CN102766677A - 乳酸脱氢酶检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents

乳酸脱氢酶检测试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了乳酸脱氢酶检测试剂盒及其制备方法。本发明试剂盒由彼此独立的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成；其中，试剂Ⅰ的组分包括：生物缓冲剂，金属离子络合物，乳酸脱氢酶的反应底物，表面活性剂，乳酸脱氢酶酶活激活剂，防腐剂和水；试剂Ⅱ的组分包括：生物缓冲剂，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化态，表面活性剂，防腐剂和水。本发明检测试剂盒采用双试剂模式有效避免了非特异性反应的干扰，同时可最大限度减少来自样本本身浊度的干扰，保证了测定结果的稳定可靠，具有稳定性好，精确度高，线性测试范围宽，重复性好，抗干扰性强等优点。此外，本发明检测试剂盒在检测过程中不需对样本进行预稀释，方便临床使用，操作简单、快速，适用于全自动生化分析仪。

Description

乳酸脱氢酶检测试剂盒及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种人体内酶含量的检测试剂盒，尤其涉及一种乳酸脱氢酶测定试剂盒及其制备方法，本发明还涉及该乳酸脱氢酶测定试剂盒在检测人体内乳酸脱氢酶含量的使用方法，属于人体内乳酸脱氢酶含量的检测领域。
背景技术
乳酸脱氢酶（LDH）是一种糖酵解酶，存在于机体所有组织细胞的胞质内，其中以肾脏含量较高。乳酸脱氢酶是能催化乳酸脱氢生成丙酮酸的酶，几乎存在于所有组织中。当人体出现急性肝炎、急性心肌梗死、充血性心功能不全、肌营养不良、多发性肌炎、恶性肿瘤、肝癌、肺癌、急性白血病、淋巴肉瘤、恶性贫血、肝硬化、阻塞性黄疸、肠梗阻等疾病时，血液中的LDH活力会升高；当人体内分泌失调、过度劳累或睡眠不佳时会导致血清中LDH活力会降低，因此可以通过检测血清中LDH的活力来观察诊断疾病。
文献报道了一种用速率法测定血清中乳酸脱氢酶的方法（颜兴伟，韩书炉等；速率法测定血清中乳酸脱氢酶，上海医学检验杂志，1991），该方法虽然比较简单，但是由于所用的辅酶I溶液需要临时配制，会给检测工作带来一些不必要的麻烦，且每批新配制的试剂无法保证试剂的稳定，会对结果造成一定程度的影响，从而对其推广应用造成了一些不良影响。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种乳酸脱氢酶检测试剂盒；
本发明的目的之二是提供一种制备所述乳酸脱氢酶检测试剂盒的方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
一种乳酸脱氢酶检测试剂盒，由彼此独立的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成；其中，试剂Ⅰ的组分包括：生物缓冲剂，金属离子络合物，乳酸脱氢酶的反应底物，表面活性剂，乳酸脱氢酶酶活激活剂，防腐剂和水；试剂Ⅱ的组分包括：生物缓冲剂，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化态，表面活性剂，防腐剂和水。
为了达到更好的检测效果，每1升试剂Ⅰ中各组分的用量优选为：生物缓冲剂1-100g，金属离子络合物0.5-10g，乳酸脱氢酶的反应底物0.05-5g，表面活性剂0.55-22.5g，乳酸脱氢酶酶活激活剂0.01-0.2g，防腐剂0.25-10g，余量为水；
进一步优选的，每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂5-50g，金属离子络合物0.8-4g，乳酸脱氢酶的反应底物0.2-1g，表面活性剂0.25-22g，乳酸脱氢酶酶活激活剂0.05-0.1g，防腐剂0.75-5g；
最优选的，每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂23g，金属离子络合物2g，乳酸脱氢酶的反应底物0.5g，表面活性剂5.5g，乳酸脱氢酶酶活激活剂0.075g，防腐剂2.6g。
每1升试剂Ⅱ中各组分的用量优选为：生物缓冲剂1-100g，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化态0.5-15g，表面活性剂0.1-5ml，防腐剂0.1-10g，余量为水;
进一步优选的，每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：生物缓冲剂5-50g，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化态1-10g，表面活性剂0.5-2ml，防腐剂0.5-2g;
最优选的，每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：生物缓冲剂20g，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化态5g，表面活性剂1.0ml，防腐剂1g。
试剂Ⅰ或试剂Ⅱ中所述的生物缓冲剂是能够用于中和酸碱的各种生物缓冲剂，例如可以是三羟甲基甲胺基乙磺酸（TES）、2-(N-吗啡啉）乙磺酸（MES）、N-(2-羟乙基)哌嗪-N'-2-乙烷磺酸（HEPES）、三羟甲基甲胺基丙磺酸（TAPS）、哌嗪-1,4-二羟基丙磺酸（POPSO）等各种常用生物缓冲液，为了达到更好的检测效果，试剂Ⅰ中所述的生物缓冲剂优选为三羟甲基甲胺基乙磺酸，试剂Ⅱ中所述的生物缓冲剂优选为2-(N-吗啡啉）乙磺酸。
试剂Ⅰ中所述的金属离子络合物能够络合检测样本中的二价金属离子，以减少二价金属离子造成的干扰；因此，能够络合二价金属离子的各种金属离子络合物均能够适用于作为试剂Ⅰ中的金属离子络合物，例如：乙二胺四乙酸二钠，氨基三乙酸、二亚乙基三胺五乙酸及其盐等，本发明优选乙二胺四乙酸二钠（EDTA）作为试剂Ⅰ中的金属离子络合物。
试剂Ⅰ中所述的乳酸脱氢酶的反应底物可以是L-乳酸锂、丙酮酸等，本发明优选L-乳酸锂作为试剂Ⅰ中所述的乳酸脱氢酶的反应底物。
试剂Ⅰ或试剂Ⅱ中所述的表面活性剂主要起到促进检测样本中各物质的溶解，达到减少样本浊度对测定结果的影响的目的；因此，现有的具有增溶性质的表面活性剂都可作为试剂Ⅰ或试剂Ⅱ中所述的表面活性剂，例如，曲拉通X-100、乙基苯基聚乙二醇等。为了达到更好的效果，试剂Ⅰ中优选将曲拉通X-100和乙基苯基聚乙二醇组合在一起使用，其中，每1升试剂Ⅰ中曲拉通X-100的用量为0.05～2.5m l，优选为0.15～2ml，最优选为0.5ml；每1升试剂Ⅰ中乙基苯基聚乙二醇的用量为0.5～20g，优选为1～10g，最优选为10g。试剂Ⅱ中所述的表面活性剂优选为曲拉通X-100。
试剂Ⅰ所述的乳酸脱氢酶酶活激活剂能够起到激活乳酸脱氢酶酶活性的作用，从而使检测反应能够顺利进行；因此，任何一种能够激活乳酸脱氢酶酶活的激活剂均可作为试剂Ⅰ中的乳酸脱氢酶酶活激活剂；优选的，本发明中所述的乳酸脱氢酶酶活激活剂为含有Mg2+的无机化合物，更优选为MgCl2.6H2O。
试剂Ⅱ中所述的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化态（NAD+）用于在乳酸脱氢酶催化的反应过程中被还原为NADH。
试剂Ⅰ或试剂Ⅱ中所述的防腐剂主要是为了防止细菌滋生导致的产品变质，所以任何一种能起到防止细菌滋生作用的防腐剂均能适用于本发明；优选的，本发明试剂Ⅰ或试剂Ⅱ中所述的防腐剂为咪唑烷基脲。
本发明检测试剂盒中所用到的每种组分均能通过商业途径从生物试剂公司或医药公司购买得到。
本发明的另外一个目的是提供一种制备所述乳酸脱氢酶检测试剂盒的方法，包括：
（1）制备试剂Ⅰ：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容至1升；（2）制备试剂Ⅱ：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容至1升；（3）将试剂Ⅰ和试剂Ⅱ单独分装，密封，即得。
本发明的又一目的是提供所述乳酸脱氢酶检测试剂盒检测样品中乳酸脱氢酶含量的检测方法，包括以下步骤：向待检测样本（校准管以校准品做样品，空白以蒸馏水为样品）中依次加入试剂Ⅰ和试剂Ⅱ混匀，其中，待检测样品用量为6uL，试剂Ⅰ用量为180～320uL，试剂Ⅱ用量为40～120uL；37℃恒温60秒后，空白管调零，波长340nm，测定初始吸光度，然后在120秒内准确测定平均每分钟吸光度变化率ΔA/min。根据两点校准品浓度和对应吸光度变化率ΔA/min，采用两点线性校准模式确定工作曲线，样本吸光度变化在标准工作曲线上相对应的浓度值即为测定浓度。
本发明检测试剂盒采用双试剂模式有效地避免了非特异性反应的干扰，同时可以最大限度减少来自样本本身浊度的干扰，保证了测定结果的稳定可靠，具有稳定性好，精确度高，线性测试范围宽，重复性好，抗干扰性强等优点。此外，本发明检测试剂盒在检测过程中不需要对样本进行预稀释，方便临床使用，操作简单、快速，适用于全自动生化分析仪，具有较大的临床实用价值。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1乳酸脱氢酶检测试剂盒的制备：
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
Figure BDA00001964445300051
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
Figure BDA00001964445300052
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
实施例2乳酸脱氢酶检测试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
Figure BDA00001964445300062
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
实施例3乳酸脱氢酶检测试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
Figure BDA00001964445300071
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
Figure BDA00001964445300072
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
实施例4乳酸脱氢酶检测试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
Figure BDA00001964445300081
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
Figure BDA00001964445300082
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
实施例5乳酸脱氢酶检测试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
Figure BDA00001964445300083
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
Figure BDA00001964445300091
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
实施例6乳酸脱氢酶检测试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
Figure BDA00001964445300092
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
Figure BDA00001964445300093
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
实施例7乳酸脱氢酶检测试剂盒的制备
1、试剂Ⅰ的制备：
按所述用量取各组分：
Figure BDA00001964445300101
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
2、试剂Ⅱ的制备：
按所述用量取各组分：
Figure BDA00001964445300102
将上述各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，定容至1升，密封保存，备用。
试验例1本发明检测试剂盒的线性范围检测试验
1、供试试剂盒：实施例1-7所制备的试剂盒；
2、试验方法及结果
配制0U/L，200U/L，400U/L，600U/L，800U/L，1000U/L，1200U/L，1400U/L的乳酸脱氢酶标准溶液，分别用本发明实施例1-7所制备乳酸脱氢酶测定试剂盒和对比检测方法（颜兴伟，韩书炉；速率法测定血清中乳酸脱氢酶，上海医学检验杂志，1991）来测定乳酸脱氢酶浓度，测定结果见表1。
本发明乳酸脱氢酶测定试剂盒测定样本中乳酸脱氢酶的方法如下：向待检测样本（校准管以校准品做样品，空白以蒸馏水为样品）中依次加入试剂Ⅰ和试剂Ⅱ混匀，其中，待检测样品用量为6uL，试剂1用量为180～320uL，试剂2用量为40～120uL；37℃恒温60秒后，空白管调零，波长340nm，测定初始吸光度，然后在120秒内准确测定平均每分钟吸光度变化率ΔA/min。根据两点校准品浓度和对应吸光度变化率ΔA/min，采用两点线性校准模式确定工作曲线，样本吸光度变化在工作曲线上相对应的浓度值即为测定浓度。
表1乳酸脱氢酶测定方法线性范围比对
  理论值(U/L)   0   200   400   600   800   1000   1200   1400
  本发明试剂盒测值(U/L)   0   201.9   403.1   597.6   795.3   1002.6   1208.9   1382.5
  对比检测方法测值(U/L)   0.2   206.7   408.5   607.8   810.7   991.4   1082.4   1175.2
两种测定方法的线性范围比对结果见表1。从检测结果可见，本发明乳酸脱氢酶检测试剂盒的线性范围比对比检测方法的线性范围高40%。本发明检测试剂盒中的所有试剂测试结果稳定，而对比检测方法由于每一批试剂都需要重新配制，导致检测结果的稳定相较差。
试验例2本发明检测试剂盒准确度检测试验
1、供试试剂盒：实施例1-7所制备的试剂盒；
2、试验方法及结果
本发明乳酸脱氢酶检测试剂盒和对比检测方法检测乳酸脱氢酶含量的方法同试验例1。以英国朗道校正品定标，测定英国朗道高值和低值质控品。连续用本发明乳酸脱氢酶测定试剂盒和对比检测方法（颜兴伟，韩书炉；速率法测定血清中乳酸脱氢酶，上海医学检验杂志，1991）进行准确度实验，试验结果见表2。
表2乳酸脱氢酶测定方法准确度比对
Figure BDA00001964445300121
由表2可以看出，本发明检测试剂盒的准确度高于对比检测方法，且本发明试剂盒同一批次的样品准确度更高，而对比检测方法样品每次使用时需要现配，其准确度难以保证。
试验例3本发明检测试剂盒的精确度检测试验
1、供试试剂盒：实施例1-7所制备的试剂盒；
2、试验方法及结果
精确度就是检测的重现性。本试验以英国朗道校正品定标，测定英国朗道高值和低值质控品，连续用本发明检测试剂盒测定20次，测量本发明检测试剂盒精确度，将其与对比检测方法（颜兴伟，韩书炉；速率法测定血清中乳酸脱氢酶，上海医学检验杂志，1991）进行精确度比较，试验结果见表3。其中，本发明乳酸脱氢酶检测试剂盒和对比检测方法检测乳酸脱氢酶含量的方法同试验例1。
表3乳酸脱氢酶测定方法精确度比对
Figure BDA00001964445300122
Figure BDA00001964445300131
从表3可以看出，本发明检测试剂盒对英国朗道质控品测值的精确度要高于对比检测方法的精确度。
试验例4本发明检测试剂盒抗干扰性能试验
1、供试试剂盒：实施例1-7所制备的试剂盒；
2、试验方法及结果
在英国朗道高值质控品中加入表4中所述的四种干扰物，再分别用本发明检测试剂盒和对比检测方法（颜兴伟，韩书炉；速率法测定血清中乳酸脱氢酶，上海医学检验杂志，1991）进行乳酸脱氢酶含量的测定，测定结果见表5。其中，本发明乳酸脱氢酶检测试剂盒和对比检测方法检测乳酸脱氢酶含量的方法同试验例1。
表4乳酸脱氢酶测定方法抗干扰性能比对
Figure BDA00001964445300132
从表4可以看出本发明试剂盒检测的抗干扰性能要明显优于对比检测方法。

Claims (10)

1.一种乳酸脱氢酶检测试剂盒，其特征在于：由彼此独立的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成；其中，试剂Ⅰ的组分包括：生物缓冲剂，金属离子络合物，乳酸脱氢酶的反应底物，表面活性剂，乳酸脱氢酶酶活激活剂，防腐剂和水；试剂Ⅱ的组分包括：生物缓冲剂，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化态，表面活性剂，防腐剂和水。
2.按照权利要求1所述的乳酸脱氢酶检测试剂盒，其特征在于：每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂1-100g，金属离子络合物0.5-10g，乳酸脱氢酶的反应底物0.05-5g，表面活性剂0.55-22.5g，乳酸脱氢酶酶活激活剂0.01-0.2g，防腐剂0.25-10g，余量为水；
每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：生物缓冲剂1-100g，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化态0.5-15g，表面活性剂0.1-5ml，防腐剂0.1-10g，余量为水。
3.按照权利要求2所述的乳酸脱氢酶检测试剂盒，其特征在于：每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂5-50g，金属离子络合物0.8-4g，乳酸脱氢酶的反应底物0.2-1g，表面活性剂0.25-22g，乳酸脱氢酶酶活激活剂0.05-0.1g，防腐剂0.75-5g；
每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：生物缓冲剂5-50g，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化态1-10g，表面活性剂0.5-2ml，防腐剂0.5-2g。
4.按照权利要求3所述的乳酸脱氢酶检测试剂盒，其特征在于：每1升试剂Ⅰ中各组分的用量为：生物缓冲剂23g，金属离子络合物2g，乳酸脱氢酶的反应底物0.5g，表面活性剂5.5g，乳酸脱氢酶酶活激活剂0.075g，防腐剂2.6g；
每1升试剂Ⅱ中各组分的用量为：生物缓冲剂20g，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氧化态5g，表面活性剂1.0ml，防腐剂1g。
5.按照权利要求1-4任何一项的乳酸脱氢酶检测试剂盒，其特征在于：试剂Ⅰ中所述的生物缓冲剂为三羟甲基甲胺基乙磺酸，试剂Ⅱ中所述的生物缓冲剂为2-(N-吗啡啉）乙磺酸。
6.按照权利要求1-4任何一项的乳酸脱氢酶检测试剂盒，其特征在于：所述的金属离子络合物是乙二胺四乙酸二钠；所述乳酸脱氢酶的反应底物是L-乳酸锂或丙酮酸。
7.按照权利要求1-4任何一项的乳酸脱氢酶检测试剂盒，其特征在于：试剂Ⅰ中所述的表面活性剂由曲拉通X-100和乙基苯基聚乙二醇组成；其中，每1升试剂Ⅰ中曲拉通X-100的用量为0.05-2.5ml，优选为0.15-2ml，最优选为0.5ml；每1升试剂Ⅰ中乙基苯基聚乙二醇的用量为0.5-20g，优选为1-10g，最优选为10g；试剂Ⅱ中所述的表面活性剂为曲拉通X-100。
8.按照权利要求1-4任何一项的乳酸脱氢酶检测试剂盒，其特征在于：试剂Ⅰ中所述乳酸脱氢酶酶活激活剂为含有Mg2+的无机化合物，优选为MgCl2.6H2O。
9.按照权利要求1-4任何一项的乳酸脱氢酶检测试剂盒，其特征在于：试剂Ⅰ或试剂Ⅱ中所述的防腐剂为咪唑烷基脲。
10.一种制备权利要求1-4任何一项所述乳酸脱氢酶检测试剂盒的方法，包括：（1）制备试剂Ⅰ：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容至1升；（2）制备试剂Ⅱ：将各组分溶解于蒸馏水或双蒸水中，混合均匀，定容至1升；（3）将试剂Ⅰ和试剂Ⅱ单独分装，密封，即得。
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