CN109536467A - 面包乳杆菌来源的乳酸脱氢酶及其应用和制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种面包乳杆菌来源的乳酸脱氢酶，其乳酸脱氢酶的基因序列如SEQ ID No.1所示，乳酸脱氢酶的蛋白质序列如SEQ ID No.2所示。所述乳酸脱氢酶的来源是面包乳杆菌。所述乳酸脱氢酶具有将酮酸转化为乳酸的活性，可用于乳酸的制备、体外诊断试剂盒的开发。本发明得到的一种面包乳杆菌来源的乳酸脱氢酶，可通过大肠杆菌原核表达和真核表达系统获得，并制备纯酶或粗酶液或用于生物催化反应。利用制得的乳酸脱氢酶，在磷酸盐缓冲液体系中，在25℃条件下，可将丙酮酸转化为乳酸，其转化率达到了94%以上。

Description

面包乳杆菌来源的乳酸脱氢酶及其应用和制备方法
技术领域
本发明涉及基因工程领域，特别是一种面包乳杆菌来源的乳酸脱氢酶及其应用和制备方法。
背景技术
乳酸脱氢酶(LDH)，广泛存在于动物组织和各种微生物细胞内，是以NADH 为辅酶，将丙酮酸经过生化反应生成L-乳酸和D-乳酸，是乳酸菌合成乳酸的关键酶。乳酸脱氢酶在生物制化工领域可用于苯乳酸等产品制备，临床上可作为心肌疾病、肝病等的诊断指标，同时也可作为食品添加剂用于发酵奶制品如干酪、腌渍品、糖果制品和饮料的生产。除此之外，乳酸脱氢酶在体外诊断领域有着广泛的应用，是丙氨酸氨基转移酶试剂盒等体外诊断试剂的主要原料，主要应用于生化研究、白血病和心肌梗塞等疾病的诊断。因此，开发新型、具有高催化活性的乳酸脱氢酶的具有重要的实际意义和良好的应用前景。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述现有技术的不足而提供一种面包乳杆菌来源的乳酸脱氢酶及其应用和制备方法。
为了实现上述目的，本发明所设计的一种面包乳杆菌来源的乳酸脱氢酶，其乳酸脱氢酶的基因序列如SEQ ID No.1所示，乳酸脱氢酶的蛋白质序列如SEQ ID No.2所示。
所述乳酸脱氢酶的来源是面包乳杆菌(Lactobacillus panis)。
所述乳酸脱氢酶具有将酮酸转化为乳酸的活性，可用于乳酸的制备、体外诊断试剂盒的开发。
本发明还公开了上述面包乳杆菌来源的乳酸脱氢酶的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、面包乳杆菌来源的乳酸脱氢酶基因的获取
本发明所提供的乳酸脱氢酶的基因序列如SEQ ID No.1所示，由人工合成来的；
步骤二、工程表达菌株的构建
将面包乳杆菌来源的乳酸脱氢酶Lp-LDH基因通过酶切连接导入到pET28a 载体，使用质粒提取试剂盒提取质粒，提取方法见质粒提取试剂盒说明书，将质粒导入大肠杆菌BL21感受态细胞，并涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，倒置培养12-15h；
步骤三、乳酸脱氢酶Lp-LDH的诱导表达
挑取表达SEQ ID No.2序列所示的乳酸脱氢酶工程菌株于2mL含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的试管中培养过夜，将上述过夜培养液转接到装有50mL LB培养液、含有50μg/mL卡那霉素的摇瓶中，转速为200rpm条件下培养至 OD600值为0.6-1左右，用3g/L的乳糖或0.1-0.4mmol/L的IPTG诱导过夜；
步骤四、乳酸脱氢酶Lp-LDH粗酶液的制备
取上述诱导完毕的发酵液，6000rpm，4℃离心10分钟，弃上清，菌体用冰预冷的0.1M PBS缓冲液洗涤1次，40mL 0.1M磷酸盐缓冲液重悬，高压破胞，将破胞液10000rpm，4℃离心10分钟，取上清，即得到乳酸脱氢酶粗酶液；
步骤五、乳酸脱氢酶Lp-LDH的纯化
将菌体沉淀悬浮于bufferA缓冲液中，高压破胞，然后4℃15,000rpm离心30分钟，然后将上清加入到预先洗好Ni-NTA beads中，4℃滚轴混合一个小时，将含有beads的菌液转移到柱子中，用bufferB缓冲液清洗3次，然后用 Elution Buffer缓冲液洗脱蛋白。
所述bufferA缓冲液包括50m M/L NaH2PO4-Na2HPO4，300mM NaCl；所述bufferB缓冲液包括50mM NaH2PO4-Na2HPO4，300mM NaCl，5mM Imidazole；所述Elution Buffer缓冲液包括50mM NaH2PO4-Na2HPO4，300mM NaCl，150mM Imidazole。
本发明得到的一种面包乳杆菌来源的乳酸脱氢酶，可通过大肠杆菌原核表达和真核表达系统获得，并制备纯酶或粗酶液或用于生物催化反应。利用制得的乳酸脱氢酶，在磷酸盐缓冲液体系中，在25℃条件下，可将丙酮酸转化为乳酸，其转化率达到了94％以上。
附图说明
图1是一种面包乳杆菌来源的乳酸脱氢酶的乳酸脱氢酶的蛋白电泳图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
实施例1：
如图1所示，本实施例提供的一种面包乳杆菌来源的乳酸脱氢酶，其乳酸脱氢酶的基因序列如SEQ ID No.1所示，乳酸脱氢酶的蛋白质序列如SEQ ID No.2所示。
所述乳酸脱氢酶的来源是面包乳杆菌。
所述乳酸脱氢酶具有将酮酸转化为乳酸的活性，可用于乳酸的制备、体外诊断试剂盒的开发。
上述一种面包乳杆菌来源的乳酸脱氢酶的制备方法包括以下步骤：
步骤一、面包乳杆菌(Lactobacillus panis)来源的乳酸脱氢酶基因的获取
本发明所提供的乳酸脱氢酶的基因序列如SEQ ID No.1所示，由人工合成来的，利用该人工合成基因的目的是为了在原核及真核表达系统中获得乳酸脱氢酶。
步骤二、工程表达菌株的构建
将面包乳杆菌来源的乳酸脱氢酶(Lp-LDH)基因通过酶切连接导入到 pET28a载体，使用质粒提取试剂盒(全式金)提取质粒，提取方法见质粒提取试剂盒说明书，将质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，并涂布于含 50μg/mL卡那霉素的LB平板上，倒置培养12-15h。
步骤三、乳酸脱氢酶Lp-LDH的诱导表达
挑取表达SEQ ID No.2序列所示的乳酸脱氢酶工程菌株于2mL含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的试管中培养过夜，将上述过夜培养液转接到装有50mL LB培养液(含有50μg/mL卡那霉素)摇瓶中，转速为200rpm条件下培养至 OD600值为0.6-1左右，用3g/L的乳糖或0.1-0.4mmol/L的IPTG诱导过夜。
步骤四、乳酸脱氢酶Lp-LDH粗酶液的制备
取上述诱导完毕的发酵液，6000rpm，4℃离心10分钟，弃上清，菌体用冰预冷的0.1M PBS缓冲液洗涤1次，40mL 0.1M磷酸盐缓冲液重悬，高压破胞，将破胞液10000rpm，4℃离心10分钟，取上清，即得到乳酸脱氢酶粗酶液。
步骤五、乳酸脱氢酶Lp-LDH的纯化
将菌体沉淀悬浮于bufferA缓冲液(50m M/L NaH2PO4-Na2HPO4，pH7.0， 300mMNaCl)中，高压破胞，然后4℃15,000rpm离心30分钟。然后将上清加入到预先洗好Ni-NTAbeads中，4℃滚轴混合一个小时。将含有beads的菌液转移到柱子中，用bufferB缓冲液(50mM NaH2PO4-Na2HPO4，pH7.0，300mM NaCl，5mM Imidazole)清洗3次，然后用ElutionBuffer缓冲液(50mM NaH2PO4-Na2HPO4，pH7.0，300mM NaCl，150mM Imidazole)洗脱蛋白。
其中Ni-NTA beads是以4％琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联了四配位的氮川三乙酸(NTA)，螯合镍离子(Ni2+)后，可以形成非常稳定的八面体结构，镍离子处于八面体的中心，这样的结构很有效的保护了镍离子免受小分子的进攻，更加稳定，Ni-NTA beads可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件，适用性更广，配体更稳定，选择性更高。
步骤六、催化丙酮酸生成乳酸
一种面包乳杆菌来源的乳酸脱氢酶将丙酮酸转化为乳酸的反应式如下：
在3mL反应体系中加入100μg乳酸脱氢酶，5mM丙酮酸，5mM NADH，反应缓冲液为磷酸盐缓冲液(pH为7.0)，其反应条件为700rpm，25℃，反应30min。通过检测检测340nm处吸光度的变化，转化率达到了94.63％。
序列表
<110> 浙江卓运生物科技有限公司
<120> 面包乳杆菌来源的乳酸脱氢酶及其应用和制备方法
<130> 2018
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1005
<212> DNA
<213> 面包乳杆菌(Lactobacillus panis)
<400> 1
atggcacaga aaatttttgc cttcagtatt cggaaggatg aagaaccgta cgtcaaagaa 60
tgggcaaacg aacacccgga tattgacgtg gactacaccg ataagctact gaccccggag 120
actgccgcac tcgccaaggg cgctgacggg gtcgttgttt accagcaact cgactacacc 180
ccggacaccc tgcaggccct tgccaatgaa ggaatcacca agatgtccct gcggaatgtt 240
ggggtcgaca acatcgacat ggacaaggcc aaggagctcg gctttgaaat caccaacgtg 300
cccgtctact cgccaaacgc cattgctgag cacgccgcca ttcagacggc ccggatcctc 360
cgccagacca aggtaatgga cgaaaagatt gccaagggcg acttacggtg ggcccccacc 420
atcggtcacg aagttcgcga ccaagtcatc ggggtagtcg gcaccggcca catcggtcgg 480
gtctacatgc aaatcatgga aggctacggg gccaaggtca tcgcttacga cccgttcgaa 540
aaccctgagc tgaaagccaa gggctactac gttgacaacc tagacgacct ctaccggcag 600
gcaaccgtca tttccctcca cgttcccgca acgaaggaaa actaccacat gatcaacgcc 660
gactccatcg ctaagatgag agacggcgtc accctggtca actgctcgcg gggggccctc 720
gttgataccg atgccgtcat caaggccctc gacagtggca agatcttcgg cttcgtcatg 780
gacacctacg aaaacgaagt cggcatcttc aacgccaatt gggagggcaa ggacttccct 840
gacgcccgcc taaacgacct catccaccgg ccaaacgtcc tggtaacgcc acacaccgcc 900
ttctacacca cccatgcggt tcgcaacatg gtgatcaagg cctttgacaa caatattgag 960
ctggtcaagg gtgagaaggc cgacaccccc gttaaggtcg gctaa 1005
<210> 2
<211> 334
<212> PRT
<213> 面包乳杆菌(Lactobacillus panis)
<400> 2
Met Ala Gln Lys Ile Phe Ala Phe Ser Ile Arg Lys Asp Glu Glu Pro
1 5 10 15
Tyr Val Lys Glu Trp Ala Asn Glu His Pro Asp Ile Asp Val Asp Tyr
20 25 30
Thr Asp Lys Leu Leu Thr Pro Glu Thr Ala Ala Leu Ala Lys Gly Ala
35 40 45
Asp Gly Val Val Val Tyr Gln Gln Leu Asp Tyr Thr Pro Asp Thr Leu
50 55 60
Gln Ala Leu Ala Asn Glu Gly Ile Thr Lys Met Ser Leu Arg Asn Val
65 70 75 80
Gly Val Asp Asn Ile Asp Met Asp Lys Ala Lys Glu Leu Gly Phe Glu
85 90 95
Ile Thr Asn Val Pro Val Tyr Ser Pro Asn Ala Ile Ala Glu His Ala
100 105 110
Ala Ile Gln Thr Ala Arg Ile Leu Arg Gln Thr Lys Val Met Asp Glu
115 120 125
Lys Ile Ala Lys Gly Asp Leu Arg Trp Ala Pro Thr Ile Gly His Glu
130 135 140
Val Arg Asp Gln Val Ile Gly Val Val Gly Thr Gly His Ile Gly Arg
145 150 155 160
Val Tyr Met Gln Ile Met Glu Gly Tyr Gly Ala Lys Val Ile Ala Tyr
165 170 175
Asp Pro Phe Glu Asn Pro Glu Leu Lys Ala Lys Gly Tyr Tyr Val Asp
180 185 190
Asn Leu Asp Asp Leu Tyr Arg Gln Ala Thr Val Ile Ser Leu His Val
195 200 205
Pro Ala Thr Lys Glu Asn Tyr His Met Ile Asn Ala Asp Ser Ile Ala
210 215 220
Lys Met Arg Asp Gly Val Thr Leu Val Asn Cys Ser Arg Gly Ala Leu
225 230 235 240
Val Asp Thr Asp Ala Val Ile Lys Ala Leu Asp Ser Gly Lys Ile Phe
245 250 255
Gly Phe Val Met Asp Thr Tyr Glu Asn Glu Val Gly Ile Phe Asn Ala
260 265 270
Asn Trp Glu Gly Lys Asp Phe Pro Asp Ala Arg Leu Asn Asp Leu Ile
275 280 285
His Arg Pro Asn Val Leu Val Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Thr Thr
290 295 300
His Ala Val Arg Asn Met Val Ile Lys Ala Phe Asp Asn Asn Ile Glu
305 310 315 320
Leu Val Lys Gly Glu Lys Ala Asp Thr Pro Val Lys Val Gly
325 330

Claims (6)

1.一种面包乳杆菌来源的乳酸脱氢酶，其特征在于：所述乳酸脱氢酶的基因序列如SEQID No.1所示。
2.根据权利要求1所述的面包乳杆菌来源的乳酸脱氢酶，其特征在于：所述乳酸脱氢酶的蛋白质序列如SEQ ID No.2所示。
3.根据权利要求1所述的面包乳杆菌来源的乳酸脱氢酶，其特征在于：所述乳酸脱氢酶的来源是面包乳杆菌。
4.一种如权利要求1-3任一项所述的面包乳杆菌来源的乳酸脱氢酶的应用，其特征在于：所述乳酸脱氢酶用于乳酸的制备、体外诊断试剂盒的开发。
5.一种如权利要求1-3任一项所述的面包乳杆菌来源的乳酸脱氢酶的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、面包乳杆菌来源的乳酸脱氢酶基因的获取
本发明所提供的乳酸脱氢酶的基因序列如SEQ ID No.1所示，由人工合成来的；
步骤二、工程表达菌株的构建
将面包乳杆菌来源的乳酸脱氢酶Lp-LDH基因通过酶切连接导入到pET28a载体，使用质粒提取试剂盒提取质粒，提取方法见质粒提取试剂盒说明书，将质粒导入大肠杆菌感受态细胞，并涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB平板上，倒置培养12-15h；
步骤三、乳酸脱氢酶Lp-LDH的诱导表达
挑取表达SEQ ID No.2序列所示的乳酸脱氢酶工程菌株于2 mL含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的试管中培养过夜，将上述过夜培养液转接到装有50mL LB培养液 、含有50μg/mL卡那霉素的摇瓶中，转速为200rpm条件下培养至OD600值为0.6-1左右，用3g/L的乳糖或0.1-0.4mmol/L的IPTG诱导过夜；
步骤四、乳酸脱氢酶Lp-LDH粗酶液的制备
取上述诱导完毕的发酵液，6000rpm，4℃离心10分钟，弃上清，菌体用冰预冷的0.1MPBS缓冲液洗涤1次，40mL 0.1M 磷酸盐缓冲液重悬，高压破胞，将破胞液10000rpm，4℃离心10分钟，取上清，即得到乳酸脱氢酶粗酶液；
步骤五、乳酸脱氢酶Lp-LDH的纯化
将菌体沉淀悬浮于buffer A缓冲液中，高压破胞，然后 4℃ 15,000 rpm 离心30 分钟，然后将上清加入到预先洗好Ni-NTA beads 中，4℃滚轴混合一个小时，将含有beads 的菌液转移到柱子中，用bufferB缓冲液清洗3 次，然后用 Elution Buffer缓冲液洗脱蛋白。
6.根据权利要求5所述的一种面包乳杆菌来源的乳酸脱氢酶的制备方法，其特征在于：所述buffer A缓冲液包括50m M/L NaH2PO4-Na2HPO4，300 mM NaCl；所述bufferB缓冲液包括50mM NaH2PO4-Na2HPO4，300mM NaCl，5mM Imidazole；所述Elution Buffer缓冲液包括50mM NaH2PO4-Na2HPO4，300mM NaCl，150mM Imidazole。
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