CN106591422A - 一种快速检测水牛乳中农药残留的试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种快速检测水牛乳中农药残留的试剂盒及其应用，属于检测农药残留技术领域。该试剂盒包括显色剂、酶和载体；其中，显色剂为吲哚酚乙酸酯、丙酮溶液；酶指从长期饲养的特定家禽类的血液提取，对有机磷和氨基甲酸酯类农药敏感的胆碱酯酶或粗酶，或配制成的溶液；载体为聚酰胺‑6‑薄膜。本发明酶来源于鸭血清内提取的胆碱酯酶，所需酶的来源广泛，廉价，并且鸭血清提取出的胆碱酯酶性质较稳定，适合用于酶片的制备；本发明酶载体为聚酰胺‑6‑薄膜，吸水性好，显色明显，对胆碱酯酶的固定性保持较好。

Description

一种快速检测水牛乳中农药残留的试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及检测农药残留技术领域，具体涉及一种快速检测水牛乳中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留检测试剂盒及其应用。
背景技术
目前国内关于快速检测农药残留的方法主要有速测卡和速测仪法。现有农药中有机磷（OPs）和氨基甲酸酯（CBs）类大多对胆碱酯酶有抑制作用，利用这一特性可方便快速地监测此类农药的残留污染。乙酰胆碱酯酶可将乙酰胆碱催化分解为胆碱和乙酸，该产物可使显色剂显色，而OPs和CBs类农药是乙酰胆碱酯酶的底物乙酰胆碱的结构类似物，因此，可以用乙酰胆碱酯酶的活性来探测样品中是否存在这两类化合物；当样品中存在OPs和CBs类农药时，它们会使乙酰胆碱酯酶催化中心中的丝氨酸残基中的羟基发生磷酸化和甲胺酰化，使乙酰胆碱酯酶彻底失去水解底物乙酰胆碱的能力。在酶反应实验中加入底物和显色剂观察颜色的变化或测定酶与某种特定化合物反应的物理化学信号的变化，可判断是否存在OPs和CBs类农药残留。
速测卡技术就是利用胆碱酯酶与底物和显色剂反应生成蓝色物质，从而根据速测卡上的颜色改变来判断农药的残留污染情况。该方法的优点是检测速度快，操作简单，但灵敏度较低，且使用的工具酶价格昂贵，使用后无法回收，此外，无论游离还是固定化工具酶需低温储存和运输，导致检测成本极高。而现有的速测仪仍是一种便携式的分光光度计，需要配合较为复杂的检测试剂与人员操作，且现场不易实施。
发明内容
本发明的目的是为了快速检测水牛乳中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留情况，提供一种检测快速快、操作简单、成本低且灵敏度高的检测试剂盒。为实现本发明目的所使用的技术方案为：
一种快速检测水牛乳中农药残留的试剂盒，包括显色剂、酶和载体；其中，显色剂为吲哚酚乙酸酯、丙酮溶液，浓度为1000-1500μg/ml；
酶指从长期饲养的特定家禽类的血液提取，对有机磷和氨基甲酸酯类农药敏感的胆碱酯酶或粗酶，或配制成的溶液；
载体为聚酰胺-6-薄膜。
优选的，所述酶的制备方法包括以下步骤：
（1）取100ml鸭血于转速5000r/min离心15min后，除去沉淀红细胞；取出后加入等体积的PB缓冲液，混匀后加入 (NH4) 2SO4调至0.25个饱和度，4℃静置12h后，于转速5000r/min离心10min后取上清液；再加入(NH4) 2SO4调至0.6个饱和度，4℃静置12h, 抽滤得滤饼，用PB 缓冲液溶解，即得粗酶液；将粗酶进行过滤除杂；
（2）将滤后的粗酶液分别用 (NH4) 2SO4使之调整饱和度为0.4、0.45，经静置、减压抽滤取滤液，即为二次盐析的酶液；
（3）将二次盐析的酶液进行抽提，即为胆碱酯酶。
优选的，制备方法还包括将胆碱酯酶附着在载体上制作成酶片。
优选的，所述PB缓冲液的浓度为0.2mol/L，pH7.2～7.5。
优选的，所述的胆碱酯酶的酶活力为995U。
优选的，所述胆碱酯酶酶片需在4℃固定30min。
一种快速检测水牛乳中农药残留试剂盒的应用，用于检测水乳中有机磷和和氨基甲酸酯类农药残留。
优选的，检测步骤包括，取5ml鲜水牛乳至离心管中，加等量PB缓冲液振摇2min后静置，取上清液为待测样品，于酶片上滴加10μL待测样品，抑制时间10min后滴加底物，显色5min后观察颜色变化，判断农药残留情况。
本发明的实质性特点和进步是：
本发明利用酶抑制法来检测农药残留，使用的胆碱酯酶制备方法简单，胆碱酯酶来源为鸭血清中，敏感度较强，其灵敏度与所用酶及显色和反应时间、温度有关，且本发明使用的酶与显色和反应时间、反应温度是最优条件，酶是影响其检测灵敏度和可靠性的最关键因素。本发明将酶固定在膜载体上制备酶片，后续的反应与操作均在酶片上进行，避免产生误差。采用酶来源于鸭血清内提取的胆碱酯酶，所需酶的来源广泛，廉价，并且鸭血清提取出的胆碱酯酶性质较稳定，适合用于酶片的制备。
本发明将提取自鸭血清的胆碱酯酶经固定化处理后加载到膜载体上，吲哚酚乙酸酯在胆碱酯酶催化下迅速发生水解反应，生产蓝色的吲哚和乙酸，如果胆碱酯酶与有机磷或氨基甲酸酯类农药结合，便失去水解吲哚酚乙酸酯的能力，因此，在样品中只要有微量有机磷或氨基甲酸酯类农药存在就能强烈的抑制蓝色产物的生成，靠目测就可判断农药残留情况。本发明酶载体为聚酰胺-6-薄膜，吸水性好，显色明显，对胆碱酯酶的固定性保持较好。
附图说明
图1为实施例2中胆碱酯酶载体选取的显色结果图；从左到右依次为醋酸纤维素膜、带正电尼龙膜和聚酰胺-6-薄膜。
图2为实施例3中不同固定温度在固定30min下酶片显色结果图；从左到右依次是4℃、-50℃和室温。
图3为实施例3中不同酶液固定量的酶活回收率关系图；
图4为实施例4中不同底物浓度下的显色效果图；从左到右是300、600、900、1500、3000、4500μg/ml的底物浓度。
图5为实施例5中四种农药检出限图；其中A：甲基立枯磷；B：甲胺磷；C：异丙威；D：甲萘威。
图6为实施例6中酶片不同保存天数下酶活回收率关系图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明方案做进一步详细描述，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
实施例1
一种胆碱酯酶的制备方法，包括以下步骤：
（1）将鸭血取100ml离心（5000r/min，15min)，除去沉淀红细胞。取出后加入等体积的PB缓冲液（0.2 mol/L pH7.5），混匀后加入相应量的(NH4) 2SO4调至0.25个饱和度，混合后放入冰箱4℃静置12h，（5000r/min，10min)离心后取上清液。再加入(NH4) 2SO4调至0.6个饱和度，混合后放入冰箱4℃静置12h后抽滤，取滤饼用PB 缓冲液少量溶解，即为粗酶液。粗酶液杂质含量较多，为了便于酶片的制备，必须对粗酶进行除杂纯化，故进行二次提取。
（2）滤后的粗酶液分别加入相应量的(NH4)2SO4使之调整饱和度0.4、0.45，经静置、减压抽滤取滤液，即为二次盐析的酶液。
（3）本实验酶源为鸭血清，粗酶液酶活力值为8200U，但粗酶液呈深红色，溶液粘稠，不利于后续酶片的制备，故进行二次提取。酶液活力995U，且呈粉红色，达到了检测要求且不影响后续的实验。
实施例2
（1）一种快速检测农药残留的酶片载体的选择：本实验选取了三种膜材料作为酶的固化载体：醋酸纤维素膜、带正电的尼龙膜、聚酰胺-6-薄膜。将三种载体膜剪成1cm×1cm的小片，醋酸纤维素膜、带正电的尼龙膜直接粘贴固定到PVC底板上，吸取10μL酶液固定到膜中央，4℃静置固定30min后，在酶液的覆盖区滴加10μL的吲哚乙酸酯进行显色反应。在酶液中加入1%的牛血清白蛋白BSA做保护剂，同上步骤固定到载体膜上，观察显色效果。
待10min后观察不同膜载体制备酶片的显色效果及测定其酶活力，比较酶活力回收情况。
（2）三种膜载体酶片显色效果不一，具体见图1。醋酸纤维素膜加显色剂后有淡蓝色显出，固定后蓝色较明显；带正电尼龙膜加显色剂固定后显色较浅。聚酰胺-6-薄膜显色明显，与醋酸纤维膜显色相似；在酶液里添加的BSA会影响酶的固定化效果，其显色结果均不理想，故选择在膜载体上直接滴加酶液。
酶液初始酶活为995U，醋酸纤维素膜与聚酰胺-6-薄膜制作的酶片酶活均约为890U，回收率90%；带正电尼龙膜制作的酶片酶活为855U，回收率86%；由此看出，三种膜材料制作的酶片酶活回收率均在85%，皆可用来固定胆碱酯酶。综合其显色效果、酶活回收率与制作难易程度、材料广泛性与廉价性考虑，确定采用聚酰胺-6-薄膜作为酶片的膜载体。
实施例3
一种快速检测农药残留的酶片的制备：
（1）酶片固定温度和固定时间的选择
将10μL酶液点样到酶片后，分别选择4℃、-50℃与室温3种固定温度进行比较，并且选择固定时间10、20、30、60、100min，观察酶片显色变化和测定其酶片酶活回收率。
固定温度酶液的初始酶活为995U，根据检测不同固定温度、固定时间制备酶片酶活力算出酶片酶活回收率，具体见下表：
表1不同固定温度与时间的酶片酶活回收率
相同固定时间下，4℃与-50℃固定的酶片显色效果相似，显色结果较理想；而室温放置的酶片效果一般，显色颜色较淡。根据以上结果，选择4℃固定温度，30min固定。
（2）固定酶液量的选择
取8、10、15、20、25μL酶液点样到膜载体上固定，随后检测其酶活回收率，其后在固定好的酶片上滴加底物，显色反应后观察显色效果。不同酶液固定量对于显色效果来说没有太大影响，显色结果相差不大。
由图3看出，酶片酶活回收率随着酶液固定量的增加呈“厂”字型曲线，在10μL固定量时回收率逐渐平稳。介于酶液固定量对显色效果差别不大、酶片酶活回收率和酶液用量来看，选择10μL的酶液固定量。
实施例4
一种快速检测农药残留显色反应的选择
（1）底物浓度的选择
底物浓度对酶促反应的结果又很大的影响。在一定范围内，酶促反应的颜色变化随着底物浓度的增加而加深，而当底物浓度在一定时，浓度过高反而会抑制酶促反应。在酶片上滴加不同浓度的底物，观察不同底物浓度对应的酶片显色效果的不同。选择300、600、900、1500、3000、4500μg/ml的底物浓度。
由图4看出，在底物浓度小于1500μg/ml时，显色效果随着底物浓度增大而加强，而大于1500μg/ml时，显色颜色有所减弱。因此选择1500μg/ml底物浓度。
（2）抑制时间的选择
抑制时间的长短对显色效果的影响也很大，过短则农药对酶的抑制作用未能充分发挥，过长，降低了工作效率且滴加底物的效果也有所影响。并且对后续酶片的灵敏度和检测限的研究有较大的偏差。分别在酶片上滴加不同浓度的甲基立枯磷标准稀释液，选择5、8、10、12、15、20min抑制，后滴加底物，观察显色效果。
由下表2看出，随着抑制时间的增加，甲基立枯磷农药对胆碱酯酶的抑制增强，酶片颜色变浅，当抑制时间在10min以上时，酶片颜色基本不再变化，说明反应已达到平衡。为保证反应充分选择10min作为抑制时间的选择。
表2不同抑制时间对检测灵敏度的影响
（3）显色时间的选择
显色时间过短使空白酶片的颜色变浅，时间过长使弱阳性的酶片颜色加深，影响酶片的显色反差。分别在酶片上滴加不同浓度的甲基立枯磷标准稀释液抑制，滴加底物，选择2、3、4、5、8、10min显色，观察显色效果。
由表3对显色时间的观察，在5min后颜色基本不再改变，直到10min后颜色变淡，说明反应已在5min时结束，故确定显色时间为5min。
表3不同显色时间对检测灵敏度的影响
实施例5
一种快速检测农药残留方法的检出限测定：
用甲基立枯磷、甲萘威、苯胺灵、异丙威做标准样品进行检测，用0.2mol/LPB缓冲液配成不同浓度的标准溶液，用酶片测试，每个浓度重复3次，确定显色强度。用缓冲液作空白对照，显色强度为一百，强阳性反应对应的显色颜色为零，观察反应后酶片的具体颜色变化。酶片检出限定义为显色强度的1/2时对应的浓度，即该农药抑制胆碱酯酶活性50%时的IC50值。并通过Origin画出显色强度随农药标准溶液浓度的标准曲线，随后计算其IC50值。
四种农药的具体检出限见图5，与国标GB2763-2012《食品中农药最大残留限量》中相对应农药最大残留量标准做对照，结果表明，本研究所制酶片检出限低于食品中最大残留限量，可用于直接检测农药残留。
表44种农药的检出限对比
农药 酶片检出限mg/kg 食品中农药最大残留量mg/kg
甲基立枯磷 1.0 2.0
甲胺磷 0.5 0.5
异丙威 0.5 0.5
甲萘威 1.0 2.0
实施例6
一种快速检测农药残留方法的稳定性检测：
将制备好的酶片放置在4℃冰箱中保存储藏，在放置2、5、10、15、20、30、50天内进行酶活检测。见图6，将酶片储存在4℃冰箱内10天时，测得的酶活回收率相对下降了25%，放置30天后相对酶活回收率下降了35%。取放置30d的酶片用于检测1mg/kg的甲基立枯磷标准样品，显色结果仍可辨别，因此，尽管酶片酶活随着保存时间的延长而有所损失，但酶片保存30d后，仍可用于检测。
实施例7
一种快速检测水牛乳中农药残留的方法的步骤：
取5ml鲜水牛乳至离心管中，加等量PB缓冲液振摇2min后静置，取上清液为待测样品。于酶片上滴加10μL待测样品，抑制时间10min后滴加底物，显色5min后观察颜色变化，判断农药残留情况。
实施例8
一种快速检测水牛乳中农药残留方法与其他方法比较：
在水牛乳中添加不同量的甲基立枯磷标准样品，用市售的广州天河绿洲生物仪器公司销售的农药残留速测卡检测，并结合气相色谱检测结果进行比较。制备的酶片与市售速测卡和气相色谱检测结果比较，结果见表5。可以看出，本方法制备的酶片与速测卡和气相色谱结果相一致，检测时未出现假阳性，表明该是指能很好的检测出水牛乳中农药残留的有无。此外，本方法操作简单，不需要贵重仪器，检测成本低，适合水牛乳现场快速检测。
表5酶片的水牛乳样品检测结果与市售速测卡和气相色谱结果比较
编号 甲基立枯磷标准样品添加量(mg/kg) 酶片检测结果 市售速测卡检测结果 GC检测结果（mg/kg）
1 0 — — 0.00
2 0.1 + + 0.0998
3 0.5 + + 0.412
4 1.0 ++ ++ 0.892

Claims (8)

1. 一种快速检测水牛乳中农药残留的试剂盒，其特征在于，包括显色剂、酶和载体；其中， 显色剂为吲哚酚乙酸酯、丙酮溶液，浓度为1000-1500μg/ml；
酶指从长期饲养的特定家禽类的血液提取，对有机磷和氨基甲酸酯类农药敏感的胆碱酯酶或粗酶，或配制成的溶液；
载体为聚酰胺-6-薄膜。
2.根据权利要求1所述快速检测水牛乳中农药残留的试剂盒，其特征在于，所述酶的制备方法包括以下步骤：
（1）取100ml鸭血于转速5000r/min离心15min后，除去沉淀红细胞；取出后加入等体积的PB缓冲液，混匀后加入 (NH4) 2SO4调至0.25个饱和度，4℃静置12h后，于转速5000r/min离心10min后取上清液；再加入(NH4) 2SO4调至0.6个饱和度，4℃静置12h, 抽滤得滤饼， 用PB 缓冲液溶解，即得粗酶液；将粗酶进行过滤除杂；
（2）将滤后的粗酶液分别用 (NH4) 2SO4使之调整饱和度为0.4、0.45，经静置、减压抽滤取滤液，即为二次盐析的酶液；
（3）将二次盐析的酶液进行抽提，即为胆碱酯酶。
3.根据权利要求2所述快速检测水牛乳中农药残留的试剂盒，其特征在于，制备方法还包括将胆碱酯酶附着在载体上制作成酶片。
4.根据权利要求2所述快速检测水牛乳中农药残留的试剂盒，其特征在于，所述PB缓冲液的浓度为0.2mol/L，pH7.2～7.5。
5.根据权利要求2所述快速检测水牛乳中农药残留的试剂盒，其特征在于，所述的胆碱酯酶的酶活力为995U。
6.根据权利要求3所述快速检测水牛乳中农药残留的试剂盒，其特征在于，所述胆碱酯酶酶片需在4℃固定30min。
7.一种快速检测水牛乳中农药残留的试剂盒的应用，其特征在于，用于检测水乳中有机磷和和氨基甲酸酯类农药残留。
8.根据权利要求7所述快速检测水牛乳中农药残留的试剂盒的应用，其特征在于，检测步骤包括，取5ml鲜水牛乳至离心管中，加等量PB缓冲液振摇2min后静置，取上清液为待测样品，于酶片上滴加10μL待测样品，抑制时间10min后滴加底物，显色5min后观察颜色变化，判断农药残留情况。
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