CN103439514A

CN103439514A - 基于微阵列检测芯片的农兽药多残留的检测方法

Info

Publication number: CN103439514A
Application number: CN201310338039XA
Authority: CN
Inventors: 李同祥; 孙会刚; 黄天姿; 候进慧
Original assignee: Xuzhou University of Technology
Current assignee: Inner Mongolia Kangxin Pasture Co ltd
Priority date: 2013-08-05
Filing date: 2013-08-05
Publication date: 2013-12-11
Anticipated expiration: 2033-08-05
Also published as: CN103439514B

Abstract

基于微阵列检测芯片的农兽药多残留的检测方法。本发明是以小分子的农兽药半抗原与牛血清白蛋白偶联制备成免疫抗原，用免疫抗原免疫小鼠制备得到相应的农兽药单克隆抗体，捕获单抗探针用生物芯片点样仪点样到琼脂糖修饰的玻片固相载体上，制备成多重复的“捕获单抗探针”微阵列。将农兽药半抗原与卵清白蛋白偶联制备成“半抗原-OVA”偶联体，然后用荧光分子Cy3标记。将待检样品液与“标记检测抗原”按一定浓度混合后，与芯片孵育，样品中的待测抗原和相应“标记检测抗原”与固定在芯片上的相应的“捕获单抗探针”直接竞争性结合，在一定的条件下洗脱。用生物芯片扫描仪检测结果。该方法能同时检测农副产品样品中多种农兽药残留，适用于种植、养殖生产中药物残留高通量、快速、准确检测。

Description

基于微阵列检测芯片的农兽药多残留的检测方法

技术领域

本发明是食品安全领域中制备农兽药多残留检测微阵列芯片的方法。

背景技术

农、兽药是目前世界各国防治农作物病虫害和养殖业病害的有效手段。大量化学农、兽药, 特别是高毒、高残留农兽药的使用,成为食品安全和危害人们健康的主要“杀手”。

目前，主要使用的化学农药按其功能不同, 主要分为杀虫剂( Insecticide)、除草剂(Herbicide) 和杀菌剂(Fungicide) 三大类。依据化学结构不同, 可分为有机氯类、有机磷类、拟除虫菊脂类、氨基甲酸脂类和无机农药等多种类型。这些化学农药的共同特点是: ①有毒性, 且靶向性差; ②残留性, 一般分为高残留、中残留和低残留等; ③迁移性和累积性, 可通过空气、土壤或地下水发生迁移, 甚至在生物体内累积。有机磷类杀虫剂成为目前使用量最大的农药之一,多属于高效农药。目前,有机磷农药包括甲拌磷、乙拌磷、内吸磷、对硫磷、甲胺磷、乙酰甲胺磷、杀螟硫磷、特普、敌百虫、乐果、马拉硫磷、甲基对硫磷、二甲硫吸磷、敌敌畏、甲基内吸磷、氧化乐果、久效磷等。有机氯农药有滴滴涕、六六六、林丹、甲氧、高残毒DDT、硫丹。常用的拟除虫菊脂类农药有溴氰菊脂、氯氰菊脂、氯菊脂、胺菊脂、甲醚菊脂等。氨基甲酸酯类有西维因、叶蝉散、涕灭威、呋喃丹和异索威等。

兽药残留分为七类：抗生素类，驱肠虫药类，生长促进剂类，抗原虫药类，灭锥虫药类，镇静剂类和β-肾上腺素能受体阻断剂。我国虽已制定“动物性食品中兽药残留最高限量”标准，但尚未得到有效实施。据估计，滥用和超标使用兽药尤其是抗菌药物的状况十分严重。

农、兽药对人体的危害不仅表现在干扰人体化学信息的传递,破坏身体的酶,而且它阻碍器官发挥正常的生理功能,导致神经系统功能失调。癌症、不孕症、内分泌紊乱等疾病均与农兽药污染有关。农兽药残留超标，会直接危及人体的神经系统和肝、肾等重要器官。大量进食农残超标蔬菜，会危害神经中枢，以致痉挛而死。农药慢性中毒时，引起人体倦乏、头痛、食欲不振、肝肾损害等，具有迟发性神经毒性。残留农兽药在人体内蓄积，最终产生致癌、致畸、致突变作用。如雌激素、硝基呋喃类、砷制剂等都已被证明具有致癌作用，许多国家都已禁止这些药物用于食品动物。

近年来食品安全问题,特别是农兽药残留超标问题已越来越受到社会的关注和高度重视,农兽药残留超标造成的危害越来越大，严重影响了人民生活。“菜篮子”、“肉篮子”和“米袋子”污染问题以农兽药残留较为突出。在日常市场监督检查中发现蔬菜、水果、肉食品中农兽药残留超标问题十分广泛和严重。如农业部对我国14个经济较发达省会城市2110个样品检测，蔬菜中农药、重金属和亚硝酸盐分别超标31.1％、23.5％、12.1％，其中尤其以有机磷农药残留最为突出。食用农产品质量安全问题，严重影响了我国居民的生活和消费，出现了部分地区居民“谈药色变”的现象，部分食品的社会消费量显著下降。

食品安全检验检测是食品安全监管的重要手段之一，它为食品安全监管提供重要的技术支持。随着农兽药残留超标造成的危害越来越大,相应的农兽药残留检测技术也得到迅速发展。目前，用于农兽药残留的检测方法主要有（1）气相色谱法（GC）：具有高选择性、高分离效能、高灵敏度等特点，是农药残留量检测最常用的方法之一。但检测成本高，仪器操作须专业人员，前处理要求较高，时间长。（2）液相色谱法（HPLC）：可用于不易气化或受热易分解的农药的检测。（3）色质联用法（GC-MS,HPLC-MS）：可同时达到定性、定量的检测目的，特别适合于农药代谢物、降解物的检测和多残留检测等，不过此法需要贵重仪器且操作繁杂困难，不适合于经常性的检测。一般可用来做最后的确认工作。（4）超临界流体色谱（SFC）：既有气谱的快速、高效、灵敏的特点，又有能检测对热不稳定和大分子化合物的液谱的特点，但需要昂贵的仪器且操作繁杂困难等。（5）毛细管电泳法（CE）：适合于一些难于用传统色谱法分离的离子化样品的分离和分析，比HPLC有高10-1000倍的分析能力，需要贵重仪器且操作繁杂困难，不适合于经常性的检测。一般可用来做最后的确认工作。

这些技术的应用，虽然大大提高农兽药残留分析的灵敏度，提高了分析效率。但这些农兽药残留分析技术检测需要贵重仪器且操作繁杂、成本高、时间长等问题，难以满足高通量、快速及在线检测的需要，制约了其在农兽药快速残毒检测的应用推广，难以成为农兽药快速现场检测的常规方法。

控制农产品中农兽药残留量的关键环节之一就是对农产品中农兽药残留量及时、快速、准确的分析检测，杜绝农兽药残留超标的产品上市销售。

这就给食品安全监管部门对农产品产前、产中、产后的监督工作带来了许多不便，因此，大量的快速检测技术孕育而生，常见农药残留检测有化学速测法、免疫分析法、酶抑制法和活体检测法等。（1）化学速测法，主要根据氧化还原反应，水解产物与检测液作用变色，用于有机磷农药的快速检测，但是灵敏度低，使用局限性，且易受还原性物质干扰。（2）免疫分析法，它具有专一性强、灵敏度高、快速、操作简单等优点，试剂盒可广泛用于现场样品和大量样品的快速检测，可准确定性、定量。但由于抗体依赖国外进口等影响，目前，我国市场上酶联免疫法成品试剂盒依赖从国外进口。（3）酶抑制法，是研究最成熟、应用最广泛的快速农残检测技术，该方法只能检测有机磷和氨基甲酸酯二类农药，对同类而不同种农药的抑制率差别很大，所以用统一的抑制率确定农药残留是否超标，必然会产生假阳性或假阴性的漏检，可说是当前“不得已而采用的速测法”，仅适用于基层初检，起着警示作用，发现超标现象时，必须用标准方法复测、确证，阴性反应也应按比例抽样，用可靠的方法复测和确证。而兽药的快速检测主要用免疫分析法。

到目前为止，国外己开发了近百种农药的免疫化学分析方法。美国分析化学协会（AOAC）推荐了四十余种农药的商品化试剂盒，试剂盒的方法以酶免疫分析法为主，尤其是酶联免疫分析法应用的最为广泛。一些检测商品试剂盒也相继研究开发出。美国 Immuno Systems Inc 1991年已生产出10余种以ELISA为基础的农药酶免疫速测箱用于测定水、果汁以及部分食品乙腈提取液中的杀虫剂、杀菌剂、除草剂，检测限在 mg/kg级，与HPLC比较有较好的相关性。这些试剂盒价格昂贵，在国内少有使用。

国内这方面的研究也渐渐起步，己有关于对硫磷、甲基对硫磷、甲基对氧磷、毒死蜱、氟虫睛、二氯哇琳酸、三哇酮、甲胺磷等农药的人工抗原和高亲和力的特异性抗体的制备及用RIA法或ELISA法进行样品中痕量农药分析的报道。但均没有商业化检测试剂盒出售。

国内外现有的研究主要集中于针对单一农兽药建立其特异性免疫检测方法，而实际上农产品中残留的农兽药往往有多种，单农兽药组分免疫分析方法及相应的检测试剂盒己难以满足实际检测的需要。

生物芯片是20世纪90年代在生命科学领域中迅速发展起来的一项高新技术。生物芯片已在疾病诊断和治疗、药物筛选、农作物的优育优选、司法鉴定、食品卫生监督、环境检测、国防、航天等领域有着广泛的应用。

目前生物芯片的研究和开发种类逐渐趋于多样化，其应用生物芯片可实现对待检样品中目标核酸分子、蛋白质分子、细胞、微小组织等物质的有无及多少进行准确、快速、大信息量检测，具有微型化、高通量和自动化的检测特征。生物芯片在生物检测、医学检测及疾病诊断、药物筛选和基因序列分析上有着极其重要的应用价值意义，因此受到广泛关注和投资，使其已经成为一个全球性的新型产业，即生物芯片产业。

鉴于此，农兽药残留检测需要技术就需要技术上的创新。因而，开发高通量、快速、准确、能定量定性、用于测定农兽药多残留检测微阵列芯片具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是是提供一种高通量、准确性高、能定量定性、便于程序化加工制作，用于制备测定农兽药多残留微阵列芯片的方法。采用如下的技术方案：

基于微阵列检测芯片的农兽药多残留的检测方法，包括如下步骤：

第1步、将琼脂糖溶液涂覆于玻片，干燥后，用NaIO₄溶液活化，用纯水冲洗后，干燥，得到琼脂糖修饰的玻片；

第2步、将农药或者兽药的单克隆抗体用含40～60%(w/w)甘油的磷酸盐缓冲溶液稀释后，点样于第1步所得的琼脂糖修饰的玻片上，得到带有捕获单抗探针的微阵列芯片；

第3步、将农药或者兽药的半抗原与卵清白蛋白偶联制备成半抗原-OVA偶联体，再用Cy3标记，得到检测抗原；

第4步、对第2步所得的带有捕获单抗探针的微阵列芯片进行温孵、封闭、洗涤，将检测抗原与不同浓度的农药或者兽药的对照品混合后，加入到微阵列芯片上的阵列中，孵育、洗脱，再用生物芯片扫描仪检测，绘制标准曲线；

第5步、对第2步所得的带有捕获单抗探针的微阵列芯片进行温孵、封闭、洗涤，将待测样品与检测抗原混合后，加入到微阵列芯片上的阵列中，孵育、洗脱，再用生物芯片扫描仪检测，通过第4步所得的标准曲线计算得到待测样品中农药或兽药的浓度。

上述方法中，所述的农药或者兽药可以是指：

甲胺磷、二氟沙星、多拉菌素、三聚氰胺、克伦特罗、磺胺甲噁唑、金霉素、磺胺二甲嘧啶、氟甲砜霉素或者氯霉素。

也可以是指：

羧基、羟基、氨基或者巯基修饰过的甲基对硫磷、克百威、三唑磷、毒死蜱、对硫磷、呋喃丹、西维因、乐果、罗丹明B或者苏丹红1号。主要是由于这些农药或者兽药不能直接作为半抗原，可通过人工设计合成其相应的具有了活性反应基团，可和载体蛋白偶联。

上述方法中，农药或者兽药的单克隆抗体可以通过常规的制备方法自制得到，也可以通过购买相应的杂交瘤细胞株分泌得到的。例如：如果需要检测三聚氰胺时，可以通过保藏编号为CGMCC No.3237的杂交瘤细胞株3B11分泌产生(参阅CN101705210B)，或者可以通过保藏编号为CGMCCNo.4303的杂交瘤细胞株B-4B5-F10-B11分泌产生(参阅CN102168071B)。

如果需要通过农药或者兽药作为半抗原制备单克隆抗体时，可以将农药或者兽药半抗原与牛血清白蛋白( BSA)偶联制备人工抗原（免疫抗原），再用合成的农兽药人工抗原免疫小鼠，取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，得到杂交瘤细胞，进而制备到其单克隆抗体。

更进一步地说，在使用农药或者兽药半抗原与BSA或者OVA偶联体时，可以采用碳二亚胺法，将二氟沙星、苏丹红1号、克伦特罗与牛血清白蛋白(BSA)偶联；或者采用NHS 法和混合酸酐法将多拉菌素与BSA 偶联制备人工抗原；或者通过戊二醛法将三聚氰胺、金霉素、罗丹明123（罗丹明B的同系物）与BSA 连接制备人工抗原；或者通过重氮化法将磺胺甲噁唑( SMZ)、磺胺二甲嘧啶（SM2）制备SMZ-HAS（人血清白蛋白）和SM2-BSA人工抗原；或者通过重氮化将氯霉素（氯霉素分子中的芳香硝基需要还原为芳香氨基）与BSA 偶联制备人工抗原；或者通过羰基二咪唑法将氟甲砜霉素与BSA偶联制备人工抗原。制备OVA偶联体时，也可以采用同BSA偶联体相同的方法。

作为优选，上述的第1步中，琼脂糖溶液的浓度为1.2%(w/w)，在将琼脂糖溶液涂覆于玻片上时，玻片预热至60℃，使用NaIO₄溶液活化30min，超纯水冲洗后，再用氮气流吹干。

作为优选，上述的第3步中，半抗原-OVA偶联体以10nmol/ml的浓度溶于0.1M的碳酸盐缓冲液，再用Cy3染料进行染色，标记反应结束后，以3000 rpm的速度离心去除未结合的荧光分子及碳酸盐缓冲液。

作为优选，上述的第4步和第5步中，带有捕获单抗探针的微阵列芯片上的阵列上加入的混合液后，室温下避光孵育1小时，再分别用0.01M PBS/0.1%Tween-20 (pH7.4)、0.01M PBS (pH7.4)和去离子蒸馏水各洗涤一次，再用氮气流吹干。

作为优选，上述的第4步和第5步中，生物芯片扫描仪的操作参数是：85% 激光强度、80%PMT增益值、5μm 分辨率；标准曲线是通过线性拟合计算得到。由于在芯片上的捕获单抗探针可以与单抗原-OVA偶联体或者待检测的农药或者兽药相结合，因此，如果在待检物料中没有农兽药残留时，被荧光标记的检测抗原（单抗原-OVA偶联体）与探针结合之后，可以通过生物扫描仪检测到荧光强度值；若待检物料中含有一部分农兽药残留时，这部分残留物也会与捕获探针结合，使一部分检测抗原不能与探针结合，再进行扫描时，就可以得到另外一个强度的荧光强度值；荧光强度值一般是与待检物料中的农兽药残留量成反比的，通过制作标准曲线即可实现对残留量的定量检测。

技术效果

本发明将酶联免疫技术和生物芯片微点样技术相结合，综合两个技术的优点，制备出高通量、特异性好、可批量化的食品安全快速检测芯片，达到创新食品安全快速检测技术体系的目的。

1、本发明以农兽药作为半抗原合成免疫抗原，制备单克隆抗体，以单克隆抗体作为探针点样制作微阵列，以抗原、抗体的特异性反应为检测基础，实现特异性杂交，确保了检测高准确性和灵敏性。

2、本发明以农兽药半抗原与卵清白蛋白(OVA) 偶联，然后用荧光分子Cy3对“半抗原-OVA” 进行标记，得到“半抗原-OVA-Cy3”复合体，即“标记检测抗原”。这样一个复合体合成设计的优点，不仅体现在”半抗原-OVA”的合成和“半抗原-BSA”合成过程和试剂同质性，而且可对半抗原进行方便、有效地标记。

3、本发明以Cy3进行标记，可直接用芯片扫描仪进行检测，不需要其他反应底物和显色反应，操作过程更简便。

4、本发明可在一张芯片上设置分区和多个平行重复点，可有效控制芯片质量，极大地提高了芯片检测结果的可靠性，使其检测的可控性和可靠性远远高于ELISA等其他常规检测方法，能满足国家对农药残留限量检测的最高要求。

5、本发明所需的单克隆抗体和“标记检测抗原”可大批量制备，这不仅使该种芯片的制备成本大大降低，而且可以按照一定工艺批量生产，其反应过程可望通过高度自动化的设备进行监控，因而便于建成标准化检测平台，可节省大量样品、检测时间和人员设备。

6、本发明的芯片配套材料可以在国内自主生产，可以有效减少对国外试剂的依赖，能够为食品安全检测提供必要的技术保障。

附图说明

图1是农兽药多残留单抗微阵列检测芯片检测原理示意图；

其中，

1：琼脂糖修饰的玻片基质

2：捕获单抗探针

3：待检农兽药

4：卵清白蛋白（OVA）

5：Cy3

(a): 点样捕获单抗探针

(b): 待检测样品 + 标记检测抗原

(c): 待检测样品+标记检测抗原，与捕获单抗探针微阵列芯片孵育

(d):芯片扫描

(e):结果分析

(1):待检测样品无检测目标农兽药残留物

(2):待检测样品有检测目标农兽药残留物

图2是“捕获单抗探针”微阵列点样布阵示意图

1：第1列所点样品为磷酸盐甘油缓冲液（阴性对照）

2-n:第2到第n列所点样品为不同农兽药“捕获单抗探针”

图3是Cy3标记的芯片系统检测3种农兽药的标准曲线

A：培氟沙星(实施例1)

B：三聚氰胺(实施例2)

C：甲胺磷 (实施例3)

D：三聚氰胺(实施例4)

具体实施方式

实施例1

第一部分培氟沙星（Pefloxacion，PEF）免疫抗原和检测抗原的合成

(1) 准确称取N－羟基琥珀酰亚胺（NHS）45 mg，碳二亚胺（EDC）210 mg，培氟沙星（PEF）36 mg，加入5 mL的N，N－二甲基甲酰胺（DMF）。并在室温下遮光搅拌孵育24 h，此溶液称为A。

(2) 准确称取牛血清白蛋白（BSA）105 mg，加入0．01 mol/L（pH值7．4）磷酸盐缓冲液（PBS）15 mL，此溶液称为B。

(3) 将孵育好的溶液A 逐滴加入到B溶液中，边加边搅拌，用0．01 mol/L（pH值7．4）PBS磁力搅拌透析6 d，期间数次换液，以除去未反应的小分子物质。12000 r/min 离心30 min，收集上清，即得PEF-BSA偶合物，将得到的PEF-BSA偶联物保存于－20 ℃冰箱备用。

将BSA替换为卵清白蛋白(OVA) 后，依同法制备得到PEF-OVA偶联物。

第二部分农兽药单克隆抗体制备

（1）小鼠免疫

① 取健康6-8周龄的雌性Balb/c小鼠6只。

② 免疫前取未经免疫的Balb/c小鼠阴性血清对照。对小鼠断尾取血，采血0.2ml（获得0.1ml免疫前血清）常温放置40min后6000rpm离心10min，上清液即为血清。

③将实施例1第一部分所得到的PEF-BSA偶联物用PBS缓冲液配制成1μg/ μL的溶液，作为免疫抗原PBS溶液。

④ 第一次免疫，将免疫抗原PBS溶液与等体积的弗氏完全佐剂充分混合（研磨成油包水的乳糜状），抽取混匀的乳液进行腹腔多点注射，每只鼠的注射量为200μL，含免疫抗原100μg。

⑤ 第二次免疫：两周后进行注射方法、注射体积及抗原剂量不变，弗氏不完全佐剂。

⑥ 第三次免疫：一周后按照第二次免疫方案一周后再进行免疫。

⑦ 采血和间接ELISA检测血清效价（第三次免疫一周后）。

⑧ 第四次免疫：（第三次免疫两周后，15天）（抗原溶于PBS或盐水）取同量免疫抗原不加佐剂对小鼠进行尾静脉注射以强化免疫。

（2）细胞融合

第四次免疫一周后，进行细胞融合。

①猝死小鼠。眼球放血处死，留血样做阳性对照（血样RT 1h后与4℃冰箱过夜，再3000rpm 离心10min，取上清-20℃保存），自来水冲洗鼠身至干净。将小鼠泡于75%酒精内进行消毒5-10min。

②超净台内无菌分离脾脏：将取出的脾脏放入预先放有10ml 1640培养液（不含血清，以下均相同）的培养皿内。

③分散脾脏轻压、研磨，将细胞充分洗入培养皿内充分混匀，计数脾细胞。

④吹打骨髓瘤细胞制成单细胞悬液转移至离心管中，补充至40ml，充分混匀，计数脾细胞。

⑤分别将脾细胞和骨髓瘤细胞悬液离心1200rpm，5min，用1640培养液洗涤离心，重复两次，1:10稀释后计数。

⑥将骨髓瘤细胞与脾细胞按照1:10充分混匀，用1640培养液洗涤一次，拍匀，1200rpm离心5min，吸去上清，轻轻将细胞团弹散开。

⑦融合步骤水浴37℃，向细胞团加入1ml PEG溶液，逐滴加入，滴一滴搅拌一次或转动离心管，90秒内滴完，搅匀，继续反应90秒，再加入10ml 37℃预热后的1640培养液，再加20ml 1640，小心吹打悬浮细胞，迅速离心1200rpm，5min，计数。

⑧以计数多的细胞计算，用37℃预热后HAT培养基将融合后的细胞稀释为5-8×10⁵个/ml的浓度，按照200μl/孔接种于96孔板。

⑨于融合后第3-4天，半量更换HAT培养基；于融合后第6-7天，半量更换HAT培养基，视集落生长情况于融合后第8-9天开始检测。

（3）杂交瘤细胞的选择

①免疫抗原用包被液稀释至10μg/ml。

②以100μl/孔量加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃吸附2小时。

③弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3分钟，拍干。

④每孔加100μl封闭液37℃封闭1小时。

⑤洗涤液洗3次。

⑥每孔加100μl待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性、阴性对照和空白对照；37℃孵育1小时；洗涤，拍干。

⑦加酶标第二抗体，每孔100μl，37℃孵育1小时，洗涤，拍干。

⑧加底物液，每孔加新鲜配制的底物使用液100μl，37℃20分钟。

⑨以2mol/L H₂SO₄终止反应，在酶联免疫阅读仪上读取OD值。

⑩结果判定：以P/N≧2.1，或P≧N+3SD为阳性。

（4）杂交瘤细胞的克隆化（有限稀释法）

①制备小鼠脾细胞为饲养细胞。

②制备待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含20%血清的HAT培养基稀释至每毫升含5、10和20个细胞3种不同的稀释度。

③按每毫升加入5×10⁴～1×10⁵细胞的比例，在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞。

④每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每孔量为100μl。

⑤37℃、5% CO₂培养6天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；在倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长的孔，取上清作抗体检测。

⑥取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养，并冻存。

（5）单克隆抗体的生产及纯化

（A）单抗大量制备

①成年BALB/c小鼠腹腔接种降植烷或液体石蜡，每只小鼠0.3-0.5ml。

②7-10天后腹腔接种用PBS或无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，每只小鼠5×10⁵/0.2ml。

③间隔5天后，每天观察小鼠腹水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，皮肤有紧张感，即可采集腹水。通常每只小鼠可采3ml腹水；

④将腹水离心（2000r/min 5分钟），除去细胞成分和其他的沉淀物，收集上清，测定抗体效价，分装，-70℃冻存备用。

（B）单克隆抗体的纯化（辛酸-硫酸铵沉淀法）

① 腹水4℃ 12000rpm离心15min，去除杂质。

②取1份腹水加2份0.06mol/L PH5.0醋酸缓冲液，按每毫升稀释腹水加33μl辛酸的比例，室温搅拌下逐滴加入辛酸，室温混合30min。

③ 4℃静置2小时，取出12000g离心30分钟，弃沉淀。

④上清经尼龙筛过滤，于50倍体积的0.01M pH7.4 PBS中4℃透析6h。

⑤在透析后的上清中加入等体积饱和硫酸铵溶液。

⑥ 4℃静置1h以上，10000g离心30分钟，弃上清。

⑦沉淀溶于适量PBS（含137mmol/L NaCl，2.6mol/L KCl，0.2mmol/L EDTA）中，于50-100倍体积的PBS中透析过夜。

⑧取少量透析后样品适当稀释后，以紫外分光光度计检测蛋白含量，SDS-PAGE， WB检测抗体纯度。

第三部分点样制备农兽药单克隆抗体微阵列

（1）琼脂糖玻片的修饰

配制1.2%(w/w)琼脂糖溶液，微波炉煮沸3 min完全溶解。将2 m1琼脂糖溶液覆盖在60℃预热的清洁玻片上；琼脂糖凝固后，玻片在37℃下过夜干燥。使用前用NaIO₄溶液(浓度0.1 M)活化30min，超纯水彻底冲洗3遍，并用氮气流吹干。

（2）点样“捕获单抗探针”微阵列

将本实施例第二部分所得的培氟沙星单克隆抗体用含50%(w/w)甘油的PBS稀释至0.1 mg/ml，用点样仪在上述琼脂糖修饰的玻片表面点样，每张芯片两排三列共6个（2×3）矩阵，每个亚阵列所点样品一致，每列为4个点，第一列所点样品为磷酸盐甘油缓冲液作为阴性对照，第二列是培氟沙星单抗的PBS溶液点样。如果需要测定多种农药或兽药时，可以在继续在后续的第n列中分别点样相应的单抗，作为“捕获单抗探针”，为农兽药检测点。

(3) 合成“标记检测抗原”

以10nmol/ml的浓度将“半抗原-OVA” ，即PEF-OVA偶联物溶于0.1M的碳酸盐缓冲液 (0.1M，pH9.0)中。在25nmol的粉末状FluoroLink^TM Cy3 染料中加入25μl 0.1M的碳酸盐缓冲液 (0.1M，pH9.0)，充分混合后加入1.5μl Cy3染料于0.5ml溶解的“半抗原-OVA”中。轻轻的混匀使“半抗原-OVA”与染料分子充分接触，避光室温反应30分钟，每分钟轻轻地晃动一次反应液。标记反应结束后，以3000rpm离心去除未结合的荧光分子及碳酸盐缓冲液。用PBS离心清洗2遍。将标记好的“半抗原-OVA”溶于100μl PBS溶液中。每10μl分装于-40℃保存备用。

5、待检测样品和“标记检测抗原”混匀，与已点样“捕获单抗探针”微阵列芯片杂交

将制备好的“捕获单抗探针”微阵列芯片在37℃杂交盒中温孵2h，用封闭液(0.01mol/L pH7. 4的PBS，含1%牛血清白蛋白和2.5%蔗糖)封闭2h，PBST洗3次，每次15s，离心机甩干，每个阵列中加入2.5μl待检测样品和2.5μl浓度为0.01nmol/μl “标记检测抗原”混合而成的混合液，然后在杂交液上盖上排斥硅烷处理过的盖玻片，最后用保鲜膜封住培养皿，置于室温下避光孵育1小时。杂交结束后，分别用0.01M PBS(pH7.4)/0.1%Tween-20、0.01M PBS (pH7.4)和去离子蒸馏水各洗涤一次，每次5分钟。然后用氮气流吹干。

6、芯片扫描及结果判读

（1）杂交后的芯片的荧光信号通过芯片扫描仪在Cy3（Cy5）波长下进行扫描，扫描条件为85% 激光强度，80% PMT增益值(PMT gain)，5μm 分辨率。系统自动对结果进行判读，给出检测结果。

（2）在农兽药浓度定量分析中，首先要用不同的已知浓度的农兽药溶液进行上面的检测分析，制作出“农兽药浓度-荧光”标准曲线，将待测农兽药溶液的荧光信号与标准曲线比较，就可以确定待测溶液中农兽药的浓度。

实施例2

第一部分三聚氰胺( Melamine) 免疫抗原和检测抗原的合成

以多元酸酐与混合酸酐联用法合成免疫抗原三聚氰胺BSA和检测抗原三聚氰胺-OVA。

（1）用多元酸酐法合成三聚氰胺戊二酸酐半醛（其中吡啶作为为溶剂和催化剂）。称取125 mg三聚氰胺（约1 mmol），加入4 mL含114 mg（约1 mmol）戊二酸酐的吡啶溶液中，在室温条件下，用磁力搅拌器搅拌反应22 h。待反应完成后，用氮气吹干吡啶。

（2）用上述产物与氯甲酸异丁酯反应得到混合酸酐。用40 mL溶剂（DMF和1，4-二氧六环1：1混合）溶解三聚氰胺-戊二酸酐半醛，加入262 μL（约1 mmol）正三丁胺，冰中搅拌10 min，加入氯甲酸异丁酯144 μL（约1 mmol），在室温条件下，用磁力搅拌器搅拌反应1 h生成混合酸酐。

（3）混合酸酐与载体蛋白偶联。在冰浴环境中，将载体蛋白溶液（0.4 g BSA溶于pH8.5，1 mol/L硼酸钠溶液中）逐滴加入混合酸酐中，然后放在室温条件下反应过夜，得到偶联物后放置于磷酸中盐缓冲液（PBS）透析3 d，过SepHadex G-25层析柱提纯，冻干存于4℃备用。

将BSA替换为卵清白蛋白(OVA)后，依同法制备得到三聚氰胺-OVA偶联物。

第二部分农兽药单克隆抗体制备、第三部分点样制备农兽药单克隆抗体微阵列

采用与实施例1相同的方法，区别在于：小鼠免疫步骤中，PEF-BSA偶联体用三聚氰胺BSA替代；合成“标记检测抗原”的步骤中，PEV-OVA偶联物用三聚氰胺-OVA偶联物替代。其余步骤和参数皆相同。

最终制得包含三聚氰胺单克隆抗体探针的微阵列芯片，用不同的已知浓度的农兽药溶液进行上面的检测分析，制作出“农兽药浓度-荧光”标准曲线，将待测农兽药溶液的荧光信号与标准曲线比较，就可以确定待测溶液中农兽药的浓度。

实施例3

第一部分甲胺磷免疫抗原和检测抗原的合成

称取100 mg 甲胺磷溶于10 mL 0.1 mol/L HCl 中,冰浴搅拌下加入预冷的1 % NaNO₂ 至淀粉碘化钾试纸变兰后继续搅拌30 min；另称取10 mg BSA溶解于2 mL pH 8.7的硼酸盐缓冲液中, 取上述重氮化产物2mL滴加到蛋白溶液中,冰浴下搅拌2h，4℃放置过夜后将反应液装入透析袋。4℃下,用PBS透析3天, 透析液冷冻干燥得到白色粉末, 贮于-20℃下备用。同法制得包被抗原甲胺磷-OVA。

采用与实施例1相同的方法，区别在于：小鼠免疫步骤中，PEF-BSA偶联体用甲胺磷-BSA偶联物替代；合成“标记检测抗原”的步骤中，PEV-OVA偶联物用甲胺磷-BSA偶联物替代。其余步骤和参数皆相同。

最终制得包含甲胺磷单克隆抗体探针的微阵列芯片，用不同的已知浓度的农兽药溶液进行上面的检测分析，制作出“农兽药浓度-荧光”标准曲线，将待测农兽药溶液的荧光信号与标准曲线比较，就可以确定待测溶液中农兽药的浓度。

实施例4

与实施例2的区别在于：第二部分单克隆抗体的制备中，三聚氰胺单抗是通过保藏编号为CGMCC No.3237的杂交瘤细胞株3B11分泌产生，具体的生产步骤是将杂交瘤细胞接种成年BALB/c小鼠腹腔中，操作步骤同实施例1的“(5)单克隆抗体的生产及纯化”。三聚氰胺-OVA偶联体的制备方法仍同实施例2。

依实施例2中同法绘制标准曲线并进行检测。

检测方法的验证

(1) 精密度验证

分别用灭菌双蒸水将甲胺磷和培氟沙星、用甲醇将三聚氰胺的标准品配制成0.004 nmol/μl的样品，使用实施例1实施例4所得的生物芯片进行检测。重复检测6次，计算相对标准偏差(RSD)，所得结果如表1所示。

表1 精密度验证结果

	实施例1	实施例2	实施例3	实施例4
					RSD	3.2%	3.1%	2.9%	2.9%

从表1可以看出，本检测方法的精密度较好，重复6次测试的相对标准偏差基本都在5%以下。

(2) 线性验证

以上实施例中，分别用灭菌双蒸水将甲胺磷和培氟沙星、用甲醇将三聚氰胺的标准品配制成9种不同浓度的样品，浓度分别是0.0005、0.001、0.002、0.004、0.008、0.016、0.032、0.064和0.128（nmol/μl），绘制其标准曲线，如图3所示，其检测区间范围包含国家最低检出限量（如甲胺磷≤0.1 mg/kg，三聚氰胺≤2.5 mg/kg），对该方法学验证数据如下：

实施例1：培氟沙星(图3(C))

y = -1.054x + 101.8，R2 = 0.965;

实施例2：三聚氰胺(图3(B))

y = -1.189x + 119.2，R2 = 0.976;

实施例3：甲胺磷(图3(A))

y = -1.305x + 129.7，R2 = 0.986;

实施例4：三聚氰胺(图3(D))

y = -1.139x + 101.3，R2 = 0.955;

(3) 回收率验证

取含有三聚氰胺的牛奶，按照快速溶剂萃取（ASE）方法制样，作为待测样品；再取待测样品，加入三聚氰胺标准品（>99%,上海安谱），加样浓度分别是0.004、0.008和0.012 nmol/μl，作为加样样品；对待测样品和加样样品分别进行检测，回收率=(加样样品三聚氰胺浓度-待测样品三聚氰胺浓度)/ 三聚氰胺加样浓度×100%。

取含有甲胺磷的西兰花，按照快速溶剂萃取（ASE）方法制样，作为待测样品；再取待样品，加入甲胺磷标准品（>99%，上海谷研），加样浓度是0.004、0.008和0.012 nmol/μl，作为加样样品；对待测样品和加样样品分别进行检测，回收率=(加样样品甲胺磷浓度-待测样品甲胺磷浓度)/ 甲胺磷加样浓度×100%。

取含有培氟沙星的鸡肉，按照快速溶剂萃取（ASE）方法制样，作为待测样品；再取待样品，加入培氟沙星标准品（>98%，哈灵科技），加样浓度是0.004、0.008和0.012 nmol/μl，作为加样样品；对待测样品和加样样品分别进行检测，回收率=(加样样品培氟沙星浓度-待测样品培氟沙星浓度)/ 培氟沙星加样浓度×100%。

每组检测平行做3次，取平均值，回收率验证结果如表2所示。

表2 回收率验证结果

从表2中可以看出，实施例1～实施例4中所得的生物芯片对于农药或兽药检测时的加样回收率基本都在95～105%之间，可以满足检测的精度要求。

利用本发明提出的技术检测农兽药时，除最后的荧光检测步骤外，在大批量完成点样制备农兽药单克隆抗体微阵列和合成“标记检测抗原”后，在实际检测中只经过待检测样品提取、芯片杂交和芯片扫描三个实验步骤就可以完成对农兽药残留的分析。用时大约30分钟，就可以完成农兽药残留的检测分析实验。由于本技术实验步骤简单，同时可以检测多种农兽药残留，因此具有较高检测效率。

Claims

1.基于微阵列检测芯片的农兽药多残留的检测方法，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的基于微阵列检测芯片的农兽药多残留的检测方法，其特征在于：所述的所述的农药或者兽药可以是指：甲胺磷、二氟沙星、多拉菌素、三聚氰胺、克伦特罗、磺胺甲噁唑、金霉素、磺胺二甲嘧啶、氟甲砜霉素或者氯霉素；或者是指：羧基、羟基、氨基或者巯基修饰过的甲基对硫磷、克百威、三唑磷、毒死蜱、对硫磷、呋喃丹、西维因、乐果、罗丹明B或者苏丹红1号。

3.根据权利要求1所述的基于微阵列检测芯片的农兽药多残留的检测方法，其特征在于：所述的第2步中，所述的兽药是三聚氰胺，三聚氰胺的单克隆抗体是通过保藏编号为CGMCC No.3237的杂交瘤细胞株3B11分泌产生，或者是通过保藏编号为CGMCCNo.4303的杂交瘤细胞株B-4B5-F10-B11分泌产生。

4.根据权利要求2所述的基于微阵列检测芯片的农兽药多残留的检测方法，其特征在于：所述的步骤2中，农药或者兽药的单克隆抗体的制备方法是：将农药或者兽药半抗原与牛血清白蛋白偶联制备人工抗原，再用合成的农兽药人工抗原免疫小鼠，取小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞进行细胞融合，得到杂交瘤细胞，进而制备到单克隆抗体。

5.根据权利要求4所述的基于微阵列检测芯片的农兽药多残留的检测方法，其特征在于：将所述的农药或者兽药半抗原与牛血清白蛋白偶联制备人工抗原时，采用碳二亚胺法，将二氟沙星、苏丹红1号、克伦特罗与牛血清白蛋白偶联；或者采用NHS法和混合酸酐法将多拉菌素与BSA偶联制备人工抗原；或者通过戊二醛法将三聚氰胺、金霉素、罗丹明123与BSA偶联制备人工抗原；或者通过重氮化将氯霉素与BSA偶联制备人工抗原，所述的氯霉素分子中的芳香硝基需要还原为芳香氨基；或者通过羰基二咪唑法将氟甲砜霉素与BSA偶联制备人工抗原。

6.根据权利要求2所述的基于微阵列检测芯片的农兽药多残留的检测方法，其特征在于：将所述的农药或者兽药半抗原与OVA偶联时，采用碳二亚胺法，将二氟沙星、苏丹红1号、克伦特罗与OVA偶联；或者采用NHS法和混合酸酐法将多拉菌素与OVA偶联；或者通过戊二醛法将三聚氰胺、金霉素、罗丹明123与OVA偶联；或者通过重氮化将氯霉素与OVA偶联，所述的氯霉素分子中的芳香硝基需要还原为芳香氨基；或者通过羰基二咪唑法将氟甲砜霉素与OVA偶联。

7.根据权利要求1所述的基于微阵列检测芯片的农兽药多残留的检测方法，其特征在于：所述第1步中，琼脂糖溶液的浓度为1.2%(w/w)，在将琼脂糖溶液涂覆于玻片上时，玻片预热至60℃，使用NaIO₄溶液活化30min，超纯水冲洗后，再用氮气流吹干。

8.根据权利要求1所述的基于微阵列检测芯片的农兽药多残留的检测方法，其特征在于：所述第3步中，半抗原-OVA偶联体以10nmol/ml的浓度溶于0.1M的碳酸盐缓冲液，再用Cy3染料进行染色，标记反应结束后，以3000 rpm的速度离心去除未结合的荧光分子及碳酸盐缓冲液。

9.根据权利要求1所述的基于微阵列检测芯片的农兽药多残留的检测方法，其特征在于：所述第4步和第5步中，带有捕获单抗探针的微阵列芯片上的阵列上加入的混合液后，室温下避光孵育1小时，再分别用0.01M PBS/0.1%Tween-20、0.01M PBS和去离子蒸馏水各洗涤一次，再用氮气流吹干。

10.根据权利要求1所述的基于微阵列检测芯片的农兽药多残留的检测方法，其特征在于：所述第4步和第5步中，生物芯片扫描仪的操作参数是：85% 激光强度、80%PMT增益值、5μm 分辨率；标准曲线是通过线性拟合计算得到。