CN1590560A - 一种从复杂组分物质如中药和化学混合物中高通量筛选、捕获和分离目标分子的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种从复杂组分物质如中药和组合化学分子及其混合物中高通量筛选、捕获和分离目标分子的新方法。该方法首先针对特定目标的双链核酸结合蛋白特别是序列特异性DNA结合蛋白,如转录因子如NF-κB、核受体等,在固相支持物表面制备一种双链核酸微阵列芯片,使其双链核酸探针上嵌合双链核酸结合蛋白的结合位点,用以高通量测定量核酸结合蛋白与双链核酸微阵列芯片上各结合位点的亲合性,建立序列核酸结合蛋白与其芯片上各核酸靶点的结合亲合性标准参数体系;再用双链核酸微阵列芯片与复杂组分物质如中药和组合化学分子及其混合物反应,反应后通过检测核酸结合蛋白与其芯片上各核酸靶点的结合亲合性变化,筛选出那些与标准参数体系比较结合亲合性发生改变的核酸靶点;将其作为核酸亲合介质连接到层析柱表面,制备特异性核酸探针层析柱;再将复杂组分物质如中药和组合化学分子及其混合物灌柱,用核酸探针捕获复杂组分物质中与核酸探针特异结合的有效分子;最后经洗脱收获与核酸探针结合的有效分子,进行其化学性质、分子生物学基础及药理学研究,开发成为核酸结合蛋白的核酸靶点特异性候选药物。该发明的技术及思想体系,在基础分子生物学研究,特别是序列特异性DNA结合蛋白(转录因子)基因表达调控,以及生物医学研究,如序列特异性DNA结合蛋白(转录因子)相关疾病药物作用机理研究和药物性分子筛选中有广泛而重要的应用价值。
Description
一、技术领域:
本发明是在基础分子生物学及生物医学领域中,提出了一种新的从复杂组分物质如中药和组合化学混合物中高通量筛选、捕获和分离目标分子的方法,即运用检测特定DNA/RNA结合蛋白的双链核酸或肽核酸微阵列芯片与DNA/RNA结合蛋白反应,建立DNA/RNA结合蛋白与芯片上双链核酸或肽核酸靶点结合的亲合性,作为标准参照体系;再将复杂组分物质与微阵列芯片反应,反应后微阵列芯片继续与DNA/RNA结合蛋白反应,通过对照标准参照体系,筛选出复杂组分物质与微阵列芯片反应后,那些与DNA/RNA结合蛋白反应亲合性发生变化的微阵列芯片探针,用这些探针制备亲合层析介质,使亲合层析介质与复杂组分物质发生亲合结合反应,捕获复杂组分物质中与亲合层析探针特异结合的组分,通过洗脱,分离该组分;本发明提出的方法为建立了一种创新性的高通量药物筛选模型,即高通量筛选DNA/RNA结合蛋白的DNA/RNA靶点结合药物性小分子,因此本发明在在生物医学领域,特别是创新药物与中药现代化研究中具有重要的应用价值。
二、背景技术:
药物研究是十分复杂的工程,最突出的特点是周期长,投入高,风险大,影响因素多,因此提高药物研发的效率在医药研究中具有重要意义。在药物研究的药物发现、临床前研究和临床研究三个阶段中,药物发现是制约药物研究的关键环节。药物发现不仅决定着药物的有无,同时也决定着药物研究的成败与药物的质量,因此国际药物研究机构都对药物发现过程给予了极大的关注。药物发现需要筛选对可能作为药物使用的物质进行药物价值的评价,即药物筛选。筛选的样品越多,发现新药的可能性越大,因此高通量药物筛选技术成为目前药物筛选的重要平台。高通量药物筛选就是应用先进的技术手段,同时对大量的被筛选样品(samples)就生物学活性或药理活性进行分析评价的过程。高通量药物筛选采用的筛选模型是体外微量实验方法,主要是分子和细胞水平的评价方法,而不是传统的动物实验或组织器官实验方法,这种微量实验方法减少了样品试剂材料的消耗,减低了筛选成本,但需要检测方法具有较高的特异性和灵敏性。高通量药物筛选所采用的药物筛选模型(或药物筛选方法)要求药物筛选模型能够高通量灵敏地反映样品所具有的内在活性,因此是实现高通量药物筛选的技术关键。常用的高通量药物筛选模型可以根据其生物学特点分为以下几类:①受体结合分析法;②酶活性测定法;③细胞因子测定法;④细胞活性测定法;⑤代谢物质测定法;⑥基因产物测定法。因此,建立更多的创新性的高通量药物筛选模型对于高通量药物筛选非常重要。
中药的药效物质基础(有效成分或部位)和作用机制非常复杂,现有的传统药理学与化学相结合的研究方法周期长、耗时多、所需财力大,且由于药理模型等因素限制,难以阐明中药多成分、多靶点的作用机制;免疫组织化学法、流式细胞仪检测法虽然研究周期大大缩短,但难以大量获取中药治病的复杂机理蕴涵的大量生物信息。生物芯片具有自动化高通量获取生物信息的功能,因而在中药作用机制的研究中已经发挥了重要作用。运用基因表达芯片检测疾病和正常组织或中药处理前后组织细胞基因表达谱的变化,能够发现病症相关基因和药物效应基因,进行中药作用机理和中药靶标筛选的研究;因此这种利用基因芯片发现药物效应基因,筛选中药作用靶点和探讨中药作用机理的研究目前已经成为中药研究的重要技术。但这种研究的局限性在于不能揭示药物究竟是如何引起效应基因表达改变的,因而对药物作用的具体靶点、途径、方式以及药物发挥作用的具体成分不得而知,对于药物发挥作用的有效成分的鉴定、分离仍然无能为力。到目前为止,这方面研究的进展并没有达到人们在药物研究中的预期结果。中药研究迫切需要研究技术的创新。
本发明所提出的双链DNA微阵列芯片研究中药作用机理和筛选中药有效成分的技术体系,充分利用双链DNA微阵列芯片能够检测生物分子相互作用的特点,特别是DNA与蛋白质的相互作用,从具体的调控蛋白分子与其不同基因的启动子序列的DNA结合特性,受到中药等小分子的调控为切入点,在基因表达调控有关的生物分子相互作用层次上,进行中药作用机理的研究。这种研究方法将“疾病—药物—作用靶点—有效成分—机理”紧密地联系在一起,既是对中药作用机理的研究,同时是对中药有效成分的筛选;能够回答中药中什么成分、通过怎样的途径、作用在什么靶点,产生了疗效;同时将那些真正发挥疗效的成分从中药复杂组成的海洋中分离出来,进行其化学性质的鉴定和药理学研究,进而开发新的候选药物和指导组合化学分子设计。因此本发明从基因表达调控中DNA/蛋白质分子相互作用的分子生物学层次,在国内外首先建立运用双链DNA微阵列芯片研究中药作用机理、筛选中药序列特异性DNA结合或DNA/蛋白质相互作用干预性成分的技术及思想体系。这一技术及思想体系完全不同于目前普遍运用单链DNA基因表达芯片研究中药作用下基因表达谱变化的方法,因此建立了一种创新的药物筛选模型,这一模型尤其适合中药等组成成分非常复杂的研究体系。
大量的研究发现,许多疾病与基因异常表达调控有关,而中药治疗这些疾病能取得显著疗效且毒副作用小,因此从基因表达调控的水平研究中药作用的机制、筛选和分离中药活性成分具有重要意义。众多研究也表明,很多药物分子依赖与基因组DNA或蛋白质分子的直接相互作用,直接或间接地影响DNA复制、基因转录、翻译和修饰等发挥其药物效应,因此直接从生物分子相互作用,特别是DNA/蛋白质相互作用的水平研究中药作用的机制和筛选中药活性成分是非常有价值的。我们的大量前期研究表明,双链DNA芯片能够非常有效地检测基因表达调控中序列特异性DNA/蛋白质的相互作用,因此本发明提出制备双链DNA微阵列芯片,从生物分子相互作用的深度研究中药作用机理、鉴定中药作用靶点、在线捕获和分离中药活性成分的研究。本发明确立的实验体系能说明中药中哪些成分,在基因表达调节的哪个靶点,通过怎样的分子相互作用,导致了中药的医疗效果。
三、发明内容:
(1)发明目的
本发明的目的是提供一种从复杂组分本发明提出一种从复杂组分物质如中药(herbs)和组合化学(combinatorial chemistry)混合物中高通量筛选(screening)、捕获(capturing)和分离(isolating)目标分子的新方法,为高通量药物筛选(highthroughput screening,HTS)建立新的药物筛选模型,即通过复杂组分物质与双链DNA(或RNA/PNA)微阵列芯片的体外微量杂交实验,从分子相互作用水平判断药物样品的DNA结合活性,并通过亲合层析捕获和分离药物样品中的DNA结合活性组分;再通过对所分离组分的化学性质及药理学研究,将所分离组分开发成为先导药物(leading drugs)。
该方法首先针对特定目标的序列特异性DNA结合蛋白,特别是转录因子如NF-κB、核受体,p53等,在固相支持物表面制备一种双链脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或具有相似功能的肽核酸(PNA)微阵列芯片,使其dsDNA探针上嵌合序列特异性DNA结合蛋白的DNA结合位点,用以高通量定量检测细胞内或人工反应体系内序列特异性DNA结合蛋白的含量,并通过序列特异性DNA结合蛋白与微阵列芯片的结合分析,建立序列特异性DNA结合蛋白与其芯片上各DNA靶点的结合亲合性标准参数体系;再运用该微阵列芯片与复杂组分物质如中药和化学混合物反应,反应后通过检测序列特异性DNA结合蛋白与其芯片上各DNA靶点的结合亲合性变化,筛选与标准参数体系比较,那些结合亲合性改变了的DNA靶点;将其作为DNA亲合介质连接到层析柱表面,制备特异性DNA探针层析柱;再将复杂组分物质如中药和化学混合物灌柱,用DNA探针捕获复杂组分物质中与DNA探针特异结合的有效分子;最后经洗脱收获与DNA探针分离的有效分子,进行其化学性质、分子生物学基础及药理学研究,开发成为序列特异性DNA结合蛋白DNA靶点特异性候选药物。该发明的技术及思想体系,在基础分子生物学研究,特别是序列特异性DNA结合蛋白(转录因子)基因表达调控,以及生物医学研究,如序列特异性DNA结合蛋白(转录因子)相关疾病药物作用机理研究和药物性分子筛选中有广泛而重要的应用价值。
(2)技术方案
本发明采用多种技术方法在固相支持物表面制备的双链DNA微阵列芯片,用于复杂组分物质中活性靶分子的筛选、捕获和分离。下面以制备和利用双链DNA微阵列芯片为例,说明本发明的技术操作流程。
(2.1)制备双链DNA微阵列芯片:
①.双分子双链DNA微阵列芯片的制备方法:
依靠原位合成法制备双分子双链DNA微阵列芯片可按照Church等的方法进行(USPatent 6326489);点样法制备双链DNA微阵列芯片可按其他方法进行,如两互补寡核苷酸复性。
②.单分子双链DNA微阵列芯片的制备方法:
单分子双链DNA微阵列芯片的制备可按照Lockhart等(US Patent 5556752)、王进科等(China Patent 02112780.8;02137945.9)的方法进行;单分子双链DNA微阵列芯片也可以用其他方法进行制备。
不管运用上述何种方法制备双链DNA微阵列芯片,该双链DNA微阵列芯片的双链DNA探针分子上必须嵌合针对特定DNA结合蛋白,特别是序列特异性DNA结合蛋白如转录因子的结合位点,如针对NF-κB蛋白的DNA结合位点Ig-κB(GGGACTTTCC)。并且,双链DNA探针分子上特定DNA结合蛋白的DNA结合位点,与固相介质间具有充分的空间距离,便于分子反应;在DNA结合位点两侧应含有适当长度的核苷酸序列,创造有利于DNA结合蛋白或药物或组合化学分子与DNA结合位点发生结合反应的有利环境。
(2.2)建立DNA/蛋白质相互作用亲合性标准体系
①.培养特定细胞(如HeLa细胞),培养基中加不同种类的DNA结合蛋白(如NF-κB)表达诱导剂(如TNF-α)诱导适当时间,收集培养细胞,抽提制备DNA结合蛋白纯蛋白;或构建DNA结合蛋白原核或真核表达载体,将载体引物原核或真核表达系统(细胞或无细胞表达系统),制备不同种类DNA结合蛋白纯蛋白;
②.DNA结合蛋白检测双链DNA微阵列芯片杂交用适当封闭剂(blocking reagents)(如牛血清白蛋白BSA;鲑鱼精DNA,脱脂奶粉;Denharts溶液等)封闭;
③.不同种类DNA结合蛋白纯蛋白与DNA结合蛋白检测双链DNA微阵列芯片在适宜温度杂交适当时间;杂交液中应含有适量两性电解质(如HEPES,Tris-HCl)、担体(如dI-dC)、阳离子(如Na+,K+)、去污剂(如NP-40)、抗氧化剂(如DTT)等,提供DNA结合蛋白与DNA结合的环境条件;
④.除去杂交液,芯片用洗涤缓冲液洗涤(如含有适量Tween-20或Triton-100的PBS溶液);
⑤.芯片与荧光标记DNA结合蛋白抗体杂交(或先与DNA结合蛋白抗体杂交,再与荧光标记二抗杂交);
步骤③-⑤也可以直接用荧光标记的DNA结合蛋白纯蛋白与芯片的杂交代替;
⑥.芯片在微阵列芯片扫描仪(或荧光显微镜、化学发光、磷光成像仪等)上观察,记录荧光等信号;
⑦.依据芯片上各DNA探针的荧光等信号,分析DNA结合蛋白与不同DNA靶点结合的亲合性,建立标准参数体系。
(2.3)筛选DNA结合蛋白的DNA靶点特异性结合小分子
①.DNA结合蛋白检测双链DNA微阵列芯片用适当封闭剂(blocking reagents)(如牛血清白蛋BSA;脱脂奶粉;Denharts溶液等)封闭;
②.DNA结合蛋白检测双链DNA微阵列芯片与含有组合化学分子或天然生物分子(如中药)的杂交液杂交;杂交液中应含有适量两性电解质(如HEPES,Tris-HCl)、担体(如dI-dC)、阳离子(如Na+,K+)、去污剂(如NP-40)、抗氧化剂(如DTT)等,提供NF-κB与DNA结合的环境条件;
③.除去杂交液,芯片用洗涤缓冲液洗涤(如含有适量Tween-20或Triton-100的PBS溶液);
④.DNA结合蛋白纯蛋白再与DNA结合蛋白检测双链DNA微阵列芯片在适宜温度杂交;杂交液中应含有适量两性电解质(如HEPES,Tris-HCl)、担体(如dI-dC)、阳离子(如Na+,K+)、去污剂(如NP-40)、抗氧化剂(如DTT)等,提供DNA结合蛋白与DNA结合的环境条件;
⑤.除去杂交液,芯片用洗涤缓冲液洗涤(如含有适量Tween-20或Triton-100的PBS溶液);
⑥.芯片与荧光标记DNA结合蛋白抗体杂交(或先与DNA结合蛋白抗体杂交,再与荧光标记二抗杂交);
步骤④-⑥也可以直接用荧光标记的DNA结合蛋白纯蛋白与芯片的杂交代替;
⑦.芯片在微阵列芯片扫描仪(或荧光显微镜、化学发光、磷光成像仪等)上观察,记录荧光等信号;
⑧.将芯片上DNA探针系统呈现的荧光等信号和芯片直接与DNA结合蛋白杂交呈现的荧光等信号(对照)进行比较,寻找那些荧光等信号出现变化的DNA探针;
⑨.用荧光等信号出现变化的DNA探针制备亲合层析介质;
⑩.用制备的亲合层析介质对组合化学分子或天然生物分子(如中药)混合物进行亲合层析,分离与DNA结合蛋白的DNA结合位点所结合的靶分子,并对分离纯化的靶分子进行化学性质鉴定及生理、药理作用分析研究,进而开发成为新的候选药物。
(2.4)筛选DNA/蛋白质相互作用干扰性小分子:
①.DNA结合蛋白检测DNA微阵列芯片杂交用适当封闭剂(blocking reagents)(如牛血清白蛋BSA;脱脂奶粉;Denharts溶液等)封闭;
②.DNA结合蛋白检测双链DNA微阵列芯片再与含有组合化学分子或天然生物分子(如中药)及DNA结合蛋白的杂交液杂交;杂交液中应含有适量两性电解质(如HEPES,Tris-HCl)、担体(如dI-dC)、阳离子(如Na+,K+)、去污剂(如NP-40)、抗氧化剂(如DTT)等,提供NA结合蛋白与DNA结合的环境条件;
③.除去杂交液,芯片用洗涤缓冲液洗涤(如含有适量Tween-20或Triton-100的PBS溶液);
④.芯片与荧光标记DNA结合蛋白抗体杂交(或先与DNA结合蛋白抗体杂交,再与荧光标记二抗杂交);
步骤②-④也可以直接用荧光标记的DNA结合蛋白纯蛋白与芯片的杂交代替;
⑤.芯片在微阵列芯片扫描仪(或荧光显微镜、化学发光、磷光成像仪等)上观察,记录荧光等信号;
⑥.将芯片上DNA探针系统呈现的荧光等信号和芯片直接与DNA结合蛋白杂交呈现的荧光等信号(对照)进行比较,寻找那些荧光等信号出现变化的DNA探针,
⑦.用那些荧光等信号出现变化的DNA探针制备亲合介质;
⑧.用DNA探针制备亲合介质对组合化学分子或天然生物分子(如中药)混合物在DNA结合蛋白存在的情况下进行亲合层析,分离与DNA结合蛋白/DNA结合位点共同作用的靶分子,并对分离纯化的靶分子进行化学性质鉴定及生理、药理作用分析研究,进而开发成为新的候选药物。
上述方法(2.2)-(2.4)中,为了实现DNA结合蛋白与芯片杂交结果的检测,所进行的DNA结合蛋白、DNA结合蛋白抗体、DNA结合蛋白二抗的荧光标记,可以用放射性同位素(如32P等)、酶(如HRP)、金属(如Ag)等标记代替,而采用放射性同位素检测(如X光膜感光、磷成像phosphoimaging等)、化学发光(如CSPD等)、化学生色(如NTP)及金标等检测方法代替;甚至DNA结合蛋白、DNA结合蛋白抗体、DNA结合蛋白二抗等不进行任何标记,而采用物理学方法如原子力显微镜(AFM)等手段进行检测;其他非标记的DNA/蛋白质相互作用检测方法同样可以用于DNA结合蛋白检测双链DNA微阵列芯片的检测。
上述技术方案中(2.3)-(2.4)仅仅是运用本发明所提出的技术体系筛选两类生物活性分子的示例,并不是本发明所提出的技术体系在药物研究或基础研究中应用的全部内容,只要是运用本发明所提出的双链DNA微阵列芯片研究药物作用机理和筛选药物或用于其他目的分子,都是本专利所包括的。
(3)技术效果
本发明提出的DNA结合蛋白检测双链核酸微阵列芯片为一种高通量检测各种与双链核酸能够在自然生物环境中发生相互作用的蛋白质的技术平台,这一技术将在两个领域发挥重要作用,一是为DNA结合蛋白相关基础分子生物学中基因表达调控和信号传导提供新的高通量研究手段,二是为生物医学中DNA结合蛋白相关多种疾病候选药物分子的高通量筛选及病理、药理学研究提供新的技术手段。
本发明提出的DNA结合蛋白检测双链核酸微阵列芯片为高检测核酸结合蛋白与其双链核酸靶点相互作用(结合作用)提供了很好的技术手段。为了确证这一功能,我们运用专利技术(02137945.9;02112780.8)制备了含有30个野生型NF-κB蛋白靶DNA序列(表1)的双链DNA微阵列芯片,检测了NF-κB家族蛋白p50同二聚体与30个野生型NF-κB靶DNA序列的结合亲合性,我们发现待检溶液中的p50同二聚体蛋白能够以非常不同的亲合性与各DNA位点结合(如附图7),证明含有30个野生型NF-κB靶DNA序列的dsDNA微阵列芯片完全能够通过一次实验,高通量测定NF-κB家族蛋白p50同二聚体与众多野生型DNA靶点结合的亲合性;这一结果有力地说明双链核酸微阵列芯片在检测序列特异性转录因子与其靶DNA序列的结合特异性和亲合性时非常高效可靠,是一种基于生物芯片技术思想的高通量检测序列特异性DNA结合蛋白与其基因组中靶dsDNA位点相互作用规律的新技术。
表1 NF-κB检测双链DNA微阵列芯片上30个野生型NF-κB结合DNA位点
Genes | DNA targets(5′→3′) | Genes | DNA targets(5′→3′) |
Ly1 | CGTACGCGCGTACG | MHC1 | CGTACGCGCGTACG |
Ly2 | CGTACGCGCGTACG | MHC2 | CGTACGCGCGTACG |
Ly3 | CGTACGCGCGTACG | MHC3 | CGTACGCGCGTACG |
Ly4-V63 | CGTACGCGCGTACG | IL-2-α1 | CGTACGCGCGTACG |
Ly5-Hm2 | CGTACGCGCGTACG | IL-2-α2 | CGTACGCGCGTAC |
TNF-1 | CGTACGCGCGTACG | IL2-κB | CGTACGCGCGTACG |
TNF-2 | CGTACGCGCGTACG | IL6-κB | CGTACGCGCGTACG |
TNF-α1 | CGTACGCGCGTACG | IL8-κB | CGTACGCGCGTACG |
TNF-α2 | CGTACGCGCGTACG | IFNβ-κB-1 | CGTACGCGCGTACG |
GM-CSF | CGTACGCGCGTACG | IFNβ-κB-2 | CGTACGCGCGTACG |
uPA-κB | CGTACGCGCGTACG | IFN-MHC | CGTACGCGCGTACG |
In-Chain II | CGTACGCGCGTACG | κB-33 | CGTACGCGCGTACG |
Ang | CGTACGCGCGTACG | κB-55 | CGTACGCGCGTACG |
VCAM-77 | CGTACGCGCGTACG | HuκB-ml | CGTACGCGCGTACG |
我们运用DNA结合蛋白NF-κB为研究对象证实了本发明的技术效果。NF-κB是一类序列特异性转录因子,参与众多基因的表达调控;如当细胞受到炎症介质、病毒感染、氧化应激等多种物质刺激后,NF-κB在胞质内被激活,进入细胞核与病毒(HIV, Adenovirus,HSV,SIV,SV-40,EBV)、细胞因子(IFN,TNF,IL-1,IL-2,IL-6,IL-8,IL-10,IL-11,IL-12,IL-13)、生长因子(G-CSF,GM-CSF,EPO,M-CSF,VEGF C)、细胞粘附分子(ELAM-1,ICAM-1,VCAM-1,MadCAM-1,Endoglin)、急性相反应蛋白(Angiotensinogen,beta-defensin-2,Tissue factor-1,Pentraxin PTX3,Complement factor C4)、酶(ADH,Lysozyme,PIM-1,Serpin 2A,GelatinaseB,GD3-synthase)、免疫球蛋白(Ig κlight chain)等基因增强子序列结合,增强这些基因的转录;因而在一系列由细胞因子、炎症介质及蛋白酶类参与的疾病的发病过程中发挥重要作用。大量的研究表明NF-κB过度活化与炎症、血管疾病、肿瘤、病毒感染、脑血管疾病、阿尔茨海默病、帕金森氏病、过敏性脑炎、感染性休克、风湿性关节炎、支气管哮喘、动脉粥样硬化、溃疡性结肠炎等病理过程存在非常密切的关系。因此目前NF-κB已成为新药开发的重要靶点,许多生物和生化抑制剂能够阻断NF-κB信号通路或抑制NF-κB/DNA结合,从而有助于NF-κB相关疾病的治疗。因此,筛选抑制NF-κB作用的最佳部位是NF-κB与DNA的相互结合作用,只要能够封闭或干扰NF-κB与DNA的相互结合作用,就能够有效地抑制NF-κB作用。大量的实验已经证明许多小分子能够与NF-κB的DNA靶点直接结合,封闭或干扰NF-κB与DNA的相互结合,有效地抑制NF-κB对DNA靶点调控的下游基因的表达增强作用,如己酮可可碱[Pentoxifylline(1-(5′-oxohexyl)3,7-dimetylxanthine,PTX)]、1,25-二羟胆骨化醇[Calcitriol(1,25-dihydroxyvitamine D3)]、羟基吡啶硫酮(Pyrithione)、甲基红霉素(Clarithromycin)、Quinadril(ACE inhibitor)、阱(Diamide)、三(氮)唑核苷,病毒唑(抗病毒药)(ribavirin)、醌衍生物[E3330(quinone derivative)]、血液复合胺衍生物[Serotonin derivative(N-(p-coumaroyl)serotonin,SC)]、除锈霉素A(Herbimycin A)、水杨酸偶氮磺胺吡啶(Sulfasalazine)、对苯二酚(Hydroquinone(HQ))、洛凡司丁(Mevinolin),5′-甲硫腺苷[5′-methylthioadenosine(MTA)]、吗啡合成衍生[KT-90(morphine synthetic derivative)]、N-乙基-顺丁烯二酰亚胺[N-ethyl-maleimide(NEM)]、烟碱(Nicotine)等。特别是研究表明,中药中存在一些小分子,能够直接与NF-κB的DNA靶点直接结合,封闭或干扰NF-κB与DNA的相互结合,有效地抑制NF-κB对DNA靶点调控的下游基因的表达增强作用,如甘草酸(Glycyrrhizin)(抗病毒)、金丝桃素(Hypericin)(抗病毒、肿瘤)、水飞蓟(黄酮)(Silymarin)(保肝)。我们运用甘草酸(甘草皂苷、甘草甜素)研究了运用NF-κB检测dsDNA微阵列芯片高通量筛选NF-κB相关多种疾病候选药物分子的可行性,我们观察到随着NF-κB蛋白体系中存在的甘草酸分子浓度的逐步提高,NF-κB蛋白与DNA靶点结合的亲合性越低,即证明甘草酸分子竞争性占据了芯片DNA探针上的NF-κB蛋白结合位点,导致芯片上可供NF-κB蛋白结合的DNA位点减少。这些研究表明运用双链核酸微阵列芯片可以高通量筛选中药或组合化学药物中潜在的“核酸结合蛋白/核酸”相互作用干扰性分子,开发新的核酸结合蛋白相关疾病候选药物、研究药物作用机理在技术上是完全可性的。
四、附图说明:
图1是固相支持物表面制备的双链核酸微阵列芯片示意图
图2是双链核酸微阵列芯片上双链核酸探针及蛋白质结合位点示意图
图3是双链核酸微阵列芯片与蛋白质结合建立亲合性标准参数体系分子示意图
图4是双链核酸微阵列芯片与复杂组分物质反应及蛋白结合检测示意图
图5是鉴定双链核酸微阵列芯片与复杂组分物质反应探针及亲合介质制备示意图
图6是亲合介质捕获并分离复杂组分物质中效应分子示意图
图7是示例蛋白与双链核酸微阵列芯片杂交建立亲合性参数体系实验图
五、具体实施方式
1、双链核酸微阵列芯片的准备
下面仅以示例蛋白NF-κB与制备在玻片上的双链DNA微阵列芯片反应为例,说明本发明技术实施。
单链寡核苷酸的设计及化学合成:运用中国专利(02112780.8)技术设计并用固相化学合成技术合成探针单链寡核苷酸,制备检测NF-κB的双链DNA微阵列芯片。合成的探针单链寡核苷酸构件如下:5′NH2-TTTTAGTTGAG
CGTACGC-
GCGTACG-OH 3′;其中方框内DNA序列为一个示例NF-κB结合位点,其他位点序列如表1所示。下划线序列为两方向互补序列。用合成的寡核苷酸,按下面技术方案进行NF-κB检测双链DNA微阵列芯片的制备:
①.固相化学合成一条较短的寡核苷酸(如表2:⑦1),使寡核苷酸含有NF-κB结合位点(红色碱基GGGACTTTCC),并且在其3′端(羟基)含有两段链内反向互补序列(黄色碱基);
②.将氨基寡核苷酸⑦1以40μM溶解在碳酸缓冲液(0.1M carbonate buffer,pH9.0)中,用PixSys5500(Cartesian Technology Inc.)点样(湿度80%)到醛基修饰玻片表面,点样后置于湿盒内0.1M碳酸缓冲液(pH9.0)浸湿的滤纸上,密封湿盒,在37℃温育1小时,再用0.1%SDS溶液洗涤2分钟;玻片用灭菌双蒸水简单淋洗后,转入硼氢化钠溶液[0.28%(w/v)NaBH4,76%(v/v)PBS,24%(v/v)alcohol]中,浸泡3分钟,再用灭菌双蒸水淋洗两次,氮气吹干,4℃保存备用;
③.将10μL杂交液加到步骤2制备的寡核苷酸⑥1的微阵列上,用憎水硅烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2% w/v in octamethylcyclotetrasixane),Pharmacia Biotech)处理的盖玻片覆盖溶液及微阵列,放置于密封湿盒内60℃复性1小时;复性后玻片用2×SSC/0.1%SDS溶液洗涤2分钟,用灭菌双蒸水简单淋洗,氮气吹干,4℃保存备用;
④.将10μL DNA聚合酶反应缓冲液[Polymerase Reaction:50mM Tris-HCl(pH7.2),10mM MgSO4,0.1mM DTT,40μM dNTP,20μg/ml acetylated BSA,2U/μl DNApolymerase Ilarge(Klenow)fragment(3′to 5′exo-;Promega,Madison,WI)]加到步骤3制备的寡核苷酸微阵列上,用憎水硅烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2% w/v in octamethylcyclotetra-sixane),PharmaciaBiotech)处理的盖玻片覆盖溶液及微阵列,放置于密封湿盒内37℃延伸反应1小时;反应后玻片用2×SSC/0.1% SDS和0.2×SSC/0.1%SDS溶液各洗涤5分钟,用灭菌双蒸水简单淋洗,氮气吹干,4℃保存备用。
2.NF-κB检测DNA微阵列芯片检测待检测物中NF-κB蛋白的技术操作
①.转录因子NF-κB p50蛋白用人p50全长cDNA(编码453氨基酸)表达载体在细菌中表达提取(Promega,Madison,WI);
②.NF-κB检测DNA微阵列芯片用5%BSA/PBS溶液封闭室温封闭1小时
③.适量NF-κB蛋白溶解于DNA结合缓冲液中(DNA-binding buffer:10mM HEPES pH7.9,50mM KCl,2.5mM DTT,0.1mM EDTA,0.05%NP-40,10%Glycerol,5%BSA),室温保育30分钟;取10μL DNA结合缓冲液滴加到NF-κB检测DNA微阵列上,用憎水硅烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2% w/v inoctamethylcyclotetrasixane),Pharmacia Biotech)处理的盖玻片覆盖溶液及微阵列,放置于密封湿盒内37℃或室温保育1小时;
④.反应后玻片在室温下分别用PBS/0.05% Tween 20,PBS/0.01% Triton 100及PBS(141mM NaCl,7.2mM Na2HPO4,2.8mM NaH2PO4,pH7.4)洗涤15min;
⑤.氮气吹干玻片,取10μL,含有适量荧光素Cy3(FluoroLinkTM Cy3 monofunctional dye,Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)标记的NF-κB蛋白抗体[NF-κB p50(E-10):sc-8414,Santa Cruz Biotechnology,Inc.]的PBS(141mM NaCl,7.2mMNa2HPO4,2.8mM NaH2PO4,pH7.4)溶液,滴加到NF-κB检测DNA微阵列上,用憎水硅烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2% w/v inoctamethylcyclotetrasixane),Pharmacia Biotech)处理的盖玻片覆盖溶液及微阵列,放置于密封湿盒内37℃或室温保育1小时;
⑥.抗体反应后,玻片用PBS(141mM NaCl,7.2mM Na2HPO4,2.8mM NaH2PO4,pH7.4)溶液室温洗涤30分钟,再用用灭菌双蒸水简单淋洗,氮气吹干。
⑦.芯片在微阵列芯片扫描仪(如ScanArrayLite,Packard Biochip Technologies)上扫描(适当参数:channel、laser power,PMT gain,resolution.),记录荧光信号;
⑧.用芯片芯片荧光信号分析软件(如QuantArraymicroarray analysis software,PackardBiochip Technologies)进行数据分析。检测结果如图7所示。
3.NF-κB检测DNA微阵列芯片检测中药中NF-κB蛋白DNA靶点结合分子的操作
①.转录因子NF-κB p50蛋白用人p50全长cDNA(编码453氨基酸)表达载体在细菌中表达提取(Promega,Madison,WI);
②.NF-κB检测DNA微阵列芯片用5%BSA/PBS溶液封闭室温封闭1小时
③.将适量中药萃取物溶于DNA结合缓冲液中(DNA-binding buffer:10mM HEPESpH7.9,50mM KCl,2.5mM DTT,0.1mM EDTA,0.05%NP-40,10%Glycerol,5%BSA),37℃保育1小时;取10μL DNA结合缓冲液滴加到NF-κB检测dsDNA微阵列上,用憎水硅烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2% w/v inoctamethylcyclotetrasixane),Pharmacia Biotech)处理的盖玻片覆盖溶液及微阵列,放置于密封湿盒内37℃或室温保育2小时;
④.反应后玻片在室温下分别用PBS/0.05% Tween 20,PBS/0.01% Triton 100及PBS(141mM NaCl,7.2mM Na2HPO4,2.8mM NaH2PO4,pH7.4)洗涤15min;
⑤.适量NF-κB蛋白溶解于DNA结合缓冲液中(DNA-binding buffer:10mM HEPESpH7.9,50mM KCl,2.5mM DTT,0.1mM EDTA,0.05%NP-40,10%Glycerol,5%BSA),室温保育30分钟;取10μL DNA结合缓冲液滴加到NF-κB检测DNA微阵列上,用憎水硅烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2% w/v inoctamethylcyclotetrasixane),Pharmacia Biotech)处理的盖玻片覆盖溶液及微阵列,放置于密封湿盒内37℃或室温保育1小时;
⑥.反应后玻片在室温下分别用PBS/0.05% Tween 20,PBS/0.01%Triton 100及PBS(141mM NaCl,7.2mM Na2HPO4,2.8mM NaH2PO4,pH7.4)洗涤15min;
⑦.氮气吹干玻片,取10μL含有适量荧光素Cy3(FluoroLinkTM Cy3 monofunctional dye,Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ)标记的NF-κB蛋白抗体[NF-κB p50(E-10):sc-8414,Santa Cruz Biotechnology,Inc.]的PBS(141mM NaCl,7.2mMNa2HPO4,2.8mM NaH2PO4,pH7.4)溶液,滴加到NF-κB检测DNA微阵列上,用憎水硅烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2% w/v inoctamethylcyclotetrasixane),Pharmacia Biotech)处理的盖玻片覆盖溶液及微阵列,放置于密封湿盒内37℃或室温保育1小时;
⑧.抗体反应后,玻片用PBS(141mM NaCl,7.2mM Na2HPO4,2.8mM NaH2PO4,pH7.4)溶液室温洗涤30分钟,再用用灭菌双蒸水简单淋洗,氮气吹干。
⑨.芯片在微阵列芯片扫描仪(如ScanArray Lite,Packard Biochip Technologies)上扫描(适当参数:channel、laserpower,PMT gain,resolution.),记录荧光信号;
⑩.用芯片荧光信号分析软件(如QuantArray microarray analysis software,PackardBiochip Technologies)进行数据分析。
.将芯片上DNA探针系统呈现的荧光等信号和芯片直接与DNA结合蛋白杂交呈现的荧光等信号(对照)进行比较,寻找那些荧光等信号出现变化的DNA探针;
.用荧光等信号出现变化的DNA探针制备亲合介质;
.用DNA探针制备亲合介质对组合化学分子或天然生物分子(如中药)混合物在DNA结合蛋白存在的情况下进行亲合层析,分离与DNA结合蛋白/DNA结合位点共同作用的靶分子
.对分离纯化的靶分子进行化学性质鉴定及生理、药理作用分析研究,进而开发成为新的候选药物。
Claims (14)
1、一种从复杂组分物质高通量筛选、捕获和分离目标分子的新方法,包括:
(a)提供双链核酸微阵列芯片,该芯片上排布大量捕获探针,其中每个探针在芯片上有区别于其它探针的具体位置,并且每个探针上都有一独特区域;
(b)将双链核酸微阵列芯片与复杂组分物质接触;
(c)筛选鉴定那些与复杂组分物质发生相互作用的探针;
(d)用所鉴定的发生相互作用的探针制备亲合介质;
(e)用鉴定探针制备的亲合介质与复杂组分物质接触;
(f)亲合介质捕获和分离复杂组分物质中与鉴定探针发生相互作用的目标分子。
2、在权利要求1中,复杂组分物质为组成成分复杂,含有大量化学性质及结构已知或未知的天然或人工合成物质。
3、在权利要求1中,复杂组分物质为中药、中药复方及组合化学分子及其混合物等。
4、在权利要求1中,双链核酸微阵列芯片为脱氧核糖核酸(DNA)微阵列芯片、核糖核酸(RNA)微阵列芯片,以及它们的组合物。
5、在权利要求1中,双链肽核酸微阵列芯片为以肽键代替核酸中磷酸二酯键形成外围双螺旋骨架的核酸人工类似物(如肽核酸)构成的微阵列芯片。
6、在权利要求1中,双链核酸微阵列芯片的每个独立的探针上的独特区域为特定目标的双链DNA或RNA结合蛋白的作用位点。
7、在权利要求1中,双链核酸微阵列芯片的每个独立的探针上的独特区域为特定目标的序列特异性双链DNA或RNA结合蛋白的作用位点。
8、在权利要求6中,特定目标的双链DNA或RNA结合蛋白为参与DNA复制、修复、重组、限制及基因表达调控的蛋白质。
9、在权利要求6中,特定目标的双链DNA或RNA结合蛋白为参与基因表达调控的蛋白质,即转录因子。
10、在权利要求1中,发生在复杂组分物质与芯片探针间的相互作用为结合作用。
11、在权利要求1中,用鉴定探针制备的亲合介质为耦联鉴定探针的亲合层析基质。
12、在权利要求1中,亲合介质与复杂组分物质接触为亲合层析过程。
13、在权利要求1中,亲合介质捕获复杂组分物质中目标分子的过程为亲合层析中亲合介质与复杂组分物质中靶分子发生结合作用的过程。
14、在权利要求1中,分离复杂组分物质中目标分子的过程为亲合层析中洗脱收集靶分子的过程。
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- 2003-09-01 CN CN 03152882 patent/CN1590560A/zh active Pending
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