CN101914611B - 用于临床检测髓过氧化物酶的试剂盒及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用于临床检测髓过氧化物酶的试剂盒及其方法，属生物化学、检验试剂领域。本发明所提供的试剂盒由三试剂构成。本发明采用特异性高、抑制力强、抑制常数Ki低的髓过氧化物酶抑制剂抑制样本中髓过氧化物酶的活力，分别测定总过氧化物酶与非髓过氧化物酶的活力，两者之差即得髓过氧化物酶活力。本发明所提供的试剂盒具有检测成本低、需要样本量少、测定准确度高、操作简便、易于推广等优点。
Description
技术领域
本发明属生物化学、检验试剂技术领域，具体涉及一种用于临床检测髓过氧化物酶(MPO)的试剂盒及其方法。
背景技术
髓过氧化物酶(英文名：Myeloperoxidase，英文缩写：MPO，EC：1.11.1.7)主要是由活化的多形核嗜中性粒细胞分泌的糖基化的血红蛋白，是一种过氧化物酶。MPO颜色为绿色，分子量140kDa，为两个相同单体构成的二聚体，两单体分开后仍有酶的活性。
研究证实：MPO是一种白细胞酶，有促炎、促动脉粥样硬化的作用，影响粥样斑块的稳定性，并通过增大氧化应激而引起急性冠状动脉粥样硬化综合征(ACS)。作为活化粒细胞的标志物，MPO是ACS危险性分层的良好指标；MPO在慢性肾炎、肾功能不全者和2型糖尿病等方面也有着重要的检测价值。
目前，测定髓过氧化物酶(MPO)的市售试剂盒有两种：一种是ELISA法(酶联免疫吸附测定法)试剂盒，在市场上占主导地位；另一种是次氯酸法试剂盒，利用以下反应测定MPO的氯化活性
以上两种试剂盒都是手工法，手工操作准确度有限，且检测周期长、需要样本量大，不能运用于全自动生化分析仪等缺点，且占主导地位的ELISA法更有价格昂贵、试剂盒制备工艺复杂、难以工业化生产等缺点，给临床诊断带来很大的不便。因此有必要研究一种价格合适、样本需要量小、适合于全自动生化分析仪运行的试剂盒，克服上述缺点。
发明内容
本发明针对现有技术的上述不足，提供一种临床应用方便、检测成本低、需要样本量少、测定准确度高、可以直接应用于全自动生化分析仪的髓过氧化物酶(MPO)试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：一种用于临床检测髓过氧化物酶的试剂盒，该试剂盒由以下三种试剂构成，其中：
试剂1：
缓冲液 20～200mmol/L
色原 0.1～5mmol/L
稳定剂 1～100g/L
防腐剂 0.1～100g/L
表面活性剂 1～100ml/L
盐酸 2～20ml/L；
试剂2：
缓冲液 20～200mmol/L
H2O2 0.1～100mmol/L
4-氨基安替比林 0.1～100mmol/L
稳定剂 1～100g/L
防腐剂 0.1～100g/L
表面活性剂 1～100ml/L
盐酸 2～20ml/L；
试剂3：
髓过氧化物酶抑制剂 20～100μmol/L
稳定剂 1～100g/L
防腐剂 0.1～100g/L
表面活性剂 1～100ml/L。
本发明上述的缓冲液为磷酸盐缓冲液(如磷酸钾缓冲液)、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、GOOD‘S缓冲液中的一种。
本发明上述试剂1中的色原为Trinder反应505nm有吸收的色原，如苯酚、愈创木酚或3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠(DHBS)等。
本发明上述的稳定剂为多元醇、乙二胺四乙酸钠、牛血清白蛋白(BSA)、甘露醇、二糖及多糖。其中多元醇为甘油、乙二醇、PEG 2000(PEG为聚乙二醇)或者PEG 6000；其中二糖及多糖为蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉。
本发明上述的防腐剂为2-甲基异噻唑酮盐酸(2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮盐酸盐CAS：26172-54-3，MIT)、叠氮化合物(如叠氮钠)、PC系列防腐剂(如PC300)。
本发明上述表面活性剂为非离子型表面活性剂，如吐温80(Tween 80)、曲拉通X-100(Triton X-100，聚乙二醇辛基苯基醚)或乳化剂OP。
本发明上述试剂3中的MPO抑制剂为本发明的关键所在，该抑制剂必须具有以下特性：
(1)特异性高：特异性抑制MPO的活力，即不能抑制其他过氧化物酶的活力；
(2)抑制常数Ki要低：为了防止过高的抑制剂可能引起副反应及控制试剂盒成本，抑制剂的抑制常数Ki要低，这样抑制掉99％以上MPO活力所采用的抑制剂浓度低，即采用很低的浓度即可将MPO的活力都抑制掉；
(3)非可逆抑制：即抑制剂抑制MPO为非可逆，这样可以保证MPO的活力都被抑制，且采用的抑制剂的浓度也不会太高。
(4)稳定性好：为了保证试剂盒在4℃储存一定时间内，该抑制剂具有同样的抑制MPO的活力，抑制剂的稳定性要好。
本发明试剂3中MPO抑制剂采用苯甲酰肼类物质，如4-氨基苯甲酰肼、4-羟基苯甲酰肼、4-氯苯甲酰肼、4-甲氧基苯甲酰肼或3-甲氧基苯甲酰肼等。该类抑制剂特异性强，具有只抑制髓过氧化物酶而不抑制其他非髓过氧化物酶的特性，其对MPO的抑制为非可逆抑制，其抑制机理如下：在双氧水的存在下，苯甲酰肼类物质被髓过氧化物酶催化氧化，从而产生一定的自由基，这些自由基可破坏髓过氧化物酶的结构，使其失去活力。而其他的过氧化物酶则没有此特性。
本发明试剂盒中的三种试剂配制工艺如下：
(1)配制试剂1：在洁净的玻璃容器中首先加入按配方比例已称量好的缓冲液，然后依次加入色原、稳定剂、防腐剂，加入适量水，然后加入表面活性剂，用盐酸调节pH到pH 6～9，然后搅拌过滤，所得滤液中再加入蒸馏水到定量得试剂1(即如以1L试剂1为定量，要求配制过程中各原料加入量满足在1L试剂1中为上述配方比例含量，试剂2和3也满足上述条件)。
(2)配制试剂2：在洁净的玻璃容器中首先加入按配方比例已称量好的缓冲液，然后依次加入4-氨基安替比林、稳定剂、防腐剂，加入适量水，然后加入H2O2和表面活性剂，用盐酸调节pH到pH 6～9，然后搅拌过滤，所得滤液中再加入蒸馏水到定量。
(3)配制试剂3：在洁净的玻璃容器中首先胺配方比例加入MPO抑制剂，然后依次加入稳定剂、防腐剂，加入适量水，然后加入表面活性剂，搅拌过滤，所得滤液中再加入蒸馏水到定量。
(4)将上述所配制的试剂灌装分至小瓶，以供医疗检验用：将试剂1灌装35mL×1瓶备用；将试剂2灌装15mL×1瓶备用；将试剂3灌装12mL×1瓶备用。
(5)要求配制上述三种试剂的操作过程均在无菌车间里进行，试剂1、2、3均为无色或者淡黄色透明液体，配制好后在2～8℃保存，可至少稳定1年。
本发明要解决的另一个技术问题，是提供一种用于临床检测髓过氧化物酶的方法，
该方法依赖原理如下：
髓过氧化物酶(MPO)是一种过氧化物酶，可发生Trinder反应：
而产物醌类化合物(红色)在505nm有吸收光，醌类化合物在505nm下的吸光值与MPO的活性呈正比；
如果为纯的MPO，没有其它过氧化物酶的干扰，则采用上述反应就可以测定MPO的活性；
而测定样本中除了髓过氧化物酶以外，往往还有其他过氧化物酶存在，我们统称为非髓过氧化物酶(非MPO)，考虑到上述非MPO的干扰，采用以下技术原理测定样本中MPO的活性：
先采用Trinder反应测定样本中总的过氧化物酶活力，然后加入MPO抑制剂，将样本中所有MPO的活性全部抑制掉，然后同样采用Trinder反应测定剩余的非MPO活力，总的过氧化物酶的量减去非髓过氧化物酶的量，就是髓过氧化物酶的量。
具体测定髓过氧化物酶的量过程如下：
第一步，4-氨基安替比林(4-AAP)和色原在过氧化物酶和双氧水的作用下，生成醌类化合物，在505nm下监测吸光度变化率(速率A)，速率A与总的过氧化物酶的量呈线性关系；
第二步，向上述反应体系中加入MPO抑制剂，同样在505nm下监测吸光度变化率(速率B)，速率B与非髓过氧化物酶的量呈线性关系。
速率A减去速率B的值与MPO的量呈线性关系。
测定髓过氧化物酶的量具体步骤为：(1)取试剂1与待测样本以一定比例混匀，孵育一定时间，再加入试剂2，然后测定总过氧化物酶的活力；
(2)然后向步骤(1)的体系中加入试剂3，试剂3中的髓过氧化物酶抑制剂抑制了髓过氧化物酶的活力，测定出此时非髓过氧化物酶的活力；
(3)将步骤(1)操作所得的总过氧化物酶的活力减去步骤(2)所得的非髓过氧化物酶的活力，即得出髓过氧化物酶的活力。
上述步骤测定过程，主要采用速率法测定样本速率。
本发明突出的实质性特点及显著进步主要表现在：
1.本发明的试剂盒，特别是试剂3中所采用的髓过氧化物酶抑制剂——苯甲酰肼类物质，抑制MPO所需要的浓度很低，半数抑制浓度IC50很小，均小于10μmol/L，当抑制剂浓度为20～100μmol/L，样本中99％以上的MPO均被抑制掉，这样确保了最终结果的准确度。试剂盒在4℃1年的观察实验表明，苯甲酰肼类物质稳定性可以达到试剂盒的稳定性要求。因此，本发明采用的髓过氧化物酶抑制剂特异性强、抑制力高、抑制常数Ki低、稳定性好的髓过氧化物酶抑制剂，因此，制备出的试剂盒准确度高，重复性好，试剂盒稳定性也好，如在2～8℃保存至少稳定1年。
3.本发明的液体试剂盒可应用于全自动生化仪，因此不同于市售ELISA与次氯酸法检测时耗时长，采用本发明的试剂盒可在短时间内处理大量样本，而且可以随到随做。
4.本发明制造工艺简便，适合工业化生产；
5.本发明因可以工业化生产，且所涉及的原料等较为便宜，故试剂盒整体成本低，检验成本低。
6.本发明所采用的方法学与目前市场上的ELISA及次氯酸法完全不同，是一种新的方法学，可定量检测样本中髓过氧化物酶的浓度，为检测髓过氧化物酶开辟了一种全新的方法。
具体实施方式
实施例1：
试剂1：
Tris缓冲液 200mmol/L
苯酚 2mmol/L
甘油 10g/L
叠氮钠 0.1g/L
吐温80 1ml/L
盐酸 5ml/L
试剂2：
Tris缓冲液 200mmol/L
H2O2 10mmol/L
4-氨基安替比林 2mmol/L
甘油 10g/L
叠氮钠 0.1g/L
吐温80 1ml/L
盐酸 5ml/L
试剂3：
4-羟基苯甲酰肼 25μmol/L
甘油 10g/L
叠氮钠 0.1g/L
吐温80 1ml/L
测定样本时，采用速率法，温度为37℃，主波长为505nm，反应方向向上(正反应)，加样步骤如下：
标本(样本) 25μL
试剂1 140μL
混匀，置37℃孵育90秒
试剂2 60μL
混匀，孵育120秒，读此时吸光度A1，再孵育180秒，
读取此时吸光度A2，计算速率A＝(A2-A1)/时间。
试剂3： 46μL
混匀，孵育120秒，读吸光度A3，再孵育180秒读取吸
光度A4，计算速率B＝(A4-A3)/时间。
Δ速率＝速率A-速率B
采用全自动生化仪操作，仪器会根据定标结果和所检测的速率自动计算出样本中髓过氧化物酶的浓度。
实施例2：
试剂1：
磷酸钾缓冲液 100mmol/L
愈创木酚 5mmol/L
甘露醇 10g/L
PC300 1g/L
曲拉通X-100 10ml/L
盐酸 10ml/L
试剂2：
磷酸钾缓冲液 150mmol/L
H2O2 15mmol/L
4-氨基安替比林 5mmol/L
甘露醇 10g/L
PC300 1g/L
曲拉通X-100 10ml/L
盐酸 10ml/L
试剂3：
3-甲氧基苯甲酰肼 40μmol/L
甘露醇 10g/L
PC300 1g/L
曲拉通X-100 10ml/L
实施例2的测定方法与实施例1相同。
实施例3：
试剂1：
GOOD’S缓冲液 100mmol/L
DHBS 5mmol/L
BSA 1g/L
MIT 0.1g/L
乳化剂OP 1ml/L
盐酸 20ml/L
试剂2：
GOOD’S缓冲液 100mmol/L
H2O2 7mmol/L
4-氨基安替比林 5mmol/L
BSA 1g/L
MIT 0.1g/L
OP 1ml/L
盐酸 20ml/L
试剂3：
4-氨基苯甲酰肼 30μmol/L
BSA 1g/L
MIT 0.1g/L
乳化剂OP 1ml/L
实施例3的测定方法与实施例1相同。
以上实施例是对本发明的说明和进一步解释，而不是对本发明的限制，在本发明的精神和权力保护范围内所做的任何修改，都落入本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种用于临床检测髓过氧化物酶的试剂盒，其特征是：该试剂盒由以下三种试剂构成，其中：
试剂1：
试剂2：
试剂
所述的髓过氧化物酶抑制剂为4-氨基苯甲酰肼、4-羟基苯甲酰肼、4-氯苯甲酰肼、4-甲氧基苯甲酰肼或3-甲氧基苯甲酰肼。
2.根据权利要求1所述的测定髓过氧化物酶的试剂盒，其特征在于：所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸缓冲液、Good′s缓冲液中的一种。
3.根据权利要求1所述的测定髓过氧化物酶的试剂盒，其特征在于：所述试剂1中的色原为苯酚、愈创木酚或3,5-二氯-2-羟基苯磺酸钠。
4.根据权利要求1所述的测定髓过氧化物酶的试剂盒，其特征在于：所述的稳定剂为多元醇、乙二胺四乙酸钠、牛血清白蛋白、二糖或多糖。
5.根据权利要求1所述的测定髓过氧化物酶的试剂盒，其特征在于：所述的防腐剂为2-甲基异噻唑酮盐酸、叠氮化合物或PC系列防腐剂。
6.根据权利要求1所述的测定髓过氧化物酶的试剂盒，其特征在于：所述的表面活性剂为吐温80、曲拉通X-100或乳化剂OP。
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