CN109470637A - 一种测定乙醇脱氢酶活性的方法 - Google Patents

一种测定乙醇脱氢酶活性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种测定乙醇脱氢酶活性的方法，通过乙醇脱氢酶催化乙醇转化为乙醛，乙醛与3‑甲基‑2‑苯并噻唑啉酮腙盐酸盐(MBTH)及FeCl3反应生成蓝色化合物，在610nm处产生吸收峰，在一定范围内，吸光度与酶活性成正比。本发明克服了一般测定中时间难以准确控制的缺点；采用酶标仪测定，实现了样品的批量测定，降低了测定的时间成本。同时，本发明不受酶液中的杂质干扰，灵敏度和准确性高，重复性好，操作简便，效率高等优点，且不依赖高档仪器设备，便于推广应用。

Description

一种测定乙醇脱氢酶活性的方法
技术领域
本发明属于生物化学领域，涉及酶活性测定技术，具体来说是一种测定乙醇脱氢酶活性的方法。
背景技术
乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase，ADH)是一种广泛存在于生物体内的锌结合酶，能在NAD(P)辅因子参与下催化短的直链醇醛之间的转化(如乙醇与乙醛)。乙醇脱氢酶广泛存在于人、动物、植物和微生物中，对于机体健康和胁迫应答等起着重要作用。在人和动物体内，乙醇脱氢酶大量存在于肝脏中，在机体解除乙醇毒性中起着关键作用。在植物中，乙醇脱氢酶不仅与植物响应低氧等胁迫密切相关，也在植物酯类等香气物质的合成中发挥着重要作用。在酵母和细菌中，乙醇脱氢酶是菌体适应低氧环境并产生发酵作用的关键酶之一。
乙醇脱氢酶的活性测定是相关研究的一个重要环节。目前乙醇脱氢酶活性测定以紫外分光光度法最为普遍，该方法基于乙醇脱氢酶催化乙醇脱氢生成乙醛的同时能够还原NAD+生成NADH，而NADH可产生340nm吸收，但这一方法极易受干扰(我们实测表明，对于一些样品，即使将煮沸变性的无活性的酶液加入到反应体系中也可产生340nm吸光度的变化)，且灵敏度差，不能满足低活性样品中酶活性的检测。此外，前人也基于荧光法通过测定反应生成的乙醛来检测乙醇脱氢酶活性，但这一方法依赖荧光分光光度计这一高档仪器，不利于推广。前人也基于色谱法通过测定反应生成的乙醛来检测乙醇脱氢酶活性，但色谱方法操作繁琐，耗时长，且依赖色谱仪这一高档仪器，也不利于推广。
基于以上背景，我们发明了一种利用比色法测定乙醇脱氢酶活性的方法，本方法可不受酶液中的杂质干扰，灵敏度和准确性高，重复性好，且操作简便，效率高，不依赖高档仪器设备，便于推广应用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供一种乙醇脱氢酶的测定方法，主要解决当前乙醇脱氢酶活性测定中易受干扰、灵敏度低、操作复杂和依赖高档仪器的技术问题。
为实现本发明的目的，主要采用技术方案如下：
本发明提供的是一种检测乙醇脱氢酶活性的方法，是一种利用比色法检测乙醇脱氢酶活性，主要原理如下：乙醇脱氢酶能在NAD+参与下，催化乙醇生成乙醛，而乙醛能够与3-甲基-2-苯并噻唑啉酮腙盐酸盐(3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazonehydrochloride，MBTH)反应生成嗪，嗪在酸性溶液中能够被FeCl3氧化成蓝色化合物，该蓝色化合物在610nm处有最大吸收峰，故通过检测610nm处的吸光度即可计算待测样品中乙醇脱氢酶的活性。
具体通过以下步骤实现：
(1)试剂配制，包括提取液配制、酶反应体系配制、MBTH盐酸溶液配制、FeCl3溶液配制和乙醛标曲母液配制；
(2)粗酶液制备，包括研磨、离心；
(3)标准曲线绘制，包括乙醛标准系列配制、吸光度测定、绘制回归方程；
(4)样品测定，包括控制反应时间、测定吸光度；
(5)结果计算，包括计算公式、酶活性表示单位。
作为一种优选的技术方案，步骤(1)试剂配制具体包括以下试剂的配制：
提取液：称取2.7218g KH2PO4、0.9216g硫胺素焦磷酸(TPP)、0.4066g MgCl2·6H2O和0.3085g二硫苏糖醇(DTT)，加入900ml蒸馏水溶解后，调节pH至7.5，最后定容至1L。
酶反应液：称取甘氨酸3.7535g，加入400ml蒸馏水溶解，用KOH调节pH至指定值(最适反应pH随生物种类略有差异)后，加入0.2654g NAD+和6.9105g乙醇，混匀定容至500ml，现配现用。空白对照为无乙醇。
MBTH盐酸溶液：取0.4gMBTH，用0.1M HCl盐酸溶解并定容至100ml，现配现用。
FeCl3溶液：取1g FeCl3·6H2O，用蒸馏水溶解并定容至100ml。
乙醛母液(100ppm)：取0.01g乙醛(折合99.5％乙醛10μl)，用蒸馏水定容至100ml。
作为一种优选的技术方案，步骤(2)粗酶液制备具体包括以下步骤：
样品在液氮中研磨成粉末后，取1g或其它重量(记录重量m，单位为克)于10ml离心管中，加入4ml提取液，混匀后冰浴15min，在10000g下离心15min，上清液转移至刻度试管，用提取液定容至5ml(或其他体积，记录酶液体积V酶，单位为毫升)，即为粗酶液。
作为一种优选的技术方案，步骤(3)标准曲线的绘制具体包括以下步骤：
a)乙醛标准系列配制：取乙醛母液，稀释一百倍，得到1ppm乙醛工作溶液，分别吸取0、2、4、6、8、10ml乙醛工作溶液于10ml刻度试管中，用蒸馏水定容至10ml。以0ppm乙醛调节零点，显色反应具体操作同样品。
b)绘制回归方程：以乙醛含量为自变量x，吸光度为因变量y，用Excel绘制散点图，建立得到回归方程y＝a x+b。
作为一种优选方案，步骤(4)样品测定具体包括以下步骤：
a)反应控制：取两只10ml离心管，管1作为对照，管2作为样品测定。管1中加入450μl无乙醇酶反应液，管2则加入450μl酶反应液，两管中均加入50μl或其它体积(记录体积V反，单位为毫升)经稀释适当倍数(记录倍数F)的粗酶液，混匀后立刻计时，在25℃下水浴反应1h或其它时长(记录反应时间t，单位分钟)后，立即加入1ml MBTH盐酸溶液，混匀后静置20min。再加入1ml FeCl3溶液，混匀静置10min。
b)测定：最后加入2.5ml蒸馏水，分别在610nm波长处测定两管液体吸光度，记作A0和A1；
作为一种优选的技术方案，步骤(5)结果计算具体如下：
其中，x表示由吸光度A1-A0的值从回归方程得到的乙醛含量(μg)；F表示粗酶液稀释的倍数；M表示乙醛的相对分子质量(g/mol)，为44.05；t表示酶反应时间(min)；m表示样品重量(g)；V酶表示提取液的体积(ml)；V反表示测定所用的粗酶液的体积(ml)；酶活性的单位为μmol乙醛g-1min-1，即每克样品在每分钟产生的乙醛的微摩尔量。
与现有技术相比，本发明采用MBTH盐酸溶液终止酶反应，克服了一般测定中时间难以准确控制的缺点；采用酶标仪测定，实现了样品的批量测定，降低了测定的时间成本。同时，还具有不受酶液中的杂质干扰，灵敏度和准确性高，重复性好，操作简便，效率高等优点，且本方法仅需可见分光光度计或酶标仪等实验室常规仪器，便于推广应用。
附图说明
图1：乙醛标准曲线。图中所示结果为以0ppm调节零点后的吸光值，回归方程为：y＝0.9706x-0.0018，R2＝0.9978。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
实施例1：乙醛标准曲线绘制
(1)配制显色反应液：0.4％(w/v)MBTH盐酸溶液(0.1M HCl)；0.73％(w/v)FeCl3溶液。
(2)配制乙醛母液：用酶反应液配制100ppm的乙醛母液。
(3)配制乙醛标准系列：取乙醛母液，稀释一百倍，得到1ppm乙醛工作溶液，分别吸取0、2、4、6、8、10ml乙醛工作溶液于10ml容量瓶中，用酶反应液定容至10ml，得到0、0.2、0.4、0.6、0.8、1ppm浓度的乙醛溶液。
(4)进行显色反应：取6只10ml离心管，分别加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1ppm的乙醛溶液500μl，再分别加入1ml MTBH盐酸溶液，混匀后静置20min。然后加入1ml FeCl3溶液，混匀后静置10min。最后加入2.5ml蒸馏水，测定其在610nm处的吸光度。以0ppm乙醛调节零点。
(5)绘制回归方程：以乙醛含量为自变量x，吸光度为因变量y，用Excel绘制散点图。以一次试验结果为例，建立得到回归方程y＝0.9706x-0.0018，R2＝0.9978(附图1)。
实施例2：柑橘果肉乙醇脱氢酶活性测定
(1)酶反应并显色：取两只10ml离心管，管1作为对照，管2作为样品测定。管1中
加入450μl无乙醇酶反应液，管2则加入450μl酶反应液，两管中均加入50μl稀释5
倍的粗酶液，混匀后立刻计时，在25℃反应1h后，立即加入1ml MBTH盐酸溶液，混
匀后静置20min。再加入1ml FeCl3溶液，混匀后静置10min。
(2)测定：加入2.5ml蒸馏水，分别在610nm波长处测定两管液体吸光度，记作A0和A1；
(3)计算：
乙醇脱氢酶活性定义为25℃，pH9.0条件下，每分钟生成1μmol乙醛的酶量为一个活力单位(U)，依据公式
计算样品中的酶活性。以一次试验结果为例，纽荷尔脐橙成熟果实果肉为样品时，A0＝0.185，A1＝0.45，计算得到x＝0.2749，试验时取用的F、t、m分别为5、60、1，V酶和V反分别为5、0.05，计算得到乙醇脱氢酶活力为0.05U g-1。

Claims (6)

1.一种测定乙醇脱氢酶活性的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
(1)试剂配制，包括提取液配制、酶反应液配制、MBTH盐酸溶液配制、FeCl3溶液配制和乙醛标曲母液配制；
(2)粗酶液制备，包括研磨、离心；
(3)标准曲线绘制，包括乙醛标准系列配制、吸光度测定、绘制回归方程；
(4)样品测定，包括控制反应时间、测定吸光度；
(5)结果计算，包括计算公式、酶活性表示单位。
2.根据权利要求1所述的一种测定乙醇脱氢酶活性的方法，其特征在于，步骤(1)试剂配制如下：
提取液：称取2.7218g KH2PO4、0.9216g硫胺素焦磷酸、0.4066g MgCl2·6H2O和0.3085g二硫苏糖醇，加入900ml蒸馏水溶解后，调节pH至7.5，最后定容至1L；
酶反应液：称取甘氨酸3.7535g，加入400ml蒸馏水溶解，用KOH调节pH至指定值后，加入0.2654g NAD+和6.9105g乙醇，混匀定容至500ml，现配现用，空白对照为无乙醇；
MBTH盐酸溶液：取0.4gMBTH，用0.1M HCl盐酸溶解并定容至100ml，现配现用；
FeCl3溶液：取1g FeCl3·6H2O，用蒸馏水溶解并定容至100ml；
乙醛母液：取0.01g乙醛，用蒸馏水定容至100ml。
3.根据权利要求1所述的一种测定乙醇脱氢酶活性的方法，其特征在于，步骤(2)粗酶液制备通过以下步骤实现：
样品在液氮中研磨成粉末后，取1g或其它重量于10ml离心管中，加入4ml提取液，混匀后冰浴15min，在10000g下离心15min，上清液转移至刻度试管，用提取液定容至5ml，即为粗酶液。
4.根据权利要求1所述的一种测定乙醇脱氢酶活性的方法，其特征在于，步骤(3)标准曲线的绘制通过以下步骤实现：
a)乙醛标准系列配制：取乙醛母液，稀释一百倍，得到1ppm乙醛工作溶液，分别吸取0、2、4、6、8、10ml乙醛工作溶液于10ml刻度试管中，用蒸馏水定容至10ml。以0ppm乙醛调节零点，显色反应具体操作同样品；
b)绘制回归方程：以乙醛含量为自变量x，吸光度为因变量y，用Excel绘制散点图，建立得到回归方程y＝ax+b。
5.根据权利要求1所述的一种测定乙醇脱氢酶活性的方法，其特征在于，步骤(4)样品测定通过以下步骤实现：
a)反应控制：取两只10ml离心管，管1作为对照，管2作为样品测定，管1中加入450μl无乙醇酶反应液，管2则加入450μl酶反应液，两管中均加入50μl或其它体积经稀释适当倍数的粗酶液，混匀后立刻计时，在25℃下水浴反应1h或其它时长后，立即加入1ml MBTH盐酸溶液，混匀后静置20min，再加入1ml FeCl3溶液，混匀静置10min；
b)测定：最后加入2.5ml蒸馏水，分别在610nm波长处测定两管液体吸光度，记作A0和A1。
6.根据权利要求1所述的一种测定乙醇脱氢酶活性的方法，其特征在于，步骤(5)结果计算具体如下：
其中：x表示由吸光度A1-A0的值从回归方程得到的乙醛含量(μg)；F表示粗酶液稀释的倍数；M表示乙醛的相对分子质量(g/mol)，为44.05；t表示酶反应时间(min)；m表示样品重量(g)；V酶表示提取液的体积(ml)；V反表示测定所用的粗酶液的体积(ml)；酶活性的单位为μmol乙醛g-1min-1，即每克样品在每分钟产生的乙醛的微摩尔量。
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