CN106467739A - 儿茶酚-o-甲基转移酶的特异性荧光探针及其应用 - Google Patents
儿茶酚-o-甲基转移酶的特异性荧光探针及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种儿茶酚-O-甲基转移酶的特异性荧光探针及其应用。该特异性探针底物为3-苯并噻唑-7,8-二羟基香豆素(3-BTD)，该底物可被COMT酶专一性催化生成8-甲氧基产物并在520nm处显示荧光信号，通过检测荧光强度的变化可定量测定COMT的活性。该探针不仅可用于不同来源生物样本中COMT酶活的定量评估，还可用于体外快速筛选COMT的抑制剂并评估其抑制能力。该方法可用于各类体外生物样品中COMT酶真实活力的定量评估，实现抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价；可用于评价不同种属COMT及具有不同氨基酸序列的COMT突变体的催化活性，进而评估其代谢儿茶酚类药物的能力。具有灵敏度高、准确度高、抗环境干扰能力强、易于高通量检测与抑制剂筛选等优势。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种儿茶酚-O-甲基转移酶特异性荧光探针及其应用。
背景技术
儿茶酚-氧-甲基化转移酶(Catechol-O-methyltransferase,COMT)是人体中重要的一种Ⅱ相转移酶，广泛分布于人体组织如肝脏，肾脏，肺，乳腺，血红细胞及大脑中。在人体中COMT负责清除活性及毒性的儿茶酚类化合物，如神经递质多巴胺，肾上腺素及去甲肾上腺素，以及儿茶酚雌激素类化合物如雌二醇等(Pharmacol Rev.1999；51(4):593-628)。另外，COMT酶还参与外源性的儿茶酚类药物(如卡比多巴，苄丝肼，阿扑吗啡，多巴酚丁胺，非诺多泮，α-甲基-L-DOPA，异丙肾上腺素和利米特罗等)的代谢清除。
人体中COMT酶呈基因多态性，根据其基因型不同分别表现为低活性(COMTLL)，中等活性(COMTLH)和高活性(COMTHH)，低活性和高活性之间有最高4倍的差异。而大量临床样本分析已证实，人体组织中COMT水平与精神分裂症，乳腺癌等都有较高的相关性。当人脑中的COMT活性偏高时，大脑中前额叶皮质突触间隙中的多巴胺分解代谢增加，大脑认知能力受损，导致精神分裂症的发生风险增加(PNAS.2001；98(12):6917–22)；而当人乳腺中COMT活性偏低时，雌二醇等雌激素无法代谢，其高暴露直接导致乳腺癌的发生(CancerRes.1998；58(10):2107-10)。临床实践已证实，人体组织中COMT含量的定量测定对于临床相关疾病的早期诊断以及疾病的愈后跟踪都有十分重要的参考价值。由于精神分裂症的临床症状复杂，而其疾病标志物的缺乏导致临床诊断的难度增加(J Clin Psychiatry.2005；66(2):183-194)；此外，乳腺癌是世界范围内发病率最高的癌症之一，也由于缺少明确的诊断指标，为疾病的及早发现与治疗造成极大障碍。另外，COMT还是帕金森病治疗的一个重要靶点(CNS DrugReviews.2007；13(3):352–379)，利用探针反应并借助体外代谢孵育体系可高通量的筛选和评价COMT抑制剂，对于帕金森病治疗药物的发现意义重大。同时，具有高活性COMT的帕金森患者在左旋多巴治疗时，“开-关”波动效应更明显(J.Neural Transm.2000,107:105-111)，因此COMT活性高低定量评判对于不同患者中左旋多巴的剂量调整具有重要的指导作用。
目前常用的COMT酶的探针底物主要有左旋多巴，多巴胺以及肾上腺素等儿茶酚胺类化合物，但这些底物的化学稳定性较差，需要加入还原剂以及避光操作。此外，上述底物在哺乳动物COMT酶的催化下都生成两个单甲基化产物，在实际检测中需要将两个同分异构体实现分离后方可进行定量分析。更为重要的是，上述底物及其代谢产物只能通过质谱分析进行定量检测，且两个产物由于结构和理化性质相近，在液相色谱上通常难以分离；加之该类化合物稳定性差、样品前处理复杂，给其定量检测带来了不便。因此，急需开发一种高效、灵敏且可定量检测人体组织中甲基化酶活性的方法。
目前，COMT的体外评价体系主要包括哺乳动物的红细胞，以及亚细胞组分等，其中亚细胞组分主要包括肝脏组织的S9、胞浆以及脑组织匀浆等成分。采用这些标准化的评价体系，结合相应的辅因子(S-腺苷甲硫氨酸)和孵育条件，可通过检测探针底物的代谢清除或产物生成速率，对上述各种体系中表达的COMT酶活性进行表征。
本发明中所用的COMT底物3-苯并噻唑-7,8-二羟基香豆素具有代谢产物单一(仅生成一个8-O-甲基化产物)、代谢产物易于检测且灵敏度高等特点。
发明内容
本发明的目的是提供一种儿茶酚-O-甲基转移酶的特异性荧光探针及其应用，该探针底物没有荧光发射，而甲基化产物具有较强的荧光发射，荧光量子产率较高易于检测。利用该方法可对多种生物体系中COMT的分布和功能进行定量评价。
本发明提供了一种儿茶酚-O-甲基转移酶的特异性荧光探针，该探针底物为3-苯并噻唑-7,8-二羟基香豆素，该底物可被COMT酶专一性催化生成8-甲氧基产物(图5)并在520nm处显示荧光信号，通过检测荧光强度的变化可定量测定COMT的活性；所述3-苯并噻唑-7,8-二羟基香豆素探针底物的结构式如图1所示，具体为：
一种儿茶酚-O-甲基转移酶的特异性荧光探针的应用，采用3-苯并噻唑-7,8-二羟基香豆素作为COMT的特异性底物进行8-O-甲基化结合反应，通过定量检测单位时间内的8-O-甲基化产物的生成率来定量测定不同生物体系中COMT的活性；其反应式如下：
所述定量测定不同生物体系中COMT的活性，具体测定方法为：
a.将待测样品加入pH 7.4Tris-HCl缓冲液(0.1M)中；
b.混匀后加入镁离子(100mM)，甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(4mM)以及二硫苏糖醇(40mM)；
c.37℃混匀后，孵育3-5min，加入3-BTD溶液(1mM)；
d.37℃下反应一定时间后，加入乙腈终止反应，离心，取上清液于酶标仪或生化仪上检测底物及目标产物的荧光值。
e.绘制产物3-BTMD的标准曲线，以3-BTMD的荧光值对其浓度作图，计算回归方程y＝a*x+b；将待测样本的荧光值代入标曲换算得到COMT酶的活性。
其测定条件如下：孵育体系中探针底物的浓度介于1/10～10Km之间，孵育体系的pH在6.5～10.5之间，反应温度介于20～60℃之间，反应时间5～120min。
孵育体系中探针底物的浓度优先选择Km；孵育体系的pH优选7.4；反应温度优选37℃。
所述生物体系为含有儿茶酚-O-甲基转移酶或其突变体的各类体外生物样品；包括重组表达COMT单酶、人或动物组织制备液、各类组织细胞等生物体系。
所述方法中所用的探针底物不具有荧光属性，而其8-O-甲基化产物具有荧光属性，可采用荧光检测器实现产物的快速、灵敏检测；8-O-甲基化产物荧光检测条件为：激发波长390nm(如图6所示)，最大发射波长为520nm(如图7所示)。
所述定量测定儿茶酚-O-甲基转移酶活性方法的应用，该方法可用于各类体外生物样品中COMT酶真实活力的定量评估，以及在诱导剂或激活剂存在条件下COMT酶残余活性的定量测定，进而实现抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。
所述定量测定儿茶酚-O-甲基转移酶活性方法的应用，该探针底物还可用于评价不同种属COMT及具有不同氨基酸序列的COMT突变体的催化活性，进而评估其代谢儿茶酚类药物的能力。
该方法中的特异性探针底物为off-on型荧光探针，其在COMT活性检测过程不易受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种重组COMT、人及动物组织制备液及各类组织细胞中COMT酶活的定量测定；同时也可作为在体及动物整体COMT的探针底物，评估代谢酶COMT的个体及种属差异。该方法中所用的8-O-甲基化代谢产物的荧光检测方法还可用于COMT抑制剂的快速筛选及抑制能力的定量评价。
采用重组COMT单酶，人肝S9孵育体系进行考察，通过特异性抑制实验(如图10所示)以及酶反应动力学几方面的证据，证明3-苯并噻唑-7,8-二羟基香豆素可特异性的经COMT代谢，生成8-O-甲基化产物。进一步采用各种哺乳动物的新鲜提取的肝细胞﹑原代培养肝细胞、肝切片﹑肝灌流等代谢评价体系进行考察，发现该检测方法具有非常良好的灵敏性。
作为高灵敏性的COMT荧光探针，该探针可以用来检测COMT酶的活性，尤其适合用于对细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌克隆表达体系生产的COMT的酶活测定，以及多种哺乳动物组织器官来源的S9、胞浆等制备物中COMT的活性标定。
选用本发明所述定量测定儿茶酚-O-甲基转移酶活性的方法检测COMT酶体外活性具有以下突出优势：
(1)高选择性：3-苯并噻唑-7,8-二羟基香豆素可被COMT高选择性地代谢成一个代谢产物，即8-O-甲基化产物。
(2)廉价易得：3-苯并噻唑-7,8-二羟基香豆素可经化学合成获得，合成工艺简单易行，荧光方法检测成本低。
(3)高灵敏度：3-苯并噻唑-7,8-二羟基香豆素的8-O-甲基化产物具有良好的荧光发射光谱特性(320～700nm)，且该底物不具有荧光发射，可通过off-on型标准曲线的建立定量测定8-O-甲基化产物，COMT单酶的检测下限为40ng/ml。
附图说明
图1.3-苯并噻唑-7,8-二羟基香豆素的结构式；
图2.3-苯并噻唑-7,8-二羟基香豆素的合成路线；
图3.3-苯并噻唑-7,8-二羟基香豆素的1H-NMR谱图；
图4.3-苯并噻唑-7,8-二羟基香豆素的13C-NMR谱图；
图5.COMT介导3-苯并噻唑-7,8-二羟基香豆素的代谢通路；
图6.3-苯并噻唑-7,8-二羟基香豆素-8-O-甲基化产物的紫外吸收光谱图(在390nm有最大吸收)；
图7.3-苯并噻唑-7,8-二羟基香豆素-8-O-甲基化产物的荧光发射光谱图(在520nm有最大发射)；
图8.3-BTD测定COMT酶活性的最低单酶检测限；
图9.3-BTD测定COMT酶活性的时间标准曲线；
图10.托卡朋对3-苯并噻唑-7,8-二羟基香豆素在人肝S9和S-COMT中的抑制实验结果。
图11.人及不同动物种属肝S9中的COMT代谢动力学实验。
具体实施方式
下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
本发明所采用的设备及其型号：荧光发射/激发光谱是在SynergyH1全功能微孔板检测仪上完成。
实施例1
.3-苯并噻唑-7,8-二羟基香豆素的合成
3-苯并噻唑-7,8-二羟基香豆素的合成路线如图2所示，称取2,3,4-三羟基苯甲醛1.0g溶于甲醇25mL中，加入2-(2-苯并噻唑)乙酸乙酯1.5mL，哌啶0.1mL，室温搅拌20分钟后，加热至65℃，反应4h，TLC检测反应结束。将反应液冷却后，加入水10mL，过滤，收集滤饼，即为粗品。将粗品加入乙腈20mL回流1h，冷却后过滤，真空干燥得产物3-苯并噻唑-7,8-二羟基香豆素1.8g,棕黄色固体，收率88％。1H NMR谱图和13C NMR谱图如图3和图4所示；
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:6.95(d,J＝4.4Hz,1H),7.45(m,2H),7.56(t,J＝8.0Hz,1H),8.04(d,J＝4.0Hz,1H),8.15(d,J＝4.0Hz,1H),9.11(s,1H)；
13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ:112.7,114.2,114.7,122.0,122.5,122.6,125.4,126.9,132.6,136.1,143.7,144.1,152.5,160.2,161.0；
ESI-MS:m/z 310.1为[M-H]－。
实施例2.
体外COMT的检测下限测定
实验在酶标仪上使用96孔板进行测定，3-苯并噻唑-7,8-二羟基香豆素5μM，S-腺苷甲硫氨酸200μM，二硫苏糖醇2mM，MgCl25mM，COMT单酶20ng/ml～200μg/ml，pH 7.4的Tris-HCl缓冲液50mM，总体积为200μL，37℃下孵育5min后通过酶标仪分析，每组的平均值与不加COMT的对照组比较，表明40ng/ml的COMT有统计学意义(P＜0.05)，确定COMT的检测下限为40ng/ml(见图8)。
实施例3
COMT时间标准曲线测定
实验在酶标仪上使用96孔板进行测定，3-苯并噻唑-7,8-二羟基香豆素5μM，S-腺苷甲硫氨酸200μM，二硫苏糖醇2mM，MgCl25mM，COMT单酶20ng/ml～200ng/ml，pH 7.4的Tris-HCl缓冲液50mM，总体积为200μL，37℃下孵育5min，每隔1分钟酶标仪分析，产物的荧光强度与孵育时间做标准曲线，每条标准曲线的R2＞0.99(见图9)，表明标准曲线线性范围宽广，可准确定量COMT的含量。
实施例4.
人肝S9和动物肝S9中COMT的代谢动力学测定
(1)选取人肝S9和7种动物肝S9，准备COMT代谢反应体系，包括pH 7.4的Tris-HCl缓冲液(50mM)、人肝微粒体(0.5mg/ml)、二硫苏糖醇40mM、MgCl250mM，3-苯并噻唑-7,8-二羟基香豆素浓度范围为0.1-40μM，于37℃条件下震荡预孵3分钟；
(2)向反应体系中加入10μl浓度为4mM的S-腺苷甲硫氨酸起始反应；
(3)5分钟后，加入200μl冰乙腈，剧烈震荡后，终止反应；
(4)用高速冷冻离心机在4℃，20,000×g的条件下，高速离心20分钟后，取上清，进行荧光检测(Ex＝390nm，Em＝520nm)，将所获荧光强度代入标准曲线后得到人肝S9及动物肝S9对3-苯并噻唑-7,8-二羟基香豆素的代谢动力学曲线(图11)。
Claims (8)
1.一种儿茶酚-O-甲基转移酶的特异性荧光探针，其特征在于：该探针底物为3-苯并噻唑-7,8-二羟基香豆素，该底物可被COMT酶专一性催化生成8-甲氧基产物并在520nm处显示荧光信号，通过检测荧光强度的变化可定量测定COMT的活性；所述3-苯并噻唑-7,8-二羟基香豆素探针底物的结构式为：
2.一种儿茶酚-O-甲基转移酶的特异性荧光探针的应用，其特征在于采用该探针底物作为COMT的特异性底物进行8-O-甲基化结合反应，通过定量检测单位时间内的8-O-甲基化产物的生成率来定量测定不同生物体系中COMT的活性，其反应式如下：
3.如权利要求2所述的一种儿茶酚-O-甲基转移酶的特异性荧光探针的应用，其特征在于所述定量测定不同生物体系中COMT的活性的方法，具体操作按照以下步骤进行：
a.将待测样品加入pH 7.4Tris-HCl缓冲液(0.1M)中；
b.混匀后加入镁离子(100mM)，甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(4mM)以及二硫苏糖醇(40mM)；
c.37℃混匀后，孵育3-5min，加入3-BTD溶液(1mM)；
d.37℃下反应一定时间后，加入乙腈终止反应，离心，取上清液于酶标仪或生化仪上检测底物及目标产物的荧光值。
e.绘制产物3-BTMD的标准曲线，以3-BTMD的荧光值对其浓度作图，计算回归方程y＝a*x+b；将待测样本的荧光值代入标曲换算得到COMT酶的活性。
4.如权利要求3所述的一种儿茶酚-O-甲基转移酶的特异性荧光探针的应用，其特征还在于其通过定量检测单位时间内的3-BTMD的生成率来定量测定不同生物体系中COMT的活性；其测定条件如下：孵育体系中探针底物的浓度介于1/10～10Km之间，孵育体系的pH在6.5～10.5之间，；反应温度介于20～60℃之间，；反应时间5～120min。
5.如权利要求3所述的一种儿茶酚-O-甲基转移酶的特异性荧光探针的应用，其特征还在于其通过定量检测单位时间内的3-BTMD的生成率来定量测定不同生物体系中COMT的活性；其测定条件如下：孵育体系中探针底物的浓度优先选择Km；孵育体系的pH优选7.4；反应温度，优选37℃。
6.如权利要求2所述的一种儿茶酚-O-甲基转移酶的特异性荧光探针的应用，其特征还在于：其甲基化产物的定量检测可借助荧光检测器快速检测，检测条件：激发波长390nm，最大发射波长为520nm。
7.如权利要求2所述的一种儿茶酚-O-甲基转移酶的特异性荧光探针的应用，其特征还在于所述生物体系为含有COMT酶或其突变体的各类体外生物样品；包括重组表达COMT单酶、动物或人源细胞、动物或人源组织制备物。
8.如权利要求3所述的一种儿茶酚-O-甲基转移酶的特异性荧光探针的应用其特征在于定量测定生物样品中COMT酶活性方法，可用于COMT酶诱导剂或激活剂的筛选及抑制或诱导能力的定量评价。
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