CN103483229B

CN103483229B - 一种atp释放剂及包含该释放剂的细菌快速检测试剂

Info

Publication number: CN103483229B
Application number: CN201310414806.0A
Authority: CN
Inventors: 郑曙剑; 殷秀飞; 应旭霞
Original assignee: HANGZHOU LONGJI BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: HANGZHOU LONGJI BIOLOGICAL TECHNOLOGY CO LTD
Priority date: 2013-09-12
Filing date: 2013-09-12
Publication date: 2015-06-17
Anticipated expiration: 2033-09-12
Also published as: CN103483229A

Abstract

本发明首先所要解决的技术问题是提供一种ATP释放剂及该释放剂的制备方法，该释放剂为5-（4-正壬烷基-苯基）-1-已烷磺酸钠。本发明还提供了一种细菌快速检测试剂，该试剂包含有浸有上述ATP释放剂的细菌采集拭子、荧光素酶、荧光素底物、反应缓冲液。本发明涉及ATP释放及测定，ATP的释放和测定一步完成，减少了ATP释放步骤，检测方法更简单，过程更为快速，数分钟就可以达到结果。本发明具有制备过程简单、成本低廉、效果显著等优点，能更好的适用于微生物的检测。

Description

一种ATP释放剂及包含该释放剂的细菌快速检测试剂

技术领域

本发明涉及ATP释放剂，更具体地说涉及包含该ATP释放剂及荧光素酶的细菌快速检测试剂。

背景技术

荧光素酶（luciferase）是一种能将化学能转变为光能的高效生物催化剂，萤火虫荧光素酶(简称虫荧光素酶，firefly luciferase，FL)以荧光素（Luciferin），三磷酸腺苷（ATP）和O₂为底物，在镁离子(Mg²⁺)存在时，将化学能转化为光能，并发出光量子，反应式如下：

Luciferin+O²+ATP+Mg²⁺+荧光素酶??Oxidized luciferin+CO2+AMP

+Pyrophosphate+hu

ATP既是荧光素酶催化发光的必须底物，又是所有生物生命活动的能量来源。ATP生物荧光法是目前认为最为快速的微生物检测方法。在其它反应底物均过量存在的情况下，荧光素酶催化发射荧光的数值与ATP的量呈线性关系。利用这一特性，早在1947年McElory等就应用FL来测定ATP，此后，荧光素酶在生物化学及生物技术的分析应用方面得到了不断发展。特别是在细菌检测方面，由于各生长时期的细菌有较恒定水平的ATP含量，提取细菌的ATP，利用生物发光法测定出ATP的含量后，即可推算出样品中的含菌量，整个过程仅需十几分钟。由于生物发光法无需培养过程、操作简便、灵敏度高，是目前监测微生物最快的方法之一。荧光素酶由于具有敏感性高、特异性好、反应迅速、操作简单和应用范围广等优点，现已成为医学、生物学、环境科学等研究领域中一种新的手段。因此，对荧光素酶的需求量也日益增加。

作为FL生产原料的萤火虫，其人工扑捉或养殖地域和季节限制，且生产周期长、养殖成本高、提取的酶成分复杂。随着分子生物学技术的发展，人们转向用基因工程方法制备荧光素酶。1985年，De Wet等首次克隆了北美萤火虫（P.Pyralis）的FL基因，并在大肠杆菌（Escherichia coli）中表达，从中得到具有生物活性的FL。随后，各种发光甲虫的FL基因相继克隆成功，并能在原核和真核表达系统中表达。但是，目前能够提供FL的厂家主要有Promega、Sigma和Roche三家国外公司，随着FL在国内需求量的增加，FL生产的国产化将是大势所趋。

传统荧光素酶的活性中心中含有大量的还原性的氨基酸，他们很容易被氧化从而减低酶的稳定性，故稳定性不强。如要长期保存，需置于-20 ℃的环境下保存，短期保存需置于4 ℃的冰箱内保存，以保存酶的稳定性。商品化ATP检测反应试剂要求在28 ℃的条件下反应，并且一旦配制后必须尽快使用，这一要求难以使ATP检测反应试剂在野外高温的环境中使用。本发明成功研制了耐热荧光素酶，在40 ℃环境中放置25 min 后活性保留90％以上，在37 ℃的条件下放置1 h 后其灵敏度基本不变，稳定性得到了提高。可用于现场快速检测细菌，从而拓广了ATP检测反应技术的应用领域。

ATP释放剂的作用是破坏细胞结构使其释放出ATP，而细胞中有一些分解ATP的酶类，可能在短时间内分解ATP，同时不同的释放剂可能对酶的活性有影响，因此还选择一个合适的释放剂，即能破坏细胞释放ATP，也能破坏细胞内的分解ATP酶类的活性，同时又不会在短时间内对荧光素的活性有太大影响。目前使用的ATP释放剂有煮沸法、稀酸法、稀碱法、表面活性剂法等。稀酸对酶类的破坏性一样，无特异性；一定浓度二甲基亚砜能改变细胞膜的通透性，使ATP释放出来，但对细胞内的ATP酶类无特异性破坏；常用的表面活性剂SDS破坏荧光素酶的活性，使酶变性失活；TritonX-100、苯扎溴铵等释放ATP效果不显著。本发明研制出的5-（4-正壬烷基-苯基）-1-已烷磺酸钠属于磺酸类离子表面活性剂，可解决以上问题，提高ATP的释放效果。

发明内容

本发明首先所要解决的技术问题是提供一种ATP释放剂，该释放剂为5-（4-正壬烷基-苯基）-1-已烷磺酸钠，其化学式为。

本发明所述的ATP释放剂可按以下步骤制备：

首先，第一步反应中，取正壬基苯和4-已烯基-1-磺酸，置于不锈钢反应釜中，密闭状态磁力搅拌反应，逐步加热到 120℃，反应 5h，静置冷却；取出反应产物于蒸馏瓶中，加热减压蒸馏出未反应的正壬基苯，得5-（4-正壬烷基-苯基）-1-已烷磺酸。

第二步反应中，在装有电动搅拌器、温度计、回流冷凝管、滴液漏斗的四口瓶中加入5-（4-正壬烷基-苯基）-1-已烷磺酸，置于水浴锅中，用滴液漏斗缓慢滴加 20％的 NaOH 异丙醇水溶液（异丙醇和水等质量比混合），反应温度控制在35℃～40℃，滴加过程中随时测定体系的 pH 值，直至 pH 值为 7～8 时停止反应，得到的产物为5-（4-正壬烷基-苯基）-1-已烷磺酸钠溶液。

本发明还解决的一个技术问题是提供一种细菌快速检测试剂，它不仅包含有浸有上述ATP释放剂的细菌采集拭子，还包括荧光素酶、荧光素底物、反应缓冲液，所述荧光素底物为：荧光素和Mg²⁺ ，所述反应缓冲液为：保护剂（牛血清蛋白、海藻糖、二硫苏糖醇、乙氧基化烷基硫酸钠）、Tris-HCl缓冲液。

进一步地，所述荧光素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所述。

本发明所具有的有益效果：

1、本发明在构建重组荧光素酶表达载体过程中，选取不影响酶活性、能提高酶热稳定性的多点突变，克服以往通过改变缓冲液和添加蛋白酶保护剂维持荧光素酶稳定性的方法。

2、本发明制备重组荧光素酶的过程中，采取37°C培养工程菌，便于迅速获得大量菌体，并通过低温、低密度、低浓度诱导剂诱导，保证重组荧光素酶可溶表达。制备萤火虫荧光素酶的方法具有过程简单、生长周期短、成本低廉、易于纯化的优点。大肠杆菌扩大培养，离心取沉淀，用低温超声波裂解细胞，取上清经过Ni螯合层析一步纯化得到纯度95%以上荧光素酶制品。

3、本发明涉及ATP释放及测定，ATP的释放和测定一步完成，减少了ATP释放步骤，检测方法更简单，过程更为快速，数分钟就可以达到结果。

本发明还涉及一种细菌总数快速检测试剂，在荧光素酶催化发光体系中，当荧光素和其他成分过量时，催化发光的强度(RLU)与ATP的量成正比关系，据研究发现细菌中ATP的含量是固定的，并且在活细胞中含量稳定，把细胞破碎后，细胞中的ATP完全释放出来，根据上述方法可以通过测量ATP的量间接估计细菌的数量。

4.本发明涉及一种新型ATP释放剂，本试剂为5-（4-正壬烷基-苯基）-1-已烷磺酸，是一种磺酸类离子表面活性剂。本试剂破坏细胞结构使其释放出ATP，同时破坏细胞内的分解ATP酶类的活性，再者不影响荧光素的活性。本试剂具有制备过程简单、成本低廉、效果显著等优点，能更好的适用于微生物的检测。

附图说明

图1表示的是孵育后的重组酶的相对信号强度对孵育温度作图，并与市售荧光素酶作对比，可以看出重组荧光素酶的稳定性较好。

图2表示的是40 ℃水浴中，孵育后的重组酶的相对信号强度对孵育时间作图，并与市售荧光素酶作对比，可以看出重组荧光素酶的稳定性较好。

图3表示的是重组表达载体pET28a-rt-LlL酶切产物进行琼脂糖电泳检测结果，结果显示重组表达载体pET28a-rt-LlL酶切后可以看到两条带，上面一条为pET28a，下面一条是大小为1720bp的荧光素酶基因。

图4表示的是重组萤火虫荧光素酶的诱导表达SDS-PAGE蛋白电泳图。

图5表示的是纯化的荧光素酶SDS-PAGE蛋白电泳图。

图6表示的使用四种不同的表面活性剂TritonX-100、SDS、苯扎溴铵和5-（4-正壬烷基-苯基）-1-已烷磺酸钠下ATP释放效果的比较。

图7表示的是通过比较使用不同浓度的ATP释放剂，荧光仪发光值的变化情况，确定ATP释放剂的最佳作用浓度。

具体实施方式

下面的实施例可更详细地说明本发明，但不可以任何形式限制本发明。并且，实施例中所涉及的实验方法，如无特殊说明，均为常规实验方法。

实施例一、含有荧光素酶基因的重组表达载体的构建

1、荧光素酶基因的获取

根据日本萤火虫荧光素酶基因（GenBank：X66919.1），采取全基因合成方法，委托上海捷瑞生物公司合成全基因，同时对蛋白质结构进行分析，对影响酶温度性，而又不影响酶活性的密码子进行了突变，将其中编码Ala 的217 密码子GCA 改为编码Leu的CTT，编码Glu 的457 密码子GAA 改为编码Ser的TCA，编码Asn 的465 密码子AAT 改为编码Ile的ATT，并在其5′和3′端分别加上CAT 和AAGCTT 以分别获得内切酶NdeⅠ和Hind Ⅲ的酶切识别位点CATATG 和AAGCTT，序列长度1656 bp将在细菌中稀有密码子替换成细菌偏爱密码子并连接在pGEM-T Vector（Promega公司产品）载体上，获得了热稳定荧光素酶的全基因序列；

2、重组表达载体构建

将上述步骤获得的含荧光素酶基因质粒载体1μg用限制性内切酶Hind Ⅲ/NdeⅠ进行双酶切，酶切产物与用同样酶切的1μg载体pET28a（+），1%琼脂糖电泳，且胶回收目的片段和载体片段，1%琼脂糖电泳检测回收片段的量，按相对分子数目的片段：载体片段=4:1混合，加入5μgT₄连接酶16°C连接过夜。取5μl连接产物转化100μl预制好的 DH5a感受态细胞，涂布抗性LB平板，37°C倒置培养过夜。挑选含有阳性质粒的克隆，将得到的含有荧光素酶的重组表达载体对的克隆命名为pET28a-rt-LlL。

3、重组表达载体的酶切鉴定

将待鉴定含重组表达载体pET28a-rt-LlL克隆小量培养，碱法快速抽提质粒，用限制性内切酶Hind Ⅲ/NdeⅠ进行双酶切，酶切产物进行琼脂糖电泳检测，结果如图3所示。其中泳道1为重组表达载体pET28a-rt-LlL酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果，M为DNA分子量标准。说明书附图3表示的是重组表达载体pET28a-rt-LlL酶切产物进行琼脂糖电泳检测结果，结果显示重组表达载体pET28a-rt-LlL酶切后可以看到两条带，上面一条为pET28a，下面一条是大小为1720bp的荧光素酶基因。

实施例二、荧光素酶的诱导表达和扩大培养

取实施例1获得的重组表达载体pET28a-rt-LlL转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，在含有卡那霉素的LB培养平板上培养，挑选单菌落接种到5mlLB培养基中筛选得到的阳性重组菌进行诱导表达，产物进行SDS-PAGE 分析，并与含有表达载体pET28a(+)的对照菌进行对比，结果如图4所示，说明书附图4表示的是重组萤火虫荧光素酶的诱导表达SDS-PAGE蛋白电泳图，其中杂蛋白较多。

与无目的基因的对照菌的破菌上清与总蛋白(图4中的泳道3、4) 相比，阳性重组菌的破菌上清与总蛋白中均可观察到分子量约为60 kDa的重组蛋白条带 (图4中的泳道1、2)，该重组蛋白的分子量与重组日本萤火虫荧光素酶的分子量相符，初步判定该条带即为rt-LlL。虽然破菌上清中的目的蛋白 (图4 中泳道1) 没有总蛋白中的目的蛋白 (图4 中泳道2) 含量高，但其所占比例与总蛋白中目的蛋白所占比例相当，说明rt-LlL 大部分以可溶形式表达，能够方便地通过镍亲和层析的方式纯化。

接种经过SDS-PAGE鉴定有目的蛋白表达的工程菌单菌落到200ml含kanamycin的LB三角瓶，200rpm，37°C震荡培养过夜，次日，按5%接种量，接种到400mlLB含kanamycin的1L三角瓶中，37°C，240rpm震荡培养至OD600=0.5，置冰水浴冷却至22°C，加入IPTG诱导荧光素酶基因表达，其中，IPTG的浓度为0.01 mM，诱导时间为6小时，震荡速度为240rpm/min。

实施例三、荧光素酶的分离纯化

由于上述实施例1构建的重组表达载体pET28a-rt-LlL上带有融合标签（His·Tag）的基因序列，所以表达出的目的蛋白上也带有His·Tag标签。因此，利用络合Ni的琼脂糖通过亲和层析法可以进行目的蛋白的纯化，亲和层析柱购于GE Healthcare公司。

按照上述实施例2的方法用IPTG进行诱导表达后，以10000 rpm/min离心5 min收获菌体沉淀；将菌体沉淀用Buffer A (20 mM Tris， 0.5 M NaCl pH 8.0)（60ml Buffer A/L菌体）重悬，250 W超声裂解90次，每次5s，间歇10s，4°C条件下12000 rpm/min 离心20 min收集上清准备上样。

具体纯化步骤如下：

1）用Buffer A 平衡Ni柱至OD280读数恒定；

2）收集的样品滤过上清上柱；

3）用含有 40 mM 咪唑的Buffer A 过柱淋洗去掉杂蛋白；

4）用含有 300 mM 咪唑的 Buffer A 缓慢过柱，将纯化的目的蛋白收集到离心管中；

5）取纯化后的目的蛋白进行SDS-PAGE，观察，目的蛋白的纯化效果；

结果如图5所示，说明书附图5表示的是纯化的荧光素酶SDS-PAGE蛋白电泳图；其中，泳道1为样品纯化后的SDS-PAGE检测结果，泳道2M为14.0kda～116.0 kDa的蛋白质分子量标准。

实施例四、荧光素酶的酶活性和稳定性鉴定

将实施例3步骤4中洗脱目的蛋白，透析除盐制成荧光素酶制品，以市售荧光素酶(PpL)作为标准品，荧光素酶制品按ATP产品荧光测定方法测定荧光，制作信号强度-活力单位标准曲线，根据该标准曲线及紫外测定的蛋白浓度计算出重组耐热荧光素酶的比活为4.29×10¹⁰ RLU/mg，比市售荧光素酶的比活(3.9×10¹⁰ RLU/mg) 高，说明rt-LlL 可以替代传统ATP检测反应体系中的荧光素酶。将rt-LlL 分别放置在25 ℃、30 ℃、35 ℃、37 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃水浴中孵育10 min，迅速取出放入冰水中冷却1min，取1μL 加入到10μL测活反应液，测定其信号强度，以不经孵育的rt-LlL 得到的信号为100％，计算各温度孵育后的重组酶的相对信号，以相对信号强度对孵育温度作图，并与商品北美荧光素酶作对比,如图1所示。

另取rt-LlL，在40 ℃水浴中分别放置0、5、10、15、20、25 min，迅速取出放入冰水冷却1 min，取1 μL 加入到10 μL 测活反应液测定其信号强度，以不经孵育的rt-LlL 得到的信号为100％，计算孵育后的rt-LlL 的相对信号，以相对信号强度对孵育温度作图，并与商品北美荧光素酶作对比，该酶稳定性有明显的提高，如图2所示。

实施例五、ATP释放剂的确定

细菌ATP存在于活菌细胞内，只有当细胞裂解后，才能提取出ATP，与发光试剂反应产生荧光信号，因此，细菌ATP提取效率的高低，取决于活菌细胞的裂解程度。先将标准ATP做系列稀释，加入到组合萤火虫荧光素、Mg²⁺、重组荧光素酶、牛血清蛋白400μl反应工作液，测定荧光读数。然后分别将一定浓度的TritonX-100、SDS、苯扎溴铵和5-（4-正壬烷基-苯基）-1-已烷磺酸钠，用pH为7.8的Tris-HCl缓冲液稀释，与原始菌液等体积混合并静置5 min后，用平板计数法对各混合体系的活菌进行计数。比较裂解前后体系的活菌数，计算各裂解剂的裂解效率，选择裂解率高的试剂为提取剂。说明书附图6表示的使用四种不同的表面活性剂TritonX-100、SDS、苯扎溴铵和5-（4-正壬烷基-苯基）-1-已烷磺酸钠下ATP释放效果的比较，最终确定5-（4-正壬烷基-苯基）-1-已烷磺酸钠为ATP释放剂；说明书附图7表示的是通过比较使用不同浓度的ATP释放剂，荧光仪发光值的变化情况，确定ATP释放剂的最佳作用浓度。从图6和图7中看出在低浓度时其读数随5-（4-正壬烷基-苯基）-1-已烷磺酸钠含量的增加而增加，在浓度达到0.05%时裂解效果最好，超过后随浓度增加而下降是因为5-（4-正壬烷基-苯基）-1-已烷磺酸钠对酶的抑制作用迅速增加，故优选0.05%5-（4-正壬烷基-苯基）-1-已烷磺酸钠为细菌ATP提取剂。

5-（4-正壬烷基-苯基）-1-已烷磺酸钠的制备过程如下：

取4.09克正壬基苯和1.64克4-已烯基-1-磺酸，逐步加热到 120℃，反应 5h，静置冷却，加热减压蒸馏出未反应的正壬基苯，得3.8克5-（4-正壬烷基-苯基）-1-已烷磺酸；

滴加 20％的 NaOH 异丙醇水溶液，反应温度控制在（35～40）℃，直至 pH 值为 7～8 时停止反应，得到的产物为5-（4-正壬烷基-苯基）-1-已烷磺酸钠溶液。

实施例六、荧光发光系统反应条件的确定

荧光发光剂的主要组成成分是荧光素、萤光素酶、Mg²⁺、蛋白保护剂。以ATP为标准品，所以不需要ATP释放剂。将萤光素酶配制成1mg/ml、荧光素配制成1mg/ml、Mg²⁺配制成20mol/L的母液。通过实验确定Mg²⁺的最佳工作浓度为1.5mM，荧光素的最佳工作浓度为0.02mg/ml，荧光素酶的最佳工作浓度为0.05mg/ml，二硫苏糖醇最佳工作浓度为1.0mM，牛血清蛋白最佳工作浓度为0.5mg/ml，乙氧基化烷基硫酸钠最佳工作浓度为1%到2%，海藻糖的最佳工作浓度选择0.15mol/L。当温度为37℃，PH为7.8时，发光值最大。

实施例七、细菌快速检测试剂制备及检测

1. 细菌快速诊断试剂制备

取70 μL5-（4-正壬烷基-苯基）-1-已烷磺酸钠ATP释放溶液浸湿取样棒棉拭子，将取样棒插入套筒内，另取萤火虫荧光素0.01mg/ml、Mg²⁺0.15mM、重组荧光素酶1mg/ml、牛血清蛋白0.5mg/ml、海藻糖0.15mol/L、二硫苏糖醇1.0mM、乙氧基化烷基硫酸钠1%到2% 、Tris-HCl缓冲液，制成400ul反应工作液，加入到带吸阀的球形管，即装配成细菌快速检测试剂。

2. 细菌快速检测试剂选择性及灵敏度检测

细菌快速检测试剂的选择性

首先分别取大肠杆菌、酵母菌、小鼠的骨髓瘤细胞、金黄色葡萄球菌、小鼠体细胞，用0.9%生理盐水稀释成10⁶/ml，将25 μL菌液加到取样棒上（现场检测时，取出用取样棒擦拭待检物体），将取样棒插入检测管中，握住吸阀，倒转装置并用另一只手的拇指和中指捏住球管，从吸阀处折断。轻挤球管两次，挤出球管内反应液，清洗检测管内标本，轻摇两到三次。将整个检测管放入便携式荧光仪(绿邦生物科技有限公司提供)中，盖紧盖子，进行测量，15秒钟后读取发光值。结果从表1中可以看出检测试剂对细胞没有选择性。

表1

细菌快速检测试剂的灵敏度

另取大肠杆菌用0.9%生理盐水配制成10¹/ml、10²/ml、10³/ml、10⁴/ml、10⁵/ml、10⁶/ml、10⁷/ml、10⁸/ml同浓度浓度的菌液，同细菌选择性检测工艺检测，结果从表2看，细菌快速检测试剂的检测灵敏度为2*10²~2*10⁴个细菌/ml。

表2

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州隆基生物技术有限公司

<120> 一种ATP释放剂及包含该释放剂的细菌快速检测试剂

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 548

<212> PRT

<213> 荧光素酶

<400> 1

Met Glu Asn Met Glu Asn Asp Glu Asn Ile Val Tyr Gly Pro Glu Pro

1 5 10 15

Phe Tyr Pro Ile Glu Glu Gly Ser Ala Gly Ala Gln Leu Arg Lys Tyr

20 25 30

Met Asp Arg Tyr Ala Lys Leu Gly Ala Ile Ala Phe Thr Asn Ala Leu

35 40 45

Thr Gly Val Asp Tyr Thr Tyr Ala Glu Tyr Leu Glu Lys Ser Cys Cys

50 55 60

Leu Gly Glu Ala Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Val Val Asp Gly Arg Ile

65 70 75 80

Ala Leu Cys Ser Glu Asn Cys Glu Glu Phe Phe Ile Pro Val Leu Ala

85 90 95

Gly Leu Phe Ile Gly Val Gly Val Ala Pro Thr Asn Glu Ile Tyr Thr

100 105 110

Leu Arg Glu Leu Val His Ser Leu Gly Ile Ser Lys Pro Thr Ile Val

115 120 125

Phe Ser Ser Lys Lys Gly Leu Asp Lys Val Ile Thr Val Gln Lys Thr

130 135 140

Val Thr Ala Ile Lys Thr Ile Val Ile Leu Asp Ser Lys Val Asp Tyr

145 150 155 160

Arg Gly Tyr Gln Ser Met Asp Asn Phe Ile Lys Lys Asn Thr Pro Gln

165 170 175

Gly Phe Lys Gly Ser Ser Phe Lys Thr Val Glu Val Asn Arg Lys Glu

180 185 190

Gln Val Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly Ser Thr Gly Leu Pro Lys

195 200 205

Gly Val Gln Leu Thr His Glu Asn Leu Val Thr Arg Phe Ser His Ala

210 215 220

Arg Asp Pro Ile Tyr Gly Asn Gln Val Ser Pro Gly Thr Ala Ile Leu

225 230 235 240

Thr Val Val Pro Phe His His Gly Phe Gly Met Phe Thr Thr Leu Gly

245 250 255

Tyr Leu Thr Cys Gly Phe Arg Ile Val Met Leu Thr Lys Phe Asp Glu

260 265 270

Glu Thr Phe Leu Lys Thr Leu Gln Asp Tyr Lys Cys Ser Ser Val Ile

275 280 285

Leu Val Pro Thr Leu Phe Ala Ile Leu Asn Arg Ser Glu Leu Leu Asp

290 295 300

Lys Tyr Asp Leu Ser Asn Leu Val Glu Ile Ala Ser Gly Gly Ala Pro

305 310 315 320

Leu Ser Lys Glu Ile Gly Glu Ala Val Ala Arg Arg Phe Asn Leu Pro

325 330 335

Gly Val Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ser Ala Ile Ile

340 345 350

Ile Thr Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly Ala Ser Gly Lys Val Val

355 360 365

Pro Leu Phe Lys Ala Lys Val Ile Asp Leu Asp Thr Lys Lys Thr Leu

370 375 380

Gly Pro Asn Arg Arg Gly Glu Val Cys Val Lys Gly Pro Met Leu Met

385 390 395 400

Lys Gly Tyr Val Asp Asn Pro Glu Ala Thr Arg Glu Ile Ile Asp Glu

405 410 415

Glu Gly Trp Leu His Thr Gly Asp Ile Gly Tyr Tyr Asp Glu Glu Lys

420 425 430

His Phe Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Ser Leu Ile Lys Tyr Lys Gly

435 440 445

Tyr Gln Val Pro Pro Ala Glu Leu Ser Ser Val Leu Leu Gln His Pro

450 455 460

Ile Ile Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Val Pro Asp Pro Ile Ala Gly

465 470 475 480

Glu Leu Pro Gly Ala Val Val Val Leu Glu Lys Gly Lys Ser Met Thr

485 490 495

Glu Lys Glu Val Met Asp Tyr Val Ala Ser Gln Val Ser Asn Ala Lys

500 505 510

Arg Leu Arg Gly Gly Val Arg Phe Val Asp Glu Val Pro Lys Gly Leu

515 520 525

Thr Gly Lys Ile Asp Gly Lys Ala Ile Arg Glu Ile Leu Lys Lys Pro

530 535 540

Val Ala Lys Met

545

<210> 2

<211> 1656

<212> DNA

<213> 荧光素酶

<400> 2

catatggaaa acatggagaa cgatgaaaat attgtgtatg gtcctgaacc attttaccct 60

attgaagagg gatctgctgg agcacaattg cgcaagtata tggatcgata tgcaaaactt 120

ggagcaattg cttttactaa cgcacttacc ggtgtcgatt atacgtacgc cgaatactta 180

gaaaaatcat gctgtctagg agaggcttta aagaattatg gtttggttgt tgatggaaga 240

attgcgttat gcagtgaaaa ctgtgaagaa ttctttattc ctgtattagc cggtttattt 300

ataggtgtcg gtgtggctcc aactaatgag atttacactc tacgtgaatt ggttcacagt 360

ttaggcatct ctaagccaac aattgtattt agttctaaaa aaggattaga taaagttata 420

actgtacaaa aaacggtaac tgctattaaa accattgtta tattggacag caaagtggat 480

tatagaggtt atcaatccat ggacaacttt attaaaaaaa acactccaca aggtttcaaa 540

ggatcaagtt ttaaaactgt agaagttaac cgcaaagaac aagttgctct tataatgaac 600

tcttcgggtt caaccggttt gccaaaaggt gtgcaactta ctcatgaaaa tcttgtcact 660

agattttctc acgctagaga tccaatttat ggaaaccaag tttcaccagg cacggctatt 720

ttaactgtag taccattcca tcatggtttt ggtatgttta ctactttagg ctatctaact 780

tgtggttttc gtattgtcat gttaacgaaa tttgacgaag agactttttt aaaaacactg 840

caagattaca aatgttcaag cgttattctt gtaccgactt tgtttgcaat tcttaataga 900

agtgaattac tcgataaata tgatttatca aatttagttg aaattgcatc tggcggagca 960

cctttatcta aagaaattgg tgaagctgtt gctagacgtt ttaatttacc gggtgttcgt 1020

caaggctatg gtttaacaga aacaacctct gcaattatta tcacaccgga aggcgatgat 1080

aaaccaggtg cttctggcaa agttgtgcca ttatttaaag caaaagttat cgatcttgat 1140

actaaaaaaa ctttgggccc gaacagacgt ggagaagttt gtgtaaaggg tcctatgctt 1200

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Claims

1.一种ATP释放剂，其特征在于它为5-(4-正壬烷基-苯基)-1-已烷磺酸钠，其化学式为：

2.权利要求1所述ATP释放剂的制备方法，其特征在于包括以下两步反应：

具体制备过程如下：

(1)取正壬基苯和4-已烯基-1-磺酸，置于不锈钢反应釜中，密闭状态磁力搅拌反应，逐步加热到120℃，反应5h，静置冷却；取出反应产物于蒸馏瓶中，加热减压蒸馏出未反应的正壬基苯得5-(4-正壬烷基-苯基)-1-已烷磺酸；

(2)在装有电动搅拌器、温度计、回流冷凝管、滴液漏斗的四口瓶中加入5-(4-正壬烷基-苯基)-1-已烷磺酸，置于水浴锅中，用滴液漏斗缓慢滴加20％的NaOH异丙醇水溶液，反应温度控制在35℃～40℃，滴加过程中随时测定体系的pH值，直至pH值为7～8时停止反应，得到的产物为5-(4-正壬烷基-苯基)-1-已烷磺酸钠溶液。

3.一种细菌快速检测试剂，其特征在于它包括浸有如权利要求1所述的ATP释放剂的细菌采集拭子、荧光素酶、荧光素底物、反应缓冲液。

4.如权利要求3所述的细菌快速检测试剂，其特征在于所述荧光素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。

5.如权利要求4所述的细菌快速检测试剂，其特征在于所述荧光素酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所述。