CN109406427A - 一种烟草内酶活的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明是一种烟草内生物酶活的检测方法，包括多酚氧化酶、过氧化物酶、淀粉酶、蛋白酶。在传统萃取和洗脱等方式制备粗酶基础上加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1）或者Folch试剂抽提粗酶制剂，最后混合液过脱盐柱（柱体积：5mL，一般上样量≤10%柱体积效果最好，不可超过25%的柱体积），用平衡液洗脱，收集洗脱液，然后测定各管洗脱液的OD₂₈₀判断蛋白质所在的位置，通过传统分光光度法检测酶活性。此方法建立了一种简便、稳定、高效的生物酶提取方法。本发明的提取方法不仅可应用于烟草生物酶的提取，还可以用于茶叶、落叶等其他陈化植物中生物酶的提取。

Description

一种烟草内酶活的检测方法

技术领域

本发明属生物化学酶工程技术领域，具体涉及一种烟草内生物酶活的检测方法。

背景技术

烟叶醇化也称之为烟叶陈化，是指复烤烟叶在存储过程中随着存储条件的变化进行缓慢的发酵，在发酵过程中发生一系列的生理生化反应，促使烟叶物理、化学特征发生变化，进而导致烟叶品质发生改变。当年采集而未经醇化的复烤烟叶，其内在品质都存在不同程度的缺陷，如青杂气重、刺激性大、烟气粗糙、烟香味被杂气掩盖，尤其是低等级的烟叶还有苦、辣、涩等不良感受，这样的烟叶是不能直接用于制造卷烟的，必须进行适当的醇化处理。通过醇化，烟叶的物理、化学特性发生变化，各大分子物质含量改变，使烟叶颜色更加均匀并适当加深，青杂气和刺激性大大减少，香味物质增加，吸味醇和、燃烧性能改善，烟叶外观色泽等特性达到生产使用要求。因此，醇化是卷烟工业进一步提高烟叶质量的一个重要环节。

在整个烟叶醇化过程中，都能检测到许多酶的存在，酶在烟叶醇化过程中起到关键的作用，但在不同时期和条件下，各类酶的活性不一。在醇化过程中，各类酶的活性规律为：醇化初期各类酶活性较低，醇化到一定时期后，酶活达到最高值。这是因为烟叶经过干制加工后，烟叶本身的酶大部分已经失活，一部分保留下的活性酶仍然起着催化作用，烟叶表面的微生物即使经过干制等加工之后，大部分仍然保持着其应有的活性，在醇化过程中，他们依靠烟草丰富的营养繁殖，同时分泌一些活性酶，如蛋白酶、淀粉酶等，这些分泌的活性酶和烟草本身的活性酶共同制约醇化过程的进行和醇化质量的好坏。因此，烟草内酶活性的测定对于促进烟叶纯化，以及防止烟草在自然纯化过程中发生腐败具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种烟草内生物酶活的检测方法，尤其是涉及烟草内多酚氧化酶、过氧化物酶、淀粉酶、蛋白酶的检测，本方法减少了许多杂质，降低了提取液中其他成分的吸光度与酶的吸光度的相似性，大大减小了测定酶活时环境对酶活性的干扰。

本发明采用的技术方案如下：

一种烟草内酶活性的检测方法，按以下步骤进行：

步骤1，检测过程中粗酶的提取：

液氮研磨至粉末状,称取1g烟叶粉末，移至15mL的离心管中，加入10mLPBS(pH7.0,0.1M)冰浴放置30min，再加入玻璃珠(0.5μm),震荡10min(震荡1min,停1min)，12,000rcf、4℃离心10min，加入与粗酶液等体积的氯仿和异戊醇，两者比例为24：1，或者加入与粗酶液等体积的Folch试剂(氯仿：甲醇＝2:1)，缓慢摇晃混匀10-15min,6,000rcf、4℃离心10min，取上清(若上清液浑浊，可重复萃取)，吸取水相，置冰上待测酶活性；

步骤2，酶活测定：

根据步骤1制备的粗酶，用分光光度法分别测定烟草内多酚氧化酶、过氧化物酶、淀粉酶、蛋白酶的活性。

进一步地，由于步骤1中提取的粗酶颜色过深，其中淀粉酶和蛋白酶的测定需要通过过脱盐柱(柱体积：5mL，一般上样量≤10％柱体积效果最好，不可超过25％的柱体积)使提取液的颜色变浅，便于用分光光度法测定OD值。

所述的过脱盐柱用平衡液洗脱，然后收集洗脱液，测定洗脱液的OD₂₈₀判断蛋白质所在的位置(目的蛋白位于洗脱3-4个柱体积所得的收集液)，洗脱液置冰上待测酶活性。

进一步地，用分光光度法测定OD值，当OD值大于2，则需要将被测样品用提取液稀释后重新测定，使提取液的颜色变浅，在最后计算酶活性时需要乘以相应的稀释倍数(稀释10倍为宜)。

由此测得的酶活结果比用普通方法测得的结果的酶活力要提高很多(例如：多酚氧化酶的活性提高了7.2倍，过氧化物酶的活性提高了215倍，淀粉酶的活性提高了9倍，蛋白酶的活性提高了5.8倍)，而且测得的OD值也更加精确。

本发明还涉及所述酶在烟草醇化过程中的应用，不仅大大减小了测定酶活时外界对酶活性的干扰，而且烟草内酶活的测定对于促进烟叶纯化，以及防止烟草在自然纯化过程中发生腐败具有重要的作用。

常规方法的粗酶制备：称取烟叶样品1g于4℃放置的研钵中研磨成匀浆，加少量pH7.8的磷酸缓冲液，混匀，移入10mL离心管，缓冲液稀释至刻度，常温放置15-20min，每2-3min摇1次。然后置于离心机中以3000rmp离心15min，得到粗酶。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

(1)本发明描述的多酚氧化酶、过氧化物酶、淀粉酶、蛋白酶的测定方法是以烟叶作为提取材料，可以直接用于研究烟叶醇化过程酶的催化机制。

(2)本发明采用的从烟叶中高效提取生物酶的新方法测得的粗酶体系的酶活结果比用普通方法测得的结果的酶活力要提高很多(例如：多酚氧化酶的活性提高了7.2倍，过氧化物酶的活性提高了215倍，淀粉酶的活性提高了9倍，蛋白酶的活性提高了5.8倍)，而且测得的OD值也更加精确。

(3)本发明所需的提取条件简单，工艺简单，成本低。发明从烟草中提取到多酚氧化酶、过氧化物酶、淀粉酶、蛋白酶，证明了这些酶在烤烟醇化过程中起到了促进作用，进而改变烤烟醇化进程，同时有利于改善烟叶品质。

附图说明

图1为本发明从烟草内提取的粗酶测定酶活性结果与常规方法从烟草内提取的粗酶测定酶活性结果对照图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实施例1：多酚氧化酶(PPO)的测定方法

1.粗酶制备：

液氮研磨至粉末状,称取1g烟叶粉末，移至15mL的离心管中，加入10mLPBS(pH7.0,0.2M)冰浴放置30min，再加入玻璃珠(0.5μm),震荡10min(震荡1min,停1min)。12,000rcf、4℃离心10min，加入与粗酶液等体积的氯仿和异戊醇(两者比例为24：1)，缓慢摇晃10-15min,6,000rcf、4℃离心10min取上清(若提取液浑浊，可重复萃取)，吸取水相，置冰上待测多酚氧化酶，可适当稀释待测液(稀释10倍为宜)。

2.多酚氧化酶活性测定

产品内容(本试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司)：

提取液：液体，60ml×1瓶，4℃保存，用前混匀；

试剂一：液体，40ml×1瓶，4℃保存；

试剂二：液体，10ml×1瓶，4℃保存。

表1多酚氧化酶测定酶活性的加样表

冷却后，5000G常温离心10min，收集上清，PBS(Ph7.0,0.2M)调零，410nm(525nm)处检测测定管和对照管的吸光度。

Note：每一个测定管需要一个对照管，可以在不同的对照管中加入不同的粗酶液，然后集中进行1min沸水浴处理。

3.多酚氧化酶活性计算

①按样本蛋白质浓度计算：

单位定义：每分钟每mg组织蛋白在每mL反应体系中使用410nm处吸光值变化0.01定义为一个酶活单位。

PPO(U/mg prot)＝V_反总*V_样总/V_样/T*100*(A_测定管-A_对照管)/Cpr

②按样品鲜重计算：

单位定义：每分钟每g组织泛白在每mL反应体系中使用410nm处吸光值变化0.01定义为一个酶活单位。

PPO(U/g鲜重)＝V_反应*V_样总/V_样/T*100*(A_测定管-A_对照管)/W

其中：

V_反总——反应体系总体积；

V_样——加入样本体积，0.035ml；

V_样总——加入提取液体积，1ml；

T——反应时间，1min；

W——样本质量，g；

Cpr——上清液蛋白浓度，mg/ml；

A_测定管——测定管的吸光度；

A_对照管——对照管的吸光度。

实施例2：过氧化物酶(POD)的测定方法

1.粗酶的制备

液氮研磨至粉末状,称取1g烟叶粉末，移至15mL的离心管中，加入10mLPBS(pH7.0,0.2M)冰浴放置30min，再加入玻璃珠(0.5μm),震荡10min(震荡1min,停1min)。12,000rcf、4℃离心10min，加入与粗酶液相同体积的Folch试剂(氯仿：甲醇＝2:1)，缓慢摇晃10-15min,6,000rcf、4℃离心10min取上清(若提取液浑浊，可重复萃取)，吸取水相，置冰上待测过氧化物酶活性。

2.过氧化物酶活性测定

产品内容(本试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司)：

提取液：液体60mL×1瓶，4℃保存；

试剂一：液体60mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：液体×2瓶，4℃保存；用时每瓶加入5mL试剂一；用不完的试剂4℃保存一周；

试剂三：液体10mL×1瓶，4℃保存。

表2过氧化物酶测定酶活性的加样表

测定之前把试剂一、二、三37℃预热10min。在比色皿中按顺序加入上述试剂，立即混匀并计时，记录下30s,90s,150s,210s时的吸光值A1和1min30s后的吸光值A2.计算A＝A2-A1Note:若一次性测定的样品较多，可将试剂一、二、三盒蒸馏水按比例配成混合液，25℃预热10min以上，测定时加入15微升样品和1055微升混合液测定。

如果A小于0.005，可将反应时间适当的延长。如果A大于0.5，可将样品用提取液稀释后重新测定，计算公式乘以相应的稀释倍数。

3.过氧化物酶活性计算

①按样品蛋白质浓度计算

单位定义：每mg组织蛋白在每mL反应体系中每分钟A470变化0.01为一个酶活单位。

POD(U/mg prot)＝A*V_反总/(V_样*Cpr)*100/T＝7133*A/Cpr

②按样品鲜重计算

单位定义：每g组织蛋白在每mL反应体系中每分钟A470变化0.01为一个酶活单位。

POD(U/g鲜重)＝A*V_反总/(W*V_样/V_样总)*100/T＝7133*A/W

其中：

V_反总——反应体系总体积；

V_样——加入样本体积，0.035ml；

V_样总——加入提取液体积，1ml；

T——反应时间，1min。

W——样本质量，g；

Cpr——上清液蛋白浓度，mg/ml；

A——测定的吸光度。

实施例3：淀粉酶的测定方法

1.粗酶的制备：

液氮研磨至粉末状,称取1g烟叶粉末，移至15mL的离心管中，加入10mLPBS(pH7.0,0.1M)冰浴放置30min，再加入玻璃珠(0.5m),震荡10min(震荡1min,停1min)。12,000rcf、4℃离心10min，加入与粗酶液相同体积的氯仿和异戊醇(两者比例为24：1)，缓慢摇晃混匀10-15min,6,000rcf、4℃离心10min取上清(若上清液浑浊，可重复萃取)。由于提取的粗酶液在测量淀粉酶时颜色过深，需要过脱盐柱(柱体积：5mL，一般上样量≤10％柱体积效果最好，不可超过25％的柱体积)，用平衡液洗脱，收集洗脱液，洗脱液置冰上待测淀粉酶活性(稀释10倍为宜)。

2.淀粉酶活性测定

(1)标准曲线的制作(根据表3)

①取7支20ml具塞刻度试管,预先洁净灭菌干燥,编号,按表加入试剂。②摇匀,至沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却,加蒸馏水定容至20ml,以1号管作为空白调零点,在520nm的波长下比色测定吸光度值。并建立通过吸光度值求麦芽糖含量的回归方程。

表3淀粉酶测定酶活性的标准曲线表

标准曲线为：y＝3.2297x+0.1467，R²＝0.9998；

其中：y为最终产物量；x为波长280nm下测得的OD值。

(2)每个样品按下表所示步骤操作，在反应过程中，从加入底物开始，向每支管中加入试剂的时间间隔要一致：

(3)反应后的试样在室温下静置10min，如出现混浊需在离心机上以4,000rpm离心10min，上清液以标准空白调零，在分光光度计550nm波长处测定样品空白(A₀)和样品溶液(A)的吸光值，A－A₀为实测吸光值。用直线回归方程计算样品淀粉酶的活性。

3.酶活计算

酶活力单位定义：在60℃、pH7.0条件下，每min从1％的可溶性淀粉溶液中释放出1mg尔麦芽糖的酶量定义为1个酶活力单位(U)

淀粉酶活性U按下式计算：

其中：

U——样品淀粉酶活性，U/ml；

K——标准曲线斜率；

A₅₅₀——在波长为550nm处的吸光度；

b——标准曲线与y轴的截距；

F——样品溶液反应前的总量，；

S——底物加入量；

30——反应时间，min。

反应12h

实施例4：蛋白酶的测定方法

1.粗酶的制备

液氮研磨至粉末状,称取1g烟叶粉末，移至15mL的离心管中，加入10mLPBS(pH7.0,0.1M)冰浴放置30min，再加入玻璃珠(0.5μm),震荡10min(震荡1min,停1min)。12,000rcf、4℃离心10min，加入与粗酶液相同体积Folch试剂(氯仿：甲醇＝2:1)，缓慢摇晃混匀10-15min,6,000rcf、4℃离心10min取上清(若提取液浑浊，可重复萃取)。由于提取的粗酶液在测量蛋白酶时颜色过深，需要过脱盐柱(柱体积：5mL，一般上样量≤10％柱体积效果最好，不可超过25％的柱体积)，用平衡液洗脱，收集洗脱液，洗脱液置冰上待测蛋白酶活性(稀释10倍为宜)。

2.蛋白酶活性测定

产品内容(本试剂盒购自北苏州科铭生物科技有限公司)：

液体一：1.5mL1×1支，4℃保存。

液体二：1mL×1支，4℃保存。

试剂一的配制：临用前按液体一：液体二：蒸馏水＝76(μL)：17(μL)：18(μL)的比例配制，现配现用，如出现白色絮状沉淀则不能用。

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加10mL蒸馏水溶解。

试剂三：粉剂×1瓶，4℃避光保存。临用前加入20mL试剂一，沸水浴中磁力搅拌溶解。

试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入50mL蒸馏水溶解。

试剂五：液体10mL×1瓶，4℃保存。

标准品：液体1mL×1支，0.25μmol/mL标准酪氨酸溶液，4℃保存。

(1)分光光度计预热30min，调节波长到680nm，蒸馏水调零。

(2)试剂二、三、四置于30℃水浴保温30min。

(3)对照管：取一支EP管，加入100μL粗酶液煮沸10min，加入200μL试剂三，加入200μLPBS(0.1M,pH7.0)，混匀37℃反应，每隔适当时间取200μL上清液，加入新的EP管，8000g、4℃离心10min；再加入1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温30min，于680nm测定光吸收，记为A对照管。

(4)测定管：取一支EP管，加入100μL粗酶液，加入200μL试剂三，加入200μLPBS(0.1M,pH7.0)，混匀37℃反应，每隔适当时间取200μL上清液，加入新的EP管，8000g、4℃离心10min；再加入1000μL试剂四，200μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温30min，于680nm测定光吸收，记为A对照管。

(5)空白管：取EP管，加入200μL蒸馏水，1000μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A空白管。

(6)标准管：取EP管，加入200μL标准品，1000μL试剂五，混匀后置于30℃水浴保温20min，于680nm测定光吸收，记为A标准管。

Note:空白管和标准管只需要测定一次。

3.蛋白酶活性计算

①按照蛋白质浓度计算

单位定义：30℃每mg蛋白质每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

蛋白酶活性(nmol/min/mg prot)＝C_标准品*(A_测定管-A_对照管)/(A_标准管-A_空白管)*稀释倍数/(Cpr*V₁)/T＝625*(A_测定管-A_对照管)/(A_标准管-A_空白管)/Cpr

②按照样品质量计算

单位定义：30℃每g样品每分钟催化水解产生1nmol酪氨酸为1个酶活单位。

蛋白酶活性(nmol/min/g鲜重)＝C_标准品*(A_测定管-A_对照管)/(A_标准管-A_空白管)*稀释倍数/(W*V₁/V₂)/T＝625*(A_测定管-A_对照管)/(A_标准管-A_空白管)/W

其中：

C_标准品——0.25μmol/mL标准酪氨酸溶液；

稀释倍数——(100+200+200)/200＝2.5；

V₁——加入反应体系中粗酶液体积，100μL＝0.1mL；

V₂——粗酶液总体积，1mL；

T——催化反应时间，10分钟；

A_测定管——测定管的吸光度；

A_对照管——对照管的吸光度

A_标准管——标准管的吸光度

A_空白管——空白管的吸光度

Cpr——上清液蛋白浓度，mg/ml

W——样品质量。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (6)

1.一种烟草内生物酶活的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤1，检测过程中粗酶的提取：

液氮研磨至粉末状,称取1g烟叶粉末，移至15mL的离心管中，加入10mLPBS， pH7.0 ,0.1M冰浴放置30min，再加入0.5μm玻璃珠,震荡10min，震荡1min,停1min，12,000 rcf、 4℃离心10min，加入与粗酶液等体积的氯仿和异戊醇，两者比例为24：1，或者加入与粗酶液等体积的Folch试剂，缓慢摇晃混匀10-15min, 6,000 rcf、 4℃离心10min，取上清，吸取水相，置冰上待测酶活性；

步骤2，酶活测定：

根据步骤1制备的粗酶，用分光光度法分别测定烟草内多酚氧化酶、过氧化物酶、淀粉酶、蛋白酶的活性。

2.根据权利要求1所的烟草内生物酶活的检测方法，其特征在于：由于步骤1中提取的粗酶颜色过深，其中淀粉酶和蛋白酶的测定需要通过过脱盐柱使提取液的颜色变浅，便于用分光光度法测定OD值。

3.根据权利要求2所的烟草内生物酶活的检测方法，其特征在于：所述的过脱盐柱柱体积：5mL，上样量≤10%柱体积，不超过25%的柱体积。

4.根据权利要求2所的烟草内生物酶活的检测方法，其特征在于：所述的过脱盐柱用平衡液洗脱，然后收集洗脱液，测定洗脱液的OD₂₈₀判断蛋白质所在的位置，目的蛋白位于洗脱3-4个柱体积所得的洗脱液，洗脱液置冰上待测酶活性。

5.根据权利要求1所的烟草内生物酶活的检测方法，其特征在于：用分光光度法测定OD值，当OD值大于2，则需要将被测样品用提取液稀释后重新测定，使提取液的颜色变浅，在最后计算酶活性时需要乘以相应的稀释倍数。

6.根据权利要求5所的烟草内生物酶活的检测方法，其特征在于：所述的稀释倍数为10倍。