CN102399851A - 酶法唾液酸检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种酶法唾液酸检测试剂盒，该试剂盒由试剂1和试剂2两种试剂构成，其中试剂1的各组分为：缓冲液、神经氨酸苷酶、乳酸脱氢酶、表面活性剂、稳定剂、防腐剂，试剂2的各组分为：缓冲液、还原性辅酶、神经氨酸醛缩酶、稳定剂、防腐剂。该试剂盒测定准确、方便适用、稳定可靠、成本低廉。
Description
技术领域
本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种酶法唾液酸检测试剂盒。
背景技术
N-乙酰神经氨酸(N-Acetylneuraminic Acid，NANA)，俗称唾液酸(Sialic acid，SA)，是多种天然神经氨酸衍生物之一，其母体结构是九个碳原子组成的内环氨基酸，是一族化合物的总称，它由于最初从颌下腺粘蛋白中分离出而得名。
唾液酸分布于哺乳动物体内，血管内皮细胞内含量尤其丰富。人体血清中总唾液酸(total sialic acid，TSA)含量约为1.5～2.5mmol/L，包括游离唾液酸和结合唾液酸。其中游离唾液酸的含量较低，约为1～3μmol/L；与脂蛋白和糖蛋白结合的唾液酸即结合唾液酸，是血清中唾液酸的主要存在形式。唾液酸位于糖蛋白、糖脂的寡糖连的末端，与细胞识别、分化以及粘附有关，参与受体组成，并诱导细胞增殖、死亡。
正常代谢时，人体血清中唾液酸含量稳定。当组织细胞恶变时，细胞表面糖蛋白在结构和功能上均发生明显改变，结合在糖蛋白上的唾液酸随异常表达的糖蛋白脱落入血，是血液中唾液酸含量升高的原因之一。许多研究发现带瘤动物及肿瘤患者的瘤体及血液中唾液酸含量增加并随病情的加重而升高、随病情的缓解而降低，因此在临床检验中唾液酸常被作为恶性肿瘤存在和发展监控的一个指标，被广泛地应用于很多肿瘤的诊断和监控中。
目前，检测总唾液酸含量的方法有很多，例如HPLC法、酶法、化学比色法(常见的有硫代巴比妥酸法、间苯二酚法)。HPLC方法具有灵敏度高、特异性好的优点，但是仪器昂贵且不适合临床批量检测。化学比色法虽然价格比较低，但是特异性低，操作复杂繁琐，需要高温萃取，不适合自动化分析，其试剂成分具有一定的腐蚀性和人体危害性。酶法通常通过神经氨酸苷酶(Neuraminidase，NA)来进行检测血清样本中的唾液酸含量。其反应原理为神经氨酸苷酶催化水解与糖蛋白、寡糖连接的N-乙酰神经氨酸残基，使唾液酸糖苷键断裂生成游离的N-乙酰神经氨酸，N-乙酰神经氨酸在神经氨酸醛缩酶的作用下生产成丙酮酸和甘露糖胺，丙酮酸与还原性辅酶(NADH)在乳酸脱氢酶(LDH)的作用下生成乳酸和NAD+，而NADH在340nm有特异性吸收，通过检测NADH的减少量就可以检测出血清样本中的唾液酸含量。其反应过程如下：
酶分析法具有特异性高，操作简单快捷、准确安全、可自动化分析的优点，但由于试剂中使用的还原性辅酶NADH在该反应条件下不稳定，必须制成干粉试剂才能长期保存稳定，复溶后必须尽快使用，否则在保存过程中由于NADH降解速度较快对试剂性能会造成很大影响，无法满足临床检测需要。同时神经氨酸苷酶、尤其是神经氨酸醛缩酶在该反应条件下不稳定，效价降低很快，因此临床上依然存在对测定准确、方便适用、稳定可靠、成本低廉的酶法唾液酸检测试剂盒的需要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种测定准确、方便适用、稳定可靠、成本低廉的酶法唾液酸检测试剂盒。
本发明所采用的技术方案为：
一种酶法唾液酸检测试剂盒，由以下两种试剂构成，其中：
试剂1：
试剂2：
所述试剂1和试剂2中的缓冲液为三羟甲基氨基缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、MES缓冲液、Good’s缓冲液、硼酸缓冲液中的一种或几种，试剂1中缓冲液的pH为6.0-8.0，试剂2中缓冲液的pH为8.5-10.0。
所述试剂1中的表面活性剂为非离子表面活性剂，进一步优选为TWEEN系列表面活性剂或SPAN系列表面活性剂或TRITON系列表面活性剂。
所述试剂1和试剂2中的稳定剂为聚乙二醇、丙三醇、丙二醇、蔗糖、海藻糖、山梨醇、BSA中的一种或者几种。
所述试剂1和试剂2中的防腐剂为山梨酸钾、苯甲酸钠、叠氮钠、亚硝酸钠、Proclin300中的一种或几种。
本发明试剂1和试剂2的配制方法为常规方法，即试剂1和试剂2所述组分分别加入蒸馏水后各自混合搅匀即可。
本发明酶法唾液酸检测试剂盒测定样本中的唾液酸的测试条件如下：温度30-37℃；比色杯光径为1.0cm。检测主波长340nm，副波长405nm。
应用本发明测定试剂盒测定样本中唾液酸的方法如下：样品(校准管以校准品做样品)加试剂1混匀，30-37℃孵育3-5min后加入试剂2混匀，30-37℃反应90s后，监测90s吸光度变化。其中样本用量5-15μl，试剂1用量240μl，试剂2用量80μl。
本发明试剂盒测定样本中唾液酸含量按以下公式进行计算：
本发明采用双试剂的方法解决了酶法唾液酸检测方法中NADH及关键工具酶不稳定带来的试剂检测步骤复杂且不稳定的问题，得到的液体双试剂2-8℃至少可稳定12个月，能够直接使用，无需复溶，方法简便，易操作，可快速得到检测结果，不需要特殊或额外的仪器，便于行业内推广应用。
附图说明
图1所示的是本发明酶法唾液酸检测试剂盒的线性范围实验的数据分布图。
图2所示的是本发明酶法唾液酸检测试剂盒的方法学对比实验的数据分布图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步具体描述，但不局限于此。
实施例1：
酶法唾液酸检测试剂盒，由以下两种试剂构成，其中：
试剂1：
试剂2：
试剂1和试剂2的配制方法为常规方法，即试剂1和试剂2所述组分分别加入蒸馏水后各自混合搅匀即可。
实施例2：
酶法唾液酸检测试剂盒，由以下两种试剂构成，其中：
试剂1：
试剂2：
实施例2试剂盒的制备方法同实施例1。
实施例3
酶法唾液酸检测试剂盒，由以下两种试剂构成，其中：
试剂1：
试剂2：
实施例3试剂盒的制备方法同实施例1。
本发明酶法唾液酸检测试剂盒测定样本中的唾液酸的测试条件如下：温度：30-37℃；比色杯光径为1.0cm。检测主波长340nm，副波长405nm。
应用本发明测定试剂盒测定样本中唾液酸的方法如下：样品(校准管以校准品做样品)加试剂1混匀，30-37℃孵育3-5min后加入试剂2混匀，30-37℃反应90s后，监测90s吸光度变化。其中样本用量8μl，试剂1用量240μl，试剂2用量80μl。
本发明试剂盒测定样本中唾液酸含量按以下公式进行计算：
得到本发明酶法唾液酸检测试剂盒测定样本中唾液酸的浓度。
下面结合实施例对本发明酶法唾液酸检测试剂盒的性能进行说明。
1、试剂盒稳定性实验
(1)37℃加速稳定性实验
将实施例3配制的试剂进行37℃加速稳定性实验(37℃加速稳定性试验7天可模拟现实4-8℃保存1年)，吸光度检测结果如表1所示。
表1
(2)4-8℃稳定性实验
将实施例3配制的试剂在4-8℃保存1年，吸光度检测结果如表2所示。
表2
(3)开盖稳定性实验
将实施例3配制的试剂定标后开盖放置试剂仓中，定期检测固定质控品，检测试剂在使用过程中的稳定性性能。吸光度检测结果如表3所示。
表3
(4)运输条件下的稳定性实验
将实施例3配制的试剂进行运输条件下稳定性实验，吸光度检测见表4。
表4
由以上数据明显显示，按照本发明制备的试剂盒，其试剂稳定性好。
2、线性范围
将高值标本进行等比稀释10个浓度，在日立7060全自动生化仪上采用实施例3制备的试剂连续测定3次，计算其均值。计算理论值和检测均值之间的线性偏差。要求回归方程的回归系数R2＞0.99。测定数据如表5所示，将测定均值进行制图，如图1所示。
表5
根据以上数据可知，本发明试剂盒在0-200mg/dl的范围内检测呈线性分布。
3、试剂盒的准确值、精密度检测
对靶值为58.6(46.9-70.3)mg/dl的质控液I和靶值为145.2(116.2-174.2)mg/dl的质控液II在相同条件下，采用实施例3制备的试剂盒对同一质控液的唾液酸浓度连续检测20次，将检测结果的平均值与靶值范围进行比较，以检测所述的试剂盒的准确性，同时比较每个测定的变异系数，以检测所述的试剂盒实施例的精密度，结果如表6所示。
表6
表6的结果表明：试剂盒20次检测结果的平均值在靶值范围内，不准确度相对偏差CV(％)不超过±5％，这说明本发明试剂盒的准确度符合诊断试剂盒的技术指标。
4、方法学对比实验
使用实施例3制备的酶法唾液酸检测试剂盒和HPLC法分部测量50例临床样本血清的唾液酸含量，测量数据如表7所示。
表7
| 编号 | 用实施例制备的试剂盒酶法检测 | HPLC检测 |
| 1 | 67.2 | 68.3 |
| 2 | 68.1 | 67.8 |
| 3 | 74.1 | 75.1 |
| 4 | 66.7 | 65.4 |
| 5 | 65.5 | 64.2 |
| 6 | 68.4 | 59.1 |
| 7 | 73.2 | 71.3 |
| 8 | 55.8 | 55.9 |
| 9 | 57.7 | 58.1 |
| 10 | 65.7 | 64.2 |
| 11 | 66.8 | 65.1 |
| 12 | 67.2 | 68.2 |
| 13 | 61.9 | 50.3 |
| 14 | 58.6 | 57.3 |
| 15 | 73.4 | 74.2 |
| 16 | 56.5 | 55.5 |
| 17 | 53.5 | 54.1 |
| 18 | 65.4 | 67.2 |
| 19 | 66 | 64.8 |
| 20 | 56.8 | 58.2 |
| 21 | 52.1 | 53.1 |
| 22 | 61 | 60.6 |
| 23 | 59.7 | 58.4 |
| 24 | 66.4 | 65.3 |
| 25 | 68.9 | 67.8 |
| 26 | 61.7 | 60.3 |
| 27 | 71.5 | 72.2 |
| 28 | 68.8 | 67.7 |
| 29 | 59.4 | 58.2 |
| 30 | 60.3 | 59.9 |
| 31 | 57.5 | 58.2 |
| 32 | 72.6 | 73.3 |
| 33 | 85.8 | 84.9 |
| 34 | 86.1 | 87 |
| 35 | 96.8 | 99.8 |
| 36 | 99.8 | 101.3 |
| 37 | 82.6 | 80.6 |
| 38 | 196.4 | 198.4 |
| 39 | 183.3 | 182.1 |
| 40 | 202.1 | 204.8 |
| 41 | 82.6 | 79.8 |
| 42 | 78.3 | 77.8 |
| 43 | 44.3 | 43.8 |
| 44 | 45 | 42.8 |
| 45 | 39.6 | 37.8 |
| 46 | 43.3 | 42.6 |
| 47 | 41.9 | 42 |
| 48 | 44.1 | 44.4 |
| 49 | 30.8 | 28.1 |
| 50 | 37.2 | 39.3 |
根据上述数据所作的相关性曲线如图2所示，由图可知，二者拟合良好。
综上所述，本发明酶法唾液酸检测试剂盒稳定性好，检测结果准确可靠、精确度高，适合在行业内推广应用。
实施例所用的原料，除另有说明外，均为市售工业品。
本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
Claims (6)
1.一种酶法唾液酸检测试剂盒，其特征在于：由以下两种试剂构成，其中：
试剂1：
试剂2：
2.根据权利要求1所述的酶法唾液酸检测试剂盒，其特征在于：所述试剂1和试剂2中的缓冲液为三羟甲基氨基缓冲液、甘氨酸-NaOH缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、MES缓冲液、Good’s缓冲液、硼酸缓冲液中的一种或几种，试剂1中缓冲液的pH为6.0-8.0，试剂2中缓冲液的pH为8.5-10.0。
3.根据权利要求1所述的酶法唾液酸检测试剂盒，其特征在于：所述试剂1中的表面活性剂为非离子表面活性剂。
4.根据权利要求3所述的酶法唾液酸检测试剂盒，其特征在于：所述试剂1中的表面活性剂为TWEEN系列表面活性剂或SPAN系列表面活性剂或TRITON系列表面活性剂。
5.根据权利要求1所述的酶法唾液酸检测试剂盒，其特征在于：所述试剂1和试剂2中的稳定剂为聚乙二醇、丙三醇、丙二醇、蔗糖、海藻糖、山梨醇、BSA中的一种或者几种。
6.根据权利要求1所述的酶法唾液酸检测试剂盒，其特征在于：所述试剂1和试剂2中的防腐剂为山梨酸钾、苯甲酸钠、叠氮钠、亚硝酸钠、Proclin 300中的一种或几种。
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| C53 | Correction of patent of invention or patent application | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 315104 Zhejiang city of Ningbo province Yinzhou District Qiming Road No. 299 Applicant after: Ningbo Meikang Biotechnology Co., Ltd. Address before: 315104 Zhejiang city of Ningbo province Yinzhou District Qiming Road No. 299 Applicant before: Meikang Biotech Co., Ltd., Ningbo |
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| COR | Change of bibliographic data |
Free format text: CORRECT: APPLICANT; FROM: MEIKANG BIOTECH CO., LTD., NINGBO TO: NINGBO MEIKANG BIOTECHNOLOGY CO., LTD. |
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20120404 |