CN108254342A - 基于激光诱导荧光技术的真菌毒素高灵敏快速检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于激光诱导荧光技术的真菌毒素高灵敏快速检测方法，包括将样品初提后经免疫亲和柱净化除杂，再采用激光诱导荧光检测器检测样品中的真菌毒素的信号强度，根据标准曲线求得该样品中的真菌毒素含量，其中，所述激光诱导荧光检测器的检测条件为激发波长260‑410nm，发射波长450‑510nm。本发明具有便捷、灵敏、准确、检测成本低等优点。
Description
技术领域
本发明涉及真菌毒素检测领域。更具体地说，本发明涉及一种基于激光诱导荧光技术的真菌毒素高灵敏快速检测方法。
背景技术
真菌毒素是真菌生长繁殖过程中产生的次级代谢物，主要污染粮食及油料作物，造成产品品质下降和严重的经济损失。目前粮油作物及以此为原料加工的食品和饲料中普遍存在的外源性污染毒素主要有黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素等。特别在饲料中，真菌毒素的污染还相当严重。由于真菌毒素具有性质稳定、熔点高、可溶性小、毒性强等特点，粮油原料一旦被污染，利用常规的加工技术很难去除，残留在粮油食品和饲料中的毒素，最终通过食物链传递严重危及食品安全。真菌毒素污染已成为危害食品安全的主要因素之一。
目前真菌毒素检测方法主要包括免疫分析法、色谱分析法和光谱分析法等。免疫检测方法虽然能实现对主要真菌毒素的快速测定，但是在检测结果的重现性、稳定性和准确性上存在不足。薄层层析法经济实用，但精确度低。色谱检测方法虽然准确、可靠，但是设备昂贵、检测成本高、不能满足大量样品快速检测的要求。荧光光度法常结合免疫亲和净化，能够定性或定量分析真菌毒素，具有方便、快捷、灵敏度高的特点，是AOAC国际组织和我国出入境检验检疫行业通常使用的标准检测方法，但检测过程中干扰大，需要进行衍生处理。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种基于激光诱导荧光技术的真菌毒素高灵敏快速检测方法，该方法便捷、灵敏、准确，且检测成本低，适用于粮油食品与饲料中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素含量的测定，可满足生产过程监控、现场检测和快速筛查需要。
为了实现根据本发明的目的和其它优点，提供了一种基于激光诱导荧光技术的真菌毒素高灵敏快速检测方法，包括将样品初提后经免疫亲和柱净化除杂，再采用激光诱导荧光检测器检测样品中的真菌毒素的信号强度，根据标准曲线求得该样品中的真菌毒素含量，其中，所述激光诱导荧光检测器的检测条件为激发波长260-410nm，发射波长450-510nm。
优选的是，所述的基于激光诱导荧光技术的真菌毒素高灵敏快速检测方法，其具体包括以下步骤：
步骤一、取5-25g粉碎后的样品，向其加入2-10g的氯化钠、20-120ml体积浓度为40％-90％的甲醇或乙腈水溶液，高速搅拌，得混合液；
步骤二、将所述混合液用滤纸过滤后，取10-30ml所得滤液，向其加入40-80ml去离子水稀释后，再用玻璃纤维纸过滤至液体澄清，得样品稀释液；
步骤三、将免疫亲和柱与容量为50ml的注射器的针管连接，并向注射器中的针筒中加入10-30ml的所述样品稀释液，调节针筒内的压力，使样品稀释液以流速2-10mL/min通过免疫亲和柱的柱体，直至2-3mL空气通过柱体，然后用5-20mL去离子水淋洗柱体两次，弃去全部流出液，并使2-3mL空气通过柱体，最后加入1-5ml的色谱级甲醇溶液洗脱，调节针筒内的压力，使色谱级甲醇溶液以流速1-5mL/min通过柱体，收集全部洗脱液，得待测液；
步骤四、用色谱级甲醇溶液配制一系列包含待检测真菌毒素的标准溶液，采用激光诱导荧光检测器，于激发波长260-410nm，发射波长450-510nm条件下，检测所述标准溶液中的真菌毒素，建立相应的标准曲线；
步骤五、采用激光诱导荧光检测器，以色谱级甲醇溶液为空白组，以制备对应真菌毒素标准曲线时的检测条件对所述待测液进行检测，并根据对应的标准曲线，将检测值进行换算，得出样品中的对应真菌毒素的实际含量。
优选的是，所述的基于激光诱导荧光技术的真菌毒素高灵敏快速检测方法，在所述步骤五中，采用激光诱导荧光检测器检测时，根据待检测的真菌毒素的标准曲线，选用一系列的硫酸奎宁标准溶液对所述激光诱导荧光检测器进行标定。
优选的是，所述的基于激光诱导荧光技术的真菌毒素高灵敏快速检测方法，所述样品包括粮油食品和饲料。
优选的是，所述的基于激光诱导荧光技术的真菌毒素高灵敏快速检测方法，所述真菌毒素为黄曲霉毒素、赭曲霉毒素或玉米赤霉烯酮。
优选的是，所述的基于激光诱导荧光技术的真菌毒素高灵敏快速检测方法，所述免疫亲和柱为黄曲霉毒素免疫亲和柱、赭曲霉毒素免疫亲和柱或玉米赤霉烯酮免疫亲和柱，所述免疫亲和柱与待检测真菌毒素一一对应。
本发明至少包括以下有益效果：
第一、本发明以激光诱导荧光技术为核心，采用高速搅拌提取、免疫亲和净化、激光诱导荧光检测实现真菌毒素的现场及实验室检测，所建方法具有前处理程序简单，简便快速，准确可靠，灵敏度高，重现性好，安全无污染等优点，能够满足粮油食品与饲料中黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素现场检测需要；
第二、现场检测时采用硫酸奎宁进行标定，与采用真菌毒素标定相比，实验操作条件要求低，对操作人员的健康危害小；
第三、采用本发明的方法样品检测实验周期约2小时，成本在60-80元/样，而采用国标方法样品检测实验周期约3小时，成本在100-120元/样。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1是根据本发明一个实施例所述的激光诱导荧光检测器的结构示意图；
图2是根据本发明一个实施例的流程框图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得；在本发明的描述中，术语“横向”、“纵向”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，并不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
如图1所示，本发明使用到的真菌毒素快速检测器，主要包括光源1、荧光探头2、光栅光谱仪3。其中，光源1发射激光使真菌毒素产生本征荧光，通过荧光探头2收集荧光，并由光栅光谱仪3将其转化成数字信号，经计算机4处理获得结果。本征荧光是指真菌毒素分子在特定波长光激发下发出特征荧光，通过检测本征荧光信号强度能够对真菌毒素进行定量分析。
如图2所示，本发明所述的基于激光诱导荧光技术的真菌毒素高灵敏快速检测方法，其具体包括以下步骤：
步骤一、取5-25g粉碎后的粮油食品和饲料，向其加入2-10g的氯化钠、20-120ml体积浓度为40％-90％的甲醇或乙腈水溶液，高速搅拌，得混合液；
步骤二、将所述混合液用滤纸过滤后，取10-30ml所得滤液，向其加入40-80ml去离子水稀释后，再用玻璃纤维纸过滤至液体澄清，得样品稀释液；
步骤三、将待检测真菌毒素对应的免疫亲和柱与容量为50ml的注射器的针管连接，并向注射器中的针筒中加入10-30ml的所述样品稀释液，调节针筒内的压力，使样品稀释液以流速2-10mL/min通过免疫亲和柱的柱体，直至2-3mL空气通过柱体，然后用5-20mL去离子水淋洗柱体两次，弃去全部流出液，并使2-3mL空气通过柱体，最后加入1-5ml的色谱级甲醇溶液洗脱，调节针筒内的压力，使色谱级甲醇溶液以流速1-5mL/min通过柱体，收集全部洗脱液，得待测液；
步骤四、用色谱级甲醇溶液配制一系列包含待检测真菌毒素的标准溶液，采用激光诱导荧光检测器，于激发波长260-410nm，发射波长450-510nm条件下，检测所述标准溶液中的真菌毒素，建立相应的标准曲线；其中，黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素标准溶液配制(溶剂为色谱级甲醇溶液)、测量结果和线性方程见下表；
步骤五、采用激光诱导荧光检测器，根据待检测的真菌毒素的标准曲线，选用一系列的硫酸奎宁标准溶液(溶剂为色谱级甲醇溶液)对所述激光诱导荧光检测器进行标定，然后以色谱级甲醇溶液为空白组，以制备对应真菌毒素标准曲线时的检测条件对所述待测液进行检测，并根据对应的标准曲线，将检测值进行换算，得出样品中的对应真菌毒素的实际含量；其中，硫酸奎宁标准溶液浓度与黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素标准溶液浓度的信号强度的对应关系见下表。
实施例1：
称取5g食用油试样放入搅拌杯中，加入2-5g氯化钠及20mL体积浓度为50％-80％的甲醇-水溶液或60-90％的乙腈-水溶液，混匀后高速搅拌，经滤纸过滤后移取10mL滤液并加入40mL去离子水稀释，用玻璃纤维纸过滤至滤液澄清，备用。将黄曲霉毒素免疫亲和柱连接于50ml注射器下方的针管上，移取25mL样品稀释液，调节压力使溶液以2-10mL/min流速通过免疫亲和柱，直至2-3mL空气通过柱体，然后以5-20mL水淋洗柱子两次，弃去全部流出液，并使2-3mL空气通过柱体，最后加入1mL色谱级甲醇溶液洗脱，控制流速为1-3mL/min，收集全部洗脱液至透明小瓶中。将透明小瓶置于已用硫酸奎宁标定好的激光诱导荧光检测器中读数，扣除色谱级甲醇溶液的空白信号后所得测量值为6537counts，其中，激发波长设定范围为260-410nm，发射波长设定范围为450-510nm，该测量值通过标准曲线换算得到食用油样品中黄曲霉毒素实际含量为1.68μg/kg。采用GB5009.22-2016《食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》液相色谱法测定相同样品，食用油中黄曲霉毒素含量检测值为1.75μg/kg。说明本发明检测结果和国标方法检测结果基本一致，在国标允许误差范围内，准确可靠。
实施例2：称取1.5kg花生，用高速粉碎机将其粉碎，过筛，使其粒径小于2mm孔径试验筛，混合均匀后缩分至100g。称取25g花生试样放入搅拌杯中，加入120mL体积浓度为60％-90％的甲醇-水溶液或乙腈-水溶液，混匀后高速搅拌，经滤纸过滤后移取20mL滤液并加入30mL水稀释，用玻璃纤维纸过滤至滤液澄清，备用。将黄曲霉毒素免疫亲和柱连接于50ml注射器下方的针管上，移取15mL样品稀释液，调节压力使溶液以2-10mL/min流速通过免疫亲和柱，直至2-3mL空气通过柱体，然后以5-20mL水淋洗柱子两次，弃去全部流出液，并使2-3mL空气通过柱体，最后加入2mL色谱级甲醇洗脱，控制流速为1-3mL/min，收集全部洗脱液至透明小瓶中。将透明小瓶置于已用硫酸奎宁标定后的激光诱导荧光检测器中读数，扣除色谱级甲醇溶液的空白信号后所得测量值为10365counts，其中，激发波长设定范围为260-410nm，发射波长设定范围为450-510nm，该测量值通过标准曲线换算得到花生中黄曲霉毒素实际含量为5.12μg/kg。采用GB 5009.22-2016《食品中黄曲霉毒素B族和G族的测定》液相色谱法测定相同样品，花生中黄曲霉毒素含量检测值为5.06μg/kg。说明本发明检测结果和国标方法检测结果基本一致，在国标允许误差范围内，准确可靠。
实施例3：称取1kg猪饲料，用四分法缩减取200g，高速粉碎机将其粉碎，过筛，使其粒径小于0.45mm孔径试验筛，混合均匀。称取25g饲料试样放入搅拌杯中，加入2-5g氯化钠及100mL体积浓度为50％-80％的甲醇-水溶液或60-90％的乙腈-水溶液，混匀后高速搅拌，经滤纸过滤后移取20mL滤液并加入40mL水稀释，用玻璃纤维纸过滤至滤液澄清，备用。将黄曲霉毒素免疫亲和柱连接于50ml注射器下方的针管上，移取10mL样品稀释液，调节压力使溶液以2-10mL/min流速通过免疫亲和柱，直至2-3mL空气通过柱体，然后以5-20mL水淋洗柱子两次，弃去全部流出液，并使2-3mL空气通过柱体，最后加入1mL色谱级甲醇洗脱，控制流速为1-3mL/min，收集全部洗脱液至透明小瓶中。将透明小瓶置于已用硫酸奎宁标定后的激光诱导荧光检测器中读数，扣除色谱级甲醇溶液的空白信号后所得测量值为30492counts，其中，激发波长设定范围为260-410nm，发射波长设定范围为450-510nm，该测量值通过标准曲线换算得到猪饲料中黄曲霉毒素实际含量为8.62μg/kg。采用GB/T 30955-2014《饲料中黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2的测定免疫亲和柱净化-高效液相色谱法》液相色谱法测定相同样品，猪饲料中黄曲霉毒素含量检测值为8.76μg/kg。说明本发明检测结果和国标方法检测结果基本一致，在国标允许误差范围内，准确可靠。
实施例4：称取25g小麦粉试样放入搅拌杯中，加入2-5g氯化钠及100mL体积浓度为50％-80％的甲醇-水溶液或乙腈-水溶液，混匀后高速搅拌，经滤纸过滤后移取10mL滤液并加入40mL水稀释，用玻璃纤维纸过滤至滤液澄清，备用。将赭曲霉毒素A免疫亲和柱连接于50ml注射器下方的针管上，移取20mL样品稀释液，调节压力使溶液以2-10mL/min流速通过免疫亲和柱，直至2-3mL空气通过柱体，然后以5-20mL水淋洗柱子两次，弃去全部流出液，并使2-3mL空气通过柱体，最后加入1mL色谱级甲醇洗脱，控制流速为1-3mL/min，收集全部洗脱液至透明小瓶中。将透明小瓶置于已用硫酸奎宁标定后的激光诱导荧光检测器中读数，扣除色谱级甲醇溶液的空白信号后所得测量值为3601counts，其中，激发波长设定范围为260-410nm，发射波长设定范围为450-510nm，该测量值通过标准曲线换算得到小麦粉中赭曲霉毒素A实际含量为1.25μg/kg。采用GB 5009.96-2016《食品安全国家标准食品中赭曲霉毒素A的测定》液相色谱法测定相同样品，小麦粉中赭曲霉毒素含量检测值为1.28μg/kg。说明本发明检测结果和国标方法检测结果基本一致，在国标允许误差范围内，准确可靠。
实施例5：称取1.5kg玉米，用四分法缩减取200g，高速粉碎机将其粉碎，过筛，使其粒径小于2mm孔径试验筛，混合均匀。称取20g玉米粉试样放入搅拌杯中，加入2-5g氯化钠及80mL浓度为60-90％的甲醇-水溶液或乙腈-水溶液，混匀后高速搅拌，经滤纸过滤后移取15mL滤液并加入45mL水稀释，用玻璃纤维纸过滤至滤液澄清，备用。将玉米赤霉烯酮免疫亲和柱连接于50ml注射器下方的针管上，移取20mL样品稀释液，调节压力使溶液以2-10mL/min流速通过免疫亲和柱，直至2-3mL空气通过柱体，然后以5-20mL水淋洗柱子两次，弃去全部流出液，并使2-3mL空气通过柱体，最后加入1mL色谱级甲醇洗脱，控制流速为1-3mL/min，收集全部洗脱液至透明小瓶中。将透明小瓶置于已用硫酸奎宁标定后的激光诱导荧光检测器中读数，扣除色谱级甲醇溶液的空白信号后所得测量值为495counts，其中，激发波长设定范围为260-410nm，发射波长设定范围为450-510nm，该测量值通过标准曲线换算得到样品中玉米赤霉烯酮实际含量为38.91μg/kg。采用GB5009.209-2016《食品安全国家标准食品中玉米赤霉烯酮的测定》液相色谱法测定相同样品，玉米中玉米赤霉烯酮毒素含量检测值为40.02μg/kg。说明本发明检测结果和国标方法检测结果基本一致，在国标允许误差范围内，准确可靠。
实施例6：称取20g空白玉米粉试样，滴加10ng/μL玉米赤霉烯酮标准溶液10μL，晾干后放入搅拌杯中，加入2-5g氯化钠及80mL体积浓度为60-90％的甲醇-水溶液或乙腈-水溶液，混匀后高速搅拌，经滤纸过滤后移取15mL滤液并加入45mL水稀释，用玻璃纤维纸过滤至滤液澄清，备用。将玉米赤霉烯酮免疫亲和柱连接于50ml注射器下方的针管上，移取20mL样品稀释液，调节压力使溶液以2-10mL/min流速通过免疫亲和柱，直至2-3mL空气通过柱体，然后以5-20mL水淋洗柱子两次，弃去全部流出液，并使2-3mL空气通过柱体，最后加入1mL色谱级甲醇洗脱，控制流速为1-3mL/min，收集全部洗脱液至透明小瓶中。将透明小瓶置于已用硫酸奎宁标定后的激光诱导荧光检测器中读数，扣除色谱级甲醇溶液的空白信号后所得测量值为52counts，其中，激发波长设定范围为260-410nm，发射波长设定范围为450-510nm，根据信噪比计算该测量值对应样品中玉米赤霉烯酮含量约为4μg/kg。采用GB5009.209-2016《食品安全国家标准食品中玉米赤霉烯酮的测定》液相色谱法测定相同样品，结果为未检出。说明本发明的检测方法的检出限更低，灵敏度高。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (6)
1.基于激光诱导荧光技术的真菌毒素高灵敏快速检测方法，其特征在于，包括将样品初提后经免疫亲和柱净化除杂，再采用激光诱导荧光检测器检测样品中的真菌毒素的信号强度，根据标准曲线求得该样品中的真菌毒素含量，其中，所述激光诱导荧光检测器的检测条件为激发波长260-410nm，发射波长450-510nm。
2.如权利要求1所述的基于激光诱导荧光技术的真菌毒素高灵敏快速检测方法，其特征在于，其具体包括以下步骤：
步骤一、取5-25g粉碎后的样品，向其加入2-10g的氯化钠、20-120ml体积浓度为40％-90％的甲醇或乙腈水溶液，高速搅拌，得混合液；
步骤二、将所述混合液用滤纸过滤后，取10-30ml所得滤液，向其加入40-80ml去离子水稀释后，再用玻璃纤维纸过滤至液体澄清，得样品稀释液；
步骤三、将免疫亲和柱与容量为50ml的注射器的针管连接，并向注射器中的针筒中加入10-30ml的所述样品稀释液，调节针筒内的压力，使样品稀释液以流速2-10mL/min通过免疫亲和柱的柱体，直至2-3mL空气通过柱体，然后用5-20mL去离子水淋洗柱体两次，弃去全部流出液，并使2-3mL空气通过柱体，最后加入1-5ml的色谱级甲醇溶液洗脱，调节针筒内的压力，使色谱级甲醇溶液以流速1-5mL/min通过柱体，收集全部洗脱液，得待测液；
步骤四、用色谱级甲醇溶液配制一系列包含待检测真菌毒素的标准溶液，采用激光诱导荧光检测器，于激发波长260-410nm，发射波长450-510nm条件下，检测所述标准溶液中的真菌毒素，建立相应的标准曲线；
步骤五、采用激光诱导荧光检测器，以色谱级甲醇溶液为空白组，以制备对应真菌毒素标准曲线时的检测条件对所述待测液进行检测，并根据对应的标准曲线，将检测值进行换算，得出样品中的对应真菌毒素的实际含量。
3.如权利要求2所述的基于激光诱导荧光技术的真菌毒素高灵敏快速检测方法，其特征在于，在所述步骤五中，采用激光诱导荧光检测器检测时，根据待检测的真菌毒素的标准曲线，选用一系列的硫酸奎宁标准溶液对所述激光诱导荧光检测器进行标定。
4.如权利要求2所述的基于激光诱导荧光技术的真菌毒素高灵敏快速检测方法，其特征在于，所述样品包括粮油食品和饲料。
5.如权利要求2所述的基于激光诱导荧光技术的真菌毒素高灵敏快速检测方法，其特征在于，所述真菌毒素为黄曲霉毒素、赭曲霉毒素或玉米赤霉烯酮。
6.如权利要求2所述的基于激光诱导荧光技术的真菌毒素高灵敏快速检测方法，其特征在于，所述免疫亲和柱为黄曲霉毒素免疫亲和柱、赭曲霉毒素免疫亲和柱或玉米赤霉烯酮免疫亲和柱，所述免疫亲和柱与待检测真菌毒素一一对应。
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