CN104198691B - 一种稳定的α-淀粉酶检测试剂盒 - Google Patents

一种稳定的α-淀粉酶检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种稳定的α‑淀粉酶检测试剂盒，包括试剂R1及试剂R2；所述试剂R1的各组分及浓度为：缓冲液0.5～100mM，NaCl20～200mM，CaCl210～100mM，十二烷基苯磺酸钠1～10g/L，α‑葡萄糖苷酶0.1～10KU/L，稳定剂0.1～10g/L，防腐剂0.1～10g/L；所述试剂R2的各组分及浓度为：缓冲液0.5～100mM，4,6‑亚乙基‑对硝基苯‑α‑D‑麦芽七糖苷0.5～10g/L，十二烷基苯磺酸钠1～10g/L，稳定剂0.1～10g/L，防腐剂0.1～10g/L。本发明通过加入十二烷基苯磺酸钠改善试剂盒性能，本发明重复性好，试剂稳定，灵敏度高，线性范围广。

Description

一种稳定的α-淀粉酶检测试剂盒
技术领域
本发明涉及医学免疫体外诊断领域，具体地，涉及一种稳定的α-淀粉酶检测试剂盒。
背景技术
淀粉酶(α-Amylase)简称AMS或AMY，一类能将淀粉分子水解的酶，一般作用于可溶性淀粉、直链淀粉、糖元等α-1，4-葡聚糖，水解α-1，4-糖苷键，产生葡聚糖、麦芽糖和葡萄糖分子。淀粉酶在胰腺和唾液腺中含量丰富，胰淀粉酶由胰腺以活性状态排入消化道，是最重要的水解碳水化合物的酶，和唾液腺分泌的淀粉酶一样都属于α-淀粉酶。淀粉酶分子量小，可通过肾小球滤过，随尿排出。当罹患胰腺疾病或有胰腺外分泌功能障碍时可引起淀粉酶活性升高或降低，因此，测定血清和尿液中的淀粉酶对胰腺炎的诊断具有重要意义。尿淀粉酶水平波动较大，所以优选血清淀粉酶检测，或两者同时测定。
α-淀粉酶是最早应用于临床检验的一个酶，早在20世纪初，就用来诊断急性胰腺炎，但是血清和尿液中的α-淀粉酶测定，长期以来一直是最难标准化的分析法。
其诊断方法：血、尿α-淀粉酶(AMY)测定在临床上的应用已有很长的历史，到目前为止，测定方法已不下200种。应用于淀粉酶测定的底物种类繁多，早期的测定方法所采用的底物是淀粉，六十年代出现了以染色淀粉为底物的测定方法，由于淀粉结构组成的不确定性及酶解产物的不均一性，使酶促反应不能按化学式量进行计算。应用不同来源、厂家、批号的淀粉作底物时，测得结果差别较大，方法不易标准化。染色淀粉中色素的加入量不易控制，操作繁杂，不适合自动分析。七十年代后期，国外出现了以具有明确结构组成的人工合成底物进行α-淀粉酶测定的方法，这些方法成为现在检测α-淀粉酶的主流，但是各个方法也存在着一些弊端，IFCC批准了用亚乙基封闭的G7-PNP作底物的酶偶联法(EPS法)作为临时推荐方法。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种稳定的α-淀粉酶检测试剂盒，本发明采用IFCC批准的对于α-淀粉酶检测的参考方法，将其制备成适用于全自动生化仪的试剂盒，使得操作更为简便，同时通过加入十二烷基苯磺酸钠改善了试剂盒的性能。采用此方法重复性好，试剂稳定，灵敏度高，线性范围广。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种稳定的α-淀粉酶检测试剂盒，包括试剂R1及试剂R2，所述试剂R1的各组分及浓度包括：
所述试剂R2的各组分及浓度包括：
优选地，所述试剂R1中的缓冲液的pH 7.0～8.0。
优选地，所述试剂R1中的缓冲液包括甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、HEPES缓冲液中的一种或几种的混合。
优选地，所述试剂R1中的稳定剂包括牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖或螯合剂EDTA中的一种。
优选地，所述试剂R1中的防腐剂为叠氮钠或proclin300防腐剂。
优选地，所述试剂R2中的缓冲液的pH 7.0～8.0
优选地，所述试剂R2中的缓冲液包括甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、HEPES缓冲液中的一种或几种的混合。
优选地，所述试剂R2中的稳定剂包括牛血清白蛋白、海藻糖、蔗糖、螯合剂EDTA中的一种或几种。
优选地，所述试剂R2中的防腐剂为叠氮钠或proclin300防腐剂。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、本发明不需要复杂的预处理及特殊仪器，试剂具有足够的稳定性及易于操作等优点；
2、本发明对IFCC批准的对于α-淀粉酶检测的参考方法进行一定的改善，以达到操作简便、灵敏度高、特异性好，快速、测定结果准确可靠的目的；
3、本发明试剂中加入十二烷基苯磺酸钠，提高了底物与α-淀粉酶的反应能力，同时也加快了由α-淀粉酶辅助的水解反应，可以减少底物与酶的用量，减少了试剂的成本，同时十二烷基苯磺酸钠可阻止底物的非特异性水解，进而使得底物的稳定性显著提高，大大加强了试剂的稳定性和重复性。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为根据朗道标准品，定标AMY试剂的定标曲线图，其中X轴表示AMY的含量，Y轴表示吸光度。
图2为本发明试剂和贝克曼公司的AMY试剂相关性对比图；其中X轴表示的是本发明试剂测定的病人血清结果，Y轴表示的是贝克曼公司试剂测定的病人血清结果，相关系数R2＝0.9996，回归方程为y＝0.9732x+0.7126。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1～3
本实施例1～3涉及一种稳定的α-淀粉酶检测试剂盒，由试剂R1及试剂R2组成，所述试剂R1、R2的各组分及浓度见表1所示：
表1
本实施例1～3描述的AMY检测试剂盒，适用于各种类型的全自动生化仪，以日立7170全自动生化仪为例，其操作如表2所示。
分析方法：速率法，即试剂R1；R2的用量分别为240ul和60ul，样本量6ul；240ul试剂R1加入6ul样本于37℃5min后加入60ulR2，延迟60秒开始读点，读数时间约120秒；检测波长分别为主波长405nm，副波长505nm。
采用本试剂及上述测定方法，采用日立7170生化分析仪测得的AMY标准品(自朗道)的曲线(如图1所示)，其中X轴表示AMY含量(U/L)；Y轴表示吸光度。
表2
相关性试验的测定
使用本法发明试剂(具体配方同实施例1)和贝克曼公司的AMY试剂，采用自动7170全自动生化分析仪对50份人血清(包括正常和异常标本)按各自参数同时进行测定，对测定值进行相关性分析。按照与上述“AMY测定方法”中的参数进行测定，结果见图2，X，Y轴均为测定值(AMY的含量U/L)，
由图2的结果看出，两种试剂的相关系为R2＝0.9996，回归方程为y＝0.9732x+0.7126。结果表明本发明试剂与进口试剂测定病人血清相关性良好，具有很好的特异性和准确性。
此外，以上实验是采用日立公司制造的7170全自动生化仪进行的，但本发明的试剂不限于上述仪器，还适用于其他全自动或半自动生化分析仪。
稳定性试验
本实验目的是检测试剂的稳定性。
采用实验例1试剂、对照试剂、标准品、质控品。
机器：日立7170自动生化分析仪。
操作步骤：使用标准品定标，测定质控3次，每2个月做一次。
结果解析：根据检测数据，计算测试均值与质控值偏差。
表3结果显示，本发明试剂贮存条件下放置12个月后结果降低10％之内。市售产品试剂放置12个月后普遍检测结果下降25％-30％。，由表3数据可看出本发明试剂稳定性好于市售产品试剂。
表3
冷藏时间 0个月 2个月 4个月 6个月 8个月 10个月 12个月 14个月
质控L(均值) 86.38 85.53 85.14 83.80 81.45 79.75 78.90 77.64
相对偏差(％) 0.44 -0.54 -1.00 -2.56 -5.29 -7.26 -8.26 -9.72
质控H(均值) 311.50 309.12 305.23 305.00 296.19 292.76 288.47 284.48
相对偏差(％) 0.48 -0.28 -1.54 -1.61 -4.45 -5.56 -6.95 -8.23
灵敏度实验
本实验目的是检测本发明试剂在测试临床样本时的灵敏度。
采用实验例1试剂、对照试剂、标准品、空白溶液(一般是生理食盐水和精制水)、正常人血清样本。
机器：日立7170自动生化分析仪。
操作步骤：使用生理食盐水或是去离子水稀释血清样本，然后50％稀释成5个点，和零点一起每一个样本测试5次，计算平均值，求得SD数值。
结果解析：根据检测数据，计算SD数值和CV数值，分别计算1SD，2SD，从最小的开始，其平均值－2SD的数值在零点平均值+2SD以上的就是试剂的最小检出感度。检测各浓度结果的SD值和CV值的大小以及最小检出感度都是灵敏度好坏的重要指标。
表4显示，本发明试剂测定稀释1/8、1/4、1/2血清时，测定平均值－2SD的数值均大于零点平均值+2SD，表明本发明试剂最低检测限至少可以达到12U/L。目前市售产品最低检测限为20～25U/L。综合以上结果可以看出，本公司试剂灵敏度优于目前市售产品试剂。
表4
综上所述：通过上述检测，本发明试剂与目前市售产品试剂进行比对，本发明试剂的稳定性、灵敏度明显优越于目前大部分市售产品试剂，并且本发明不需要复杂的预处理及特殊仪器，试剂具有足够的稳定性及易于操作等优点；本发明对IFCC批准的对于α-淀粉酶检测的参考方法进行一定的改善，以达到操作简便、灵敏度高、特异性好，快速、测定结果准确可靠的目的。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。

Claims (5)

1.一种稳定的α-淀粉酶检测试剂盒，其特征在于，包括试剂R1及试剂R2；所述试剂R1的各组分及浓度包括：
所述试剂R2的各组分及浓度包括：
所述试剂R1中的稳定剂包括牛血清白蛋白、蔗糖中的一种，
所述试剂R1中的缓冲液包括甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液中的一种，
所述试剂R2中的稳定剂包括牛血清白蛋白、蔗糖中的一种，
所述试剂R2中的缓冲液包括甘氨酸缓冲液、Tris缓冲液中的一种。
2.如权利要求1所述的稳定的α-淀粉酶检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的缓冲液的pH 7.0～8.0。
3.如权利要求1所述的稳定的α-淀粉酶检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R1中的防腐剂为叠氮钠或proclin300防腐剂。
4.如权利要求1所述的稳定的α-淀粉酶检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中的缓冲液的pH 7.0～8.0。
5.如权利要求1所述的稳定的α-淀粉酶检测试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中的防腐剂为叠氮钠或proclin300防腐剂。
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