CN104725465A - 一种分离dna结合蛋白并精确定位其dna结合位点的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种分离DNA结合蛋白并精确定位其DNA结合位点的方法，分离DNA结合蛋白：通过利用带有生物素标记的引物PCR扩增待研究DNA片段，先后加入核蛋白或胞质蛋白和亲和素包被的磁珠，共同孵育，洗去非特异结合的蛋白，加入SDS使蛋白质变性释放，鉴定蛋白质；定位蛋白质的DNA结合位点：以待研究的DNA片段为模板，采用不同的引物通过PCR反应获得相互重叠的DNA片断；根据上述相互重叠的DNA片断对分离蛋白质亲和力的差异定位分离蛋白质的DNA结合位点。
Description
技术领域
本发明涉及DNA结合蛋白，具体地说，涉及一种分离DNA结合蛋白并精确定位其DNA结合位点的方法。
背景技术
目前对启动子DNA结合蛋白的研究方法可分为两大类。第一类是细胞内方法，以已知的启动子DNA序列筛选与其相结合的蛋白编码基因，通过生物信息学分析来确定该蛋白质，如酵母单杂交系统(yeastone hybrid system，Y1H)、噬菌体展示技术(phage display，PD)等。第二类是细胞外法，即在体外用重组的已知蛋白质与启动子DNA结合，如凝胶阻滞实验、DNase I足迹试验等。
细胞内方法由于是细胞内筛选，符合生理状态，适合高通量筛选用于寻找未知基因及蛋白质，但是只能筛选可与启动子DNA特异性结合的蛋白，但不能检查出精确的蛋白质结合位点，而且其特异性需要进一步验证。细胞外法可以查出精确的蛋白质结合位点，但效率低下、操作复杂，一般不用于寻找未知基因及蛋白质。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种可以寻找潜在DNA结合蛋白并且可以对其与DNA结合位点进行精确定位的方法。
为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
一种分离DNA结合蛋白并精确定位其DNA结合位点的方法，
分离DNA结合蛋白：通过利用带有生物素标记的引物PCR扩增待研究DNA片段，先后加入核蛋白或胞质蛋白和亲和素包被的磁珠，共同孵育，洗去非特异结合的蛋白，加入SDS使蛋白质变性释放，鉴定蛋白质；
这样扩增的每个PCR片段末端都带有一个生物素基团，生物素与亲和素包被磁珠(Streptavidin Sepharose)结合，而亲和素包被磁珠又可以与带吸力真空准备工具(vacuum prep tool)结合，从而被分离出来。
定位蛋白质的DNA结合位点：以待研究的DNA片段为模板，采用不同的引物通过PCR反应获得相互重叠的DNA片断，根据相互重叠的DNA片断对结合蛋白亲和力的差异定位结合蛋白的DNA结合位点。
进一步地，所述方法具体包括如下步骤：
S1：DNA片段的扩增：
以待研究的DNA片段为模板，利用带有生物素标记的引物通过PCR反应进行扩增；经1％琼脂糖凝胶电泳，切下带有目的片断的凝胶回收纯化，获得纯的DNA片断(0.5-3.0ug)；
S2：蛋白质的分离：
PCR产物中加入核蛋白或胞质蛋白，共同孵育；
加入亲和素包被的磁珠，共同孵育；
缓冲液洗去非特异结合的蛋白；
加入SDS使蛋白质变性释放，鉴定蛋白质；
S3：定位蛋白质的DNA结合位点：
以待研究的DNA片段为模板，采用不同的引物通过PCR反应获得相互重叠的DNA片断；
根据上述相互重叠的DNA片断对结合蛋白亲和力的差异定位结合蛋白的DNA结合位点。
更进一步地，所述待研究的DNA片段为200-300bp。
所述步骤S1中任意一条引物的5’末端采用生物素标记。
进一步地，所述步骤S2具体为：
1)在96孔板中预先加入30μL ddH2O；
2)100μL PCR产物中加入50μL核蛋白或胞质蛋白，37℃孵育15分钟；
3)Streptavidin SepharoseTM HP(链霉亲和素琼脂糖凝胶)混匀，取6μL加入到46μL binding buffer(结和缓冲液)，以吸头混匀5分钟，混合物加入到含有PCR产物-蛋白混合物的96孔PCR反应板；
4)在Vacuum prep workstation(真空准备工作站)中，四个样品板中依次加入180ml高纯水、Denaturation buffer(变性缓冲液)、washingbuffer(清洗缓冲液)和PBS(磷酸缓冲液)；
5)打开vacuum prep workstation(真空准备工作站)的抽气泵，将vacuum prep tool(真空准备工具)在高纯水中清洗30秒；
6)将vacuum prep tool(真空准备工具)移到PCR板中，抓取亲和素包被磁珠-生物素-DNA-蛋白质复合物；
7)将vacuum prep tool(真空准备工具)在Denaturation buffer(变性缓冲液)、washing buffer(清洗缓冲液)或PBS(磷酸缓冲液)中洗涤15秒；
8)关掉抽气泵，将vacuum prep tool(真空准备工具)放入含有超纯水的96孔板中，摇动，释放混合物；
9)吸取混合物，放入离心管中，-20℃保存；
10)DNA结合蛋白的鉴定。
其中，DNA结合蛋白的鉴定通过本领域常规方法鉴定，如：SDS-PAGE、凝胶阻滞实验室或色谱法鉴定。
本发明的有益效果在于：
本发明采用生物素-亲和素作用方法来确定与启动子结合蛋白，方法简便易行，且周期较短；并且通过PCR反应控制PCR产物的长度和位置，且能方便的引入基因突变，以及适应于大通量的筛选，因此该方法即可用于大通量的分析与DNA结合的蛋白质，又可准确定位蛋白在DNA上的作用位点，并可通过引入突变来判断其与位点的结合特异性。
附图说明
图1为本发明实施例中样本在12％的SDS-PAGE上电泳图；
蛋白质分子量标准自上至下分别是97、66、44、31、21和14kD；1和2分别是提取的核蛋白和胞质蛋白，D1和D2分别是处理后经denaturation buffer洗涤的核蛋白和胞质蛋白，W1和W2分别是处理后经washing buffer洗涤的核蛋白和胞质蛋白，P1和P2分别是处理后经PBS洗涤的核蛋白和胞质蛋白。
图2为本发明实施例中与启动子片段结合的蛋白的凝胶阻滞试验检测结果。
图3为本发明所述分离DNA结合蛋白并精确定位其DNA结合位点的方法示意图。
具体实施方式
本实施例以hCLP46基因启动子CpG岛结合蛋白为例，用于说明本发明技术方案，但不用来限制本发明的范围。
实施例1 hCLP46基因启动子CpG岛结合蛋白的分离与结合位点的定位
1、hCLP46启动子区的扩增
应用Primer Premier 5.0设计引物(表1)，100μL反应体系中包含10×PCR Buffer 10μL，2.5mM dNTP mix 8μL，各4.0μL 10uM上、下游引物，2.0μL U937 DNA，1.0μL 5U/μL Taq(TakaRa)和71.0μLddH2O。混合物混匀离心后在PCR仪上执行扩增反应(95℃3min；95℃30s，59℃30s，72℃1min，45 cycles；72℃5min；4℃forever)。
表1 hCLP46启动子扩增引物
2、U937细胞胞质蛋白和核蛋白提取
U937细胞按照上述方法进行培养，使用核蛋白和胞质蛋白提取试剂盒(南京凯基)提取细胞核蛋白和胞质蛋白，简略步骤如下：
1)取培养的U937细胞5×106～1×107个/mL，弃去培养液，细胞用预冷的PBS洗涤两遍；
2)用1mL预冷的PBS洗涤细胞后转移至预冷的1.5mL微量离心管中；
3)4℃离心，500×g，3min收集细胞，用移液枪尽可能取去上清，勿留残液，估计细胞压积PCV(离心后的紧实细胞体积)；
4)每20μl细胞压积中，加入200μl预冷的Buffer A(使用前每mL Buffer A加入1μl DTT，5μl PMSF，10μl蛋白酶抑制剂)，最大转速涡旋剧烈振荡15s，放置冰上15min；
5)加入11μl冷Buffer B，最大转速涡旋剧烈振荡5s，放置冰上1min；
6)再次最大转速涡旋剧烈振荡5S后，4℃离心，16000×g，5min；
7)尽快将上清转入另一预冷的洁净微量离心管，置于冰上，即得胞质蛋白；
8)在离心沉淀物(细胞核)中加入100μl预冷的Buffer C(使用前每mL Buffer C加入1μl DTT，5μl PMSF，10μl蛋白酶抑制剂)，最大转速涡旋剧烈振荡15S，放置冰上40min，每间隔10min涡旋剧烈振荡15S；
9)4℃离心，16000×g，10min，尽快将上清转入一预冷的洁净微量离心管，即得核蛋白；
10)胞质蛋白和核蛋白，分装并保存于-80℃，避免反复冻融。提取的蛋白可用于进一步的转录因子活性分析、凝胶阻滞实验(gelshift assay)、免疫共沉淀、Western Blotting、酶活性测定等后续蛋白质研究。
3、分离与hCLP46启动子区相互作用的蛋白
在PSQ 96板(biotage)中预先加入30μl ddH2O；
100μLPCR产物中加入50μL核蛋白或胞质蛋白，37℃孵育15分钟；
Streptavidin SepharoseTM HP(Amersham)混匀，取6μL加入到46μLbinding buffer(biotage)，以吸头混匀5分钟，混合物加入到含有PCR产物-蛋白混合物的96孔PCR反应板；
在Vacuum prep workstation(biotage)中，四个样品板中依次加入180ml高纯水、Denaturation buffer、washing buffer(biotage)和PBS；
打开vacuum prep workstation的泵，将vacuum prep tool在高纯水中清洗30秒；
将vacuum prep tool移到PCR板中，抓取亲和素包被磁珠-生物素-DNA-蛋白质；
将vacuum prep tool在Denaturation buffer、washing buffer或PBS中洗涤15秒；
关掉泵，将vacuum prep tool放入含有ddH2O的PSQ 96板中，摇动，释放混合物；
吸取混合物，放入离心管中，-20℃保存。
4、SDS-PAGE
1)按照分子克隆指南配置10％SDS，30％Aa:Bis，1X电泳缓冲液(pH 8.3)，10％过硫酸铵，2×SDS电泳上样缓冲液，考马斯亮兰染色液、脱色液、12％的分离胶和4％的积层胶；
2)将样品加入等量的2×SDS上样缓冲液，100℃加热3-5min，12000×g离心20min，取上清用于SDS-PAGE分析；
3)取20μl处理后的样品加入样品池中，并加入5μl标准蛋白Marker作对照；
4)电泳:在电泳槽中加入1×电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电泳时，积层胶电压80V，分离胶电压140V，电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止(约需2hr)；
5)染色:将胶从玻璃板中取出，切除浓缩胶，考马斯亮兰染色液染色，室温摇床1-2hr；
6)脱色:将胶从染色液中取出，放入脱色液中，多次脱色至蛋白带清晰。
7)利用凝胶成像仪对脱色好的凝胶拍照保存并分析。
用生物标记的引物扩增启动子区DNA片段，PCR产物分别与核蛋白和胞质蛋白共孵育，然后加入与生物素结合的StreptavidinSepharoseTM HP，以Vacuum prep workstation吸取蛋白质-DNA-生物素-Streptavidin SepharoseTM HP复合物，以denaturation buffer、washingbuffer或PBS洗涤后释放到96孔板。样本在12％的SDS-PAGE上电泳，结果(见图1)显示经washing buffer和PBS洗涤的样本在14.0kD处有一条显著的条带。
5、凝胶阻滞实验
PCR产物，与核蛋白共孵育的DNA-蛋白质复合物，与胞浆蛋白共孵育的DNA-蛋白质复合物，与核蛋白孵育的磁珠-生物素-DNA-蛋白质(washing buffer清洗)，与胞浆蛋白孵育的磁珠-生物素-DNA-蛋白质(washing buffer清洗)，分别与适量的Loading Buffer(TakaRa)混合后，在1％琼脂糖凝胶上进行电泳，电泳完毕后用凝胶成像仪摄像和分析。
结果(见图2)显示未经洗涤纯化的DNA-核蛋白或胞质蛋白中有在大于500bp处有模糊的DNA染色，而洗涤纯化后的片段则有单一的条带，其迁移速度都显著低于单纯的蛋白质。SDS-PAGE后分离捕获的蛋白质片断，采用质谱(MS)方法对目的多肽进行检测，确定该蛋白是组蛋白2A家族的H2A.A蛋白。
6、多肽质量指纹图谱鉴定
SDS-PAGE后分离捕获的蛋白质片断，采用质谱(MS)方法对目的多肽进行检测。通过对不同长度和位置PCR片段所结合的蛋白质的鉴定，可以对DNA上蛋白质结合位点进行定位。譬如片段1(2201-2300)上结合某蛋白质(Protein1)，若使用片段2(2221-2300)则不结合Protein1，则DNA(2201-2220)是Protein1在DNA上的结合位点。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (6)
1.一种分离DNA结合蛋白并精确定位其DNA结合位点的方法，其特征在于，分离DNA结合蛋白：通过利用带有生物素标记的引物PCR扩增待研究DNA片段，先后加入核蛋白或胞质蛋白和亲和素包被的磁珠，共同孵育，洗去非特异结合的蛋白，加入SDS使蛋白质变性释放，鉴定蛋白质；定位蛋白质的DNA结合位点：以待研究的DNA片段为模板，采用不同的引物通过PCR反应获得相互重叠的DNA片断，根据相互重叠的DNA片断对结合蛋白亲和力的差异定位结合蛋白的DNA结合位点。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：
S1：DNA片段的扩增：
以待研究的DNA片段为模板，利用带有生物素标记的引物通过PCR反应进行扩增；
S2：蛋白质的分离：
PCR产物中加入核蛋白或胞质蛋白，共同孵育；
加入亲和素包被的磁珠，共同孵育；
缓冲液洗去非特异结合的蛋白；
加入SDS使蛋白质变性释放，鉴定蛋白质；
S3：定位蛋白质的DNA结合位点：
以待研究的DNA片段为模板，采用不同的引物通过PCR反应获得相互重叠的DNA片断；
根据上述相互重叠的DNA片断对结合蛋白亲和力的差异定位结合蛋白的DNA结合位点。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述待研究的DNA片段为200-300bp。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中任意一条引物的5’末端采用生物素标记。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤S2具体为：
1)在96孔板中预先加入30μL高纯水；
2)100μL PCR产物中加入50μL核蛋白或胞质蛋白，37℃孵育15分钟；
3)Streptavidin SepharoseTM HP(链霉亲和素琼脂糖凝胶)混匀，取6μL加入到46μL binding buffer(结和缓冲液)，以吸头混匀5分钟，混合物加入到含有PCR产物-蛋白混合物的96孔PCR反应板；
4)在Vacuum prep workstation(真空准备工作站)中，四个样品板中依次加入180ml高纯水、Denaturation buffer(变性缓冲液)、washingbuffer(清洗缓冲液)和PBS(磷酸缓冲液)；
5)打开vacuum prep workstation(真空准备工作站)的抽气泵，将vacuum prep tool(真空准备工具)在高纯水中清洗30秒；
6)将vacuum prep tool(真空准备工具)移到PCR板中，抓取亲和素包被磁珠-生物素-DNA-蛋白质复合物；
7)将vacuum prep tool(真空准备工具)在Denaturation buffer(变性缓冲液)、washing buffer(清洗缓冲液)或PBS(磷酸缓冲液)中洗涤15秒；
8)关掉抽气泵，将vacuum prep tool(真空准备工具)放入含有超纯水的96孔板中，摇动，释放混合物；
9)吸取混合物，放入离心管中，-20℃保存；
10)DNA结合蛋白的鉴定。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，DNA结合蛋白通过SDS-PAGE、凝胶阻滞实验室或色谱法鉴定。
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