CN109022515A - 一种6-o-去甲罂粟碱的生物催化制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术中生物转化领域；一种生物催化法制备6‑O‑去甲罂粟碱的方法，其特征在于按如下步骤实现：取罂粟碱或其盐经生物催化剂催化底物罂粟碱选择性脱甲基化，可得6‑O‑去甲罂粟碱。本发明所述的生物催化制备6‑O‑去甲罂粟碱的方法仅需一步催化反应即可得到6‑O‑去甲罂粟碱，选择性高，操作简单，条件温和，反应的后处理简单，绿色环保。

Description

一种6-O-去甲罂粟碱的生物催化制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术中生物转化领域，更具体地涉及一种生物催化法制备 6-O-去甲罂粟碱的方法。
背景技术：
罂粟碱是一种苄基异喹啉类阿片类生物碱,化学名称为1-[(3,4-二甲氧基苯基)甲基]-6,7-二甲氧基异喹啉。可从罂粟科植物中提取分离得到。罂粟碱对血管、心脏或其他平滑肌有直接的非特异性松弛作用，具有抗血管痉挛，扩张血管，加速组织扩张等作用。罂粟碱临床应用广泛，可用于治疗大脑、心脏及外周血管痉挛所致的缺血，肾、胆或胃肠道等内脏痉挛。同时还可治疗阴茎勃起障碍以及常规治疗无效的结石性肾绞痛等[1]。研究表明罂粟碱也是潜在的抗肿瘤药物，可抑制肝癌细胞HepG2中端粒酶活性以抑制肝癌细胞的增殖[2]，同时罂粟碱能够通过NF-κB通路诱导前列腺癌细胞PC-3的凋亡[3]。
6-O-去甲罂粟碱为罂粟碱的体内代谢产物之一。研究表明，罂粟碱经小鼠及豚鼠肝微粒体代谢可生成6-O-去甲罂粟碱。文献报道，利用丝状真菌Aspergillus alliaceus对罂粟碱生物转化，产物中鉴定得到6-O-去甲罂粟碱[4]。但利用野生型菌株(特别是遗传背景复杂的丝状真菌)全细胞的转化，其转化产物较多，从培养基中分离目标产物繁琐困难。除此研究外，对6-O-去甲罂粟碱的制备未见其他报道。随着当前医学研究的发展，罂粟碱的临床应用范围不断扩大，对罂粟碱的药物代谢动力学研究也随之增加。6-O-去甲罂粟碱作为罂粟碱的代谢产物之一，在罂粟碱的临床药代动力学研究及生物活性、毒性研究中需求日益广泛。由于选择性在罂粟碱的C6位去甲基实现困难，使得目前6-O-去甲罂粟碱对照品价格昂贵。资料显示，美国SDG品牌6-O-去甲罂粟碱市场价格为每10mg对照品售价为16520元(人民币)。另一方面，6-O-去甲罂粟碱为潜在药物先导化合物，因其与罂粟碱具有相同的母核结构，其差异在于侧链氧甲基基团的变化。相关文献及临床研究表明该类化合物侧链氧甲基基团与羟基基团的转变会显著改变其生理活性[5]。研究表明，罂粟碱在使用过程中可能出现肝功能受损的副作用，表现出血嗜酸性细胞、丙氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、门冬氨酸氨基转移酶及胆红素可增高。与罂粟碱相比6-O-去甲罂粟碱其的急性和慢性肝毒性明显降低[6]。
6-O-去甲罂粟碱具有复杂的稠环结构，化学全合成困难，也难以选择性地对罂粟碱C6位去甲基化以制备6-O-去甲罂粟碱。基于酶催化的生物催化技术在有机合成中的应用正日益受到广泛关注，具有位点选择性好，条件温和，绿色环保等优势。本发明所涉及到的生物催化剂为含有细胞色素P450酶中的一种 CYP105D1的酶促催化体系。CYP105D1未见用于6-O-去甲罂粟碱的制备的报道。罂粟碱经人体中的P450酶(肝药酶)代谢可产生包括6-O-去甲罂粟碱在内的多种代谢产物，但人体中的P450酶难以异源表达及用于6-O-去甲罂粟碱的制备。细胞色素P450酶CYP105D1从灰色链霉菌(Streptomyces griseus ATCC 13273) 中鉴定得到，CYP105D1与人体中的细胞色素P450酶同源性均低于30％。本发明开发了含有细胞色素P450酶CYP105D1的生物催化体系在制备6-O-去甲罂粟碱的新用途。
参考文献
[1]刘绪文，孙云廷.罂粟碱的临床及药理作用研究进展.中国药物与临床,2006,6(9):697-699
[2]S K Noureini and M Wink.Antiproliferative Effect of theIsoquinoline Alkaloid Papaverine in Hepatocarcinoma HepG-2Cells—Inhibitionof Telomerase and Induction of Senescence.Molecules 2014,19,11846-11859
[3]Papaverine selectively inhibits human prostate cancer cell(PC-3)growth by inducing mitochondrial mediated apoptosis,cell cycle arrest anddownregulation of NF-κB/PI3K/Akt signalling pathway.JBUON 2017；22(1):112
[4]JP.Rosazza,M Kammer,L Youel.Microbial Models of MammalianMetabolism O-Demethylations of Papaverine.Xenobiotica,1977,7(3):133-143.
[5]Mo J,Guo Y,Yang YS,Shen JS,Jin GZ,Zhen X(2007)Recent Developmentsin Studies of l-Stepholidine and its Analogs:Chemistry,Pharmacology andClinical Implications.Current Medicinal Chemistry 14(28):2996-3002
[6]JC Davila,CG Reddy,PJ Davis,D Acosta.Toxicity assessment ofparaverine hydrochloride and papaverine-derived metabolites in primarycultures of rat hepatocytes.Vitro Cellular&Developmental Biology,1990,26(5):515-524.
发明内容：
1.本发明的目的
含有细胞色素P450酶CYP105D1的催化体系在制备6-O-去甲罂粟碱中的新用途。
本发明所采用的技术方案
一种生物催化法制备6-O-去甲罂粟碱的方法，其特征在于按如下步骤实现：罂粟碱或其盐经生物催化剂催化底物罂粟碱或其盐，选择性脱甲基化，获得6-O- 去甲罂粟碱及盐。
所述的生物催化剂为CYP105D1，CYP105D1突变体，含有CYP105D1的野生菌株以及表达CYP105D1的工程菌株。
CYP105D1来源的野生菌株为灰色链霉菌(Streptomyces griseus)ATCC 13273。
所述的CYP105D1的氨基酸序列为Seq ID NO.1。
所述的CYP105D1的突变体的氨基酸序列为Seq ID NO.2、Seq ID NO.3、Seq IDNO.4、Seq ID NO.5或Seq ID NO.6。
所述的CYP105D1及其突变体作为催化剂时，还需要细胞色素P450酶系的电子供体及电子传递蛋白。
所述的一种生物催化法制备6-O-去甲罂粟碱的方法，其特征在于所述的电子传递蛋白为camA和camB
所述底物罂粟碱的CAS号为58-74-2，其结构如下所示；盐酸罂粟碱CAS 号为61-25-6。
本发明所述酶法制备6-O-去甲罂粟碱的方法，其合成路线如下所示，即利用CYP105D1生物催化系统对罂粟碱生物转化，转化产物即为6-O-去甲罂粟碱。生物催化反应选择性高，催化效率较高，产物单一便于分离纯化。
采用上述生物催化及制备6-O-去甲罂粟碱的技术方案分述如下：
1)S.griseus ATCC 13273制备6-O-去甲罂粟碱技术方案。
S.griseus ATCC 13273菌种保藏培养基为含1.0％琼脂的PDA固体培养基；种子培养基为PDA液体培养基；转化培养基成分为：玉米粉15-30g/L，豆粕5-10 g/L，酵母粉2-5g/L，NaCl 2-4g/L，K2HPO4 2-4g/L，葡萄糖1-3g/L，FeSO4 0.02-0.4 g/L，维生素B1 0.01-0.2g/L。
S.griseus ATCC 13273生物催化制备6-O-去甲罂粟碱的工艺过程为：将保藏S.griseus ATCC 13273菌株，划线接种于PDA固体培养基上，20-32℃恒温培养 3-7天，待菌种活化后转接于PDA液体培养基中，20-32℃，150-220rpm水平震荡培养24-48小时，即得种子液。将种子液转接于转化培养基中，20-32℃，150-220 rpm震荡培养15-30小时后加入助溶剂溶解的底物罂粟碱或其盐酸盐，相同条件下继续转化培养36-72小时，有机溶剂萃取发酵液，回收有机溶剂后硅胶柱层析法分离得到6-O-去甲罂粟碱纯品。
2)利用细胞色素P450酶CYP105D1及其突变体制备6-O-去甲罂粟碱技术方案
所述细胞色素P450酶CYP105D1，其氨基酸序列为Seq ID NO.1：
所述细胞色素P450酶CYP105D1的突变体的突变位点包括但不限于103位 Leu残基，188位Leu残基，299位Glu残基，302位Gln残基，402位Ile残基其序列特征在于与序列SeqID NO.1相同或至少约75％-99％相似度。
细胞色素P450酶CYP105D1在生物催化过程中需要电子传递系统蛋白将来自于辅酶NAD(P)H的电子传递至CYP105D1的催化活性中心，以维持CYP105D1 的生物催化活性。因此在利用CYP105D1纯酶进行生物转化制备6-O-去甲罂粟碱的过程中，反应体系中需要添加电子传递蛋白及电子供体。本发明选择camA 及camB(camA：putidaredoxin reductase,accession number:AAA25758.1； camB:putidaredoxin,accession number:BAA00414.1)作为CYP105D1的电子传递蛋白，NADH作为电子供体。
利用酶法合成制备6-O-去甲罂粟碱的方法：
按照分子克隆常规操作技术流程，对所述细胞色素P450酶CYP105D1或其突变体在大肠杆菌中表达，并在其N末端融合组氨酸标签，利用Ni2+亲和层析色谱技术对细胞色素P450酶纯化。
酶法制备6-O-去甲罂粟碱工艺过程：首先，在缓冲液中添加细胞色素P450 酶CYP105D1或其突变体，至终浓度为0.5-2mM，添加电子传递系统蛋白camA 及camB，使其终浓度分别为10-40mM及2.5-10mM，添加电子供体NADH，使其终浓度为0.1-1M。投料底物罂粟碱或盐酸罂粟碱，20-28℃，250rpm震荡转化制备，转化时间为60-300min，有机溶剂萃取发酵液，回收有机溶剂后硅胶柱层析法分离得到6-O-去甲罂粟碱纯品。
优选地，所述缓冲溶液为pH值为6.8-8.0、浓度为0.05-0.2M的磷酸钠缓冲溶液。需要说明的是，所述缓冲溶液包括但不限于缓冲溶液，只要能够在酶催化反应时，起到保持盐平衡、调整的适宜的缓冲作用即可。所述缓冲溶液是指磷酸盐缓冲溶液,其成分包括但不限于Na2HPO4以及NaH2PO4，本领域技术人员根据实际需求可对其成分进行调整。
3)利用表达有细胞色素P450酶CYP105D1的工程菌株制备6-O-去甲罂粟碱技术方案
所述工程菌株为共表达CYP105D1(或其突变酶)及电子传递系统蛋白camA 及camB的大肠杆菌。
培养基：LB液体培养基。其成分包括：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L， NaCl 10g/L，5mol/L NaOH调pH至7.0；TB液体培养基。其成分包括：酵母粉 24g/L，蛋白胨12g/L，K2HPO49.4g/L，KH2PO4 2.2g/L，甘油4mL/L。
工程菌株生物催化制备6-O-去甲罂粟碱的工艺过程：从斜面保藏培养基中刮取一环4℃保藏菌种，接至LB培养基中，30-37℃，150-250rpm震荡培养过夜，制备种子液。将种子液以1-4％接种量接入至TB培养基中，30-37℃， 150-250rpm震荡培养2-5h，添加亚铁血红素生物合成前体ALA至终浓度 0.5-2mM，并添加IPTG进行诱导，IPTG终浓度为0.01-0.5mM，温度调整至14-22℃，转速调整至150-200rpm，诱导6-12h后，向发酵液中添加助溶剂助溶的底物，18-28℃，150-250rpm，转化12-48h，有机溶剂萃取发酵液，回收有机溶剂后硅胶柱层析法分离得到6-O-去甲罂粟碱纯品。
本发明的有益效果
本发明所述的生物酶法制备6-O-去甲罂粟碱的方法仅需一步催化反应即可得到6-O-去甲罂粟碱，操作简单，条件温和，反应的后处理简单，易操作，产生的三废量比较少，对环境友好，填补了酶法制备6-O-去甲罂粟碱的工艺空白。
附图说明：
图1是用于表达CYP105D1的质粒示意图
图2是质粒测序结果(利用T7/T7ter通用引物对质粒测序)；其中a:利用T7引物对构建所得质粒pET28a-cyp105D1测序峰图；b:利用T7ter引物对构建所得质粒pET28a-cyp105D1测序峰图
图3是转化产物的HPLC图谱；其中a:罂粟碱标准对照品HPLC检测图谱
b:6-O-去甲罂粟碱标准品HPLC检测图谱
c:无细胞色素P450酶CYP105D1催化体系对底物罂粟碱的转化HPLC检测示意图(阴性对照)
d:含细胞色素P450酶CYP105D1催化体系对底物罂粟碱的转化HPLC检测示意图
图4是转化产物与6-O-去甲罂粟碱标准品MS/MS图谱，a为转化产物，b为6-O- 去甲罂粟碱标准品
图5是转化产物13C HMR图谱
图6是转化产物1H HMR图谱
具体实施方式：
根据下述实施例，可以更好地理解本发明，然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅限于说明本发明，而不应该也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1利用灰色链霉菌(Streptomyces griseus)ATCC 13273生物催化制备 6-O-去甲罂粟碱
保藏的S.griseus ATCC 13273菌种划线接种于PDA固体培养基上，在28℃的恒温培养箱中培养5天，将活化后的菌种转接于PDA液体培养基中，置于28℃， 180转每分钟的水平摇床中培养36小时，得到种子液。以2％的接种量转接入转化培养基中，培养12小时后在培养体系中加入转化底物罂粟碱或其盐(PEG-200 或甲醇助溶，底物终浓度为50mg/L)，在28℃条件下转化发酵培养48小时，转化发酵液以乙酸乙酯萃取获得6-O-去甲罂粟碱获得，经HPLC检测，按照公式1 计算转化率，转化率为32％。利用S.griseus ATCC 13273生物催化制备6-O-去甲罂粟碱，其转化率较低，转化时程较长，且有较多副产物的生成，对后续的纯化制备造成困难。
公式1：
实施例2CYP105D1的制备及其生物催化制备6-O-去甲罂粟碱
1.CYP105D1的制备
为了将细胞色素CYP105D1的N端融合组氨酸标签，便于纯化，本实施例利用pET28a(购自Novagen)构建CYP105D1表达载体，将目的片段插入至 pET28a的NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位点。所得质粒命名为pET28a-CYP105D1。具体操作如下：
利用引物对F-GGAATTCCATATGACGGAATCCACGACGGACC(Seq ID NO.9)/R-GGAATTCTCACCAGGCCACGGGCAGGT(Seq ID NO.10)，以 S.griseus ATCC 13273基因组DNA为模板进行PCR，退火温度为60℃，可扩增得到cyp105D1基因的目的片段，利用PCR产物纯化试剂盒(EasyPure PCR Purification Kit，购自于北京全式金生物技术有限公司)对其纯化。利用限制性内切酶NdeⅠ和EcoRⅠ对上述扩增所得片段及载体pET-28a进行双酶切。酶切体系如下所示，酶切反应为37℃孵育30min：
利用T4DNA连接酶(购自宝生物工程有限公司)对目的片段和线性化载体进行连接
20μL连接体系如下：
16℃连接过夜后，化转至E.coli DH5α感受态细胞中，涂布于卡那霉素抗性平板上，待其生长12h后出现单菌落，进行菌落PCR，选取阳性克隆子进行测序。测序验证成功后，将质粒化转至表达菌株E.coli BL21(DE3)中进行表达，获得菌株BL21-pET28a-CYP105D1。
将BL21-pET28a-CYP105D1接种于5mL试管LB培养基中，添加卡那霉素至终浓度50μg/mL。37℃，200rpm震荡培养过夜，即得种子液。将种子按1％接种量接种于50mL TB培养基中，添加卡那霉素至终浓度为50μg/mL。37℃， 200rpm震荡培养3小时，添加亚铁血红素生物合成前体氨基乙酰丙酸(ALA)，至终浓度为1mM，以及FeCl3至终浓度为0.5mM，并降低温度至25℃，继续震荡30min后，添加诱导剂IPTG，使其终浓度为0.1mM，进行诱导表达，诱导过程中温度为20℃，转速调整为150rpm，诱导表达至12h，收集菌体用于蛋白纯化。
电子传递系统蛋白camA，camB的制备
因CYP105D1催化过程中需要还原伴侣蛋白的参与，因此有必要对电子传递系统蛋白camA及camB进行制备(camA：putidaredoxin reductase,accession number:AAA25758.1；camB:putidaredoxin,accession number:BAA00414.1)。利用 pET22b(购自Novagen)载体，构建camA和camB的表达载体，分别命名为 pET22b-camA及pET22b-camB。使表达所得camA及camB的C末端融合组氨酸标签，以便蛋白的分离纯化，具体操作步骤如下：
1)目的片段的扩增：
以Pseudomonas putida基因组DNA为模板，利用 F-GGAATTCCATATGGTGACGCAAACGACAACGTGG(Seq ID NO.11) /R-CCGCTCGAGGGCACTACTCAGTTCAGCTTTG(Seq ID NO.12)引物对camA 编码序列进行扩增；利用F-GGAATTCCATATGTCTAAAGTAGTGTATGTGTC (Seq ID NO.13)/R-CCGCTCGAGCCATTGCCTATCGGGAACATCG(Seq ID NO.14)引物对camB编码序列进行扩增。PCR反应体系如下：
PCR反应体系(50μL)
PCR反应条件
96℃ 5min预变性，96℃ 1min变性，60℃ 30s退火，72℃ 1min延伸，循环30次。
2)camA、camB目的片段及质粒的双酶切与连接
利用限制性内切酶NdeⅠ和XhoⅠ分别对目的片段camA、camB以及载体 pET22b进行双酶切。利用T4DNA连接酶分别将酶切后的pET22b载体和camA 片段以及pET22b载体和camB片段进行连接。16℃连接过夜后，化转至E.coli DH5α感受态细胞中，涂布于氨苄青霉素抗性平板上，待其生长12h后出现单菌落，进行菌落PCR，选取阳性克隆子进行测序。测序验证成功后，将质粒化转至表达菌株E.coli BL21(DE3)中进行表达。所得菌株分别命名为BL21-pET22b-camA及BL21-pET22b-camB。
将BL21-pET22b-camA及BL21-pET22b-camB菌株分别接种于5mL试管LB 培养基中，添加氨苄青霉素至终浓度50μg/mL。37℃，200rpm震荡培养过夜，即得种子液。按1％接种量将种子液接种于50mL TB培养基中，添加氨苄青霉素至终浓度为50μg/ml。37℃，200rpm震荡培养3小时，添加诱导剂IPTG，使其终浓度为0.1mM，开始诱导，诱导过程中温度为20℃，转速调整为150rpm，诱导表达至12小时，收集菌体用于蛋白纯化。
2.蛋白纯化与含量测定
收取诱导表达12小时后菌体50mL，4000rpm离心5min，弃上清。用pH7.4 的50mM磷酸钠缓冲液洗涤菌体三遍后，利用20mL非变性裂解液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，用氢氧化钠调节pH值至8.0)将菌体重悬，并添加 2mM EDTA,1.5mM dTT,20％甘油以及1mM PMSF，冰浴，超声破碎菌体，超声条件为：超声3s，间隔5s，超声功率为300W，超声80次。12000rpm，4℃离心10min，上清液即为粗酶液，用于后续的亲和纯化。上清必须保持澄清，即不含任何不溶物，才能进行下一步的纯化。
利用镍柱对带有6×His标签蛋白进行纯化，其操作流程如下：
1)取适量混合均匀的50％His-tag Purification Resin(购自于碧云天生物技术有限公司)，4℃离心(1000g×10s)弃去储存液，向凝胶中加入一个柱体积的非变性裂解液混匀以平衡凝胶，4℃离心(1000g×10s)弃去液体，再重复平衡 1-2次，弃去滤液。
2)按照每0.5ml凝胶中加入4ml细菌裂解液上清的比例(1:8)，混合His-tagPurification Resin和细菌裂解液上清。4℃在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动60 min。
3)将裂解液和His-tag Purification Resin的混合物装入适当的空柱管中。
4)将纯化柱底部的盖子打开，在重力作用下使主内液体流出。
5)洗柱5次，每次加入1-2个柱体积的非变性洗涤液(50mM NaH2PO4， 300mM NaCl，2mM imidazole，用氢氧化钠调节pH值至8.0)。
6)洗脱目的蛋白10-15次，每次用一个柱体积的非变性洗脱液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，50mM imidazole，用氢氧化钠调节pH至8.0)。将每次的洗脱液分别收集到不同的离心管中。收集获得的洗脱液即为纯化的蛋白样品。
以分子截留量为10kDa超滤管浓缩纯化后的重组蛋白，同时更换缓冲液除去蛋白溶液中高浓度的咪唑。具体操作为，首先将纯化后获得的蛋白溶液置于超滤管中，4℃4500g离心30min；再加入50mM pH7.4的磷酸钠缓冲液10mL，离心，重复5次。最终获得的浓缩及脱盐后的蛋白溶液中加入甘油至终浓度20％保存于-20℃备用，SDS-PAGE垂直电泳检测。获得CYP105D1的氨基酸序列为 Seq ID NO.1，camA氨基酸序列为Seq ID NO.7，camB氨基酸序列为Seq ID NO.8。
细胞色素P450的物质的量浓度利用CO差视光谱法测定，详见Omura T,Sato R(1964)The Carbon Monoxide-Binding Pigment Of Liver Microsomes.I.Evidence forIts Hemoprotein Nature.J Biol Chem 239:2370-8)。电子传递蛋白camA及camB 的摩尔量利用紫外光谱法测定，详见Girhard M,Klaus T,Khatri Y,Bernhardt R, Urlacher VB(2010)Characterization of the versatile monooxygenase CYP109B1 from Bacillussubtilis.Appl Microbiol Biotechnol 87(2):595-607)。
3.P450酶CYP105D1生物催化制备6-O-去甲罂粟碱
酶促催化制备6-O去甲罂粟碱的反应体系总体积在本实施例中设定为50 mL。在50mM pH 7.4的磷酸钠缓冲液的条件下，添加0.5μM的细胞色素P450 酶，以及电子传递系统蛋白组分：camA(2.5μM)，camB(10μM)。底物罂粟碱利用甲醇或PEG-200助溶，添加至反应体系中至终浓度为50mg/L，添加电子供体NADH至终浓度为0.2mM启动反应。28℃，180rpm震荡孵育1小时后两倍体积乙酸乙酯萃取，经HPLC检测，利用公式1计算得转化率为49％。利用CYP105D1酶法生物催化制备6-O-去甲罂粟碱的方法，生物催化反应的选择性强，无副产物的产生，生物转化率较高，转化时程较短，但该方法涉及到酶的提取与纯化过程，造成成本较高。
实施例3利用基因工程菌株生物催化制备6-O-去甲罂粟碱
1.基因工程菌株的构建
以Pseudomonas putida基因组DNA为模板，利用
F-CGGGATCCATGGTGACGCAAACGACAACGTGG/R-CCCAAGCTTAATGGCACTACTCAGTTCAGCTTTG引物对camA进行扩增获得PCR扩增产物 camA(BamHⅠ-HindⅢ)；利用F-GGAATTCCATATGTCTAAAGTAGTGTATGTGT C/R-GGGGTACCAATCCATTGCCTATCGGGAACATCG引物对camB进行扩增，获得PCR扩增产物camB(NdeⅠ-KpnⅠ)。PCR反应体系如下：
PCR反应体系(50μL)
PCR反应条件
96℃ 5min预变性，96℃ 1min变性，60℃ 30s退火，72℃ 1min延伸，循环30次。
利用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ分别对目的片段camA(BamHⅠ-Hind Ⅲ)以及载体pACYCDuet-1(购自Novagen)进行双酶切。利用T4DNA连接酶将酶切后的pACYCDuet-1载体和camA((BamHⅠ-HindⅢ)片段进行连接，获得质粒pACYCDuet-camA。进而利用限制性内切酶NdeⅠ和KpnⅠ分别对目的片段 camB(NdeⅠ-KpnⅠ)以及质粒pACYCDuet-camA进行双酶切。利用T4DNA连接酶将酶切后的pACYCDuet-camA载体和camB(NdeⅠ-KpnⅠ)片段进行连接，获得质粒pACYCDuet-camAB。
将质粒pET28a-CYP105D1以及质粒pACYCDuet-camAB共化转至E.coli BL21(DE3)感受态细胞中。所得工程菌株命名为BL21-CYP105D1-camAB。该菌株即为用于生物催化制备6-O-去甲罂粟碱的基因工程菌株。
2.基因工程菌株生物催化制备6-O-去甲罂粟碱工艺
将工程菌株BL21-CYP105D1-camAB接种至5mL种子培养基中，37℃， 200rpm震荡培养过夜，制备种子液。将种子液以1％接种量接入至50mL发酵培养基(TB培养基)中，37℃，200rpm震荡培养3h，添加终浓度为1mM 的δ-氨基乙酰丙酸，添加终浓度为0.1mM的IPTG，调节温度至20℃，调节转速至150rpm，进行蛋白的诱导。诱导12h后，向菌体培养液中添加底物罂粟碱(甲醇或PEG-200助溶)，使其终浓度为50mg/L。22℃，200rpm，转化 12h。等体积乙酸乙酯对发酵液萃取两次，经HPLC检测，利用公式1计算得转化率为55％。利用基因工程菌株生物催化制备6-O-去甲罂粟碱的方法，其转化率较高，转化过程无副产物的产生，产物单一，便于纯化，转化周期较短，且无需酶的大量纯化操作，生产成本较低，适用于工业化生产。
产物经HPLC-MS/MS及核磁波谱鉴定为6-O-去甲罂粟碱。QTOF-MS m/z 326.1405[M+H]+(calcd for C19H19NO4),310.1094,266.0820,238.0870,188.0712, 156.0449,128.0501.1H NMR(500MHz,MeOD)δ8.10(d,J＝5.9Hz,1H),7.49–7.42(m,2H),7.09(s,1H),6.92(d,J＝1.8Hz,1H),6.85(d,J＝8.3Hz,1H),6.78(dd, J＝8.2,1.9Hz,1H),4.52(s,2H),3.91(s,3H),3.75(d,J＝14.0Hz,6H).13C NMR (126MHz,MeOD)δ151.78,150.62,149.21,138.82,136.26,133.32,123.39,121.94, 119.88,113.62,113.26,109.99,105.45,56.50,56.42,56.32,41.45.
实施例5利用P450酶CYP105D1突变体L103A催化制备6-O-去甲罂粟碱
利用定点突变试剂盒(Mut Express MultiS Fast Mutagenesis Kit V2，购自于诺维赞生物科技有限公司)，按照试剂盒说明书流程进行操作，对CYP105D1的103 位点的异亮氨酸残基进行突变，将其突变为丙氨酸，获得突变体L103A；其氨基酸序列见Seq IDNO.2。并参照实施例2方法大量制备。
突变体酶促催化制备6-O去甲罂粟碱的反应体系总体积为50mL。在50mM pH 7.4的磷酸钠缓冲液的条件下，添加0.5μM的细胞色素P450酶，以及还原伴侣蛋白组分：camA(2.5μM)，camB(10μM)。底物罂粟碱利用甲醇或 PEG-200助溶，添加至反应体系中至终浓度为50mg/L，添加NADH至终浓度为0.2mM启动反应。28℃，180rpm震荡孵育12小时后两倍体积乙酸乙酯萃取，经检测得转化率为43％。
实施例6利用P450酶CYP105D1突变体L188A催化制备6-O-去甲罂粟碱
利用定点突变试剂盒对CYP105D1的188位点的亮氨酸残基进行突变，将其突变为丙氨酸，获得突变体L188A，其氨基酸序列见Seq ID NO.3。并参照实施例2方法大量制备。
突变体酶促催化制备6-O去甲罂粟碱的反应体系总体积为50mL。在50mM pH 7.4的磷酸钠缓冲液的条件下，添加0.5μM的细胞色素P450酶，以及还原伴侣蛋白组分：camA(2.5μM)，camB(10μM)。底物罂粟碱利用甲醇或 PEG-200助溶，添加至反应体系中至终浓度为50mg/L，添加NADH至终浓度为0.2mM启动反应。28℃，180rpm震荡孵育12小时后两倍体积乙酸乙酯萃取，经检测得转化率为57％。
实施例7利用P450酶CYP105D1突变体G300A催化制备6-O-去甲罂粟碱
利用定点突变试剂盒对CYP105D1的301位点的甘氨酸残基进行突变，将其突变为丙氨酸，获得突变体G300A，其氨基酸序列见Seq ID NO.4。并参照实施例2方法大量制备。
突变体酶促催化制备6-O去甲罂粟碱的反应体系总体积为50mL。在50mM pH 7.4的磷酸钠缓冲液的条件下，添加0.5μM的细胞色素P450酶，以及还原伴侣蛋白组分：camA(2.5μM)，camB(10μM)。底物罂粟碱利用甲醇或 PEG-200助溶，添加至反应体系中至终浓度为50mg/L，添加NADH至终浓度为0.2mM启动反应。28℃，180rpm震荡孵育12小时后两倍体积乙酸乙酯萃取，经检测得转化率为34％。
实施例8利用P450酶CYP105D1突变体Q302A催化制备6-O-去甲罂粟碱
利用定点突变试剂盒对CYP105D1的301位点的亮氨酸残基进行突变，将其突变为丙氨酸，获得突变体Q302A，其氨基酸序列见Seq ID NO.5。并参照实施例2方法大量制备。
突变体酶促催化制备6-O去甲罂粟碱的反应体系总体积为50mL。在50mM pH 7.4的磷酸钠缓冲液的条件下，添加0.5μM的细胞色素P450酶，以及还原伴侣蛋白组分：camA(2.5μM)，camB(10μM)。底物罂粟碱利用甲醇或 PEG-200助溶，添加至反应体系中至终浓度为50mg/L，添加NADH至终浓度为0.2mM启动反应。28℃，180rpm震荡孵育12小时后两倍体积乙酸乙酯萃取，经检测得转化率为54％。
实施例9利用P450酶CYP105D1突变体I402A催化制备6-O-去甲罂粟碱
利用定点突变试剂盒对CYP105D1的301位点的亮氨酸残基进行突变，将其突变为丙氨酸，获得突变体I402A，其氨基酸序列见Seq ID NO.6。并参照实施例2方法大量制备。
突变体酶促催化制备6-O去甲罂粟碱的反应体系总体积为50mL。在50mM pH 7.4的磷酸钠缓冲液的条件下，添加0.5μM的细胞色素P450酶，以及还原伴侣蛋白组分：camA(2.5μM)，camB(10μM)。底物罂粟碱利用甲醇或 PEG-200助溶，添加至反应体系中至终浓度为50mg/L，添加NADH至终浓度为0.2mM启动反应。28℃，180rpm震荡孵育12小时后两倍体积乙酸乙酯萃取，经检测得转化率为60％。
由此可见本发明利用细胞色素P450酶的专一性和高效性，O-去甲基化反应制备6-O-去甲罂粟碱,经过进一步优选优化细胞色素P450酶的种类及含量，使得该方法制备6-O-去甲罂粟碱具有条件更加温和，选择性更好，催化效率更高，催化剂容易移除，副产物更少，产品质量更好等优点。可见，本发明提供的一种酶法6-O-去甲罂粟碱的制备方法实用性较强，有利于放大规模推广，其应用前景较为广阔。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举，而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 中国药科大学
<120> 一种6-O-去甲罂粟碱的生物催化制备方法
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 412
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
Met Thr Glu Ser Thr Thr Asp Pro Ala Arg Gln Asn Leu Asp Pro Thr
1 5 10 15
Ser Pro Ala Pro Ala Thr Ser Phe Pro Gln Asp Arg Gly Cys Pro Tyr
20 25 30
His Pro Pro Ala Gly Tyr Ala Pro Leu Arg Glu Gly Arg Pro Leu Ser
35 40 45
Arg Val Thr Leu Phe Asp Gly Arg Pro Val Trp Ala Val Thr Gly His
50 55 60
Ala Leu Ala Arg Arg Leu Leu Ala Asp Pro Arg Leu Ser Thr Asp Arg
65 70 75 80
Ser His Pro Asp Phe Pro Val Pro Ala Glu Arg Phe Ala Gly Ala Gln
85 90 95
Arg Arg Arg Val Ala Leu Leu Gly Val Asp Asp Pro Glu His Asn Thr
100 105 110
Gln Arg Arg Met Leu Ile Pro Thr Phe Ser Val Lys Arg Ile Gly Ala
115 120 125
Leu Arg Pro Arg Ile Gln Glu Thr Val Asp Arg Leu Leu Asp Ala Met
130 135 140
Glu Arg Gln Gly Pro Pro Ala Glu Leu Val Ser Ala Phe Ala Leu Pro
145 150 155 160
Val Pro Ser Met Val Ile Cys Ala Leu Leu Gly Val Pro Tyr Ala Asp
165 170 175
His Ala Phe Phe Glu Glu Arg Ser Gln Arg Leu Leu Arg Gly Pro Gly
180 185 190
Ala Asp Asp Val Asn Arg Ala Arg Asp Glu Leu Glu Glu Tyr Leu Gly
195 200 205
Ala Leu Ile Asp Arg Lys Arg Ala Glu Pro Gly Asp Gly Leu Leu Asp
210 215 220
Glu Leu Ile His Arg Asp His Pro Asp Gly Pro Val Asp Arg Glu Gln
225 230 235 240
Leu Val Ala Phe Ala Val Ile Leu Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr
245 250 255
Ala Asn Met Ile Ser Leu Gly Thr Phe Thr Leu Leu Ser His Pro Glu
260 265 270
Gln Leu Ala Ala Leu Arg Ala Gly Gly Thr Ser Thr Ala Val Val Val
275 280 285
Glu Glu Leu Leu Arg Phe Leu Ser Ile Ala Glu Gly Leu Gln Arg Leu
290 295 300
Ala Thr Glu Asp Met Glu Val Asp Gly Ala Thr Ile Arg Lys Gly Glu
305 310 315 320
Gly Val Val Phe Ser Thr Ser Leu Ile Asn Arg Asp Ala Asp Val Phe
325 330 335
Pro Arg Ala Glu Thr Leu Asp Trp Asp Arg Pro Ala Arg His His Leu
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<210> 2
<211> 412
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
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Arg Arg Arg Val Ala Leu Ala Gly Val Asp Asp Pro Glu His Asn Thr
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Val Pro Ser Met Val Ile Cys Ala Leu Leu Gly Val Pro Tyr Ala Asp
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225 230 235 240
Leu Val Ala Phe Ala Val Ile Leu Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr
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325 330 335
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<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
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<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
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Gln Arg Arg Met Leu Ile Pro Thr Phe Ser Val Lys Arg Ile Gly Ala
115 120 125
Leu Arg Pro Arg Ile Gln Glu Thr Val Asp Arg Leu Leu Asp Ala Met
130 135 140
Glu Arg Gln Gly Pro Pro Ala Glu Leu Val Ser Ala Phe Ala Leu Pro
145 150 155 160
Val Pro Ser Met Val Ile Cys Ala Leu Leu Gly Val Pro Tyr Ala Asp
165 170 175
His Ala Phe Phe Glu Glu Arg Ser Gln Arg Leu Leu Arg Gly Pro Gly
180 185 190
Ala Asp Asp Val Asn Arg Ala Arg Asp Glu Leu Glu Glu Tyr Leu Gly
195 200 205
Ala Leu Ile Asp Arg Lys Arg Ala Glu Pro Gly Asp Gly Leu Leu Asp
210 215 220
Glu Leu Ile His Arg Asp His Pro Asp Gly Pro Val Asp Arg Glu Gln
225 230 235 240
Leu Val Ala Phe Ala Val Ile Leu Leu Ile Ala Gly His Glu Thr Thr
245 250 255
Ala Asn Met Ile Ser Leu Gly Thr Phe Thr Leu Leu Ser His Pro Glu
260 265 270
Gln Leu Ala Ala Leu Arg Ala Gly Gly Thr Ser Thr Ala Val Val Val
275 280 285
Glu Glu Leu Leu Arg Phe Leu Ser Ile Ala Glu Gly Leu Gln Arg Leu
290 295 300
Ala Thr Glu Asp Met Glu Val Asp Gly Ala Thr Ile Arg Lys Gly Glu
305 310 315 320
Gly Val Val Phe Ser Thr Ser Leu Ile Asn Arg Asp Ala Asp Val Phe
325 330 335
Pro Arg Ala Glu Thr Leu Asp Trp Asp Arg Pro Ala Arg His His Leu
340 345 350
Ala Phe Gly Phe Gly Val His Gln Cys Leu Gly Gln Asn Leu Ala Arg
355 360 365
Ala Glu Leu Asp Ile Ala Met Arg Thr Leu Phe Glu Arg Leu Pro Gly
370 375 380
Leu Arg Leu Ala Val Pro Ala His Glu Ile Arg His Lys Pro Gly Asp
385 390 395 400
Thr Ala Gln Gly Leu Leu Asp Leu Pro Val Ala Trp
405 410
<210> 7
<211> 422
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 7
Met Asn Ala Asn Asp Asn Val Val Ile Val Gly Thr Gly Leu Ala Gly
1 5 10 15
Val Glu Val Ala Phe Gly Leu Arg Ala Ser Gly Trp Glu Gly Asn Ile
20 25 30
Arg Leu Val Gly Asp Ala Thr Val Ile Pro His His Leu Pro Pro Leu
35 40 45
Ser Lys Ala Tyr Leu Ala Gly Lys Ala Thr Ala Glu Ser Leu Tyr Leu
50 55 60
Arg Thr Pro Asp Ala Tyr Ala Ala Gln Asn Ile Gln Leu Leu Gly Gly
65 70 75 80
Thr Gln Val Thr Ala Ile Asn Arg Asp Arg Gln Gln Val Ile Leu Ser
85 90 95
Asp Gly Arg Ala Leu Asp Tyr Asp Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Gly
100 105 110
Arg Pro Arg Pro Leu Pro Val Ala Ser Gly Ala Val Gly Lys Ala Asn
115 120 125
Asn Phe Arg Tyr Leu Arg Thr Leu Glu Asp Ala Glu Cys Ile Arg Arg
130 135 140
Gln Leu Ile Ala Asp Asn Arg Leu Val Val Ile Gly Gly Gly Tyr Ile
145 150 155 160
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165 170 175
Leu Leu Asp Thr Ala Ala Arg Val Leu Glu Arg Val Thr Ala Pro Pro
180 185 190
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195 200 205
Arg Thr Gly Thr Gln Val Cys Gly Phe Glu Met Ser Thr Asp Gln Gln
210 215 220
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225 230 235 240
Leu Val Ile Ala Gly Ile Gly Leu Ile Pro Asn Cys Glu Leu Ala Ser
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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325 330 335
Gly Leu Lys Met Val Gly Leu Ser Glu Gly Tyr Asp Arg Ile Ile Val
340 345 350
Arg Gly Ser Leu Ala Gln Pro Asp Phe Ser Val Phe Tyr Leu Gln Gly
355 360 365
Asp Arg Val Leu Ala Val Asp Thr Val Asn Arg Pro Val Glu Phe Asn
370 375 380
Gln Ser Lys Gln Ile Ile Thr Asp Arg Leu Pro Val Glu Pro Asn Leu
385 390 395 400
Leu Gly Asp Glu Ser Val Pro Leu Lys Glu Ile Ile Ala Ala Ala Lys
405 410 415
Ala Glu Leu Ser Ser Ala
420
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 8
Met Ser Lys Val Val Tyr Val Ser His Asp Gly Thr Arg Arg Glu Leu
1 5 10 15
Asp Val Ala Asp Gly Val Ser Leu Met Gln Ala Ala Val Ser Asn Gly
20 25 30
Ile Tyr Asp Ile Val Gly Asp Cys Gly Gly Ser Ala Ser Cys Ala Thr
35 40 45
Cys His Val Tyr Val Asn Glu Ala Phe Thr Asp Lys Val Pro Ala Ala
50 55 60
Asn Glu Arg Glu Ile Gly Met Leu Glu Cys Val Thr Ala Glu Leu Lys
65 70 75 80
Pro Asn Ser Arg Leu Cys Cys Gln Ile Ile Met Thr Pro Glu Leu Asp
85 90 95
Gly Ile Val Val Asp Val Pro Asp Arg Gln Trp
100 105
<210> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 9
ggaattccat atgacggaat ccacgacgga cc 32
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 10
ggaattctca ccaggccacg ggcaggt 27
<210> 11
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 11
ggaattccat atggtgacgc aaacgacaac gtgg 34
<210> 12
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 12
ccgctcgagg gcactactca gttcagcttt g 31
<210> 13
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 13
ggaattccat atgtctaaag tagtgtatgt gtc 33
<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 14
ccgctcgagc cattgcctat cgggaacatc g 31

Claims (7)

1.一种生物催化法制备6-O-去甲罂粟碱的方法，其特征在于按如下步骤实现：罂粟碱或其盐经生物催化剂催化底物罂粟碱或其盐，选择性脱甲基化，获得6-O-去甲罂粟碱及盐。
2.根据权利要求1所述的一种生物催化法制备6-O-去甲罂粟碱的方法，其特征在于所述的生物催化剂为CYP105D1，CYP105D1突变体，含有CYP105D1的野生菌株以及表达CYP105D1的工程菌株。
3.根据权利要求1所述的一种生物催化法制备6-O-去甲罂粟碱的方法，其特征在于，CYP105D1来源的野生菌株为灰色链霉菌（Streptomyces griseus）ATCC 13273。
4.根据权利要求1所述的一种生物催化法制备6-O-去甲罂粟碱的方法，其特征在于所述的CYP105D1的氨基酸序列为Seq ID NO.1。
5.根据权利要求1所述的一种生物催化法制备6-O-去甲罂粟碱的方法，其特征在于所述的CYP105D1的突变体的氨基酸序列为SeqID NO.2、SeqID NO.3、SeqID NO.4、SeqID NO.5或SeqID NO.6。
6.根据权利要求1所述的一种生物催化法制备6-O-去甲罂粟碱的方法，其特征在于所述的CYP105D1及其突变体作为催化剂时，还需要细胞色素 P450 酶系的电子供体及电子传递蛋白。
7.根据权利要求1所述的一种生物催化法制备6-O-去甲罂粟碱的方法，其特征在于所述的电子传递蛋白为camA和camB。
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