CN110373325B - 一种微量血液孵化装置及微量血液孵化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种微量血液孵化装置及微量血液孵化方法，包括：一容器，用于容纳葡萄糖溶液；一血液孵化单元，用于细胞的孵化，包括：一多孔毛细管，设于所述容器内；一透析膜，覆盖于所述多孔毛细管的表面；一电渗流柱塞泵，设于所述多孔毛细管的一端；及两电极，设于所述多孔毛细管的两端，所述电极与电渗流柱塞泵相配合使多孔毛细管内的细胞按一定频率上下翻转；一葡萄糖溶液供给单元，与所述容器连接，用于供给不同浓度的葡萄糖溶液；及一温度控制单元，设于所述容器的外部，用于控制该装置运行的温度。本发明具有还原人体血糖变化环境、持续供给营养和带走代谢废物、模拟还原血液流动状况和精确控制还原人体温度等多种优点。

Description

一种微量血液孵化装置及微量血液孵化方法
技术领域
本发明涉及分析化学技术、生物技术和转化医学等技术领域，具体涉及一种微量血液孵化装置及微量血液孵化方法。
背景技术
糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病。据2010年中国慢性病调查数据,我国成人糖尿病患病率为9.7％(陈伟伟,等.《中国心血管病报告2015》概要[J].中国循环杂志,2016,31(06):521-528)，其诊断和治疗消耗了大量的社会财富。目前用于糖尿病诊断的指标有HbA1c、空腹血糖以及OGTT糖耐量，其中最常使用的指标为HbA1c，通常认为其能反应近期2-3个月内的平均水平。尽管科研人员有多种测量HbA1c的方法，如液相色谱(HPLC)和毛细管电泳(CE)等，但仍有一些时候，会出现所测HbA1c与多日内平均血糖不一致的情况(Michael S.Radin.Pitfalls in Hemoglobin A1c Measurement:When Results may beMisleading[J].Journal of General Internal Medicine,2014,29(2))，可能使得医生或是病人误判病情，导致不必要的后果。
目前科学家对于HbA1c值和平均血糖不匹配的原因仍未完全理解透彻，其中一个原因即是缺少动态的连续多日内培养红细胞的系统。据我们目前所知，一种专门用于红细胞的培养基EAS81(Hess JR,et al.Buffering and dilution in red blood cellstorage.Transfusion 2005；45:50–54)仅能实现红细胞的储存，但该体系为静态封闭的系统，无法实现的物质供给和废料移除；由重力驱动培养液的无泵培养系统(V.v.Duinen,etal.Sci.Rep.7(2017)18071)或是单泵的培养系统(Park,J.Y.,etal.Microfluid.Nanofluid.2010,8,263–268.)仅能实现固定浓度的培养液供给，无法实现变化浓度的培养液供给；而多泵多通道的灌注培养系统如刘等人发明的脂肪细胞培养芯片(Yunxiao Liu,et al.Lab on a Chip,2019,19,241-253)尽管能独立多通道灌注培养分布在不同隔室的细胞，仍不能实现动态的培养液供给，同时细胞隔室内无搅拌系统，细胞在培养过程中也多为静止状态。且整个培养芯片无温控系统，芯片需另置恒温箱内才能保证所需温度条件。
另外，目前用于细胞培养的系统多以聚二甲基硅氧烷(PDMS)为材料。也有科研团体用PDMS加工多孔屏障，以模拟毛细血管内皮(Kim Sudong,et al.Lab on a chip,2013,13,1489-1500)，其可隔离细胞和大分子而不影响其小分子的物质交换，使得人体内部某些器官微环境的模拟还原有了较大提高，但PDMS材料会吸收一些有机复合物，且其有不易大批量生产的缺点，阻碍了其实际的应用和发展。
发明内容
本发明的目的就是为了解决上述问题而提供一种微量血液孵化装置及微量血液孵化方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种微量血液孵化装置，包括：
一容器，用于容纳葡萄糖溶液；
一血液孵化单元，用于细胞的孵化，包括：
一多孔毛细管，设于所述容器内；
一透析膜，覆盖于所述多孔毛细管的表面；
一电渗流柱塞泵，设于所述多孔毛细管的一端；及
两电极，设于所述多孔毛细管的两端，所述电极与所述电渗流柱塞泵相配合使多孔毛细管内的细胞按一定频率上下翻转；
一葡萄糖溶液供给单元，与所述容器连接，用于供给不同浓度的葡萄糖溶液；及
一温度控制单元，设于所述容器的外部，用于控制该装置运行的温度。
进一步地，所述的容器为圆柱形套管，分别设有进样入口和出口，所述葡萄糖溶液供给单元连接于进样入口。
进一步地，所述多孔毛细管可拆卸式安装于所述容器内，外径为0.5-2.0mm，管壁厚度为50-100um，长度为2.0-3.0cm，所述多孔毛细管内接种细胞。
进一步地，所述多孔毛细管为石英毛细管，多孔结构由HF溶液刻蚀形成。
进一步地，所述透析膜为纤维素酯透析膜，厚度为20-100um，截留分子量为500D。
进一步地，所述两电极包括正极和负极，分别通过导线连接交流电源。
进一步地，所述葡萄糖溶液供给单元包括三端口纳米阀、用于输送不同浓度葡萄糖溶液的第一进样泵及第二进样泵，所述第一进样泵与第二进样泵均与三端口纳米阀连接，所述三端口纳米阀的出口端与所述容器连接，通过程序控制第一进样泵或第二进样泵的流速，而无需改变高、低浓度葡萄糖溶液浓度，即可模拟人体的血糖变化。
由第一进样泵和第二进样泵泵入的溶液经三端口纳米阀混合后，泵入套管内的葡萄糖溶液浓度由如下公式计算：
Figure BDA0002126767380000031
其中，Cmax为第一进样泵泵入的较高浓度的葡萄糖溶液浓度，V1为第一进样泵泵入流速，Cmin为第二进样泵泵入的较低浓度的葡萄糖溶液浓度，V2为第二进样泵泵入流速。
若混合后葡萄糖溶液浓度C与时间的函数为：
C1＝f(t) (2)
令V1恒定，可得V2为：
Figure BDA0002126767380000032
因此，可通过程序控制V2流速，而无需改变高、低浓度葡萄糖溶液浓度，即可模拟人体的血糖变化。
进一步地，所述温度控制单元包括温控半导体、风扇及温度传感器，所述温控半导体设于所述容器表面，所述温度传感器用于监测装置温度，所述温度传感器、温控半导体以及风扇协同控制装置温度，使装置运行温度维持在36.5-37.5℃。
进一步地，所述的电渗流柱塞泵通过以下方法制得：将硅酸盐和二氧化硅粉末混合，添加到多孔毛细管的一端，然后高温烧结，形成柱塞，之后在溶液和电场作用下，柱塞细颗粒表面解离带zelta电势，形成电渗流柱塞泵。
一种基于上述装置的微量血液孵化方法，包括如下步骤：
(1)在多孔毛细管内接种细胞后，将多孔毛细管安装于容器内；
(2)设置实验所需的温度，打开葡萄糖溶液供给单元，供给试验所需血糖浓度的葡萄糖溶液；
(3)血液孵化单元工作，并利用两电极及电渗流柱塞泵，控制多孔毛细管内的细胞运动方向和运动速度，模拟血液在血管内流动；
(4)拆卸多孔毛细管，对拆卸后的多孔毛细管内的细胞进行多种后续分析和鉴定。
本发明不仅能够实现细胞的长时间培养，还能够实现细胞外环境葡萄糖溶液浓度的精确控制，同时，交变电流控制下的电渗流柱塞泵能够驱动多孔毛细管内的细胞上下运动，可模拟血液流动的状态，使其更加接近人体生理状态。
与现有培养细胞容器相比，本发明能够实现以下新功能：
1、可以还原人体血糖变化环境。通过2个进样泵实现对进样溶液中葡萄糖浓度的连续控制，通过程序设置能够混合后溶液模拟人体内血糖浓度变化，还原体内血糖环境，有益于细胞生长和科学研究；
2、本装置可持续供给营养和带走代谢废物。通过亲水性高分子层可隔离细胞而不影响小分子物质间交换，可持续供给营养和带走废物而不影响细胞在毛细管内的附着；
3、可以模拟还原血液流动状况。交变电流控制电渗流柱塞泵使得细胞以一定频率上下翻转，保持其运动，模拟血液流动状况，且使其不会发生凝血等反应；
4、可以精确控制还原人体温度。电极槽一侧的温度传感器、温控半导体以及风扇能够控制部件温度在37℃左右，接近人体温度，适宜细胞培养和生长。
附图说明
图1为本发明装置的整体结构示意图。
图2为本发明实施例混合浓度C1随时间t的曲线图。
图3为本发明实施例混合浓度C2与溶液从进样口流至l处的曲线图。
图中：第一进样泵1、第二进样泵2、三端口纳米阀3、电渗流柱塞泵4、套管5、电极6、生物技术纤维素酯透析膜7、多孔石英毛细管8、温度传感器9、温控半导体10、风扇11、交变电源12、导线13。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例
如图1所示，一种微量血液孵化装置，用于孵化红细胞，包括第一进样泵1、第二进样泵2、三端口纳米阀3、电渗流柱塞泵4、套管5、电极6、生物技术纤维素酯透析膜7、多孔石英毛细管8、温度传感器9、温控半导体10、风扇11、交变电源12和导线13，具体连接关系如图所示。多孔石英毛细管8安装于套管5中部，生物技术纤维素酯透析膜7覆盖于多孔石英毛细管8表面，电渗流柱塞泵4安装于多孔石英毛细管8上端，电极6包括正负极，分别设于套管5上下两端，并通过导线13与交变电源12连接。其中，电渗流柱塞泵4通过以下方法制得：将硅酸盐和二氧化硅粉末混合，添加到多孔毛细管的一端，然后高温烧结，形成柱塞，之后在溶液和电场作用下，柱塞细颗粒表面解离带zelta电势，形成电渗流柱塞泵。
三端口纳米阀3分别与第一进样泵1、第二进样泵2和套管5相连；多孔石英毛细管8一端有电渗流柱塞泵4；电极6通过导线13与交变电源12相连，形成电流通路；电极6一侧附上温度传感器9、温控半导体10以及风扇11，电极槽一侧的温度传感器、温控半导体以及风扇能够控制部件温度在37℃左右，接近人体温度，适宜红细胞培养和生长。经HF刻蚀后的多孔石英毛细管8外覆生物技术纤维素酯透析膜7后接种一定量红细胞，再安装电渗流柱塞泵4后和套管5相连，套管5上下两端各接有一电极6组成电极槽，电极槽进样口与三端口纳米阀3通过导管连接。三端口纳米阀3前接第一进样泵1和第二进样泵2，第一进样泵1可泵入较高浓度葡萄糖溶液，第二进样泵2可泵入较低浓度葡萄糖溶液，两种溶液都含一定浓度PBS溶液用于pH缓冲，泵入溶液速度由程序控制，经三端口纳米阀3混合后，泵入葡萄糖浓度如公式(1)所示：
Figure BDA0002126767380000051
其中，Cmax为第一进样泵1泵入的较高浓度的葡萄糖溶液浓度，V1为第一进样泵泵入流速，Cmin为第二进样泵2泵入的较高浓度的葡萄糖溶液浓度，V2为第二进样泵泵入流速。
若混合后葡萄糖浓度C与时间的函数为
C1＝f(t) (2)
令V1恒定，可得V2为
Figure BDA0002126767380000052
即只需通过程序控制V2流速，而无需改变高、低浓度葡萄糖浓度，即能实现进样溶液中葡萄糖浓度的连续且精确的控制，还原人体血糖变化情况。
混合浓度C1随时间t的示意图如图2所示，因泵入混合液流速较低且恒定，则在确定的时间点t0时，距离电泳槽进样口l处的葡萄糖溶液浓度为：
Figure BDA0002126767380000061
其中tl为混合溶液从进样口流至l处所需时间，V3为混合泵所控制的流经电泳槽混合溶液流速。公式(4)表明C2与l所成图形是f(l)在l坐标上的平移与压缩(或平移与拉伸，拉伸或压缩取决于V3)，如图3所示。
当混合溶液流经多孔石英毛细管8时，其表层的生物技术纤维素酯透析膜7使得其内的红细胞能够与其外的混合溶液进行小分子(如葡萄糖、无机盐等物质)的物质交换，而隔绝其细胞和大分子的交换。在电路连接好后，交变电源12能够在一定频率下控制多孔石英毛细管8内电渗流的方向和速度，从而模拟红细胞在血管内的运动状况，同时使得其不发生凝集反应。因温度对糖化反应速率有较大影响，需要精确的温度控制，所以在孵化器一侧配置温度传感器9以及温控半导体10，以精准控制体系温度，保证实验所需温度条件被精准控制。
应用上述装置的微量血液孵化方法，具体包括如下步骤：
(1)在多孔毛细管内接种红细胞后，将多孔毛细管安装于容器内；
(2)设置实验所需的温度，打开葡萄糖溶液供给单元，供给试验所需血糖浓度的葡萄糖溶液；
(3)血液孵化单元工作，并利用两电极及电渗流柱塞泵，控制多孔毛细管内的红细胞运动方向和运动速度，模拟血液在血管内流动；
(4)拆卸多孔毛细管，对拆卸后的多孔毛细管内的红细胞进行多种后续分析和鉴定。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种微量血液孵化装置，其特征在于，包括：
一容器，用于容纳葡萄糖溶液；
一血液孵化单元，用于细胞的孵化，包括：
一多孔毛细管，设于所述容器内；
一透析膜，覆盖于所述多孔毛细管的表面；
一电渗流柱塞泵，设于所述多孔毛细管的一端；及
两电极，设于所述多孔毛细管的两端，所述电极与所述电渗流柱塞泵相配合使多孔毛细管内的细胞按一定频率上下翻转；
一葡萄糖溶液供给单元，与所述容器连接，用于供给不同浓度的葡萄糖溶液；及
一温度控制单元，设于所述容器的外部，用于控制该装置运行的温度；
所述的容器为圆柱形套管，分别设有进样入口和出口，所述葡萄糖溶液供给单元连接于进样入口；
所述的电渗流柱塞泵通过以下方法制得：将硅酸盐和二氧化硅粉末混合，添加到多孔毛细管的一端，然后高温烧结，形成柱塞，之后在溶液和电场作用下，柱塞细颗粒表面解离带zelta电势，形成电渗流柱塞泵。
2.根据权利要求1所述的一种微量血液孵化装置，其特征在于，所述多孔毛细管可拆卸式安装于所述容器内，外径为0.5-2.0mm，管壁厚度为50-100um，长度为2.0-3.0cm，所述多孔毛细管内接种细胞。
3.根据权利要求2所述的一种微量血液孵化装置，其特征在于，所述多孔毛细管为石英毛细管，多孔结构由HF溶液刻蚀形成。
4.根据权利要求1所述的一种微量血液孵化装置，其特征在于，所述透析膜为纤维素酯透析膜，厚度为20-100um，截留分子量为500D。
5.根据权利要求1所述的一种微量血液孵化装置，其特征在于，所述两电极包括正极和负极，分别通过导线连接交流电源。
6.根据权利要求1所述的一种微量血液孵化装置，其特征在于，所述葡萄糖溶液供给单元包括三端口纳米阀、用于输送不同浓度葡萄糖溶液的第一进样泵及第二进样泵，所述第一进样泵与第二进样泵均与三端口纳米阀连接，所述三端口纳米阀的出口端与所述容器连接，通过程序控制第一进样泵或第二进样泵的流速，模拟人体的血糖变化。
7.根据权利要求1所述的一种微量血液孵化装置，其特征在于，所述温度控制单元包括温控半导体、风扇及温度传感器，所述温控半导体设于所述容器表面，所述温度传感器用于监测装置温度，所述温度传感器、温控半导体以及风扇协同控制装置温度，使装置运行温度维持在36.5-37.5℃。
8.一种基于权利要求1所述装置的微量血液孵化方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)在多孔毛细管内接种细胞后，将多孔毛细管安装于容器内；
(2)设置实验所需的温度，打开葡萄糖溶液供给单元，供给试验所需血糖浓度的葡萄糖溶液；
(3)血液孵化单元工作，并利用两电极及电渗流柱塞泵，控制多孔毛细管内的细胞运动方向和运动速度，模拟血液在血管内流动；
(4)拆卸多孔毛细管，对拆卸后的多孔毛细管内的细胞进行多种后续分析和鉴定。
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Title
Single cell trapping in larger microwells capable of supporting cell spreading and proliferation;Joong Yull Park et al.;《Microfluid Nanofluidics》;20100201;263–268 *

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