CN109182285A - 坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶及其应用和制备方法 - Google Patents

坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶及其应用和制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶，其乳酸脱氢酶的基因序列如SEQ ID No.1所示，乳酸脱氢酶的蛋白质序列如SEQ ID No.2所示。所述乳酸脱氢酶的来源是坎德勒氏乳杆菌。所述乳酸脱氢酶具有将酮酸转化为乳酸的活性，可用于D‑乳酸的制备、体外诊断试剂盒的开发。本发明得到的一种坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶，可通过大肠杆菌原核表达和真核表达系统获得，并制备纯酶或粗酶液或用于生物催化反应。利用制得的乳酸脱氢酶，在磷酸盐缓冲液体系中，在25℃条件下，可将丙酮酸转化为乳酸，其转化率达到了93%以上。

Description

坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶及其应用和制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别是一种坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶及其应用和制备方法。
背景技术
乳酸脱氢酶(LDH)，广泛存在于动物组织和各种微生物细胞内，是以NADH为辅酶,将丙酮酸经过生化反应生成L-乳酸和D-乳酸，是乳酸菌合成乳酸的关键酶。乳酸脱氢酶在生物制化工领域可用于苯乳酸等产品制备，临床上可作为心肌疾病、肝病等的诊断指标，同时也可作为食品添加剂用于发酵奶制品如干酪、腌渍品、糖果制品和饮料的生产。除此之外，乳酸脱氢酶在体外诊断领域有着广泛的应用，是丙氨酸氨基转移酶试剂盒等体外诊断试剂的主要原料，主要应用于生化研究、白血病和心肌梗塞等疾病的诊断。因此，开发新型、具有高催化活性的乳酸脱氢酶的具有重要的实际意义和良好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述现有技术的不足而提供一种坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶及其应用和制备方法。
为了实现上述目的，本发明所设计的一种坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶，其乳酸脱氢酶的基因序列如SEQ ID No.1所示，乳酸脱氢酶的蛋白质序列如SEQ ID No.2所示。
所述乳酸脱氢酶的来源是坎德勒氏乳杆菌(Weissella kandleri)。
所述乳酸脱氢酶具有将酮酸转化为乳酸的活性，可用于D-乳酸的制备、体外诊断试剂盒的开发。
本发明还公开了一种坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶基因的获取
本发明所提供的乳酸脱氢酶的基因序列如SEQ ID No.1所示，由人工合成来的；
步骤二、工程表达菌株的构建
将坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶Wk-LDH基因通过酶切连接导入到pET28a载体，使用质粒提取试剂盒提取质粒，提取方法见质粒提取试剂盒说明书，将质粒导入大肠杆菌感受态细胞，并涂布于含50μg/ml卡那霉素的LB平板上，倒置培养12-15h；
步骤三、乳酸脱氢酶Wk-LDH的诱导表达
挑取表达SEQ ID No.2序列所示的乳酸脱氢酶工程菌株于2m1含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的试管中培养过夜，将上述过夜培养液转接到装有50ml LB培养液、含有50μg/ml卡那霉素的摇瓶中，转速为200rpm条件下培养至OD600值为0.6-1左右，用3g/L的乳糖或0.1-0.4mmol/L的IPTG诱导过夜；
步骤四、乳酸脱氢酶Wk-LDH粗酶液的制备
取上述诱导完毕的发酵液，6000rpm，4℃离心10分钟，弃上清，菌体用冰预冷的0.1M PBS缓冲液洗涤1次，40ml 0.1M磷酸盐缓冲液重悬，高压破胞，将破胞液10000rpm，4℃离心10分钟，取上清，即得到乳酸脱氢酶粗酶液；
步骤五、乳酸脱氢酶Wk-LDH的纯化
将菌体沉淀悬浮于buffer A缓冲液中，高压破胞，然后4℃15,000rpm离心30分钟，然后将上清加入到预先洗好Ni-NTA beads中，4℃滚轴混合一个小时，将含有beads的菌液转移到柱子中，用bufferB缓冲液清洗3次，然后用Elution Buffer缓冲液洗脱蛋白。
所述buffer A缓冲液包括50m M/L NaH2PO4-Na2HPO4，300mM NaCl；所述bufferB缓冲液包括50mM NaH2PO4-Na2HPO4，300mM NaCl，5mM Imidazole；所述Elution Buffer缓冲液包括50mM NaH2PO4-Na2HPO4，300mM NaCl，150mM Imidazole
本发明得到的一种坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶，可通过大肠杆菌原核表达和真核表达系统获得，并制备纯酶或粗酶液或用于生物催化反应。利用制得的乳酸脱氢酶，在磷酸盐缓冲液体系中，25℃和搅拌条件下，可将丙酮酸转化为乳酸，实现乳酸的生物制备，其转化率达到了93％以上。
附图说明
图1是一种坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶的乳酸脱氢酶的蛋白电泳图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
实施例1：
如图1所示，本实施例提供的一种坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶，其乳酸脱氢酶的基因序列如SEQ ID No.1所示，乳酸脱氢酶的蛋白质序列如SEQ ID No.2所示。
所述乳酸脱氢酶的来源是坎德勒氏乳杆菌。
所述乳酸脱氢酶具有将酮酸转化为乳酸的活性，可用于D-乳酸的制备、体外诊断试剂盒的开发。
上述一种坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶的制备方法包括以下步骤：
步骤一、坎德勒氏乳杆菌(Weissella kandleri)来源的乳酸脱氢酶基因的获取
本发明所提供的乳酸脱氢酶的基因序列如SEQ ID No.1所示，由人工合成来的，利用该人工合成基因的目的是为了在原核及真核表达系统中获得乳酸脱氢酶。
步骤二、工程表达菌株的构建
将Wk-LDH基因通过酶切连接导入到pET28a载体，使用质粒提取试剂盒(全式金)提取质粒，提取方法见质粒提取试剂盒说明书，将质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，并涂布于含50μg/ml卡那霉素的LB平板上，倒置培养12-15h。
步骤三、乳酸脱氢酶Wk-LDH的诱导表达
挑取表达SEQ ID No.2序列所示的乳酸脱氢酶工程菌株于2m1含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的试管中培养过夜，将上述过夜培养液转接到装有50ml LB培养液(含有50μg/ml卡那霉素)摇瓶中，转速为200rpm条件下培养至OD600值为0.6-1左右，用3g/L的乳糖或0.1-0.4mmol/L的IPTG诱导过夜。
步骤四、乳酸脱氢酶Wk-LDH粗酶液的制备
取上述诱导完毕的发酵液，6000rpm，4℃离心10分钟，弃上清，菌体用冰预冷的0.1M PBS缓冲液洗涤1次，40ml 0.1M磷酸盐缓冲液重悬，高压破胞，将破胞液10000rpm，4℃离心10分钟，取上清，即得到乳酸脱氢酶粗酶液。
步骤五、乳酸脱氢酶Wk-LDH的纯化
将菌体沉淀悬浮于bufferA缓冲液(50m M/LNaH2PO4-Na2HPO4，pH7.0，300mMNaCl)中，高压破胞，然后4℃15,000rpm离心30分钟。然后将上清加入到预先洗好Ni-NTAbeads中，4℃滚轴混合一个小时。将含有beads的菌液转移到柱子中，用bufferB缓冲液(50mM NaH2PO4-Na2HPO4，pH7.0，300mM NaCl，5mM Imidazole)清洗3次，然后用ElutionBuffer缓冲液(50mM NaH2PO4-Na2HPO4，pH7.0，300mM NaCl，150mM Imidazole)洗脱蛋白。
其中Ni-NTA beads是以4％琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联了四配位的氮川三乙酸(NTA)，螯合镍离子(Ni2+)后，可以形成非常稳定的八面体结构，镍离子处于八面体的中心，这样的结构很有效的保护了镍离子免受小分子的进攻，更加稳定，Ni-NTA beads可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件，适用性更广，配体更稳定，选择性更高。
步骤六、催化丙酮酸生成乳酸
一种坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶将丙酮酸转化为乳酸的反应式如下：
在3ml反应体系中加入100μg乳酸脱氢酶，5mM丙酮酸，5mM NADH，反应缓冲液为磷酸盐缓冲液(pH7.0)，其反应条件为700rpm，25℃，反应30min。通过检测检测340nm处吸光度的变化，转化率达到了93.72％。
序列表
<110> 浙江卓运生物科技有限公司
<120> 坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶及其应用和制备方法
<130> 2018
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 999
<212> DNA
<213> 坎德勒氏乳杆菌(Weissella kandleri)
<400> 1
atggcaaaga tttttgcata tggtattcga gatgacgaaa ttccgtcatt gaacggatgg 60
aaggaagaac atccagaagt aacagtagat tatactcaag aattattgga tcctgagact 120
gctaagttag ctgaaggcta tgatgcggtc aacgtctacc aacaattaga ttatacgcgt 180
gagactttgg ccgctttgca tgaagtaggc atcaacaaga tgtcattgcg taatgttgga 240
actgataaca ttgatatgga tgctgcgcgt gaatttggtt tccaaatttc aaacgtgcca 300
gtttattccc caaatgcgat tgctgagcac tcaatgattc aaatgtcacg gttgctccgt 360
cgtactaagg ctttggatgc aaagattgcg cgtcatgact tacgttgggc tccaacaatc 420
ggtcgtgaga tgcggatgca aaccatcgga attgtcggaa ctggtcacat aggacgggtt 480
gcgatgaaga ttgctcaagg cttcggagca aaggtgattg cttatgacct ttacaagaac 540
gacgaagttg aagctcaagg tttgtatgtt gatactttgg atgagttgta tgctcaagct 600
gatgttattt cattgtacgt tcctggagtt cctgctaacg agcacatgat taatgctgaa 660
tcaattgcta agatgaaaga tggcgtagta atcgtgaact gctcacgtgg aaacttggtt 720
gacactgacg cagttattgc tggtttggac tcaggaaaga tttctgactt tgccatggac 780
gtttatgagg atgaagttgg attgttcaat gaagactggg aaggtaaaga attccctgac 840
gcacggatcg ccgatttgat ttcacgcgaa aacgttttgg taactcctca cactgctttc 900
tatactacta aggcagttta tgagatggtt acacaatcaa tgtcagctag cttggacttt 960
atcaatggtg ttacaccaag tatcgccgtt gaatactaa 999
<210> 2
<211> 332
<212> PRT
<213> 坎德勒氏乳杆菌(Weissella kandleri)
<400> 2
Met Ala Lys Ile Phe Ala Tyr Gly Ile Arg Asp Asp Glu Ile Pro Ser
1 5 10 15
Leu Asn Gly Trp Lys Glu Glu His Pro Glu Val Thr Val Asp Tyr Thr
20 25 30
Gln Glu Leu Leu Asp Pro Glu Thr Ala Lys Leu Ala Glu Gly Tyr Asp
35 40 45
Ala Val Asn Val Tyr Gln Gln Leu Asp Tyr Thr Arg Glu Thr Leu Ala
50 55 60
Ala Leu His Glu Val Gly Ile Asn Lys Met Ser Leu Arg Asn Val Gly
65 70 75 80
Thr Asp Asn Ile Asp Met Asp Ala Ala Arg Glu Phe Gly Phe Gln Ile
85 90 95
Ser Asn Val Pro Val Tyr Ser Pro Asn Ala Ile Ala Glu His Ser Met
100 105 110
Ile Gln Met Ser Arg Leu Leu Arg Arg Thr Lys Ala Leu Asp Ala Lys
115 120 125
Ile Ala Arg His Asp Leu Arg Trp Ala Pro Thr Ile Gly Arg Glu Met
130 135 140
Arg Met Gln Thr Ile Gly Ile Val Gly Thr Gly His Ile Gly Arg Val
145 150 155 160
Ala Met Lys Ile Ala Gln Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Ala Tyr Asp
165 170 175
Leu Tyr Lys Asn Asp Glu Val Glu Ala Gln Gly Leu Tyr Val Asp Thr
180 185 190
Leu Asp Glu Leu Tyr Ala Gln Ala Asp Val Ile Ser Leu Tyr Val Pro
195 200 205
Gly Val Pro Ala Asn Glu His Met Ile Asn Ala Glu Ser Ile Ala Lys
210 215 220
Met Lys Asp Gly Val Val Ile Val Asn Cys Ser Arg Gly Asn Leu Val
225 230 235 240
Asp Thr Asp Ala Val Ile Ala Gly Leu Asp Ser Gly Lys Ile Ser Asp
245 250 255
Phe Ala Met Asp Val Tyr Glu Asp Glu Val Gly Leu Phe Asn Glu Asp
260 265 270
Trp Glu Gly Lys Glu Phe Pro Asp Ala Arg Ile Ala Asp Leu Ile Ser
275 280 285
Arg Glu Asn Val Leu Val Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Thr Thr Lys
290 295 300
Ala Val Tyr Glu Met Val Thr Gln Ser Met Ser Ala Ser Leu Asp Phe
305 310 315 320
Ile Asn Gly Val Thr Pro Ser Ile Ala Val Glu Tyr
325 330

Claims (6)

1.一种坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶，其特征在于：所述乳酸脱氢酶的基因序列如SEQ ID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶，其特征在于：所述乳酸脱氢酶的蛋白质序列如SEQ ID No.2所示。
3.根据权利要求1所述的坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶，其特征在于：所述乳酸脱氢酶的来源是坎德勒氏乳杆菌。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶的应用，其特征在于：所述乳酸脱氢酶用于D-乳酸的制备、体外诊断试剂盒的开发。
5.一种如权利要求1-3任一项所述的坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶基因的获取
本发明所提供的乳酸脱氢酶的基因序列如SEQ ID No.1所示，由人工合成来的；
步骤二、工程表达菌株的构建
将坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶Wk-LDH基因通过酶切连接导入到pET28a载体，使用质粒提取试剂盒提取质粒，提取方法见质粒提取试剂盒说明书，将质粒导入大肠杆菌感受态细胞，并涂布于含50μg/ml卡那霉素的LB平板上，倒置培养12-15h；
步骤三、乳酸脱氢酶Wk-LDH的诱导表达
挑取表达SEQ ID No.2序列所示的乳酸脱氢酶工程菌株于2 m1含有终浓度为50μg/ml卡那霉素的试管中培养过夜，将上述过夜培养液转接到装有50ml LB培养液、含有50μg/ml卡那霉素的摇瓶中，转速为200rpm条件下培养至OD600值为0.6-1左右，用3g/L的乳糖或0.1-0.4mmol/L的IPTG诱导过夜；
步骤四、乳酸脱氢酶Wk-LDH粗酶液的制备
取上述诱导完毕的发酵液，6000rpm，4℃离心10分钟，弃上清，菌体用冰预冷的0.1MPBS缓冲液洗涤1次，40ml 0.1M 磷酸盐缓冲液重悬，高压破胞，将破胞液10000rpm，4℃离心10分钟，取上清，即得到乳酸脱氢酶粗酶液；
步骤五、乳酸脱氢酶Wk-LDH的纯化
将菌体沉淀悬浮于buffer A缓冲液中，高压破胞，然后 4℃ 15,000 rpm 离心30 分钟，然后将上清加入到预先洗好Ni-NTA beads 中，4℃滚轴混合一个小时，将含有beads 的菌液转移到柱子中，用bufferB缓冲液清洗3 次，然后用 Elution Buffer缓冲液洗脱蛋白。
6.根据权利要求5所述的坎德勒氏乳杆菌来源的乳酸脱氢酶的制备方法，其特征在于：所述buffer A缓冲液包括50m M/L NaH2PO4-Na2HPO4， 300 mM NaCl；所述bufferB缓冲液包括50mM NaH2PO4-Na2HPO4，300mM NaCl，5mM Imidazole；所述Elution Buffer缓冲液包括50mM NaH2PO4-Na2HPO4，300mM NaCl，150mM Imidazole。
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