CN109085273B

CN109085273B - 化妆品12种直接染料的高效液相色谱同时分离检测方法

Info

Publication number: CN109085273B
Application number: CN201811201089.2A
Authority: CN
Inventors: 潘城; 高宇; 游飞明; 谢勇; 胡朝阳; 黄永辉
Original assignee: FUJIAN INSPECTION AND RESEARCH INSTITUTE FOR PRODUCT QUALITY
Current assignee: FUJIAN INSPECTION AND RESEARCH INSTITUTE FOR PRODUCT QUALITY
Priority date: 2018-07-10
Filing date: 2018-10-16
Publication date: 2021-03-23
Anticipated expiration: 2038-10-16
Also published as: CN109085273A

Abstract

本发明公开了化妆品中12种直接染料的高效液相色谱同时分离检测方法，所述的12种直接染料为直接红80、直接蓝6、直接蓝1、直接紫48、直接红81、直接红23、直接红28、直接橙39、直接棕95、直接黑51、直接黄12、直接黑38。方法包括如下步骤：(1)制备混合标准储备液和混合标准工作液；(2)制备待测样品溶液；(3)高效液相色谱分析条件；(4)建立标准工作曲线；(5)结果分析。本方法建立了化妆品中12种直接染料含量同时测定的高效液相色谱法。

Description

化妆品12种直接染料的高效液相色谱同时分离检测方法

技术领域

本发明涉及化妆品中12种直接染料的高效液相色谱同时分离检测方法。

背景技术

着色剂可赋予化妆品美丽的颜色，对化妆品起到美化、修饰的作用，因此在很多化妆品尤其是彩妆产品中得到了广泛的应用。但是化妆品中使用的着色剂多数是合成工业染料，可引起眼睛、口腔、皮肤等器官发炎，影响人体内分泌和生殖系统，甚至诱发癌症，长期或过量使用会对人体健康产生潜在的危害。直接染料类着色剂是工业合成染料中一大类活性较强的染料，由于大多数为偶氮类结构，具有致癌、致突变作用，直接染料品种被禁用数量居各染料品种之首。近年来，世界范围内都在持续致力于开发利用各种天然或功能性材料来吸附降解环境中的直接染料类化合物，以降低其对环境和人体的风险。欧盟和我国也相继出台了化妆品中直接染料的禁准用规定。欧盟化妆品法规（EC）No1223/2009禁用组分列表中涉及的直接染料类着色剂有直接黄12（第1264条），直接红81（第1267条），直接红80（第1270条），直接红 23（第1269条），直接黑51（第1266条），直接红28（第986条）、直接黑38（第987条），直接棕95（第991条）和直接蓝6（第988条），直接紫48（第1268条），准用表中涉及的有直接橙39（第54条），直接橙39专用于仅和皮肤暂时接触的化妆品。我国《化妆品安全技术规范》（2015年版）禁用列表中涉及的直接染料有直接黄12（第67条），直接红81（第123条），直接红80（第124条），直接红 23（第136条），直接黑51（第159条），直接红28（第503条）、直接黑38（第504条），直接棕95（第505条）和直接蓝6（第1225条），直接紫48（第1290条），准用表中涉及的有直接橙39（第53条），直接橙39专用于仅和皮肤暂时接触的化妆品。

目前对直接染料类着色剂的检测方法大多采用分光光度法、液质联用法、高效液相色谱法。分光光度法测定灵敏度较差，同时无法对多种直接染料分别定量分析，液质联用仪仪器昂贵，检测成本较高，难以普及应用，高效液相色谱已被大量应用于工业合成染料的检测中，具有检测成本低，适合高通量分析，定量准确可靠等优点。当前，直接染料类着色剂研究主要集中在食品、纺织品、水体等领域，且只针对一种或几种直接染料进行分析，无法满足现代分析高通量筛查的需求，同时化妆品中多种禁准用直接染料类着色剂的高通量分析检测方法还未见文献报道，这使得化妆品尤其是彩妆类化妆品的质量安全引发社会的广泛关注。

发明内容

本发明的目的在于提供化妆品中12种直接染料的同时分离检测方法，为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：该方法是一种能够实现化妆品中12种直接染料的同时分离检测方法，其主要特点是，所述的12种直接染料类着色剂包括直接红80、直接蓝6、直接蓝1、直接紫48、直接红81、直接红23、直接红28、直接橙39、直接棕95、直接黑51、直接黄12、直接黑38，所述的检测方法包括如下步骤：

（1）制备混合标准储备液和混合标准工作液，所述混合标准储备液为浓度从490mg/L到4077 mg/L混标储备液，混合标准工作液为从0.245 mg/L到408 mg/L之间的8个系列混合标准工作溶液；

（2）制备待测样品溶液：若化妆品样品为膏状、粉状等固体样品以及指甲油等，则加入三氯甲烷涡旋溶解分散样品，随后加入0.02 mol/L的乙酸铵溶液（pH=9.0）液液萃取5min，离心后，取上层水相溶液过膜，滤液供液相色谱测定；若样品为水状液体样品，加入0.02 mol/L的乙酸铵溶液（pH=9.0）稀释定容至10 mL，混匀，过膜，滤液供液相色谱测定。

（3）所用仪器为高效液相色谱仪，检测器为光电二极管阵列检测器,色谱柱为反相C18柱，柱温为35±1 ℃，选择625nm作为直接蓝6、直接蓝1、直接黑51、直接黑38的检测波长，选择404nm作为直接黄12的检测波长；选择508nm作为直接红80、直接紫48、直接红81、直接红23、直接红28、直接橙39、直接棕95的检测波长;流动相A为乙腈，流动相B为0.02 mol/L乙酸铵水溶液（pH=9.0）；洗脱梯度程序: 0 ～ 3 min，3%A；3 ～ 15 min，3% ～ 30%A；15～ 30 min，30% ～ 38%A；30 ～ 35 min，38%～ 60%A；35.0 ～ 35.1 min，60%～ 3%A；35.1～ 40 min，3%A；流速：1. 0 mL /min；进样量：20 μL。

（4）标准曲线的绘制：将12种直接染料的系列混合标准工作溶液注入高效液相色谱仪中，在步骤（3）的色谱条件下进行梯度洗脱和检测，以保留时间定性，根据各浓度所测峰面积的大小与其浓度的对应关系绘制标准曲线。

（5）结果分析：取（2）中滤液注入高效液相色谱仪中，在步骤（3）的色谱条件下进行梯度洗脱和检测，测得滤液中各目标物的峰面积，以保留时间定性，根据（4）中制作的标准曲线定量，计算出待测样品中各直接染料的含量。

与现有技术相比较，本发明具有以下突出优点：

1.本发明填补了化妆品中直接染料检测领域空白，考虑到直接染料类目标物多达12种，不同直接染料对于pH值的敏感性不同，同时其最大吸收波长也不同，选择C18柱为固定相，不断优化流动相的pH值以及选择不同组的吸收波长，通过创造性的研究得出适合本发明直接染料分离的色谱条件，使得各直接染料类目标物能够完全分离，同时获得最佳峰型和灵敏度。

2.本发明采用三氯甲烷分散溶解化妆品样品后液液萃取其中的直接染料类着色剂，不仅能充分释放出样品中的直接染料类化合物，而且避免了更多干扰成分的带入，抗干扰能力强。

3.本发明针对的直接染料目标物多达12种，完全覆盖化妆品中规定的禁限用直接染料，完全满足化妆品监管需要。

4.本发明可对多达12种直接染料目标物进行高通量分析，同时前处理操作简单高效，可以大大缩短检测周期，提高检测效率。

5.本发明所使用的分析仪器为高效液相色谱仪配备光电二极管阵列检测器，相对于液质联用仪等造价高昂的仪器，更加易于方法普及和推广应用。同时又能克服分光光度计灵敏度较差，无法对多种直接染料分别定量分析的缺点

6.本发明弥补了目前尚无化妆品中禁限用直接染料含量检测方法的不足之处，使得该方法能够针对化妆品中多种禁限用直接染料含量进行高通量准确分析，检测的直接染料多达12种且前处理操作简单、抗干扰能力强，适合多批次化妆品高通量分析检测，具有操作效率高，灵敏度高和高通量等特点，适用于化妆品中直接染料的日常检测。

同时前处理快速简便，易于操作。

附图说明

图1为本发明的化妆品中12种直接染料的同时分离检测方法的混合标准溶液高效液相色谱分离图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。本实施案例在以本发明技术为前提下进行实施，现给出详细胡实施方式和具体的操作过程，来说明本发明具有创造性，但本发明的保护范围不限于以下的实施例。

实施例

1 试剂和材料

除特别说明外，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的二级水。

1.1 乙腈：色谱纯。

1.2 乙酸铵、三氯甲烷：优级纯。

1.3 直接染料标准品：直接红28（direct red 28，纯度98%），直接棕95（directbrown 95，纯度100%），直接蓝6（direct blue 6，纯度100%），直接黑38（direct black 38，纯度98%），直接黄12（direct yellow 12，纯度100%），直接红80（direct red 80，纯度100%），直接蓝1（direct blue 1，纯度100%），直接红81（direct red 81，纯度98%），直接红23（direct red 23，纯度99%），直接橙39（direct orange 39，纯度100%），直接黑51（directblack 51，纯度95%），直接紫48（direct violet 48，纯度98%）。

1.4 12种染料混标储备液的配制：称取适量各染料标准品，置于100 mL容量瓶中，用0.02mol/L 乙酸铵水溶液（pH=9.0）溶解并定容至刻度，配制成490 mg/L到4077 mg/L混标储备液。4℃保存，可使用3个月。

1.5 12种染料混合标准工作溶液的配制：将混合标准储备液采用逐级稀释的方法，用0.02mol/L乙酸铵水溶液（pH=9.0）配制浓度从0.245 mg/L到408 mg/L之间的8个系列混合标准工作溶液，标准储备液和系列标准工作溶液均置于冰箱中0 ℃ ~ 4 ℃温度下保存，可使用1个月。

2 仪器和设备

2.1高效液相色谱仪：配有二极管阵列检测器。

2.2分析天平：感量0.0001 g和感量0.01 g。

2.4超声波发生器：功率大于180 W。

2.5离心机：转速不低于4000 r/min；。

2.6 PTFE滤膜：0.20 μm。

3 方法

3.1 高效液相色谱条件

a) 色谱柱：XB-C18柱，5 μm，150 mm×4.6 mm；

b）流动相：流动相：A，乙腈；B，0.02mol/L 乙酸铵水溶液（pH=9.0）。梯度洗脱程序0～ 3 min，3%A；3 ～ 15 min，3% ～ 30%A；15 ～ 30 min，30% ～ 38%A；30 ～ 35 min，38%～ 60%A；35.0 ～ 35.1 min，60%～ 3%A；35.1 ～ 40 min，3%A；

c）流速：1.0 mL/min；

d）柱温：35 ℃；

e) 进样量：20 μL；

f）光电二极管阵列检测器的检测条件：检测波长：选择625nm作为直接蓝6，直接蓝1，直接黑51，直接黑38的检测波长，选择404nm作为直接黄12的检测波长；选择508nm作为直接红80，直接紫48，直接红81，直接红23，直接红28，直接橙39，直接棕95的检测波长

3.2 标准曲线绘制

分别取混合标准工作溶液（1.5），按照3.1的色谱条件进行色谱测定。以各分析物的峰面积（Y）对相应的质量浓度（X，mg /L）进行线性回归绘制标准曲线，得到线性回归方程。

4 样品测试步骤

4.1样品前处理

4.1.1 膏状、粉状等固体样品以及指甲油等

称取试样1.0 g（精确至0.0001 g）于50 mL螺纹盖离心管中（口红等膏状样品用玻璃棒均匀涂抹在离心管底部），加入25 mL的三氯甲烷涡旋溶解分散样品，随后加入0.02mol/L的乙酸铵溶液（pH=9.0）10 mL液液萃取5 min，经10000 r/min离心5 min后，取上层水相溶液过0.20μmPTFE滤膜，滤液供液相色谱测定。

4.1.2 水状液体样品

称取试样1.0 g（精确至0.0001 g）于25mL具塞比色管中，用0.02 mol/L的乙酸铵溶液（pH=9.0）稀释定容至10 mL，混匀，过0.20μmPTFE滤膜，滤液供液相色谱测定。

4.4 试液测定

在相同胡色谱条件下，将制备的试样溶液进行色谱测定，以保留时间定性，以外标法定量。

5 分析结果的表述

试样中12种染料的含量按下式（1）计算：

X＝

（1）

式中：

X——试样中染料的含量，单位为微克每克（µg /g）；

C _i——试液的进样浓度，单位为毫克每升（mg/L）；

V——试样定容体积，单位为毫升（mL）；

m——试样质量，单位为克（g）。

以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

6方法学考察，其中包括线性、检测限、定量限、回收率、精密度。

6.1线性、检测限、定量限：配制混合标准系列溶液，以各分析物的峰面积（Y）对相应的质量浓度（X，mg /L）绘制标准曲线，得到线性回归方程，经逐级稀释法检测各直接染料的含量，计算检出限（信噪比S/N =3）及定量限（S/N = 10）。12种直接染料的线性方程、线性范围、相关系数、检出限及定量限见表1。结果表明，在各目标物质量浓度范围内，12 种染料的线性关系良好，相关系数（r）不小于0.9994，检出限不大于1.7 µg /g，定量限不大于5.6 µg /g。

表1 12种直接染料的线性方程、线性范围、线性系数、检出限及定量下限

Y : 峰面积; X : 质量浓度, mg/L.

6.2回收率和精密度：以空白基质样品进行3个水平加标回收实验，在优化后的测试条件下，每个水平平行测定6 次，平均加标回收率为85. 6%～113.4%，相对标准偏差（RSD）为0.96%～7.7%（见表2）。结果表明，该方法具有良好的精密度和准确度，可用于化妆品中直接染料的日常分析检测。

表2 空白基质样品中12种分析物平均加标回收率及其相对标准偏差（n=6）

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照校佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.化妆品中12种直接染料的高效液相色谱同时分离检测方法，其特征在于, 所述的12种直接染料为直接红80、直接蓝6、直接蓝1、直接紫48、直接红81、直接红23、直接红28、直接橙39、直接棕95、直接黑51、直接黄12、直接黑38；所述的检测方法包括如下步骤：

a、制备混合标准储备液和混合标准工作溶液，所述混合标准储备液为浓度从490 mg/L到4077 mg/L混合标准储备液，混合标准工作液为从0.245 mg/L到408 mg/L之间的8个系列混合标准工作溶液；

b、制备待测样品溶液：若化妆品样品为膏状、粉状固体样品以及指甲油，则加入三氯甲烷涡旋溶解分散样品，随后加入0.02 mol/L的乙酸铵溶液,pH=9.0,液液萃取5 min，离心后，取上层水相溶液过膜，滤液供液相色谱测定；若样品为水状液体样品，加入0.02 mol/L的乙酸铵溶液,pH=9.0,稀释定容至10 mL，混匀，过膜，滤液供液相色谱测定;

c、所用仪器为高效液相色谱仪，检测器为光电二极管阵列检测器,色谱柱为反相C18柱，柱温为35±1 ℃，选择625nm作为直接蓝6、直接蓝1、直接黑51、直接黑38的检测波长，选择404nm作为直接黄12的检测波长；选择508nm作为直接红80、直接紫48、直接红81、直接红23、直接红28、直接橙39、直接棕95的检测波长;流动相A为乙腈，流动相B为0.02 mol/L 乙酸铵水溶液；洗脱梯度程序: 0 ～ 3 min，3%A；3 ～ 15 min，3% ～ 30%A；15 ～ 30 min，30% ～ 38%A；30 ～ 35 min，38%～ 60%A；35.0 ～ 35.1 min，60%～ 3%A；35.1 ～ 40min，3%A；流速：1. 0 mL /min；进样量：20 μL;

d、标准曲线的绘制：将12种直接染料的系列混合标准工作溶液注入高效液相色谱仪中，在步骤c的色谱条件下进行梯度洗脱和检测，以保留时间定性，根据各浓度所测峰面积的大小与其浓度的对应关系绘制标准曲线;

e、结果分析：取步骤b中滤液注入高效液相色谱仪中，在步骤c的色谱条件下进行梯度洗脱和检测，测得滤液中各目标物的峰面积，以保留时间定性，根据步骤d中制作的标准曲线定量，计算出待测样品中各直接染料的含量。

2.根据权利要求1所述化妆品中12种直接染料的高效液相色谱同时分离检测方法，其特征在于，步骤a中所述混合标准储备液的配制具体步骤为：准确称取适量各染料标准品，置于100 mL容量瓶中，用0.02mol/L 乙酸铵水溶液,pH=9.0,溶解并定容至刻度，配制成490mg/L到4077 mg/L混合标准储备液；步骤a中所述混合标准工作溶液的配制具体步骤为：将混合标准储备液采用逐级稀释的方法，用0.02mol/L乙酸铵水溶液,pH=9.0,配制浓度从0.245 mg/L到408 mg/L之间的8个系列混合标准工作溶液; 混合标准储备液和系列混合标准工作溶液均置于冰箱中0 ℃ ~ 4 ℃温度下保存。

3.根据权利要求1所述化妆品中12种直接染料的高效液相色谱同时分离检测方法，其特征在于，步骤b中所述待测样品溶液的制备具体步骤为：

1）、样品为膏状、粉状固体以及指甲油：称取试样1.0 g,精确至0.0001 g,于50 mL螺纹盖离心管中,口红膏状样品用玻璃棒均匀涂抹在离心管底部，加入25 mL的三氯甲烷涡旋溶解分散样品，随后加入0.02 mol/L的乙酸铵溶液,pH=9.0,10 mL液液萃取5 min，经10000r/min离心5 min后，取上层水相溶液过0.20μmPTFE滤膜，滤液供液相色谱测定;

2）、样品为水状液体：称取试样1.0 g,精确至0.0001 g,于25mL具塞比色管中，用0.02mol/L的乙酸铵溶液,pH=9.0,稀释定容至10 mL，混匀，过0.20 μmPTFE滤膜，滤液供液相色谱测定。

4.根据权利要求1所述化妆品中12种直接染料的高效液相色谱同时分离检测方法，其特征在于，步骤c中所述反相C18色谱柱规格为150 mm×4.6 mm内径，颗粒粒径5 μm。

5.根据权利要求1所述化妆品中12种直接染料的高效液相色谱同时分离检测方法，其特征在于，步骤c中所述流动相B中0.02 mol/L乙酸铵水溶液用氨水调节pH至9.0。

6.根据权利要求1所述化妆品中12种直接染料的高效液相色谱同时分离检测方法，其特征在于，步骤d中所述标准曲线系数不小于0.999。

7.根据权利要求1所述化妆品中12种直接染料的高效液相色谱同时分离检测方法，其特征在于，所述化妆品为彩妆类化妆品。