CN104328109A - 微阵列底物上的生物材料的选择性处理 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微阵列底物上的生物材料的选择性处理。本发明提供了用于从微阵列载玻片上的独特空间位置上选择性洗脱生物材料的方法和系统。例如，在一个方面，用于回收与微阵列载玻片偶联的生物材料的方法可以包括：选择要从微阵列载玻片回收的生物材料，在微阵列载玻片表面上的独特空间区域内找到该生物材料，并且从所述独特空间区域洗脱至少一部分所选择的生物材料，但不从所述独特空间区域之外的微阵列载玻片区域洗脱实质数量的非选择的生物材料。

Description

微阵列底物上的生物材料的选择性处理

在先申请

    本申请是国际申请日为2009年9月18日的国际PCT/US2009/057539进入中国、申请号为200980145609.5的题为“微阵列底物上的生物材料的选择性处理”的发明专利申请的分案申请。本申请要求2008年9月22日提交的美国临时申请系列号61/099,035和2008年10月16日提交的美国临时专利申请系列号61/106,083的权益，二者通过引用方式并入本文。

技术领域

本发明涉及在微阵列载玻片表面上的生物材料的处理。因此，本发明涉及分子生物学和化学领域。

背景技术

微阵列是一种高通量技术，其由被称作“特征”的排列的一系列数以千计的生物材料的精微的斑点组成。例如，DNA微阵列包括含有特定DNA序列的DNA片段的特征。这可以包括基因或其它DNA元件的短的部分，其被用作可以在适当的条件下与cDNA或cRNA样品（有时称作靶标）杂交的探针。使用基于荧光的检测法通过检测荧光团标记的靶标来测定核酸序列的相对丰度，从而可以检测并定量探针-靶标的杂交。在标准的微阵列中，探针与固体表面例如玻璃或硅共价偶联。

发明内容

本发明提供了用于从微阵列载玻片上的一个或多个独特的和/或不连续的空间位置上选择性洗脱生物材料的方法和系统。例如，在一个方面，用于回收与微阵列载玻片偶联的生物材料的方法可以包括：选择要从微阵列载玻片回收的生物材料，在微阵列载玻片表面上的独特或不连续空间区域内找到该生物材料，并且从所述独特的空间区域洗脱至少一部分所选择的生物材料，但不从所述独特或不连续空间区域之外的微阵列载玻片区域洗脱实质数量的非选择的生物材料。在一个具体方面，洗脱进一步包括向所述独特或不连续空间区域施加洗脱缓冲液。在另一个具体方面，所述洗脱缓冲液是变性缓冲液，其作用是从微阵列载玻片表面释放该部分的生物材料。在另一个具体方面，将至少一部分的不连续空间区域加热以促进从微阵列表面释放至少一部分所选择的生物材料。预期多种类型的生物材料用于本发明，包括但不限于，DNA、cDNA、RNA、肽、及其组合。

在本发明的另一个方面，提供了用于从微阵列回收核酸材料的方法。此方法可以包括：选择已经在独特或不连续空间区域内的微阵列载玻片表面上杂交的核酸材料，向所述独特空间区域施加变性缓冲液以使所选择的核酸材料至少部分变性，以及使用惰性回收缓冲液冲洗所述微阵列表面以回收所选择的核酸材料的变性的部分。在更具体的方面，该方法还可以包括从所述惰性回收缓冲液中收集所选择的核酸材料的变性的部分。在另一个更具体的方面，该方法还可以包括向所述独特空间区域施加热量以促进至少一部分所选择的核酸材料的变性。

本发明另外提供了用于从微阵列载玻片上的独特空间位置选择性洗脱生物材料的系统。例如，在一个方面，用于从微阵列回收核酸材料的系统可以包括：微阵列扫描器，其配置为扫描微阵列表面并鉴定待回收的核酸材料的位置；分配器，其配置为接收来自所述微阵列扫描器的输入并将洗脱缓冲液在由所述微阵列扫描器指定的位置处分配在所述微阵列表面的不连续分配区；和回收器，其配置为从所述微阵列表面回收所述洗脱缓冲液。还有可能接受来自另一个来源例如不同阵列的信息输入，以确定从哪个区域进行洗脱。在更具体的方面，所述系统还可以包括加热器，其配置为加热所述不连续分配区。在另一个更具体的方面，所述加热器是激光。

本发明还提供了用于选择性标记与微阵列载玻片偶联的生物材料的方法。在一个方面，此方法可以包括：选择待标记的生物材料，确定该生物材料在微阵列载玻片表面上的独特空间区域内的位置，并且标记至少一部分来自该独特空间区域的所选择的生物材料，而不标记来自所述独特空间区域之外的微阵列载玻片区域的实质数量的非选择的生物材料。虽然可以使用多种选择性标记技术，但是在一个方面，标记可以进一步包括向所述独特空间区域施加缓冲液，该区域不包括实质上在所述独特空间区域之外的微阵列载玻片的区域；和将标记物加入到所述独特空间区域的缓冲液中，从而所述缓冲液内的至少一部分生物材料掺入所述标记物。还有可能分配有反应活性的化合物，其可以使位于感兴趣的空间区域或位置处的核酸脱保护。这些经脱保护的序列可以与随后的处理选择性反应。在一些方面，这可以通过使用通常用于合成阵列的设备来进行。在本发明的另一个方面，可以使用光来促进标记并回收存在于所选择的位置处的材料。例如，定向的光可用于使有反应活性的基团脱保护，然后所述基团可以与荧光团或其它可见标记物或半抗原例如生物素反应。在一些方面，这可以通过使用用于合成阵列的设备来进行。此外，所选择的生物材料可以包括能够被标记的任何生物材料，包括但不限于，DNA、cDNA、RNA、肽、及其组合。

本发明还提供了用于扩增与微阵列载玻片偶联的生物材料的方法。在一个方面，此方法可以包括：选择待扩增的生物材料，确定该生物材料在微阵列载玻片表面上的独特空间区域内的位置，和扩增至少一部分来自该独特空间区域的所选择的生物材料，而不扩增来自所述独特空间区域之外的微阵列载玻片区域的实质数量的非选择的生物材料。在一个具体方面，扩增可以进一步包括向所述独特空间区域施加扩增缓冲液，该区域不包括实质上在所述独特空间区域之外的微阵列载玻片的区域；和扩增所述扩增缓冲液内的至少一部分所选择的生物材料。在本发明的另一个方面，光可用于促进存在于所选择的位置处的材料的扩增。例如，光可用于使所选择的区域内的核酸的3’末端脱保护并促进所选择的扩增。在一些情况下，这可以通过使用用于合成阵列的设备来进行。

能够扩增微阵列载玻片表面上的生物材料的任何扩增技术应该被认为在本发明范围内。非限制性实例可以包括等温循环和热循环。

因此相当宽泛地概述了本发明的重要的特征，从而可以更好地理解以下的其详细描述，并且从而更好地认识本发明对现有技术的贡献。通过以下的本发明的详细描述并结合附图和权利要求，可以更清晰地获知本发明的其它特征，或者通过实施本发明可以学习本发明。

具体实施方式

在公开并描述本发明之前，应该理解，本发明不限于本文公开的特定的结构、方法步骤或材料，而是延伸至如相关领域普通技术人员所认识到的其等同物。还应该理解，本文使用的术语仅是为了描述特定实施方式的目的，不是意在限制。

必须注意，除非上下文另有明确指明，否则如本说明书和随附的权利要求中所使用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指称。因此，例如，提及“一种缓冲液”包括一种或多种此类缓冲液，提及“该化学品”包括提及一种或多种此类化学品。

定义

在描述并要求保护本发明时，将根据以下列出的定义使用以下术语。

如本文使用的术语“洗脱”是指从底物或溶液中移除生物材料的动作。在一些方面，所述的移除可以通过使用液体或流体，例如缓冲液来进行。

如本文使用的术语“独特空间位置”是指可以从中回收生物材料的微阵列载玻片上的独特空间位置。在一个方面，所述独特空间位置可以是这样的探针集合：在所述探针集合的周围有独特的边界。此类边界可以包括不含附着的探针的载玻片表面上的空间。在另一个方面，所述独特空间位置可以是位于微阵列载玻片的表面上的沉积探针的较大区域内的探针集合，并且在这样的情况下，可以没有围绕不含探针的独特空间位置的区域。

如本文使用的术语“实质上”是指某作用、特性、性质、状态、结构、项目或结果的完全或几乎完全的程度或度。例如，“实质上”被包被的物体意思是该物体完全被包被或接近完全被包被。在一些情况下，偏离绝对完全性的精确的可允许程度取决于具体情形。但是，一般而言，完全性的接近性将与如同获得绝对且全部完全性具有相同的总体结果。当用于否定式含义以指称完全没有或几乎完全没有某作用、特性、性质、状态、结构、项目或结果时，“实质上”同样适用。例如，“实质上不含”颗粒的组合物将完全缺乏颗粒，或如此接近完全缺乏颗粒以致于效应将与如同完全缺乏颗粒一样。换言之，“实质上不含”某成分或要素的组合物实际上仍然可以含有此类项目，只要不存在其可测定的效应。

如本文使用的术语“大约”用于通过提供给定数值可以比端点值“高一点”或“低一点”而提供数值范围端点值的灵活性。

如本文使用的多个项目、结构元件、组合物要素、和/或材料可以为了方便而呈现为普通列举式。但是，这些列举应该被解释为该列举的每个成员均被单一地指明作为单独的且独特的成员。因此，除非另有指明，否则不应仅仅基于它们呈现在共同的组中而将此类列举的单个成员解释为同一列举的任意其它成员的事实上的等同物。

浓度、数量和其它数值数据在本文中可以表示或呈现为范围的形式。应该理解，此类范围形式仅仅是为了方便和简洁而使用，因此，应该灵活地解读为：不仅包括明确记载的作为范围限值的数值，而且包括该范围内包括的所有单一数值或亚范围，如同明确记载了每个数值和亚范围一样。举例而言，“大约1至大约5”的数值范围应该被解读为：不仅包括明确记载的大约1至大约5的数值，而且包括指明范围内的单一数值和亚范围。因此，该数值范围内包括例如2、3和4的单一数值，以及例如1-3、2-4、和3-5等亚范围，以及单个的1、2、3、4和5。该原则同样适用于仅记载作为最小值或最大值的一个数值的范围。此外，与所描述的范围或特征的宽度无关，此类解读都应该适用。

发明

本发明提供了用于从微阵列载玻片上的独特空间位置选择性洗脱生物材料的方法和系统。如已经描述的那样，在一个方面，微阵列载玻片包含多个用于测定生物材料的特异性结合或杂交位点。例如，在DNA微阵列的情况下，具有特定序列的核苷酸在特定特征处聚簇在一起，通常被称作探针组。然后互补性核苷酸序列可以与对应于靶核苷酸序列的探针特征杂交并由此定位于所述探针特征处。因此，由于在对应于该序列的探针处的核苷酸结合，可以验证样品中的特定核苷酸序列的存在。

由于其高诊断实用性，微阵列已经被经常使用。但是，之前的用途经常局限于编目生物材料或分析表达水平的变化。事实证明难以从阵列中分离特定的序列，这是因为微阵列中结合了大量的靶序列。从微阵列中回收靶序列一般需要使所有结合的序列从微阵列中变性，并且扩增感兴趣的靶序列。

本发明提供了用于从微阵列载玻片分离靶序列或靶序列集合的技术。此类靶序列，或者换言之，生物材料，被选择为从微阵列载玻片中回收。可以由于微阵列载玻片的诊断性用途而选择生物材料。例如，可以基于其在微阵列载玻片上的结合位置而鉴定想要的生物材料。因此，可以将微阵列载玻片表面设计为将探针在空间上排列于促进鉴定和选择性回收与其结合的生物材料的位置处。另外，可以将探针排列于微阵列载玻片表面，从而相关的生物材料在空间上被归组在一起，以促进相伴地鉴定和选择性回收归组的生物材料。

应该注意，可以通过多种方式定义探针集合，所有这些方式都应该包括在本发明的范围内。例如，在一个方面，探针的集合可以包括多个探针的混合物，它们沉积在微阵列载玻片上的独特空间位置或斑点处。因此，探针可以遍及所述独特空间位置均匀混合在一起。回收与该探针集合杂交的生物材料将包括与沉积在该独特位置处的探针混合物匹配的生物材料的混合物。在另一个方面，探针集合可以沉积在微阵列载玻片上，从而独特空间位置可以包括很多单一或多个探针斑点。换言之，该独特空间位置可以由很多较小的探针斑点构成，其中每个探针斑点包括探针总集合的子集，但是其中探针的总集合由遍及探针斑点的集合所代表。在一个具体方面，每个探针斑点可以包含单一探针序列。在另一个具体方面，每个探针斑点可以包含来自总集合的探针序列的子集。生物材料可以从遍及整个独特空间位置回收，或者在一些情况下，从探针集合内的探针斑点的子集回收。还预期独特空间位置可以由含有单一探针序列的探针斑点的集合以及含有一个以上探针序列的探针斑点的集合组成。

然后将所选的生物材料定位于特征中，或换言之，定位于微阵列载玻片的独特位置处。然后从所述独特空间区域洗脱至少一部分所选择的生物材料，但不从所述独特空间区域之外的微阵列载玻片区域洗脱实质数量的非选择的生物材料。此类选择性洗脱可以通过多种方式进行。例如，可以将洗脱缓冲液施加到微阵列上。在一个方面，所述洗脱缓冲液可以是变性缓冲液，其促进所选择的生物材料从微阵列中变性。在此种情况下，有益的是将变性溶液的施用限定于独特空间位置，以避免非选择的生物材料的变性。

在另一个方面，该洗脱缓冲液可以配置为不实质上促进该生物材料变性的缓冲液。在这样的情形中，将施加第二变性机制以使所选择的生物材料变性。例如，在一个方面，可以将洗脱缓冲液施加到独特空间位置，并且可以通过将热源应用到所述独特空间位置而使所选择的生物材料变性。因此，从所述热源产生的热可用于使生物材料变性，然后所述生物材料从微阵列中释放出来以悬浮在该洗脱缓冲液中。在另一个方面，可以将洗脱缓冲液施加至跨越微阵列的较大的区域，并且可以将热源应用到独特空间位置以使所选择的生物材料变性。因为所述洗脱缓冲液不实质上促进生物材料的变性，所以主要的所选择的生物材料应该由于变性热源的定位化的作用而从微阵列载玻片的表面释放进入该洗脱缓冲液中。与仅将缓冲液应用到独特空间位置的情况相比，由于可以使用较大体积的洗脱缓冲液，所以在该技术中可以使用较高的热。还应该注意，可以在存在变性缓冲液的情况下将热源应用至独特空间位置，以进一步促进所选择的生物材料的变性。在另一个方面，可以通过光来促进洗脱。例如，如果包含预杂交的微阵列的寡核苷酸利用光不稳定性化学键附着至表面，则定向的光可以在所选择的位置特异性切割该寡核苷酸和杂交的材料。在一些情况下，这可以通过使用用于合成阵列的设备来进行。

所选择的生物材料变性之后，可以使用惰性回收缓冲液冲洗微阵列以回收洗脱的生物材料。然后可以在回收缓冲液中使用所选择的生物材料，或者可以使用标准技术从回收缓冲液中进一步分离此类材料。通过重复应用洗脱缓冲液、变性和生物材料回收的步骤，可以从单个微阵列载玻片实现不同靶材料的分别回收。

在本发明的一个具体方面，可以通过使用带电的表面来回收所选择的生物材料。例如，在回收核酸的情况下，表面将带有正电荷。带电的表面可以是任何促进生物材料回收的几何构型。非限制性实例可以包括平面、针、半球，等等。在一个方面，变性缓冲液可以放置于感兴趣的独特空间区域，可以将带正电的表面导入变性缓冲液中以将带负电的生物材料吸引至其上。然后可以将带电的表面放置于回收溶液中，可以向所述带电表面施加负电荷以释放所述生物材料。此类技术的一个益处包括具有在释放该生物材料之前清洗带电表面以回收变性缓冲液的能力。

然后回收的洗脱的生物材料片段可随后用于进一步处理，例如测序、杂交、PCR等等。在一个方面，回收的材料可用作用于测序的输入样品。例如，微阵列可用于从输入库中分离核酸片段的一个或多个子集，然后回收的子集可用于测序。在一些方面，可以扫描杂交后的阵列，并且选择靶核酸片段，单一地或同时地收集以用于测序或其它用途。阵列上的位置可用作鉴定用于回收的靶片段的方法的一部分。在该过程中可以预先鉴定用来收集的靶片段，或者可以在该过程中鉴定。根据本发明的方法鉴定并收集靶片段的能力极大地改善了后续的测序过程的效率。

在另一个方面，所述生物材料可用于原位杂交。在更具体的方面，一种原位杂交技术可以包括使用该生物材料作为探针或作为多个探针以用于通过aCGH（阵列比较型基因组杂交）鉴定的染色体区域的FISH（荧光原位杂交）分析。aCGH是基于阵列的技术，其用于检查基因组拷贝数变异。aCGH的一个潜在问题是输入样品的异质性，尤其是肿瘤组织的异质性，其经常发生反复的基因组变异并经常与非转化的组织混合。如果用于制备样品的细胞群体中的基因组拷贝数是可变的，则得到的数据将代表该群体的平均值，并因此将降低来自感兴趣的任何单一细胞的灵敏性。FISH允许进行单个细胞的检查和特异性染色体基因座定量。

染色体FISH中靶DNA分子的数目经常会很小，在正常情况下是2个分子/细胞。因此，必须从每个探针分子产生显著的荧光信号，以便在标准的实验室荧光显微镜下观察得到。为了补偿，用于FISH的核酸探针（通常是BAC）通常很长（大于100 kb），从而每个探针中掺入数以千计的荧光染料分子。可以将这些BAC探针剪成小的DNA片段，但是结果是，荧光标记的探针靶向的感兴趣的染色体区域通常超过100 kb。在使用从基因组范围的CGH阵列回收的片段时（其中探针相对稀疏地沿着染色体定位，并且标记的靶标相对较短），这是个潜在的问题。一个实例可以是300,000个探针的人CGH阵列，其与平均长度为300个碱基的标记的靶标杂交。如果想回收材料以靶向FISH中的100 kb的区域，则将从微阵列上的仅10个探针回收材料(300,000探针/30亿碱基= 1 探针/10,000碱基)，并且靶向仅3%的感兴趣的染色体区域(1 探针/10,000碱基 x 平均300碱基/探针 = 3%)。因此，潜在的信号将仅是使用BAC探针可以获得的信号的3%，使用BAC探针靶向多达100%的感兴趣区域。因此，优选的是在微阵列实验中使用高密度阵列和较长的标记靶标。例如，如果在FISH实验中使用600 bp的片段杂交2,100,000探针的阵列，则将靶向42%的感兴趣染色体区域(2,100,000探针/3,000,000,000碱基 = 1探针/1430碱基x 平均600碱基/探针 = 42%)。

如已经描述的那样，本发明提供了用于从高密度阵列上的单一探针回收片段的方法。但是，在其它方面，可能需要产生由固定的探针的“集合”组成的微阵列，给定集合中的每个探针是不同的序列，并且探针的每个集合对应于单一的基因组位置。例如，可以通过产生3000个探针集合的微阵列通过阵列CGH来测试3000 MB的人类基因组。这些集合将在阵列上空间上分离，从而可以从单一或一小组集合内的每个探针变性并回收杂交的材料，而不影响任何邻近的集合。可以通过使用微量吸液针头完成变性和回收，其在给定的探针位置反复地分配并吸取极小滴的变性缓冲液。在该实例中，每个集合将代表源自连续1 MB区域内的序列的探针。集合将由大约均匀分布在1 MB区域内的1000个探针组成。该过程将产生1 MB的分辨率，换言之，允许对任意1 MB的窗口内的所有基因组片段取样，以用于后续的生物化学处理，例如FISH。

应该注意，固定于“集合”中的探针可以对应于多个基因组位置。例如，针对具有相似功能，或者与特定疾病或病况具有相关性的生物材料的靶序列的探针可以定位于集合中，以便促进功能上相关的生物材料的同时回收。

在一个方面，如果洗脱的标记的样品可以直接用作FISH探针而无需扩增，则该技术对于FISH可以是特别有利的。由于洗脱的材料的总量可能是极低的，所以仪器应该以非常小的体积回收洗脱的材料，例如1微升，以使杂交反应中的浓度最大化。因此，用于FISH杂交的组织样品需要非常小（直径为数毫米或更小）并且腔室的体积需要为仅数微升。该技术特别好地适合于微流量装置。此类装置的实例可以包括但不限于，BioMicro's 16 chamber MAUI Mixer。在另一个方面，可以在从微阵列载玻片回收之后但是在使用之前扩增生物材料，或对生物材料进行化学修饰。

另外预期可以通过本发明的技术分离可能位于微阵列载玻片表面上的所有类型的生物材料。此类生物材料的非限制性实例包括DNA、cDNA、RNA、肽、脂、碳水化合物等，及其组合。本领域普通技术人员将理解微阵列的构型、溶液和缓冲液，热源和温度等可以根据生物材料的类型而变化。因此，这些变化应该被认为是在本发明的范围内。

本发明另外提供了用于从微阵列载玻片上的独特空间位置选择性洗脱生物材料的系统。例如，在一个方面，用于从微阵列回收核酸材料的系统可以包括：微阵列扫描器，其配置为扫描微阵列表面并鉴定待回收的核酸材料的位置；分配器，其配置为接收来自所述微阵列扫描器的输入并在由所述微阵列扫描器指定的位置处将洗脱缓冲液分配在所述微阵列表面的不连续分配区；和回收器，其配置为从所述微阵列表面回收所述洗脱缓冲液。在更具体的方面，所述系统还可以包括加热器，其配置为加热所述不连续分配区。在另一个更具体的方面，所述加热器是激光。

作为实例，片段洗脱过程可以按照如下进行：可以使用标准的微阵列扫描器扫描经杂交并清洗的微阵列。得到的输出文件将用于指导分配器将变性缓冲液精确放置于微阵列上。例如，微阵列点染器例如ArrayJet?可用作分配器。所述变性缓冲液和程序应该有效洗脱其接触的杂交片段，在该过程中不应该蒸发，并且应该可以被回收而不使来自阵列上的不想要的位置的片段变性。在一个方面，一种可能的方案是分配含有脲和甘油的缓冲液，加热阵列以引起变性，冷却阵列以终止变性，然后以非变性回收缓冲液冲洗整个阵列并收集洗脱的片段。

此外，变性和回收效率可能随着每一轮的载玻片清洗和干燥而显著并持续下降。为了稳定杂交的片段并改善特异性回收效率，可以开发稳定化清洗缓冲液（含有特殊的表面活性剂）或微阵列表面。

应该注意，来自阵列上的位置的未经历变性缓冲液处理的片段的回收可能污染洗脱的片段。直接从分配洗脱缓冲液的阵列上的位置回收所述洗脱缓冲液将是有用的。这可以通过使用最少的回收缓冲液将洗脱缓冲液从微阵列上吸取回来并且尽可能少地涉及邻近的阵列位置来实现。还可以通过印迹或通过使用珠子来回收液体和变性的片段。这应该防止任何流体接触阵列的其它部分，这应该消除不想要的片段的回收。

很多微阵列的特征的中心至中心斑点距离可以比变性缓冲液的分配的液滴的最小可能大小小得多，这会使得难以从单一斑点回收片段。一个可能的方案是应用tiling阵列，其中斑点排列为使任意“洗脱空间”中的探针之间的几何距离最小化。

在本发明的另一个方面，提供了用于选择性标记与微阵列载玻片偶联的生物材料的方法。在一个方面，此方法可以包括：选择待标记的生物材料，确定该生物材料在微阵列载玻片表面上的独特空间区域内的位置，以及标记至少一部分来自该独特空间区域的所选择的生物材料，而不标记来自所述独特空间区域之外的微阵列载玻片区域的实质数量的非选择的生物材料。虽然可以使用多种选择性标记技术，但是在一个方面，标记可以进一步包括向所述独特空间区域施加缓冲液，所述区域不包括实质上在所述独特空间区域之外的微阵列载玻片的区域；和将标记物加入到所述独特空间区域的缓冲液中，从而所述缓冲液内的至少一部分生物材料掺入所述标记物。此外，所选择的生物材料可以包括能够被标记的任何生物材料，包括但不限于，DNA、cDNA、RNA、肽、及其组合。

此类选择性可以包括仅标记存在于阵列上的特定位置处的生物材料。在标记步骤之后，可以从精确位置回收经标记的材料，或者可以从整个阵列回收经标记的材料联同其它材料。如果非标记的（或以不同标记物标记的）回收的材料不干扰ISH测定，则回收经标记的材料联同未标记（或以不同标记物标记）的材料的技术可用于下游处理，例如原位杂交（ISH）。一个实例为，以荧光标记的靶标进行的CGH测定。在一个方面，空间特异性标记可以使用半抗原，例如生物素、独特的寡聚体或肽序列，或可以在随后的ISH测试中被区分的其它分子。使用独特的寡聚体或肽序列的优势在于可以在多个不同位置同时进行多个标记反应。从阵列表面回收之后，可以在同一ISH测试中同时检测来自aCGH分析的多个暗示的区域。在一些方面，随后还可以使用多个标记物将差别化标记的和回收的片段亲和纯化进入不同的库，以用于下游应用，例如测序。

标记步骤之后，可以使用多种机制从微阵列表面释放固定的材料，例如探针。非限制性机制可以包括，使杂交的或非共价结合的材料变性，在探针与底物之间引入可逆的键合（例如硫键），部分切割想要的材料（例如，使用核酸酶），或总体释放与底物结合的所有材料。在一个具体方面，从阵列上的特定位置释放材料的机制可以使用光不稳定性键，其被定向的光切断，这将允许精确地释放仅感兴趣的材料。

在本发明的另一个方面，提供了用于选择性扩增与微阵列载玻片偶联的生物材料的方法。在一个方面，此方法可以包括：选择待扩增的生物材料，确定该生物材料在微阵列载玻片表面上的独特空间区域内的位置，以及扩增至少一部分来自该独特空间区域的所选择的生物材料，而不扩增来自所述独特空间区域之外的微阵列载玻片区域的实质数量的非选择的生物材料。在一个具体方面，扩增可以进一步包括向所述独特空间区域施加扩增缓冲液，所述区域不包括实质上在所述独特空间区域之外的微阵列载玻片的区域；和扩增所述扩增缓冲液内的至少一部分的所选择的生物材料。能够扩增微阵列载玻片的表面上的生物材料的任意扩增技术应该被认为在本发明范围内。非限制性实例可以包括等温循环和热循环。

此类用于扩增的方法有几个潜在的益处，包括但不限于：1）可以在阵列上的不同位置同时进行多个扩增；和2）每个扩增可以掺入不同的标记物，因此允许一起回收所有的扩增产物并且每个产物可以保持其独特性质。

此外，以下方法可用于在微阵列上的特定位置完成扩增：1）杂交的核酸可以用作模板；和2）固定的探针可以用作针对存在于反应试剂中的非位置特异性模板的探针。在后一种情况下，可以从不同的来源例如不同的微阵列获得空间信息。

可以使用一定的方式或机制例如移液或喷墨打印机将包括引物的扩增反应试剂精确地施加至想要的位置。然后，使用热循环或等温方式或方法进行扩增反应。多种热和等温方法是已知的，适用于选择性扩增微阵列载玻片上的生物材料的任意此类方法均应被认为是在本发明的范围内。

在一个方面，可以通过首先封闭在阵列上的所有位置的扩增，然后精确地在感兴趣区域解除封闭而将扩增控制在不连续位置。可以使用定向的光精确控制解除封闭。

当然，应该理解，以上描述的安排仅仅是为了解释本发明的原理的应用。本领域技术人员可以不脱离本发明的精神和范围而获得多种修饰和替代性安排，随附的权利要求意在包括此类修饰和安排。因此，虽然上文以特性和细节联同现在被认为是本发明的最实用和优选的实施方式描述了本发明，但是对本领域普通技术人员显而易见的是可以不脱离本文给出的原理和概念作出多种改变，包括但不限于关于大小、材料、形状、形式、功能和操作方式、组装和用途的改变。

Claims (29)

1.用于回收与微阵列载玻片偶联的生物材料的方法，包括：

选择要从微阵列载玻片回收的生物材料；

在微阵列载玻片表面上的独特空间区域内找到该生物材料；和

从所述独特空间区域洗脱至少一部分所选择的生物材料，但不从所述独特空间区域之外的微阵列载玻片区域洗脱实质数量的非选择的生物材料，其中洗脱包括向至少所述独特空间区域施加洗脱缓冲液。

2.权利要求1的方法，其中所述洗脱包括向仅仅所述独特空间区域施加洗脱缓冲液。

3.权利要求2的方法，其中所述洗脱缓冲液是变性缓冲液，其作用是从微阵列载玻片表面释放该部分的生物材料。

4.权利要求2的方法，其中将至少一部分的独特空间区域加热以促进从微阵列表面释放至少一部分所选择的生物材料。

5.权利要求1的方法，其中所选择的生物材料为选自DNA、cDNA、RNA、肽、及其组合的成员。

6.用于从微阵列回收核酸材料的方法，包括：

选择已经杂交至独特空间区域内的微阵列载玻片表面的核酸材料；

向所述独特空间区域施加变性缓冲液以使所选择的核酸材料至少部分变性；和

使用惰性回收缓冲液冲洗所述微阵列表面以回收所选择的核酸材料的变性的部分。

7.权利要求6的方法，还包括从所述惰性回收缓冲液中收集所选择的核酸材料的变性的部分。

8.权利要求6的方法，还包括向所述独特空间区域施加热量以促进至少一部分所选择的核酸材料的变性。

9.用于从微阵列回收核酸材料的系统，其包括：

微阵列扫描器，其配置为扫描微阵列表面并鉴定待回收的核酸材料的位置；

分配器，其配置为接收来自所述微阵列扫描器的输入并将洗脱缓冲液在由所述微阵列扫描器指定的位置处分配在所述微阵列表面的不连续分配区，其中所述洗脱缓冲液不使来自阵列上的不想要的位置的片段变性；和

回收器，其配置为从所述微阵列表面回收所述洗脱缓冲液。

10.权利要求9的系统，还包括加热器，其配置为加热所述不连续分配区。

11.权利要求10的系统，其中所述加热器是激光。

12.权利要求10的系统，其中所述回收器是带电的表面。

13.使用生物材料作为原位杂交探针的方法，包括：

如权利要求1所述回收生物材料；

使用所述生物材料作为用于原位杂交的探针。

14.权利要求13的方法，其中不经过显著扩增使用所述生物材料作为探针。

15.权利要求13的方法，其中在被用作探针之前，所述生物材料经过扩增。

16.权利要求13的方法，其中所述原位杂交是荧光原位杂交。

17.选择性标记与微阵列载玻片偶联的生物材料的方法，包括：

选择待标记的生物材料；

确定该生物材料在微阵列载玻片表面上的独特空间区域内的位置；和

标记至少一部分来自该独特空间区域的所选择的生物材料，而不标记来自所述独特空间区域之外的微阵列载玻片区域的实质数量的非选择的生物材料。

18.权利要求17的方法，其中所述标记进一步包括：

在独特空间位置选择性修饰生物材料；和

使用仅能与经过之前修饰的那些生物材料反应的试剂处理微阵列载玻片的一部分或整个微阵列载玻片。

19.权利要求18的方法，其中使用定向的光选择性修饰所述生物材料。

20.权利要求18的方法，其中使用分配剂选择性修饰所述生物材料。

21.权利要求17的方法，其中所述标记还包括：

向所述独特空间区域施加缓冲液，所述区域不包括实质上在所述独特空间区域之外的微阵列载玻片的区域；和

将标记物加入到所述独特空间区域的缓冲液中，从而所述缓冲液内的至少一部分的生物材料掺入所述标记物。

22.权利要求17的方法，其中所选择的生物材料为选自DNA、cDNA、RNA、肽、及其组合的成员。

23.用于选择性扩增与微阵列载玻片偶联的生物材料的方法，包括：

选择待扩增的生物材料；

确定该生物材料在微阵列载玻片表面上的独特空间区域内的位置；和

扩增至少一部分来自该独特空间区域的所选择的生物材料，而不扩增来自所述独特空间区域之外的微阵列载玻片区域的实质数量的非选择的生物材料。

24.权利要求23的方法，其中所述标记进一步包括：

在独特空间位置选择性修饰生物材料；和

使用仅能与经过之前修饰的那些生物材料反应的试剂处理微阵列载玻片的一部分或整个微阵列载玻片。

25.权利要求24的方法，其中使用定向的光选择性修饰所述生物材料。

26.权利要求24的方法，其中使用分配剂选择性修饰所述生物材料。

27.权利要求23的方法，其中所述扩增还包括：

向所述独特空间区域施加扩增缓冲液，所述区域不包括实质上在所述独特空间区域之外的微阵列载玻片的区域；和

扩增所述扩增缓冲液内的至少一部分的所选择的生物材料。

28.权利要求23的方法，其中通过等温循环扩增所选择的生物材料的部分。

29.权利要求23的方法，其中通过热循环扩增所选择的生物材料的部分。