CN102841159A

CN102841159A - 一种家蚕体内辛硫磷残留量的检测方法

Info

Publication number: CN102841159A
Application number: CN2012103642913A
Authority: CN
Inventors: 李兵; 王燕红; 顾芝亚; 沈卫德; 洪法水
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2012-09-26
Filing date: 2012-09-26
Publication date: 2012-12-26

Abstract

本发明公开了一种家蚕体内辛硫磷残留量的检测方法，包括以下步骤：（1）待测样本经甲醇或乙酸乙酯提取后在40℃～50℃烘干得到提取物；（2）将提取物溶于乙腈，再用0.4μm～0.5μm的滤膜过滤得到提取物溶液；（3）以乙腈-水溶液作为流动相溶剂，利用高效液相色谱分析法进行检测，得到辛硫磷残留量；待测样本选自家蚕个体血液、经过匀浆处理后的去除肠道中内容物后的个体或者家蚕各器官经过匀浆处理后的样本中的一种。该方法的对辛硫磷农药的检出限为0.010μg/mL，可用于家蚕体内辛硫磷含量的检测，不受家蚕品种、发育阶段以及中毒方式的限制，具有高效、准确的特点。

Description

一种家蚕体内辛硫磷残留量的检测方法

技术领域

本发明涉及一种农药残留量的检测方法，具体涉及一种家蚕体内辛硫磷残留量的检测方法。

背景技术

家蚕（Bombyx mori）属鳞翅目，蚕蛾科，是重要的经济昆虫，已经被驯养5700多年。经过长期的选择，家蚕形成了具有不同产丝性能的品种。由于家蚕长期在室内环境下饲养，其对化学农药的抗性较弱。生产上由于桑园用药不当或者农林生产过程中农药随空气扩散传播而导致家蚕中毒，已经成为近年来影响我国家蚕健康生产的重要因素。

另外，随着家蚕全基因组测序工作的完成，家蚕基因的功能都将从分子水平被阐明。以家蚕为昆虫研究模式，分析化学农药在鳞翅目昆虫体内的代谢残留特征以及昆虫对化学农药的解毒机制，已经成为研究昆虫和化学农药相互作用的重要途径。

辛硫磷是一种低毒有机磷杀虫剂，其杀虫谱广，击倒力强，以触杀和胃毒为主，无内吸作用，对鳞翅目幼虫很有效。适合于防治地下虫害，对虫卵也有一定的杀伤作用，对危害花生、小麦、水稻、棉花、玉米、果树、蔬菜、桑、茶等作物的多种鳞翅目害虫的幼虫有良好的作用效果。但该药施入土中，残留期很长。由于家蚕也是鳞翅目昆虫，因此，该农药的残留对于家蚕生产影响较大。

现有技术中，对于辛硫磷残留量的检测，主要针对谷类、蔬菜和水果进行，其方法是，将样本用石油醚（或石油醚/丙酮）避光浸提12小时左右，洗涤抽滤或回流处理，滤液中加硫酸钠水溶液，再用石油醚萃取，浓缩获得样品；将样品在富氢焰上燃烧，采用带光焰光度检测器的气相色谱仪进行检测。该方法操作过程复杂、检测时间长，不能快速获得检测结果。并且，目前尚未有对于家蚕体内的辛硫磷残留量进行检测的报道。

由于家蚕对化学农药非常敏感，不同剂量农药中毒以后的症状比较相似，所以不能准确从病症中进行诊断。为了准确诊断化学农药中毒后家蚕体内农药的残留量，迫切需要开发出具有针对性的化学农药检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种家蚕体内辛硫磷残留量的检测方法。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种家蚕体内辛硫磷残留量的检测方法，包括以下步骤：

（1）待测样本经甲醇或乙酸乙酯提取后在40℃～50℃烘干得到提取物；

（2）将提取物溶于乙腈，再用0.4μm～0.5 μm的滤膜过滤得到提取物溶液；

（3）以乙腈-水溶液作为流动相溶剂，利用高效液相色谱分析法对所述提取物溶液进行检测，得到辛硫磷残留量；

所述步骤（1）中的待测样本选自0.5ml～0.8ml家蚕个体血液、0.3g～0.6g经过匀浆处理后的去除肠道中内容物后的个体或者0.3g～0.6g家蚕各器官经过匀浆处理后的样本中的一种。

上述技术方案中，所述家蚕各器官包括中肠、脂肪体、丝腺、生殖腺、表皮、血液、脑、神经、马氏管。

优选的技术方案，所述步骤(2)中的滤膜孔径为0.45μm。

步骤(1)中的提取方法是，在待测样本中加入甲醇或乙酸乙酯，进行混匀处理后，以10000～12000转/分的转速离心处理10～15分钟，取上层清液，重复提取1～4次，合并上清液，40℃～50℃烘干得到提取物。

步骤（2）中对应每克待测样本乙腈的用量为0.5～1.5ml。

所述步骤(3)中，利用高效液相色谱分析法得到辛硫磷残留量的方法是，采用辛硫磷标准品由高效液相色谱分析获得不同辛硫磷浓度下对应的高效液相色谱检测到的辛硫磷对应峰的峰面积，制备标准曲线，对待测的提取物溶液进行高效液相色谱检测，获得其辛硫磷对应峰的峰面积，与标准曲线对比获得样品的辛硫磷残留量。其中，辛硫磷标准品可以采用辛硫磷稀释成不同浓度梯度的乙腈溶液制成。

采用上述技术方案，对辛硫磷残留量的检出限为0.010 μg/mL。

被检测家蚕没有品种、发育阶段的限制，其可以是人为添农药后用于药理分析的样本，也可以是由于桑叶用药残留导致中毒的样本。获取的待测样本如果不能及时检测，应存放于－20℃—－80℃避光保存。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点:

1．本发明提供了一种对家蚕体内的辛硫磷残留量进行检测的方法，对于指导家蚕生产进行家蚕抗毒机理研究具有积极的意义；

2．与现有技术中检测蔬菜水果中辛硫磷残留的方法相比，本发明采用高效液相色谱方法，取样时间短，检测速度快；

3．本发明的检测结果准确，辛硫磷检测限为0.010 μg/mL，能够满足药物残留定量的要求。

附图说明

图1是本发明实施例提供的辛硫磷标准品液相色谱图。

图2是本发明实施例提供的血液空白样品液相色谱图。

图3是实施例中辛硫磷内标样品液相色谱图。

图4是实施例中辛硫磷添毒样品液相色谱图。

图5是本发明实施例提供的辛硫磷的浓度与测试的峰面积之间的关系曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：家蚕体内血液中辛硫磷残留量的检测方法

⑴材料及设备：

家蚕品种为“苏秀×春丰”，采用桑叶育饲养至5龄第3天备用，农药采用辛硫磷标准品(sigma公司产品，编号：14816-18-3)，色谱级的甲醇、乙腈，分析纯乙酸乙酯、丙酮、正己烷均购自国药集团化学试剂有限公司。

高效液相色谱仪为日本岛津公司产品（LC-20A），包括SPD-20A紫外检测器、CTO-10AS柱温箱、LC-20AT泵；电热恒温干燥箱为上海秣马恒温设备厂（DGH-9023A），分析天平为日本岛津公司产品（AUY220型），色谱柱ODS C18为上海欢奥科技有限公司产品（150mm×4.6mm×5μm）。

⑵给药及采样：

采用常规饲养方法将家蚕饲养至5龄第3天，将辛硫磷农药稀释至1 μg/μL，取5 μl工作液分别涂布在0.5g的新鲜桑叶上，添食1头家蚕，设30头重复区。待桑叶食完后1h，采集血液0.5 mL，分别置于1.5 mL EP管中，做3个平行样，经4000 r/min离心5 min，分离出血清，保存于-80℃冰箱中。

⑶样品处理

0.5 mL血浆中加入甲醇0.5 mL，涡旋混匀1 min，12000 r/min离心15 min，取上层清液，重复提取一次，合并两次上清液，于45℃烘箱内烘干。残留物用1 mL乙腈溶解后过0.45 μm滤膜，取20 μL进行高效液相色谱分析。

⑷色谱条件的选择

流动相：乙腈-水溶液（体积比为7:3），流速：1 mL/min，柱温：30℃

进样量：20 μL，测定波长：282 nm

⑸辛硫磷标准液的配制

100 mg辛硫磷原液溶于1 mL丙酮，配制成100 mg/mL的辛硫磷原液，然后用乙腈稀释成1 000 μg/mL的标准贮备液，避光冷藏保存。取适量标准贮备液，用乙腈配制成0.1、0.5、1、2.5、5、10、20 μg/mL的系列标准工作液。

⑹标准曲线与最低检测限

取各浓度标准工作液，经0.45 μm滤膜过滤，取20 μL进样测定，每个系列进样3次，取平均峰面积值。以辛硫磷质量浓度X（μg/mL）为横坐标，以相应的峰面积Y为纵坐标绘制工作曲线，求得回归方程。以响应值与浓度变化的增量确定仪器的灵敏度，根据2倍噪音与灵敏度之比计算药物的检测限。

⑺分析方法评价

准确度指测定值（平均值）与真实值的接近程度，表示分析结果的正确性。采用标准添加法，在家蚕的血液中添加3个不同水平浓度的辛硫磷进行回收率试验。每个加标水平重复测定5次，同时作空白实验，以回收率大于95%为标准。

精密度指用方法重复测定同一均质样品所得的测定值彼此接近程度，表示分析结果的重复性，常用相对标准偏差（RSD）表示。

⑻方法验证

辛硫磷标准品色谱图参见附图1所示，从图中可以看出

辛硫磷标准品在282 nm下检测到的出峰时间是11.253 min。

特异性分析

通过测定空白样品，辛硫磷内标样品及添毒样品的色谱峰来检测辛硫磷在样品中的出峰情况，辛硫磷在血液中的出峰情况如图2-4所示，结果显示，血液空白样品在11 min左右没有出峰（图2），加标样品在11.186 min有一个明显的峰，即辛硫磷样品峰（图3）。喂食辛硫磷农药以后的脂肪体样品，在11.253 min处检测到辛硫磷峰（图4）。

如图5所示，为紫外检测器所检测到的峰面积与辛硫磷浓度的关系曲线，可见，辛硫磷在0.1～20μg/mL浓度范围内，辛硫磷的浓度值与响应峰面积值之间的相关系数为0.9985，呈良好的线性关系。辛硫磷检测限为0.010μg/mL，能够满足药物残留定量的要求。

样品加标回收率和相对标准偏差

采用标准添加法，在家蚕的血液、中肠、脂肪体、丝腺空白匀浆组织中添加3个不同水平浓度的辛硫磷进行回收率试验，每个加标水平重复测定5次。根据上述处理方法，样品的回收率都大于95%，相对标准偏差小于5%。回收率高，满足检测微量农药的需求，相对标准偏差较小，说明方法重现性好，是可以采用的。

⑼血液中辛硫磷含量

血液中在1 h时辛硫磷含量浓度为1.72 μg/mL。

实施例二：家蚕体内脂肪体中辛硫磷残留量的检测方法

采用常规饲养方法将家蚕饲养至5龄第3天，将辛硫磷农药稀释至1 μg/μL，取5μl工作液分别涂布在0.5g的新鲜桑叶上，添食1头家蚕，设30头重复区。待桑叶食完后1h，解剖取脂肪体保存于-80℃冰箱中。

精密称取0.3g脂肪体，研碎后各加入1mL乙酸乙酯，于高速匀浆机3 000 r/min匀浆5 min，10000r/min离心10min，取乙酸乙酯层，重复提取4次，合并乙酸乙酯层，于50℃烘箱内烘干。残留物用1mL乙腈溶解后过0.4μm滤膜，取20μL进行高效液相色谱分析。

采用实施例一同样的方法进行检测，1h时脂肪体中辛硫磷的浓度为2.24μg/mL。

实施例三：去除肠道中内容物后的个体中辛硫磷残留量的检测方法

采用常规饲养方法将家蚕饲养至5龄第3天，将辛硫磷农药稀释至1 μg/μL，取5μl工作液分别涂布在0.5g的新鲜桑叶上，添食1头家蚕，设30头重复区。待桑叶食完后1h，解剖去除肠道内容物后保存于-80℃冰箱中。

称取去除肠道中内容物后的个体重量，按照每0.3g，加入乙酸乙酯1mL，实称重量为1.5g，实际加入乙酸乙酯5 mL，于高速匀浆机3 000 r/min匀浆5 min，10000r/min离心10min，取乙酸乙酯层，重复提取4次，合并乙酸乙酯层，于50℃烘箱内烘干。残留物用5mL乙腈溶解后过0.4μm滤膜，取20μL进行高效液相色谱分析。

采用实施例一同样的方法进行检测，1h时去除肠道中内容物后的个体中辛硫磷的浓度为1.86μg/mL。

Claims

1.一种家蚕体内辛硫磷残留量的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的家蚕体内辛硫磷残留量的检测方法，其特征在于：所述家蚕各器官包括中肠、脂肪体、丝腺、生殖腺、表皮、血液、脑、神经、马氏管。

3.根据权利要求1所述的家蚕体内辛硫磷残留量的检测方法，其特征在于：所述步骤(2)中的滤膜孔径为0.45μm。

4.根据权利要求1所述的家蚕体内辛硫磷残留量的检测方法，其特征在于：步骤(1)中的提取方法是，在待测样本中加入甲醇或乙酸乙酯，进行混匀处理后，以10000～12000转/分的转速离心处理10～15分钟，取上层清液，重复提取1～4次，合并上清液，40℃～50℃烘干得到提取物。

5.根据权利要求1所述的家蚕体内辛硫磷残留量的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中，利用高效液相色谱分析法得到辛硫磷残留量的方法是，采用辛硫磷标准品由高效液相色谱分析获得不同辛硫磷浓度下对应的高效液相色谱检测到的辛硫磷对应峰的峰面积，制备标准曲线，对待测的提取物溶液进行高效液相色谱检测，获得其辛硫磷对应峰的峰面积，与标准曲线对比获得样品的辛硫磷残留量。

6.根据权利要求1所述的家蚕体内辛硫磷残留量的检测方法，其特征在于：步骤（2）中对应每克待测样本乙腈的用量为0.5～1.5ml。