基因526位点(rs7412)
实施例1基因芯片的制备
醛基修饰的载玻片(产品编号：BSM03011，上海百傲科技股份有限公司)。人工合成(生工生物工程(上海)股份有限公司)以下探针，用水溶解成浓度为100pmol/μL的溶液，然后用2×点样buffer(产品编号：BST02010，上海百傲科技股份有限公司)等比(体积比)混合。接着，用上海百傲科技股份有限公司的BD-1点样仪按说明书所述方法点制如图1左图的阵列(图1右边为每种数字对应的探针)。室温放置过夜。
各特异性探针序列如下：
检测位点388C的特异性寡核苷酸探针的序列如SEQ ID No.3(下划线部分)所示：
NH2-TTTTTTTTTTTTTTTTATGGAGGACGTGCGCGG；
检测位点388T的特异性寡核苷酸探针的序列如SEQ ID No.4(下划线部分)所示：
NH2-TTTTTTTTTTTTTTTTATGGAGGACGTGTGCGGC；5'端还包含一段5'氨基(-NH2)修饰的16聚PolydT(多聚脱氧胸苷酸)。
ApoE基因388位阴性对照探针的序列如SEQ ID No.7(下划线部分)所示：
NH2-TTTTTTTTTTTTTTTT ATGGAGGACGTGTACGGC。
检测位点526C的特异性寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NO.5(下划线部分)所示：
NH2-TTTTTTTTTTTTTTTT TGACCTGCAGAAGCGCCTG；
检测位点526T的特异性寡核苷酸探针的序列如SEQ ID NO.6(下划线部分)所示：
NH2-TTTTTTTTTTTTTTTT TGCAGAAGTGCCTGGCAGT；5'端还包含一段5'氨基(-NH2)修饰的16聚PolydT(多聚脱氧胸苷酸)。
ApoE基因526位阴性对照探针的序列如SEQ ID NO.8(下划线部分)所示：
NH2-TTTTTTTTTTTTTTTT TGACCTGCAGAATCGCCTG。
如图1所示，在载玻片上点上阳性质控探针(购于上海百傲科技股份有限公司)、388C探针(SEQ ID NO.3)、388T探针(SEQ ID NO.4)、526C探针(SEQ ID NO.5)、526T探针(SEQ ID NO.6)、ApoE基因388位阴性对照探针(SEQ ID NO.7)、ApoE基因526位阴性对照探针(SEQ ID NO.8)和空白对照。其中0为阳性质控探针；1为388C探针；2为388T探针；12为388阴性质控探针；3为526C探针；4为526T探针；34为526阴性质控探针；00为空白对照。
实施例2用本发明提供的引物通过PCR方法扩增ApoE基因片段
委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成引物，引物信息如下。
上游引物序列SEQ ID NO.1：
5’-ctgtccaaggagctgcagg-3’，
下游引物序列SEQ ID NO.2：
5’-gctgcccatctcctccatc-3’，
并且，引物的5’端用生物素进行修饰。
然后用水溶解并稀释至浓度为10pmol/μL。
按以下配方配制PCR扩增体系：
| 试剂 | 加入量(μL) |
| 血液模板(无需任何预处理) | 1 |
| 上游引物(10μM) | 0.8～2.4 |
| 下游引物(10μM) | 2.4 |
| 2×TransDirectTM PCR SuperMix | 12.5 |
| ddH2O | 添加至25 |
用PCR仪(TC-96/G/H(b)PCR扩增仪，购自杭州博日科技有限公司)按如下程序进行扩增：
50℃5min，94℃5min，然后按95℃20sec，60℃20sec，72℃20sec做40个循环，最后72℃延伸5min，98℃10min。
序列表中SEQ ID NO.17为ApoE基因388位点的SNP序列，该序列来自NCBI的SNP数据库信息，通过rs429358即可找到ApoE基因388位点序列，是ApoE的部分序列，本发明扩增的目的产物包含于这个序列中。其中Y代表的是简并碱基，即C/T。第388对应的就是这个Y(C/T)。
序列表中SEQ ID NO.18为ApoE基因526位点的SNP序列，该序列来自NCBI的SNP数据库信息，通过rs7412即可找到ApoE基因526位点序列，是ApoE的部分序列，本发明扩增的目的产物包含于这个序列中。其中Y代表的是简并碱基，即C/T。第526对应的就是这个Y(C/T)。
实施例3将实施例1制得的基因芯片与实施例2制得的PCR产物杂交
采用上海百傲科技股份有限公司出品的杂交显色试剂盒(BST03021)，在全自动杂交仪(上海百傲科技股份有限公司，BSE03011)中，按以下方法进行杂交：杂交显色试剂盒为碱性磷酸酶显色反应。
1)杂交反应液配制：吸取杂交显色试剂盒中的190μL杂交缓冲液，加入实施例2中的扩增产物各10μL，混匀。
2)将实施例1制得的基因芯片放置在杂交仪上，盖紧。
3)设置杂交程序：预杂交液，45℃，5min；杂交反应液，45℃，30min；洗液1，45℃，6min；洗液1，45℃，6min；洗液2，28℃，5min；洗液2，28℃，5min；抗体液(链霉亲和素碱性磷酸酶复合物)，28℃，20min；洗液2，28℃，5min；洗液2，28℃，5min；洗液3，28℃，3min；显色液(BCIP和NBT溶液)，45℃，30min；预杂交液，28℃，2min；预杂交液，28℃，2min；具体操作见仪器使用说明书。运行程序，杂交显色反应自动进行。
实施例4基因芯片杂交信号的检测结果
将杂交并洗涤完毕的基因芯片置于BaiO BE3.0生物芯片识读仪(上海百傲科技股份有限公司)上扫描后得到如图2所示的检测结果，检测结果十分直观。结果表明受检者的ApoE基因型属于E3E4型(即388CT、526CC型)，检测结果经测序验证，测序结果如图3、图4，结果完全符合。
实施例5灵敏度检测结果
1)样品制备
取ApoE基因E2E3型血液，ApoE基因E3E3型血液，ApoE基因E3E4型血液(临床合作单位提供，均为已知基因型血液样本)，将各种血液使用阴性对照进行稀释，稀释得到白细胞含量不同的样本如下表：
2)检测
按照实施例1～4的方法，对上述样品进行检测。
3)结果
杂交结果如图5所示：其中图A、B、C、D、E、F、G、H、I分别对应E2E3-1、E2E3-2、E2E3-3、E3E3-1、E3E3-2、E3E3-3、E3E4-1、E3E4-2、E3E4-3。
综合以上检测结果可以看出，该检测方法检测灵敏度高，能够检测出0.4×109个/L白细胞浓度的血液，即灵敏度为400个白细胞。
实施例6干扰试验检测结果
1)样品制备
选择已知为ApoE基因E3E3基因型的EDTA抗凝全血样本(临床合作单位提供，均为已知基因型血液样本)，按以下方法制备含有干扰物的样本：根据干扰物在血液基质中的溶解性，对易溶物采用将干扰物固体直接加入血液中，溶解、混匀的方法制备；对于难溶物，采用合适溶剂溶解后加入基质中，混匀制备；干扰物含量不同的样本如下表：
| 干扰物名称 | 浓度 |
| 总胆固醇 | 250mg/dL |
| 甘油三脂 | 3000mg/dL |
| 胆红素 | 20mg/dL |
2)检测
按照实施例1～4的方法，基因芯片对上述样品进行检测。
3)结果
杂交结果如图6所示：其中图J、K、L分别对应总胆固醇、甘油三脂、胆红素。
血液中250mg/dL总胆固醇；3000mg/dL甘油三酯；20mg/dL胆红素对本发明检测不会产生干扰。
实施例7不同引物浓度条件下的检测结果
取ApoE基因E2E3型血液，不同引物浓度配比的扩增液，按照实施例1～4的方法进行检测。检测结果如图7所示。
| 引物配比1 | 引物配比2 | 引物配比3 | |
| 上游引物(μM) | 0.2 | 0.32 | 0.4 |
| 下游引物(μM) | 0.6 | 0.96 | 1.2 |
综合以上结果上游引物和下游引物的浓度可知，引物浓度在0.2～1.2μM的范围内均可，较佳地为0.32μM和0.96μM。
实施例8不同探针浓度条件下的检测结果
取ApoE基因E3E4型血液，不同探针浓度配比的基因芯片，按照实施例1～4的方法进行检测。检测结果如图8所示。
| 探针配比1 | 探针配比2 | |
| SEQ ID NO.3(μM) | 5 | 3.3 |
| SEQ ID NO.4(μM) | 5 | 3.3 |
| SEQ ID NO.5(μM) | 1.7 | 1.4 |
| SEQ ID NO.6(μM) | 2.5 | 3.3 |
| SEQ ID NO.7(μM) | 2.5 | 2.5 |
| SEQ ID NO.8(μM) | 2.5 | 2.5 |
SEQ ID NO.3为388C探针，SEQ ID NO.4为388T探针，SEQ ID NO.5为526C探针,SEQID NO.6为526T探针，SEQ ID NO.7为388阴性探针,SEQ ID NO.8为526阴性探针。
综合以上结果388C探针、388T探针、526C探针、526T探针、388阴性探针和526阴性探针的浓度，较佳地为5μM、5μM、1.7μM、2.5μM、2.5μM和2.5μM。
对比例
1)引物对1：
SEQ ID NO.9：5’-TGGCACTGGGTCGCTTTTGGGATTA-3’
SEQ ID NO.10：5’-TCGCGGGTCCGGCTGCCCATCTCCT-3’
产物：598bp
引物对2：
SEQ ID NO.11：5’-CGCTTTTGGGATTAC-3’
SEQ ID NO.12：5’-GCTGCCCATCTCCT-3’
产物：576bp
2)探针：
检测388CC设计失败探针SEQ ID NO.13(下划线部分)：
NH2-TTTTTTTTTTTTTTTTggacaTGGAGGACGTGCGCGG
检测388TT设计失败探针SEQ ID NO.14(下划线部分)：
NH2-TTTTTTTTTTTTTTTTggacaTGGAGGACGTGtGCGGccg
检测526CC设计失败探针SEQ ID NO.15(下划线部分)：
NH2-TTTTTTTTTTTTTTTTccgaTGACCTGCAGAAGCGCCTG
检测526TT设计失败探针SEQ ID NO.16(下划线部分)：
NH2-TTTTTTTTTTTTTTTTgcagaagtgcctggcagtgtacc
使用上述引物对1和引物对2，分别和上述探针配制扩增液和芯片，使用已知为ApoE基因E3E3基因型的全血(临床合作单位提供，均为已知基因型血液样本)为样本，按照实施例1～4进行试验，检测图片分别如图9的左图和右图所示。从图中可知，无论是用引物对1还是引物对2，基因芯片的信号均较弱，无法正常判断基因型。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海百傲科技股份有限公司
<120> 用于检测ApoE基因的方法、试剂盒、引物对及探针
<130> P19012380C
<160> 18
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 上游引物序列
<400> 1
ctgtccaagg agctgcagg 19
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 下游引物序列
<400> 2
gctgcccatc tcctccatc 19
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ApoE基因388位点探针
<400> 3
atggaggacg tgcgcgg 17
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ApoE基因388位点探针
<400> 4
atggaggacg tgtgcggc 18
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ApoE基因526位点探针
<400> 5
tgacctgcag aagcgcctg 19
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ApoE基因526位点探针
<400> 6
tgcagaagtg cctggcagt 19
<210> 7
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ApoE基因388位点阴性探针
<400> 7
atggaggacg tgtacggc 18
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ApoE基因526位点阴性探针
<400> 8
tgacctgcag aatcgcctg 19
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物对1上游引物
<400> 9
tggcactggg tcgcttttgg gatta 25
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物对1下游引物
<400> 10
tcgcgggtcc ggctgcccat ctcct 25
<210> 11
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物对2上游引物
<400> 11
cgcttttggg attac 15
<210> 12
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物对2下游引物
<400> 12
gctgcccatc tcct 14
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 检测388CC设计失败探针
<400> 13
ggacatggag gacgtgcgcg g 21
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 检测388TT设计失败探针
<400> 14
ggacatggag gacgtgtgcg gccg 24
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 检测526CC设计失败探针
<400> 15
ccgatgacct gcagaagcgc ctg 23
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 检测526TT设计失败探针
<400> 16
gcagaagtgc ctggcagtgt acc 23
<210> 17
<211> 801
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ApoE基因388位点的SNP序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (401)
<223> y is c or t
<400> 17
cctcggcctc ccaaagtgct gggattagag gcatgagcca ccttgcccgg cctcctagct 60
ccttcttcgt ctctgcctct gccctctgca tctgctctct gcatctgtct ctgtctcctt 120
ctctcggcct ctgccccgtt ccttctctcc ctcttgggtc tctctggctc atccccatct 180
cgcccgcccc atcccagccc ttctccccgc ctcccactgt gcgacaccct cccgccctct 240
cggccgcagg gcgctgatgg acgagaccat gaaggagttg aaggcctaca aatcggaact 300
ggaggaacaa ctgaccccgg tggcggagga gacgcgggca cggctgtcca aggagctgca 360
ggcggcgcag gcccggctgg gcgcggacat ggaggacgtg ygcggccgcc tggtgcagta 420
ccgcggcgag gtgcaggcca tgctcggcca gagcaccgag gagctgcggg tgcgcctcgc 480
ctcccacctg cgcaagctgc gtaagcggct cctccgcgat gccgatgacc tgcagaagcg 540
cctggcagtg taccaggccg gggcccgcga gggcgccgag cgcggcctca gcgccatccg 600
cgagcgcctg gggcccctgg tggaacaggg ccgcgtgcgg gccgccactg tgggctccct 660
ggccggccag ccgctacagg agcgggccca ggcctggggc gagcggctgc gcgcgcggat 720
ggaggagatg ggcagccgga cccgcgaccg cctggacgag gtgaaggagc aggtggcgga 780
ggtgcgcgcc aagctggagg a 801
<210> 18
<211> 1001
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ApoE基因526位点的SNP序列
<220>
<221> misc_feature
<222> (501)
<223> y is c or t
<400> 18
caccttgccc ggcctcctag ctccttcttc gtctctgcct ctgccctctg catctgctct 60
ctgcatctgt ctctgtctcc ttctctcggc ctctgccccg ttccttctct ccctcttggg 120
tctctctggc tcatccccat ctcgcccgcc ccatcccagc ccttctcccc gcctcccact 180
gtgcgacacc ctcccgccct ctcggccgca gggcgctgat ggacgagacc atgaaggagt 240
tgaaggccta caaatcggaa ctggaggaac aactgacccc ggtggcggag gagacgcggg 300
cacggctgtc caaggagctg caggcggcgc aggcccggct gggcgcggac atggaggacg 360
tgtgcggccg cctggtgcag taccgcggcg aggtgcaggc catgctcggc cagagcaccg 420
aggagctgcg ggtgcgcctc gcctcccacc tgcgcaagct gcgtaagcgg ctcctccgcg 480
atgccgatga cctgcagaag ygcctggcag tgtaccaggc cggggcccgc gagggcgccg 540
agcgcggcct cagcgccatc cgcgagcgcc tggggcccct ggtggaacag ggccgcgtgc 600
gggccgccac tgtgggctcc ctggccggcc agccgctaca ggagcgggcc caggcctggg 660
gcgagcggct gcgcgcgcgg atggaggaga tgggcagccg gacccgcgac cgcctggacg 720
aggtgaagga gcaggtggcg gaggtgcgcg ccaagctgga ggagcaggcc cagcagatac 780
gcctgcaggc cgaggccttc caggcccgcc tcaagagctg gttcgagccc ctggtggaag 840
acatgcagcg ccagtgggcc gggctggtgg agaaggtgca ggctgccgtg ggcaccagcg 900
ccgcccctgt gcccagcgac aatcactgaa cgccgaagcc tgcagccatg cgaccccacg 960
ccaccccgtg cctcctgcct ccgcgcagcc tgcagcggga g 1001
Claims (15)
1.一种用于检测ApoE基因的试剂盒，其特征在于，其包括PCR反应体系和基因芯片，所述PCR反应体系包括强耐受DNA聚合酶和引物对，所述基因芯片包括探针；其中，
所述引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所示；
和，所述ApoE基因388位点探针的核苷酸序列如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示；
和，所述ApoE基因526位点探针的核苷酸序列如SEQ ID NO: 5和SEQ ID NO: 6所示。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应体系中的上游引物的浓度为0.2~1.2 μM；
和/或，所述PCR反应体系中的下游引物的浓度为0.6~1.2 μM；
和/或，所述基因芯片中的探针的浓度为1.5~10 μM。
3. 如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应体系中的上游引物的浓度为0.32 μM；
和/或，所述PCR反应体系中的下游引物的浓度为0.96 μM；
和/或，所述基因芯片中的探针的浓度为为2.5 μM。
4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物对为5’端有生物检测标记物修饰的引物对；
和/或，所述探针为5’端有和基因芯片的固相支持物的修饰物相结合的基团修饰的探针；
和/或，所述强耐受DNA聚合酶为Direct PCR Mix、Trans DirectTM PCR Super Mix、Phusion Blood Direct PCR Master Mix中的一种；
和/或，用于所述试剂盒的待测样品为含基因组DNA的生物样本。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述生物检测标记物为生物素、地高辛、荧光分子、碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光分子为荧光素或荧光素衍生物。
7.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述探针为有氨基修饰的探针。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述探针为有氨基和16个碱基T修饰的探针。
9.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，用于所述试剂盒的待测样品为全血或口腔黏膜脱落细胞。
10.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应体系还包括PCR反应缓冲液和/或脱氧核苷三磷酸；
和/或，所述试剂盒中还包括ApoE基因388位点阴性探针和/或ApoE基因526位点阴性探针。
11. 如权利要求10所述的试剂盒，其特征在于，所述ApoE基因388位点阴性探针核苷酸序列如SEQ ID NO: 7所示；和/或，
所述ApoE基因526位点阴性探针核苷酸序列如SEQ ID NO: 8所示。
12.如权利要求1~11任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括杂交溶液；和/或，所述试剂盒还包括能够与所述引物对的检测标记物发生反应的溶液和显色液。
13.一种非诊断目的的检测ApoE基因的方法，其特征在于，其包括以下步骤：将待测样品利用权利要求1~12中任一项所述的试剂盒所定义的PCR反应体系进行PCR反应，再将所得产物与权利要求1~12中任一项所述的试剂盒所定义的基因芯片进行杂交，检测杂交信号。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，在与所述的基因芯片杂交之前，所述所得产物与杂交缓冲液混合；
和/或，在与所述的基因芯片杂交之前，先将所述基因芯片与预杂交液进行预杂交；
和/或，所述检测杂交信号的方法为碱性磷酸酶催化的四氮唑蓝显色反应、辣根过氧化物酶催化的5-溴-4-氯-3-吲哚酚-磷酸-4-甲苯胺显色反应、辣根过氧化物酶催化的四甲基联苯胺反应和/或者荧光检测；
和/或，所述检测的样品为含基因组DNA的生物样本。
15.如权利要求13或14所述的方法，其特征在于，所述检测的样品为全血或口腔黏膜脱落细胞。
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