CN113801913B - 一种comt酶活性的整体水平表征方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种COMT酶活性的整体水平表征方法，其特征在于，以瑞香素或其衍生物作为底物，该底物在COMT酶的作用下发生C‑8位的甲基取代反应，并经磺酸水解酶和葡萄糖醛酸水解酶处理后生成8‑O‑甲基化产物，通过定量检测单位时间内底物及其8‑O‑甲基代谢物的含量来测定各生物样品中COMT酶的活性。本发明提供的方法能够从整体水平表征生物体内的COMT酶的活性水平，瑞香素或其衍生物只会转换为其8‑甲基代谢物，特异性好，检测检测精准度高；检测灵敏度好，具有较高安全性；该方法运用到试剂盒中，能够精确检测COMT酶活性，通过底物含量与8‑O‑甲基化产物含量的比值确定生物样品中COMT酶的活性，给出明确COMT酶的活性的评判标准。

Description

一种COMT酶活性的整体水平表征方法及其应用
技术领域
本发明涉及医药检测技术领域，具体是指一种COMT酶活性的整体水平表征方法及其应用。
背景技术
COMT酶是哺乳动物体内广泛分布的一种重要的甲基化转移酶，其主要生理功能是负责内源性的神经递质（如肾上腺素，去甲肾上腺素及其代谢产物，多巴胺等）和外源性的儿茶酚内化合物（如卡比多巴，阿扑吗啡，多巴酚丁胺等）的代谢。
人体中COMT酶的活性呈基因多态性，根据基因类型的不同可分为高、中、低代谢人群。据大量临床样本分析表明，COMT酶的体内活性与疼痛，酒精中毒，乳腺癌及精神类疾病密切相关。例如，人脑中COMT酶的活性偏高或偏低可能诱发各种精神类疾病。当人脑中COMT酶活性偏低，将导致疼痛敏感度增加。同样地，低活性COMT酶基因携带者会导致雌二醇的体内暴露量增加，增加乳腺癌患病几率。因此，定量测定体内COMT酶活性对疾病的临床诊断、治疗具有重要意义。此外，作为帕金森病的药物治疗靶点，明晰帕金森患者体内COMT酶活性对COMT酶抑制剂剂量调整，提高左旋多巴的治疗效果也具有临床指导意义。
目前，虽然已有体内COMT酶探针的研究报道，但由于COMT酶在体内组织器官广泛分布的特点，难以用于整体水平COMT酶活性评价。而现有的体内COMT没探针多数为儿茶酚胺类化合物，水溶性较高，代谢途径复杂，如图1所示，因此其检测难度较大。现有中国专利CN103193746A公开了一类儿茶酚-0-甲基转移酶的特异性探针底物及其应用，最后的甲基产物无法确定，仅以7-O-甲基代谢产物的量来对COMT酶活性的进行测定，误差极大，另外，其对COMT的测试使用的生物样品只能是肝细胞等器官的组织，不能整体上反应生物体内COMT酶活性的整体水平。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种特异性好，检测灵敏度高，且安全性好的COMT酶活性的整体水平表征方法。
本发明的另一个目的在于提供上述方法的具体应用。
为了实现上述目的，本发明通过下述技术方案实现：一种COMT酶活性的整体水平表征方法，以瑞香素或其衍生物作为底物，该底物在COMT酶的作用下发生C-8位的甲基取代反应，并经磺酸水解酶和葡萄糖醛酸水解酶处理后生成8-O-甲基化产物，通过定量检测单位时间内底物及其8-O-甲基代谢物的含量来测定各生物样品中COMT酶的活性。
本技术方案的工原理为，瑞香素本身透膜能力强，体内分布广泛，可被COMT快速代谢为甲基代谢物。向尿液中加入磺酸水解酶和葡萄糖醛酸水解酶后，尿液中的瑞香素只会转换为其8-甲基代谢物，该甲基代谢物可通过荧光、紫外、质谱等检测技术分析，提高了检测便利性，另外，由于瑞香素已经上市，该方法在临床推广过程中将具有较高的可行性。
为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述瑞香素衍生物的结构通式如下：
其中，R1、R2、R3、R4为独立的氢原子、卤素原子、甲氧基、烷基、烃基、氰基、炔基、硝基、氨基、苯基、甲基苯基、乙基苯基、丙基苯基、己基苯基、、/>、、/>、/>、/>中的一种；
R2和R4不能同时为氢原子。
为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述用来检测COMT酶活性的生物样品为尿液或血液。
为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述生物样品中COMT酶的活性是通过底物含量与8-O-甲基化产物含量的比值进行确定的。
为了更好地实现本发明的方法，进一步地，所述定量检测单位时间内底物含量及其8-O-甲基代谢物含量的方法为液相色谱、液相质谱、毛细管电泳、荧光光谱中的至少一种。
为了应用上述方法而制得的一种检测COMT酶活性的试剂盒，所述试剂盒包含服用试剂和检测试剂，所述服用试剂为溶解有定量瑞香素或其衍生物的无毒溶液，所述检测试剂采用上述COMT酶活性的整体水平表征方法对生物样品进行检测。
为了更好的应用上述方法，进一步地，所述服用试剂是通过质量分数为5%的吐温-80溶解瑞香素或其衍生物制得。
为了更好的应用上述方法，进一步地，所述试剂盒能够用于帕金森疾病的临床早期诊断、临床药物剂量调整、以及临床预后评估。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
（1）本发明提供的方法能够针对尿液和血液进行检测，其能够从整体水平表征生物体内的COMT酶的活性水平，且该方法在检测过程中，加入磺酸水解酶和葡萄糖醛酸水解酶后，瑞香素或其衍生物只会转换为其8-甲基代谢物，特异性好，检测检测精准度高；
（2）本发明所述方法检测灵敏度好，基于质谱定量的瑞香素及其甲基代谢的最低定量限仅为2 ng；
（3）本发明采用的瑞香素或其衍生物安全性好，瑞香素是从瑞祥属植物长白瑞香中提取的有效成分，动物实验的LD50值超过1200mg/kg。该化合物已被开发为临床治疗脉管炎等的辅助药物，上市30多年来未发现临床不良反应，具有较高安全性；
（4）本发明提供的方法运用到试剂盒中，能够精确检测生物样品中的COMT酶活性，试剂盒构成简单，检测方便，另外，通过底物含量与8-O-甲基化产物含量的比值确定生物样品中COMT酶的活性，给出明确的COMT酶的活性的评判标准，适宜广泛推广应用。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其他特征、目的和优点将会变得更为明显：
图1为瑞香素在大鼠体内的代谢途径；
图2为瑞香素(a)在正离子模式下的质谱；
图3为8-甲基代谢物(b) 在正离子模式下的质谱；
图4为在正离子模式下获得瑞香素(a)、8-甲基代谢物(b)和IS(c)的质谱；
图5为8-甲基代谢物(b)的1H-NMR谱、13C-NMR谱；
图6为空白尿液样品（a）、加分析物(LLOQ)和IS的空白尿液样品(b)以及灌入瑞香素2h后的尿液样品(c)的MRM色谱图、8-甲基代谢物和IS；
图7为尿液水解前后的甲基代谢物的量的变化（n=6）；
图8为不同个体尿液中COMT酶活性的比值；
图9为动物CCL4模型VS正常组，8-甲基代谢物和瑞香素的比值vs（n=6）；
图10为体外检测与体内检测COMT酶活性相关性分析图；
图11为体外检测所得的肝脏COMT酶活性与体内检测所得的整体COMT酶活性相关性分析图；
图12为COMT酶108位突变患者与正常人的COMT活性比较。
具体实施方式
为使本发明的目的、工艺条件及优点作用更加清楚明白，结合以下实施实例，对本发明作进一步详细说明，但本发明的实施方式不限于此，在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内，此处所描述的具体实施实例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：
本实施例确定用3-氨基香豆素作为IS，具体操作如下：
高信号强度的目标分析物是必要的一个MS-based分析方法。对色谱分离条件和质谱参数进行了优化。
基于Q1全扫描质谱的分析物(瑞香素和daphnetin-Me 100 ng / mL),发现强烈的信号在正离子模式下daphnetin-Me明显高于在负离子模式下,而瑞香素在正离子和负离子模式下的MS信号比较，表明正离子模式对瑞香素和8-甲基代谢物的测定有好处，如图2，图3所示。根据这一观察，考虑到3-氨基香豆素对质子的接受能力，以及与瑞香素和8-甲基代谢物在结构和保留时间上的相似性，最终选择了3-氨基香豆素作为内标。
实施例2：
本实施例提供瑞香素代谢产物的水解处理过程，具体操作如下：
（1）选择SD大鼠(雄性，200±20 g)，实验前将大鼠置于温度25±2℃、湿度50±5%的标准环境中饲养2周(12/12h暗/光周期)。给药前禁食过夜；
（2）用吐温-80溶解瑞香素，并灌入大鼠体内，收集一段时间内大鼠尿液；
（3）取相同量尿液，向其中加入磺酸水解酶和尿苷二磷酸葡萄醛酸转移酶水解；
（4）最终尿液中剩余物质为瑞香素及其8-甲基代谢物。
实施例3：
本实施例提供液相色谱与液相质谱检测系统的分析条件，具体如下：
检测系统包括液相色谱与液相质谱。分析条件如下：所有分析均采用LC-MS/MS系统进行，系统包括LC-30AD × 2输液泵、DGU-20A5在线除气器、SIL-30AC自动采样装置、CTO-20A柱式炉、CBM-20A系统控制器和8045三四极杆质谱仪。计算机配备LC-MS/MS解决方案软件(V version 5.85)。采用Acchrom Xcharge C18柱(2.1×150mm, 5µm)进行色谱分离，柱温为40℃。流动相组成为0.1%甲酸-乙腈(63:37,v/v)的混合物。流速为0.3 mL/min，自动进样器温度保持在10℃。注射量为10 µL，每个样品运行时间为4.7 min。定量分析采用ESI阳性的多反应监测(MRM)模式。根据质谱片段分析，分别用m/z 179.15→51.10、193.30→150.05和162.00→106.20的前驱体到产物的离子转变来监测瑞香素、8-甲基代谢物和IS。优化的光谱测定条件为:离子喷雾电压3.5kV，源温度400和脱溶温度200，雾化气流量2.5 L/min，加热气流量8.0 L/min，干燥气流量10.0 L/min。Q1 Pre Bias、碰撞能量和Q3Pre Bias的优化值分别为:瑞香素为-12 V、-49 V和-19 V, 8-甲基代谢物为-11 V、-25 V和-27 V, IS为-11 V、-21 V和-20 V。离子停留时间设置为100毫秒。
实施例4：
本实施例提供瑞香素用于检测健康大鼠体内COMT酶的活性，具体步骤如下：
（1）选择SD大鼠(雄性，200±20 g)，实验前将十只大鼠置于温度25±2℃、湿度50±5%的标准环境中饲养2周(12/12h暗/光周期)，给药前禁食过夜；
（2）用吐温-80溶解瑞香素，并灌入大鼠体内，收集一段时间内大鼠尿液；
（3）取相同量尿液，向其中加入磺酸水解酶和尿苷二磷酸葡萄醛酸转移酶水解，最终尿液中剩余物质为瑞香素及其8-甲基代谢物；
（4）将瑞香素、8-甲基代谢物和IS溶于乙腈中，制备1000 µg/mL的原液；
（5）进行连续稀释，得到IS的工作液(20000 ng/mL)和不同浓度的乙腈工作液(1040000 ng/mL)，所有溶液在分析前保存在4℃，样品制备采用液-液萃取法；
（6）将100µL尿液样本用于混合30 µL盐酸(2摩尔/升)，10 µL的IS工作液，20 µL的瑞香素或8-甲基代谢物的相应工作液；搅拌1 min后，与1000 µL的乙酸乙酯混合，搅拌5min，离心后，上层有机相转移，在40℃的温和氮气流下蒸发干燥；
（7）用含0.1%甲酸的100 µL初始流动相重新溶解，20000 ×g离心10 min，用10 µL的上清液注入LC-MS/MS系统进行分析，以配制的工作液为基础，分别用不同浓度的瑞香素和8-甲基代谢物(2、10、20、50、150、200、300、600、800、1500、4000、8000 ng/mL)配制12个校准样品(CS)，同样，制备5个质量控制品，分别为5 ng/mL、100 ng/mL、1000 ng/mL、3000 ng/mL和6000 ng/mL瑞香素和8-甲基代谢物。所有溶液和QC样品在-20℃保存至分析；
（8）通过MS/MS破碎分析，采用MRM在正离子模式下检测瑞香素、8-甲基代谢物和IS的优化质量跃移离子对，如图4所示，瑞香素、8-甲基代谢物和IS的保留时间分别为2.12min、2.72 min和4.06 min，如图5所示。除m/z为51.10外，还得到了m/z为76.90的产物离子。m/ z51等产物离子灵敏度低，没有选择性(m的重叠干扰)，未被选择进行定量；
（9）利用所得数据，建立8-甲基代谢物浓度与8-甲基代谢物和IS的质谱响应比值的标曲曲线；
（10）通过质谱分析和液相色谱，分别得到两组大鼠尿液中8-甲基代谢物和IS的质谱响应比值，分别带入相应曲线，即可求得尿液中瑞香素及8-甲基代谢物的含量。再求得其比例分别为2：1、2.5:1、1：2、1：3、2：3、1：2、3：3.5、2：4、1：3.5、2：5则可分别判定这些大鼠体内COMT的活性高低。
实施例5：
本实施例提供检测健康大鼠尿液水解前后的8-甲基代谢物的含量变化，具体步骤如下：
（1）选择SD大鼠10只(雄性，200±20 g)，实验前将大鼠置于温度25±2℃、湿度50±5%的标准环境中饲养2周(12/12h暗/光周期)，给药前禁食过夜；
（2）用5%吐温-80溶解瑞香素，并灌入大鼠体内，收集一段时间内大鼠尿液；
（3）取两组相同量尿液，一组尿液不进行水解处理为水解前尿液，另一组尿液向其中加入磺酸水解酶和尿苷二磷酸葡萄醛酸转移酶水解最终尿液中剩余物质为瑞香素及其8-甲基代谢物，该组为水解后尿液；
（4）利用上述检测方法进行尿液中瑞香素及其8-甲基代谢物含量的检测；
（5）利用所得数据，建立8-甲基代谢物浓度与8-甲基代谢物和IS的质谱响应比值建立标曲曲线；
（6）通过质谱分析和液相色谱，分别得到两组大鼠尿液中8-甲基代谢物和IS的质谱响应比值，分别带入相应曲线，即可求得两组大鼠尿液中8-甲基代谢物的含量；
（7）比较两组大鼠尿液中8-甲基代谢物含量的差异，可得出水解前后大鼠尿液中8-甲基代谢物含量的变化，如图6，图7所示。
实施例6：
本实施例提供比较健康大鼠和四氯化碳（CCl4）模型大鼠体内COMT酶的活性的差异，
具体步骤如下：
（1）选择十只SD大鼠(雄性，200±20 g)和十只CCl4模型鼠，实验前将大鼠置于温度25±2℃、湿度50±5%的标准环境中饲养2周(12/12h暗/光周期)，给药前禁食过夜；
（2）用吐温-80溶解瑞香素，并灌入健康大鼠和CCl4模型鼠体内，收集一段时间内大鼠尿液，取相同量尿液，向其中加入磺酸水解酶和尿苷二磷酸葡萄醛酸转移酶水解，最终尿液中剩余物质为瑞香素及其8-甲基代谢物；
（3）利用上述检测方法，得到大鼠尿液中瑞香素与IS质谱响应峰面积的比值以及8-甲基代谢物与IS质谱响应峰面积的比值，利用所得数据，建立8-甲基代谢物浓度与8-甲基代谢物和IS的质谱响应比值的标曲曲线，分别带入相应曲线，即可求得大鼠尿液中瑞香素及8-甲基代谢物的含量；
（4）分别计算出健康大鼠和CCl4模型大鼠尿液中瑞香素和8-甲基代谢物的含量比值，并作出含量比值模型图，如图8，图9所示。
实施例7：
本实施例提供采用瑞香素作为体内探针考察健康成年人体中COMT酶的活性的差异，具体步骤如下：
（1）让成年人口服瑞香素胶囊0.45 g，一段时间内收集尿液，取相同量尿液，向其中加入磺酸水解酶和尿苷二磷酸葡萄醛酸转移酶水解，最终尿液中剩余物质为瑞香素及其8-甲基代谢物；
（2）将瑞香素、8-甲基代谢物和IS溶于乙腈中，制备1000 µg/mL的原液进行连续稀释，得到IS的工作液(20000 ng/mL)和不同浓度的乙腈工作液(10 40000 ng/mL)。所有溶液在分析前保存在4℃，样品制备采用液-液萃取法；
（3）利用之前所述检测方法，得到人体尿液中瑞香素与IS质谱响应峰面积的比值以及8-甲基代谢物与IS质谱响应峰面积的比值，分别带入相应曲线，即可求得尿液中瑞香素及8-甲基代谢物的含量；
（4）最后得到不同人尿液中，瑞香素及其8-甲基代谢物的含量比值为2.4、2.7、4.1、3.0、2.6、3.5、3.8、4、3.3、4.2，据此可判定这些人体内COMT的活性高低。
实施例8：
本实施例提供已有的体外检测方法与本专利体内检测方法检测大鼠体内COMT酶的活性的相关性比较，具体步骤如下：
体内检测：
（1）选择SD大鼠二十只(雄性，200±20 g)，实验前将大鼠置于温度25±2℃、湿度50±5%的标准环境中饲养2周(12/12h暗/光周期)；
（2）用吐温-80溶解瑞香素，并灌入大鼠体内，收集一段时间内大鼠尿液。
（3）取相同量尿液，向其中加入磺酸水解酶和尿苷二磷酸葡萄醛酸转移酶水解，最终尿液中剩余物质为瑞香素及其8-甲基代谢物；
（4）将瑞香素、8-甲基代谢物和IS溶于乙腈中，制备1000 µg/mL的原液，进行连续稀释，得到IS的工作液(20000 ng/mL)和不同浓度的乙腈工作液(10 40000 ng/mL)，所有溶液在分析前保存在4℃，样品制备采用液-液萃取法；
（5）利用之前所述检测方法，得到大鼠尿液中瑞香素与IS质谱响应峰面积的比值以及8-甲基代谢物与IS质谱响应峰面积的比值，利用所得数据，建立8-甲基代谢物浓度与8-甲基代谢物和IS的质谱响应比值的标曲曲线。分别带入相应曲线，即可求得尿液中瑞香素及8-甲基代谢物的含量。并用其比值反应COMT的活性。
体外检测：
（1）取上述二十只大鼠的肝脏，脑，血液，肾，肠，肺，分别制成匀浆，离心后获得上清液；
（2）分别将获得的上清液与40 mM DTT以及5 mM MgCl2，终浓度为10 µl的瑞香素置于37℃下孵育3分钟，10分钟后，向其中加入200 µl乙腈，剧烈振荡后终止反应；
（3）在20，000×g的条件下，用高速冷冻离心机分别离心上述体系20分钟后，取上清液，进行HPLC-UV检测，最终可分别获得每只大鼠的肝脏，脑，血液，肾，肠，肺中的COMT活性，将其相加，可近似看作该大鼠的整体COMT活性；
（4）将本专利的体内检测方法所得的大鼠COMT活性与已有方法所得的COMT活性做相关性比较，如图10所示，再分别将获得的二十只大鼠肝脏，脑，血液，肾，肠，肺的COMT活性与用本专利提供的方法所测得的整体COMT活性做相关性分析，（以肝脏的COMT活性和整体的COMT活性做相关性分析为例，如图11所示。分析可知，用本专利提供的方法可测的整体COMT的活性，而体外检测方法不可测得。
实施例9：
本实施例提供COMT108位突变患者与正常人的COMT活性比较，具体步骤如下：
（1）通过基因型检测，选择十位COMT基因为Met/Met (A/A)的COMT 108位突变患者和十位正常健康人。
（2）让上述人群每人服用瑞香素胶囊0.45g，一段时间内收集尿液。取相同量尿液，向其中加入磺酸水解酶和尿苷二磷酸葡萄醛酸转移酶水解。最终尿液中剩余物质为瑞香素及其8-甲基代谢物。
（3）将瑞香素、8-甲基代谢物和IS溶于乙腈中，制备1000 µg/mL的原液进行连续稀释，得到IS的工作液(20000 ng/mL)和不同浓度的乙腈工作液(10 40000 ng/mL)。所有溶液在分析前保存在4℃。样品制备采用液-液萃取法。
（4）利用之前所述检测方法，得到人体尿液中瑞香素与IS质谱响应峰面积的比值以及8-甲基代谢物与IS质谱响应峰面积的比值，利用所得数据，建立8-甲基代谢物浓度与8-甲基代谢物和IS的质谱响应比值的标曲曲线。分别带入相应曲线，即可求得尿液中瑞香素及8-甲基代谢物的含量。
（5）最后得到10位COMT108位突变患者尿液中，瑞香素及其8-甲基代谢物的含量比值为1.3、2.2、1.5、1.7、1.8、2.1、2.3、1.4、2.4、2；而10位健康正常人中，瑞香素及其8-甲基代谢物的含量比值为2.4、2.7、4.1、3.0、2.6、3.5、3.8、4、3.3、4.2，如图12所示。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (2)

1.一种COMT酶活性的整体水平表征方法，其特征在于，以瑞香素或其衍生物作为底物，该底物在COMT酶的作用下发生C-8位的甲基取代反应，并经磺酸水解酶和葡萄糖醛酸水解酶处理后生成8-O-甲基化产物，通过定量检测单位时间内底物及其8-O-甲基代谢物的含量来测定各生物样品中COMT酶的活性，所述生物样品为尿液或血液；所述生物样品中COMT酶的活性是通过底物含量与8-O-甲基化产物含量的比值进行确定的。
2.根据权利要求1所述的一种COMT酶活性的整体水平表征方法，其特征在于，所述定量检测单位时间内底物含量及其8-O-甲基代谢物含量的方法为液相色谱、液相质谱、毛细管电泳、荧光光谱中的至少一种。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105624268A (zh) * 2014-11-05 2016-06-01 中国科学院大连化学物理研究所 一种定量测定儿茶酚-o-甲基转移酶活性的方法及其应用
CN106467739A (zh) * 2015-08-18 2017-03-01 中国科学院大连化学物理研究所 儿茶酚-o-甲基转移酶的特异性荧光探针及其应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105624268A (zh) * 2014-11-05 2016-06-01 中国科学院大连化学物理研究所 一种定量测定儿茶酚-o-甲基转移酶活性的方法及其应用
CN106467739A (zh) * 2015-08-18 2017-03-01 中国科学院大连化学物理研究所 儿茶酚-o-甲基转移酶的特异性荧光探针及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Methylation, Glucuronidation, and Sulfonation of Daphnetin in Human Hepatic Preparations In Vitro: Metabolic Profiling, Pathway Comparison, and Bioactivity Analysis";Si-Cheng Liang 等;《 Journal of Pharmaceutical Sciences》;第105卷;第808-816页 *
"祖师麻主要活性成分的口服吸收及代谢研究";单进军;《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》(第5期);第97页 *

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