CN106706539A - 一种测定植物过氧化氢酶活性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种测定植物过氧化氢酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：试剂配制包括过氧化氢溶液配制、缓冲溶液配制、硫酸溶液配制和高锰酸钾溶液配制；植物样品制备，包括采样、清洗、剪碎、研磨、过滤或离心；标准曲线绘制，包括过氧化氢的标定、标准系列配制、吸光度测定、绘制回归方程；样品测定，包括吸样、加入试剂、控制反应时间、定容、测定吸光度；结果计算,包括计算公式、酶活性的表示单位。本发明解决了当前植物过氧化氢酶活性测定方法方面的不足，为植物过氧化氢酶活性的测定提供了一种简单、快速、精确、廉价的测定方法。
Description
技术领域
本发明涉及植物酶活性测定技术领域，尤其是涉及一种测定植物过氧化氢酶活性的方法。
背景技术
植物酶活性是研究植物生理生化过程的重要生理指标，植物过氧化氢酶是植物生长中的一种重要酶类，与植物抗氧化性有关，可以保护植物细胞免受氧化胁迫的伤害，消除过氧化氢对植物的损伤。当前测定植物过氧化氢酶活性的方法以高锰酸钾滴定法为主，由于植物酶提出液中总是含有可溶性有机物，能够被高锰酸钾氧化，所以到了滴定终点时很容易褪色，严重影响滴定终点的确定，从而带来很大的不确定性和误差，滴定体积需要人为读数，也会存在读数误差。也有用分光光度法测定植物过氧化氢酶活性的方法报道，但是有的需要过氧化氢酶做标准，试剂昂贵，不容易购买和保存，有的利用动态反应，时间控制和读数难以同时控制，本人也曾报道过紫外分光光度法测定植物过氧化氢酶活性，但是吸样量太少，吸样和稀释倍数会带来较大的误差。
总之，为了克服当前植物过氧化氢酶活性测定方法的不足，我们发明一种利用紫外分光光度法测定植物过氧化氢酶活性测定方法，本方法利用硫酸抑制反应，终点容易控制，吸样体积较大，减少吸样和稀释误差，利用分光光度计仪器读数，减少人为读数误差，操作简单，不需要昂贵仪器和特殊的试剂，成本低廉，为植物过氧化氢酶的研究提供了方便。
发明内容
本发明提出一种测定植物过氧化氢酶活性的方法，解决了当前植物过氧化氢酶活性测定方法方面的不足，为植物过氧化氢酶活性的测定提供了一种简单、快速、精确、廉价的测定方法。
本发明的技术方案是这样实现的：一种测定植物过氧化氢酶活性的方法，包括以下步骤：
S1、试剂配制，所述试剂配制包括过氧化氢溶液配制、缓冲溶液配制、硫酸溶液配制和高锰酸钾溶液配制；
S2、植物样品制备，包括采样、清洗、剪碎、研磨、过滤或离心；
S3、标准曲线绘制，包括过氧化氢的标定、标准系列配制、吸光度测定、绘制回归方程；
S4、样品测定，包括吸样、加入试剂、控制反应时间、定容、测定吸光度；
S5、结果计算,包括计算公式、酶活性的表示单位。
作为一种优选的技术方案，步骤S1试剂配制具体包括以下试剂的配制：
试剂1：缓冲溶液的配制，称取65.52g Na2HPO4.12H2O、2.66gNaH2PO4.2H2O、10g聚乙烯吡咯烷酮，用900mL水溶解，检查调节pH后，定容至1L；
试剂2：过氧化氢溶液的配制，吸取30％的过氧化氢溶液1.5mL，用蒸馏水定容至100mL，用高锰酸钾标定其浓度；
试剂3：8％硫酸溶液的配制，吸取40mL浓硫酸缓慢加入400mL水中，冷却后，定容至500mL；
试剂4：高锰酸钾溶液的配制，称取3.16g高锰酸钾，溶解后定容至1L；
试剂5：0.1M草酸钠溶液的配制，称取于105-110℃烘2小时并在干燥器中冷却的草酸钠1.3600g，用试剂3溶解后，并用试剂3定容至100mL。
作为一种优选的技术方案，步骤S2植物样品制备具体包括以下步骤：
(1)样品采集：采取特定部位的植物叶片，装入自封袋中，立即带回实验室；
(2)样品清洗：将步骤(1)的植物叶片用自来水洗净叶片上的尘土，再用蒸馏水漂洗3次，用干净的吸水纸吸干叶片表面的水分；
(3)剪碎：将用干净的剪刀将步骤(2)中的叶片剪碎，混匀后称取0.5g放入研钵中；
(4)研磨：加入少量石英砂于研钵中，加入5mL的试剂1，将样品研磨成匀浆，转移于25mL比色管中，用试剂1冲洗研钵3次，每次用试剂1用3mL，并将液体转移于同一比色管中，最后用试剂1定容至刻度，充分摇匀；
(5)离心：将(4)的混合液转移于50mL离心管中，在4000rpm下离心10分钟，将离心液转移于25mL比色管中，保存于4℃冰箱中备用。
作为一种优选的技术方案，步骤S3标准曲线绘制具体包括以下步骤：
(1)试剂2的标定：吸取2.5mL试剂2，加入2.5mL试剂3，用试剂4滴定由无色至紫红色，保持半分钟不褪色为终点，记录试剂4的用量；
(2)试剂4的标定：吸取5mL试剂5，用试剂4滴定，接近终点时，加热至65℃，继续滴定至粉红色保持30秒不褪色为终点，记录试剂4的用量，同时做空白试验；
(3)标准系列制备：分别吸取0、1、2、3、4、5mL试剂2依次放于6支50mL的比色管中，各家1mL试剂1和2mL试剂3，定容至刻度。在240nm处，以蒸馏水调节零点，测定各管的吸光度；
(4)回归方程绘制：以吸光度为自变量x，以过氧化氢浓度为因变量y，用Excel绘制散点图，再通过添加趋势线，选择公式和相关系数平方，即可得出回归方程：y＝bx+a；
作为一种优选的技术方案，步骤S4样品测定具体包括以下步骤：
(1)样品吸取：取2支50mL比色管，管1作为对照，管2作为样品测定。向管1和管2各加S2(5)中的样品待测液1mL；
(2)反应控制：管1加入2mL试剂3，摇匀。管2加入2mL试剂2，摇匀后立即用秒表计时，在恒定的室温下反应10分钟后，立即加入2mL试剂3终止反应；
(3)测定：然后将管1和管2分别用蒸馏水定容至刻度，分别在240nm波长处测定吸光度，分别记为A1和A2；
作为一种优选的技术方案，步骤S5结果计算：
其中，y表示由吸光度A1-A2的值从S3(4)中的回归方程总计算得到的过氧化氢的浓度mg mL-1；V表示提取待测液的体积mL，Vs表示测定时吸取待测液的体积mL，W表示所称取的叶片重量g；t表示反应的时间min；酶活性的表示单位为mg H2O2g-1min-1，即每克叶片在每分钟内分解的过氧化氢的毫克数。
采用了上述技术方案，本发明的有益效果为：用分光光度计测定，克服了滴定法终点不容易控制的缺陷，消除人为读数误差；利用硫酸溶液终止反应，克服了一般动力学光度法时间和读数难以控制准确的不足；使用常规试剂，不需要昂贵的过氧化氢酶做标准，降低了试剂保存和测定成本；吸样量大，减少了吸样和稀释误差。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的一种测定植物过氧化氢酶活性的方法流程图；
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
1、方法原理：
过氧化氢酶能酶促过氧化氢分解，过氧化氢在240nm的紫外区有强烈吸收，通过测定有无酶促反应的吸光度之差，即得酶促反应消耗的过氧化氢的量，可用单位时间内所消耗的过氧化氢的量表示植物过氧化氢酶的活性。
2、试剂配制：
试剂1：缓冲溶液，称取65.52g Na2HPO4.12H2O、2.66g NaH2PO4.2H2O、10g聚乙烯吡咯烷酮，用900mL水溶解，检查调节pH后，定容至1L。
试剂2：过氧化氢溶液，吸取30％的过氧化氢溶液1.5mL，用蒸馏水定容至100mL，用高锰酸钾标定其浓度。
试剂3：8％硫酸溶液，吸取40mL浓硫酸缓慢加入400mL水中，冷却后，定容至500mL。
试剂4：高锰酸钾溶液，称取3.16g高锰酸钾，溶解后定容至1L。
试剂5：0.1M草酸钠溶液，称取于105-110℃烘2小时并在干燥器中冷却的草酸钠1.3600g，用试剂2溶解后，并用试剂3定容至100mL。
3样品制备：
3.1样品采集：采取特定部位的植物叶片，装入自封袋中，立即带回实验室。
3.2样品清洗：将3.1的植物叶片用自来水洗净叶片上的尘土，再用蒸馏水漂洗3次，用干净的吸水纸吸干叶片表面的水分。
3.3剪碎：将用干净的剪刀将3.2中的叶片剪碎，混匀后称取0.5g放入研钵中。
3.4研磨：加入少量石英砂于研钵中，加入5mL的试剂1，将样品研磨成匀浆，转移于25mL比色管中，用试剂1冲洗研钵3次，每次用试剂1用3mL，并将液体转移于同一比色管中，最后用试剂1定容至刻度，充分摇匀
3.5离心：将3.4的混合液转移于50mL离心管中，在4000rpm下离心10分钟，将离心液转移于25mL比色管中，保存于4℃冰箱中备用。
4标准曲线
4.1试剂2的标定：吸取2.5mL试剂2，加入2.5mL试剂3，用试剂4滴定由无色至紫红色，保持半分钟不褪色为终点，记录试剂4的用量。
4.2试剂4的标定：吸取5mL试剂5，用试剂4滴定，接近终点时，加热至65℃，继续滴定至粉红色保持30秒不褪色为终点，记录试剂4的用量，同时做空白试验。
4.3标准系列制备：分别吸取0、1、2、3、4、5mL试剂2依次放于6支50mL的比色管中，各家1mL试剂1和2mL试剂3，用蒸馏水定容至刻度。在240nm处，以蒸馏水调节零点，测定各管的吸光度。
4.4回归方程绘制：以吸光度为自变量x，以过氧化氢浓度为因变量y，用Excel绘制散点图，再通过添加趋势线，选择公式和相关系数平方，即可得出回归方程：y＝bx+a
5样品测定
5.1样品吸取：取2支50mL比色管，管1作为对照，管2作为样品测定。向管1和管2各加3.5中的样品待测液1mL。
5.2反应控制：管1加入2mL试剂3，摇匀。管2加入2mL试剂2，摇匀后立即用秒表计时，在恒定的室温下反应10分钟后，立即加入2mL试剂3终止反应。
5.3测定：然后将管1和管2分别用蒸馏水定容至刻度，分别在240nm波长处测定吸光度，分别记为A1和A2。
6结果计算
6.1计算公式
y表示由吸光度A1-A2的值从4.4中的回归方程中计算得到的过氧化氢的浓度mgmL-1；V表示提取待测液的体积mL，Vs表示测定时吸取待测液的体积mL，W表示所称取的叶片重量g；t表示反应的时间min。
6.2酶活性表示单位
酶活性的表示单位为mg H2O2g-1min-1，即每克叶片在每分钟内分解的过氧化氢的毫克数。
与现有测定方法相比，本发明具有如下有益效果：用分光光度计测定，克服了滴定法终点不容易控制的缺陷，消除人为读数误差；利用硫酸溶液终止反应，克服了一般动力学光度法时间和读数难以控制准确的不足；使用常规试剂，不需要昂贵的过氧化氢酶做标准，降低了试剂保存和测定成本；吸样量大，减少了吸样和稀释误差。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种测定植物过氧化氢酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、试剂配制，所述试剂配制包括过氧化氢溶液配制、缓冲溶液配制、硫酸溶液的配制和高锰酸钾溶液配制；
S2、植物样品制备，包括采样、清洗、剪碎、研磨、过滤或离心；
S3、标准曲线绘制，包括过氧化氢的标定、标准系列配制、吸光度测定、绘制回归方程；
S4、样品测定，包括吸样、加入试剂、控制反应时间、定容、测定吸光度；
S5、结果计算,包括计算公式、酶活性的表示单位。
2.如权利要求1所属的一种测定植物过氧化氢酶活性的方法，其特征在于，步骤S1试剂配制具体包括以下试剂的配制：
试剂1：缓冲溶液的配制，称取65.52g Na2HPO4.12H2O、2.66g NaH2PO4.2H2O、10g聚乙烯吡咯烷酮，用900mL水溶解，检查调节pH后，定容至1L；
试剂2：过氧化氢溶液配制，吸取30％的过氧化氢溶液1.5mL，用蒸馏水定容至100mL，用高锰酸钾标定其浓度；
试剂3：8％硫酸溶液的配制，吸取40mL浓硫酸缓慢加入400mL水中，冷却后，定容至500mL；
试剂4：高锰酸钾溶液的配制，称取3.16g高锰酸钾，溶解后定容至1L；
试剂5：0.1M草酸钠溶液的配制，称取于105-110℃烘2小时并在干燥器中冷却的草酸钠1.3600g，用试剂3溶解后，并用试剂3定容至100mL。
3.如权利要求1所属的一种测定植物过氧化氢酶活性的方法，其特征在于，步骤S2植物样品的制备具体包括以下步骤：
(1)样品采集：采取特定部位的植物叶片，装入自封袋中，立即带回实验室；
(2)样品清洗：将步骤(1)的植物叶片用自来水洗净叶片上的尘土，再用蒸馏水漂洗3次，用干净的吸水纸吸干叶片表面的水分；
(3)剪碎：将用干净的剪刀将步骤(2)中的叶片剪碎，混匀后称取0.5g放入研钵中；
(4)研磨：加入少量石英砂于研钵中，加入5mL的试剂1，将样品研磨成匀浆，转移于25mL比色管中，用试剂1冲洗研钵3次，每次用试剂1用3mL，并将液体转移于同一比色管中，最后用试剂1定容至刻度，充分摇匀；
(5)离心：将(4)的混合液转移于50mL离心管中，在4000rpm下离心10分钟，将离心液转移于25mL比色管中，保存于4℃冰箱中备用。
4.如权利要求1所属的一种测定植物过氧化氢酶活性的方法，其特征在于，步骤S3标准曲线的绘制具体包括以下步骤：
(1)试剂2的标定：吸取2.5mL试剂2，加入2.5mL试剂3，用试剂4滴定由无色至紫红色，保持半分钟不褪色为终点，记录试剂4的用量；
(2)试剂4的标定：吸取5mL试剂5，用试剂4滴定，接近终点时，加热至65℃，继续滴定至粉红色保持30秒不褪色为终点，记录试剂4的用量，同时做空白试验；
(3)标准系列制备：分别吸取0、1、2、3、4、5mL试剂2依次放于6支50mL的比色管中，各加1mL试剂1和2mL试剂3，用蒸馏水定容至刻度。在240nm波长处，以蒸馏水调节零点，测定各管的吸光度；
(4)回归方程绘制：以吸光度为自变量x，以过氧化氢浓度为因变量y，用Excel绘制散点图，再通过添加趋势线，选择公式和相关系数平方，即可得出回归方程：y＝bx+a。
5.如权利要求1所属的一种测定植物过氧化氢酶活性的方法，其特征在于，步骤S4样品测定具体包括以下步骤：
(1)样品吸取：取2支50mL比色管，管1作为对照，管2作为样品测定。向管1和管2各加S2(5)中的样品待测液1mL；
(2)反应控制：管1加入2mL试剂3，摇匀。管2加入2mL试剂2，摇匀后立即用秒表计时，在恒定的室温下反应10分钟后，立即加入2mL试剂3终止反应；
(3)测定：然后将管1和管2分别用蒸馏水定容至刻度，分别在240nm处测定吸光度，分别记为A1和A2。
6.如权利要求1所属的一种测定植物过氧化氢酶活性的方法，其特征在于，步骤S5结果计算：
其中，y表示由吸光度A1-A2的值从S3(4)中的回归方程总计算得到的过氧化氢的浓度mgmL-1；V表示提取待测液的体积mL，Vs表示测定时吸取待测液的体积mL，W表示所称取的植物叶片重量g；t表示反应的时间min；酶活性的表示单位为mg H2O2g-1min-1，即每克叶片在每分钟内分解的过氧化氢的毫克数。
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