CN110551793A - α-淀粉酶检测试剂及检测方法 - Google Patents

α-淀粉酶检测试剂及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种α‑淀粉酶检测试剂，化学成分如下：NaCl 50.0～500.0mmol/L，CaCl210.0～50.0mmol/L，TRIS‑HCL缓冲液50.0～500.0mmol/L，稳定剂EDTA 1.0～5.0mmol/L，叠氮钠0.1～10.0g/L，亚乙基‑4‑硝基酚‑1,4‑α‑D‑麦芽七糖苷0.5～10.0mmol/L，α‑葡萄糖苷酶5.0～50.0KU/L；所述缓冲液为N‑2羟乙基哌嗪‑N’‑乙基磺酸缓冲液、TRIS‑HCL缓冲液或1,4‑哌嗪二乙磺酸缓冲液；所述缓冲液的PH为7.00～8.00。本发明的α‑淀粉酶检测试剂取得了如下显著的进步：(1)采用单试剂的配方工艺，减少了仪器试剂位置占用，同时使用更加方便，提高了检测工作效率；(2)特定的配方使得α‑淀粉酶检测试剂在开瓶后仍具有较好的稳定性，在开瓶65天后仍未发生变质，可以保证检测结果准确，避免了因开瓶使用后储存过久导致的试剂浪费。

Description

α-淀粉酶检测试剂及检测方法
技术领域
本发明涉及α-淀粉酶检测技术，特别涉及一种α-淀粉酶检测试剂，以及使用该试剂检测α-淀粉酶的方法。
背景技术
由于淀粉酶对底物分子大小的限定性不强，但催化水解的作用点(多糖类分子中的α-1，4糖苷键)非常明确，所以曾出现过的测定淀粉酶的方法不少于200种。早期主要是以天然淀粉为底物的测定方法，其共同缺点是天然淀粉缺少统一明确的分子结构和化学性质，因此难以达到方法学标准化；且因天然淀粉的分子量巨大，配成底物溶液时难以达到10倍Km的浓度，限制酶反应的初速率，测定的准确度和重复性较差。后期建立了避免上述两大缺陷的方法，主要是以人工合成的麦芽寡糖苷为底物的方法。其优点在于人工合成麦芽寡糖苷的结构和分子质量确定，溶解度好可配制较高浓度，以使酶反应初速率达到最大，满足零级反应的要求。这类方法均适合自动化分析，速度快，精密度高，酶的活性可以用国际单位表达。
α-淀粉酶项目是目前医院常规检测项目，α-淀粉酶检测试剂开瓶后的稳定性一直是医院关注的重点，目前同品类产品由于稳定剂与缓冲溶液无法良好匹配，开瓶后，试剂会因基质分解出硝基酚或酚基苯胺而变黄，使试剂失去反应而无法准确测得结果，具体表现为空白吸光度变高，线性范围变窄，低值重复性差等问题，导致现有产品的开瓶稳定性基本只有2～3周，诸如社区医院这样的小型医院遇到非体检时间病人少时，容易出现试剂变质导致结果不准的情况。因此，有必要研发一款开瓶后稳定性好的α-淀粉酶检测试剂，以方便试剂消耗量小的医院使用，保证结果准确。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的上述不足，本申请提供了α-淀粉酶检测试剂，该试剂在具有良好的准确度的同时，具有开瓶后稳定性好的特点，避免了因开瓶使用后储存过久试剂变质导致浪费；且本申请的检测试剂采用单试剂的配方工艺减少了仪器试剂位置占用，同时具有使用方便的特点，提高了检测工作效率。对应的，本申请还提供了一种使用前述本申请的α-淀粉酶检测试剂检测α-淀粉酶的方法。
对于检测试剂，本申请的技术方案是：
α-淀粉酶检测试剂，化学成分如下：
所述缓冲液为N-2羟乙基哌嗪-N’-乙基磺酸缓冲液、TRIS-HCL缓冲液或1,4-哌嗪二乙磺酸缓冲液；所述缓冲液的PH为7.00～8.00。
与现有技术相比，本发明的α-淀粉酶检测试剂具有特定的配方，取得了如下显著的进步：
(1)采用单试剂的配方工艺，减少了仪器试剂位置占用，同时使用更加方便，提高了检测工作效率；
(2)本发明中，缓冲液能够良好的缓解空气中二氧化碳对试剂缓冲体系的影响，进而缓解整个反应环境遭到破坏，加上本发明合适的PH选择保证了试剂中酶类物质可以保持良好活性，以及特定浓度的防腐剂，使得本发明的α-淀粉酶检测试剂可以较好的抑制气中沉降菌的污染，本发明的α-淀粉酶检测试剂在开瓶后仍具有较好的稳定性。试验表明，本申请的α-淀粉酶检测试剂在开瓶65天后仍未发生变质，可以保证检测结果准确，避免了因开瓶使用后储存过久导致的试剂浪费。
前述的α-淀粉酶检测试剂中，所述稳定剂可以选用氯化镁MgCl2或螯合剂EDTA。
前述的α-淀粉酶检测试剂中，所述防腐剂可以选用叠氮钠或Proclin300系列。
作为优化，前述的α-淀粉酶检测试剂的化学成分如下：
试验表明，采用上述配方的试剂与对比试剂的相关性较好，相关系数可以达到0.9995以上，检测准确率高。
优选的，所述缓冲液的PH为7.5。
优选的，前述的α-淀粉酶检测试剂的化学成分如下：NaCl300.0mmol/L，CaCl230.0mmol/L，TRIS-HCL缓冲液300.0mmol/L，稳定剂EDTA 3.0mmol/L，叠氮钠1.0g/L，亚乙基-4-硝基酚-1,4-α-D-麦芽七糖苷5.0mmol/L，α-葡萄糖苷酶30.0KU/L。试验表明，此时，本发明的试剂与对比试剂相关系数可以达到0.9999，回归方程为y＝0.9835x+0.489，检测准确性高。
优选的，前述的α-淀粉酶检测试剂的化学成分如下：NaCl50.0mmol/L，CaCl210.0mmol/L，TRIS-HCL缓冲液50.0mmol/L，稳定剂EDTA 1.0mmol/L，叠氮钠0.1g/L，亚乙基-4-硝基酚-1,4-α-D-麦芽七糖苷0.5mmol/L，α-葡萄糖苷酶5.0KU/L。试验表明，此时，本发明的试剂与对比试剂相关系数可以达到0.9998，回归方程为y＝0.9651x+1.0896，检测准确性高。
优选的，前述的α-淀粉酶检测试剂的化学成分如下：NaCl500.0mmol/L，CaCl250.0mmol/L，TRIS-HCL缓冲液500.0mmol/L，稳定剂EDTA 5.0mmol/L，叠氮钠10.0g/L，亚乙基-4-硝基酚-1,4-α-D-麦芽七糖苷10.0mmol/L，α-葡萄糖苷酶50.0KU/L。试验表明，此时，本发明的试剂与对比试剂相关系数可以达到0.9995，回归方程为y＝1.0147x-1.3037，检测准确性高。
对于检测方法，本申请的技术方案是：α-淀粉酶检测的检测方法，该方法使用前述本申请的α-淀粉酶检测试剂检测α-淀粉酶。本申请的检测方法在检测准确度有保证的同时，具有操作简单，方便的特点。
附图说明
图1是本发明实施例1的试剂与对比试剂的相关性对比图；
图2是本发明实施例2的试剂与对比试剂的相关性对比图；
图3是本发明实施例3的试剂与对比试剂的相关性对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式(包括具体实施例和附图)对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
使用本发明的α-淀粉酶检测试剂检测α-淀粉酶可以采用IFCC推荐的α-淀粉酶参考方法。
本发明的α-淀粉酶检测试剂适用于各种全自动生化分析仪，以东芝TBA-40FR为例，其分析方法见表1、2。
表1
样本量：6ul 试剂量：250ul 测定方法：速率法
主波长：404nm 副波长：无 校准模式：Liner
反应方向：正上升 反应温度：37℃ 反应时间：1～3min
表2
以下通过实施例1～3对本发明作进一步说明。实施例1-3中的各组分及浓度见表3。
表3
相关性试验：
使用本发明试剂和对比试剂(浙江世纪康大医疗科技股份有限公司的双试剂，中华人民共和国医疗器械注册证标号为浙械注准20182400426)，采用东芝40全自动生化分析仪对40份人血清(包括正常和异常标本)按各自参数同时进行测定，对测定值进行相关性分析，按照表1、表2中的参数进行测定，结果见图1、图2、图3，X轴为对比试剂的测定值，Y轴为本发明试剂测定值(AMY单位U/L)。由图1、图2、图3可以看出，两种试剂的相关系数分别为R2＝0.9999、R2＝0.9998、R2＝0.9995，回归方程分别为y＝0.9835x+0.489、y＝0.9651x+1.0896、y＝1.0147x-1.3037，结果表明本发明试剂与对比试剂测定病人血清相关性良好，具有很好检测准确性。
以上实验是采用东芝公司制造的TBA-40FR全自动生化仪进行的，但本发明的试剂不限于上述仪器，还适用于其他全自动或半自动生化分析仪。
开瓶稳定性试验：
本试验目的是监测试剂的开瓶稳定性，试验对象为本发明实施例1-3的检测试剂。匹配第三方朗道校准品、质控品。
仪器：东芝TBA-40FR全自动生化分析仪。
操作步骤：使用校准品定标，测定质控品3次，每3至7天测定一次。
试验方案：将本试剂开瓶置于试剂仓内，以第一次校准数据定期监测RANDOX复合质控血清所测值与其靶值偏差。
结果分析：测试质控值与质控偏差，要求≤10％。
下表4～6时开瓶65天后的稳定性试验结果。表4～6数据表明本发明试剂开瓶第65天时质控偏差仍≤10％，由此可见本试剂开瓶稳定性足够满足大至三甲医院小至社区医院日常使用，无需担心因试剂日使用量少而引起的试剂开瓶不稳定出现变质的情况。
表4：实施例1开瓶稳定试验
开瓶时间 第0天 第4天 第7天 第10天 第17天 第24天 第31天
质控L(均值) 82.1 83.8 82.3 83.5 83.0 86.35 81.7
相对偏差％ -3.4 -1.4 -3.2 -1.8 -2.3 1.6 -3.9
质控H(均值) 270.7 268.05 264 270.25 272.1 270.3 271.5
相对偏差％ 3.3 2.3 0.8 3.1 3.8 3.2 3.6
开瓶时间 第38天 第43天 第48天 第53天 第58天 第65天
质控L(均值) 88.0 84.65 85.0 84.3 85.2 83.7
相对偏差％ 3.6 -0.4 0.0 -0.8 0.2 -1.5
质控H(均值) 273.7 270.55 267.0 267.9 262 265.3
相对偏差％ 4.5 3.3 1.9 2.3 0.0 1.3
表5：实施例2开瓶稳定性试验
开瓶时间 第0天 第4天 第7天 第10天 第17天 第24天 第31天
质控L(均值) 83.9 85.1 85.4 85.3 82.0 83.2 82.8
相对偏差％ -1.3 0.1 0.5 0.4 -3.5 -2.1 -2.6
质控H(均值) 282.6 279.1 278.4 275.3 273.6 270.9 274.2
相对偏差％ 7.9 6.5 6.3 5.1 4.4 3.4 4.7
开瓶时间 第38天 第43天 第48天 第53天 第58天 第65天
质控L(均值) 87.4 84.8 84.7 85.2 88.0 84.2
相对偏差％ 2.8 -0.3 -0.4 0.2 3.5 -0.9
质控H(均值) 274.7 267.9 270.1 262 266.3 268.7
相对偏差％ 4.8 2.3 3.3 0.0 1.6 2.6
表6：实施例3开瓶稳定性试验
开瓶时间 第0天 第4天 第7天 第10天 第17天 第24天 第31天
质控L(均值) 84.2 83.5 83.1 83.6 85.3 81.8 82.7
相对偏差％ -0.9 -1.8 -2.3 -1.6 0.4 -3.8 -2.7
质控H(均值) 268.7 266.7 264.7 264.4 265.8 269.5 274.5
相对偏差％ 2.6 1.9 1.0 0.9 1.5 2.9 4.8
开瓶时间 第38天 第43天 第48天 第53天 第58天 第65天
质控L(均值) 81.9 80.7 82.0 81.2 80.3 81.4
相对偏差％ -3.6 -5.1 -3.5 -4.5 -5.5 -4.2
质控H(均值) 270.8 269.1 265.6 262.2 260.5 259.3
相对偏差％ 3.4 2.7 1.4 0.1 -0.6 -1.0
上述对本申请中涉及的发明的一般性描述和对其具体实施方式的描述不应理解为是对该发明技术方案构成的限制。本领域所属技术人员根据本申请的公开，可以在不违背所涉及的发明构成要素的前提下，对上述一般性描述或/和具体实施方式(包括实施例)中的公开技术特征进行增加、减少或组合，形成属于本申请保护范围之内的其它的技术方案。

Claims (9)

1.α-淀粉酶检测试剂，其特征在于，化学成分如下：
所述缓冲液为N-2羟乙基哌嗪-N’-乙基磺酸缓冲液、TRIS-HCL缓冲液或1,4-哌嗪二乙磺酸缓冲液；所述缓冲液的PH为7.00～8.00。
2.根据权利要求1所述的α-淀粉酶检测试剂，其特征在于：所述稳定剂为MgCl2或EDTA。
3.根据权利要求1所述的α-淀粉酶检测试剂，其特征在于：所述防腐剂为叠氮钠或Proclin300系列。
4.根据权利要求1所述的α-淀粉酶检测试剂，其特征在于，化学成分如下：
5.根据权利要求4所述的α-淀粉酶检测试剂，其特征在于：所述缓冲液的PH为7.5。
6.根据权利要求4或5所述的α-淀粉酶检测试剂，其特征在于，化学成分如下：NaCl300.0mmol/L，CaCl2 30.0mmol/L，TRIS-HCL缓冲液300.0mmol/L，稳定剂EDTA 3.0mmol/L，叠氮钠1.0g/L，亚乙基-4-硝基酚-1,4-α-D-麦芽七糖苷5.0mmol/L，α-葡萄糖苷酶30.0KU/L。
7.根据权利要求4或5所述的α-淀粉酶检测试剂，其特征在于，化学成分如下：NaCl50.0mmol/L，CaCl2 10.0mmol/L，TRIS-HCL缓冲液50.0mmol/L，稳定剂EDTA 1.0mmol/L，叠氮钠0.1g/L，亚乙基-4-硝基酚-1,4-α-D-麦芽七糖苷0.5mmol/L，α-葡萄糖苷酶5.0KU/L。
8.根据权利要求4或5所述的α-淀粉酶检测试剂，其特征在于，化学成分如下：NaCl500.0mmol/L，CaCl2 50.0mmol/L，TRIS-HCL缓冲液500.0mmol/L，稳定剂EDTA 5.0mmol/L，叠氮钠10.0g/L，亚乙基-4-硝基酚-1,4-α-D-麦芽七糖苷10.0mmol/L，α-葡萄糖苷酶50.0KU/L。
9.α-淀粉酶的检测方法，其特征在于，该方法使用权利要求1-7任一权利要求所述的α-淀粉酶检测试剂检测α-淀粉酶。
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